Summary
Het onderzoeken van meerdere, kunnen endogene posttranslationele modificaties voor een eiwit-doelstelling zeer uitdagend. De hier beschreven technieken gebruiken een geoptimaliseerde lysis buffer en filter systeem ontwikkeld met specifieke PTM-targeting, affiniteit matrices te sporen van de acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 en tyrosine fosforylering wijzigingen voor een doel eiwit met behulp van een enkele, gestroomlijnde systeem.
Abstract
Het is nu goed gewaardeerd dat posttranslationele modificaties (PTMs) een integrale rol spelen in het reguleren van de structuur en de functie, die essentieel zijn voor een bepaald eiwit rol zowel fysiologisch en pathologisch van een eiwit. Verrijking van PTMs is het vaak nodig bij het onderzoeken van de PTM status van een doel-eiwit, omdat PTMs vaak van voorbijgaande aard zijn en relatief laag in overvloed. Vele valkuilen worden aangetroffen als verrijkend voor een PTM van een doel-eiwitten, zoals buffer onverenigbaarheid, is het doel eiwit antilichaam niet IP-compatibele, verlies van PTM signaal, en anderen. De graad van moeilijkheid wordt vergroot bij het onderzoeken van meerdere PTMs zoals acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 en tyrosine fosforylering voor een bepaald doel-eiwit. Bestuderen van een combinatie van deze PTMs kan noodzakelijk zijn als Overspraak tussen PTMs overwegend en essentieel voor eiwit-verordening is. Deze PTMs worden vaak bestudeerd in verschillende lysis buffers en met unieke remmer composities. Om het proces te vereenvoudigen, unieke denatureren lysis werd een systeem ontwikkeld dat effectief isoleert en behoudt deze vier PTMs; waardoor onderzoek van potentiële overspraak in een enkele lysis-systeem. Een uniek filtersysteem werd ontworpen om te verwijderen besmetten genomic DNA van de lysate, die een problematische bijproduct van de denaturering van buffers. Robuuste affiniteit matrices gericht op elk van de vier PTMs werden ontwikkeld in samenspraak met de buffersysteem om de verrijking en de detectie van de endogene Staten van deze vier PTMs te maximaliseren. Deze uitgebreide PTM detectie toolset stroomlijnt het proces van het verkrijgen van belangrijke informatie over of een eiwit is gewijzigd door een of meer van deze PTMs.
Introduction
Posttranslationele modificaties (PTMs) zijn sterk gereguleerde wijzigingen aan een proteïne, waarbij de wijziging wordt toegevoegd of verwijderd op een specifieke wijze. PTMs zijn vaak dynamische, voorbijgaande veranderingen die aanzienlijk veranderen de eiwitstructuur, interacties met partner eiwitten, ruimtelijke lokalisatie en uiteindelijk waardoor de eiwitten voor het uitvoeren van verschillende functies1,2 , 3 , 4. PTMs zijn zo overvloedig dat ze het aantal unieke eiwit vormen (of proteoforms) van ongeveer 30.000 genproducten tot meer dan een miljoen proteoforms5,6 stijgen. Het identificeren van PTMs en definiëren hun effect op een doel-proteïne is kritisch naar het begrip van het eiwit van fysiologische en pathologische functies7,8,9,10, 11,12,13,14. Werken op select eiwitten zoals tubuline, p53 en epidermale groeifactor receptor (EGFR) de regelgevende taken van PTMs15,16,17hebben toegelicht. Deze studies aan het licht gebracht dat de verordening van deze eiwitten ontstaat door meerdere PTMs, en in veel gevallen deze wijzigingen werken in concert ter bevordering van een specifieke functie. Nieuwe studies hebben aangetoond dat zowel de negatieve als de coöperatieve PTM Overspraak kan plaatsvinden op diverse verschillende eiwitten18,19,20,21,22, 23,24,25. Echter zijn de PTM profielen van de meerderheid van eiwitten opgebouwd uit verschillende studies die hebben gebruikt verschillende modellen en unieke omstandigheden. Een geoptimaliseerde systeem te onderzoeken van meerdere PTMs in één systeem zou zeer gunstig inzicht te krijgen in de potentiële PTM Overspraak voor een doel-eiwit.
Een uitdaging met het onderzoek naar PTMs in één systeem is dat er specifieke PTMs worden onderzocht met behulp van verschillende lysis buffers. Bijvoorbeeld het gebruik van buffers zoals RIPA of NP-40 die vaak worden gebruikt voor fosforylatie of ubiquitination onderzoeken mogelijk onvoldoende voor het bestuderen van een labiele PTM zoals kleine ubiquitin-achtige modifier (SUMO) ylation26. Bovendien, niet-denaturering buffers niet toereikend zijn om eiwitinteractie distantiëren, en kunnen leiden tot valse positieve PTM identificatie27. Onderzoek naar PTMs in een denatureren lysis-buffermengsel kan zijn voorkeur, en het is aanzienlijk beter bij het isoleren van eiwitten uit alle cellulaire compartimenten28, zal de meeste eiwitinteractie distantiëren, zal remmen proteasen die veranderen van PTM Staten, zoals deSUMOylases 26; echter de denaturering van buffers kan de integriteit van specifieke affiniteit reagentia zoals ubiquitin bindend domein gebaseerde tools27compromis. Ontwikkeling van een systeem van de lysis van de denaturering-achtige om te bestuderen van meerdere PTMs van een proteïne in een affiniteit reagens-compatibel systeem zou zeer nuttig zijn voor PTM Overspraak onderzoeken.
Hoewel denatureren buffers belangrijke voordelen ten opzichte van niet-denaturering buffers hebben voor het onderzoek naar PTMs, ze kunnen minder vaak gebruikte vanwege hun aanzienlijke nadelen, zoals incompatibiliteit met conventionele eiwit testen, aanzienlijke genomic deoxyribonucleic acid (DNA) verontreiniging en verstoring van immunoprecipitation (IP) reagentia29. Deze nadelen kunnen leiden tot langere voorbereidingstijd en mogelijke schade aan target eiwitten wanneer scheren genomic DNA. Twee veelgebruikte methoden wilt schuintrekken DNA omvatten spuit lysis en ultrasoonapparaat29. Beide methoden vereisen uitgebreide optimalisatie en ontbreekt het vaak aan precieze reproduceerbaarheid. Alternatieve methoden voor het verwijderen van genomic DNA omvatten de toevoeging van DNAses; echter hiervoor kunnen aanvullende optimalisatie en wijzigingen in de samenstelling van de buffer. Uiteindelijk, een eenvoudige en reproduceerbare methode om te verwijderen van genomic DNA besmetting zou zinvol zijn bij het werken met de denaturering van lysis buffers voor PTM onderzoeken.
Het doel van deze techniek is het ontwikkelen van een systeem om te isoleren en onderzoeken ubiquitination (Ub), tyrosine fosforylering (pY), SUMOylation 2/3 (SUMO 2/3) en acetylation (Ac) PTMs in één systeem beter onderzoeken PTM Overspraak voor een doel-eiwit. Dit detectiesysteem PTM werd gebruikt om te onderzoeken snel het endogene PTM-Profiel van verschillende doel eiwitten in een enkel systeem. Nieuw inzicht in de potentiële Overspraak was geïdentificeerde30,31. Over het geheel genomen de hier beschreven techniek verbetert op bestaande methoden te onderzoeken PTMs en PTM Overspraak op drie verschillende manieren: 1) een unieke denatureren buffer werd ontwikkeld dat isoleert van eiwitten uit alle cellulaire compartimenten, terwijl nog steeds compatibel met PTM affiniteit reagentia, 2) een uniek filtersysteem werd ontwikkeld dat snel genomic DNA besmetting verwijderd gedenatureerde lysates met hoge reproduceerbaarheid en vereist geen gespecialiseerde apparatuur, en 3) de robuuste affiniteit kralen, lysis systeem, en remmende reagentia stroken; Dus, het vereenvoudigen van het isolement van deze vier PTMs voor een doel-eiwit om te maximaliseren PTM verrijking, en potentiële Overspraak efficiënt te onderzoeken.
Protocol
1. de monstervoorbereiding: De cultuur van de cel
- Vier 150 mm platen van A431 cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum groeien.
- De A431 cellen groeien tot 50% confluentie.
- Serum beperken de vier platen van A431 cellen met serumvrij DMEM gedurende 24 uur.
- Behandelen twee platen van A431 cellen met 33,3 mg/mL epidermale groeifactor voor 1 h. laten de andere twee platen onbehandeld.
Opmerking: Cel groei en behandeling voorwaarden hieronder geven een voorbeeld; Deze methode is echter toepassing op veel verschillende soorten cellen en behandeling voorwaarden.
- Voorbereiden blastR lysis en verdunning buffers met remmers (tabel 1). Combineer 2.895 mL lysisbuffermengsel blastR met 15 µL van tyrosine fosfatase-remmer, 30 µL van deubiquitinase en deSUMOylase-remmer, 30 µL van histone deacetylase (HDAC) remmer en 30 µL van proteaseinhibitor cocktail.
- Combineer 9.65 mL van blastR verdunning buffer met 50 µL van tyrosine fosfatase-remmer, 100 µL van deubiquitinase en deSUMOylase-remmer, 100 µL van histone deacetylase (HDAC) remmer en 100 µL van de proteaseinhibitor cocktail.
Opmerking: Zie Tabel van materialen voor informatie over de samenstelling en Inhibitor van de omwenteling van de buffer.
- Combineer 9.65 mL van blastR verdunning buffer met 50 µL van tyrosine fosfatase-remmer, 100 µL van deubiquitinase en deSUMOylase-remmer, 100 µL van histone deacetylase (HDAC) remmer en 100 µL van de proteaseinhibitor cocktail.
- Giet af de voedingsbodems en plaats de cellen op het ijs. Vervolgens wassen de cellen tweemaal met 10 mL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Verwijder zo veel PBS mogelijk voorafgaand aan toe te voegen blastR lysis-buffermengsel maximaliseren van lysis van de cel.
Opmerking: Zie Tabel van materialen voor de samenstelling van de buffer.
- Verwijder zo veel PBS mogelijk voorafgaand aan toe te voegen blastR lysis-buffermengsel maximaliseren van lysis van de cel.
- Voeg 600 µL van blastR lysis buffer voor elke 150 mm plaat. Het bedrag van de buffer is gebaseerd op verwachte eiwit opbrengst (tabel 2).
- Lyse de cellen met behulp van een cel schraper. De lysate zal worden als gevolg van lysis van de nucleaire viskeuze.
- Gebruik een fijngesneden 1 mL pipet tip de ruwe lysate overbrengen naar een blastR-filter dat is geplaatst in een collectie-tube van 15 mL (Figuur 1). Hier, wordt een tube van 15 mL falcon gebruikt.
- Gebruik een meegeleverde filter plunjer volledig comprimeren het filter blastR en verzamelen de lysate doorstroom, met inbegrip van alle bubbels, in een tube van 15 mL (Figuur 1).
- Optioneel: Overdracht verduidelijkt lysate een tube van 1,5 mL microcentrifuge en een centrifuge de lysate op ongeveer 10.000 x g voor 1 min bij 4 ° C.
- Het supernatant overbrengen in een nieuwe falcon-tube van 15 mL.
- Verdun de geklaarde lysate met blastR verdunning buffer tot een eindvolume van 3 mL voor elke 150 mm plaat. Het eindvolume is gebaseerd op verwachte eiwit opbrengst (tabel 2).
Opmerking: Deze stap is belangrijk aangezien de buffer van de definitieve samenstelling gevolgen voor de IP-reactie striktheid hebben zal. - Kwantificeren eiwitconcentratie (sectie 2).
2. eiwitten Quantitation Assay
Opmerking: Gebruik een standaard colorimetrische eiwit kwantificatie test om te bepalen eiwit kwantificatie. Hier, is kwantificatie van eiwit bepaald met behulp van precisie rode geavanceerde eiwit bepaling.
- 1 mL van precisie rode geavanceerde assay eiwitreagens aan elk van de twee 1 mL cuvettes toevoegen.
- Mix 10 µL van blastR lysis-buffermengsel en 40 µL van blastR verdunning buffer in een schone 1,5 mL microcentrifuge buis op ijs.
Opmerking: Dit zal worden gebruikt voor het lezen van de lege eiwitSteekproef. - 20 µL van het mengsel van de buffer lysis/verdunning (uit stap 2.2) aan de eerste cuvette en mix toevoegen door twee tot drie keer omkeren.
- Voeg 20 µL van de verdunde cel lysate (van experiment) naar de tweede cuvette, mengen zoals hierboven.
- Monsters voor 1 minuut bij kamertemperatuur incuberen.
- Lege spectrofotometer met de lysis/verdunning buffer mix monster (uit stap 2.3).
- Meet de extinctie van de lysate monster (uit stap 2.4) op 600 nm.
- Bepaal de lysate eiwitconcentratie als volgt;
monster lezen OD600 x 5 = eiwitconcentratie in mg/mL
Opmerking: OD lezingen onder de 0,05 of boven 0,5 liggen dicht bij de capaciteit van de lineaire bereik van de bepaling van eiwit. Voor lezingen > 0,5, monsters kunnen worden verdund. Voor lezingen < 0,05, meer lysate kunnen worden toegevoegd aan de precisie rode geavanceerde assay eiwitreagens (maximaal 50 µL). Zie tabel 3 voor multiplicatoren spectrofotometer lezingen omzetten in mg/mL lysate eiwitconcentratie. Als er onvoldoende eiwit in één plaat, is het aanbevolen om het gebruik van 2 of meer platen per IP. In dit geval zal de platen in de serie, het overbrengen van de oorspronkelijke 300 µL van lysis buffer tussen platen worden geoogst. - Op basis van eiwitconcentratie, Verdun monster met een mix van de buffer (1 deel lysis van de blastR: 4 delen blastR verdunning) naar een gewenste eindconcentratie (meestal 1 mg/mL).
- Module bevriezen aliquots van monsters die niet onmiddellijk zal worden gebruikt.
- Winkel monsters op 70 ° C.
- Gaat u verder met sectie 3.
3. Immunoprecipitation (IP) Assay
Opmerking: Affiniteit kraal concentraties, lysate concentraties en incubatie tijden worden aanbevolen richtsnoeren en uniek voor elke doelgroep eiwitten en specifieke PTM onderzocht kunnen worden.
- Omkeren voorraad reagens buizen met Ub affiniteit kralen, pY affiniteit kralen, SUMO 2/3 affiniteit kralen en Ac affiniteit kralen meerdere malen om ervoor te zorgen dat de kralen zijn volledig geresuspendeerde in de buis.
- Voor elk IP-assay, aliquoot kraal schorsing in aparte 1,5 mL microcentrifuge buizen op ijs (IP-buis). Hier, 20 µL van ubiquitin affiniteit kralen, 30 µL van phosphotyrosine affiniteit kralen, 40 µL van SUMOylation 2/3 affiniteit kralen of 50 µL van acetylation affiniteit kralen toevoegen aan afzonderlijke 1,5 mL microcentrifuge buizen op ijs.
Opmerking: Zie tabel 4 voor de aanbevolen hoeveelheid kraal schorsing te gebruiken voor elke kraal affiniteit. - Omkeren voorraad reagens buizen met ubiquitination IP-controle kralen en kralen van IgG controle meerdere malen om ervoor te zorgen dat de kralen zijn volledig geresuspendeerde in de buis.
- Aliquot controle kralen per besturingselement reactie om niet-specifieke binding (controle IP-buis). Hier, 20 µL van Ub controle kralen, 30 µL van pY controle kralen, 40 µL van SUMO 2/3 controle kralen of 50 µL van Ac control kralen toevoegen aan afzonderlijke 1,5 mL microcentrifuge buizen op ijs.
Opmerking: Zie tabel 4 voor de aanbevolen hoeveelheid kraal schorsing te gebruiken voor elk soort affiniteit kraal. - Een kleine hoeveelheid lysate (20 µL) uit te voeren aan een westelijke vlek lysate controle-invoer opslaan. Voeg 5 µL van 5 x monster buffer en kook bij 95 ° C gedurende 5 min.
Opmerking: Zie Tabel van materialen voor de samenstelling van de buffer. - Voeg toe lysate naar elk IP-buis en controle IP-buis. 1 mg lysate werd hier gebruikt per IP en controle reactie, resulterend in een totaal van 8 IP-reacties.
Opmerking: 1,0 mg lysate per assay wordt aanbevolen als uitgangspunt. De hoeveelheid lysate vereist zal variëren afhankelijk van de overvloed van gemodificeerde doel eiwit. - Incubeer de buizen op een roterend platform van eind over bij 4 ° C gedurende 2 uur. Hier werd een ATR buis rotator gebruikt bij snelheid 22.
- Kralen verzamelen door centrifugeren bij 3000-5000 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C.
- Gecombineerd uit zoveel supernatant mogelijk zonder verstoring van de kralen.
- Wassen kralen in 1 mL blastR was Buffer (remmers zijn niet nodig in dit stadium) gedurende 5 minuten op een 4 ° C roteren van platform.
- Kralen verzamelen door centrifugeren bij 3000-5000 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C.
- Gecombineerd uit zoveel supernatant mogelijk zonder verstoring van de kralen.
- Herhaal de stap wassen (stappen 3.10-3.12) twee keer.
- Na de definitieve wash, volledig verwijderen buffer supernatant. Minimale verstoring van de kraal pellet is aanvaardbaar (tot een verlies van 5%). Residuele bovendrijvende vloeistof verwijderen met behulp van een boete droeg eiwit laden tip.
- Voeg 30 µL van kraal elutie buffer en resuspendeer de kralen door zachtjes te tikken/flicking de kant van de buis. Gebruik een pipet niet in dit stadium.
Opmerking: Zie Tabel van materialen voor de samenstelling van de buffer. - Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Spoel zachtjes elke kraal-suspensie op een 1,5 mL microcentrifuge spin kolom die in een tube van 1,5 mL microcentrifuge is geplaatst.
Opmerking: Het is aanbevolen om het einde off van de overdracht Pipetteer tip voor zachtere overdracht snip. - Centrifugeer bij 9000-10.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur aan de IP-monster verzameld.
- 2 µL van 2-mercaptoethanol toevoegen aan elk monster en meng goed.
Opmerking: Het is handig om snap het deksel uit de kolom van de spin en gebruik dit om de dop van de tube collectie voor verdere verwerking. - Leg monsters in een bad van water van 95 ° C voor 5 min. verzamelen monster door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 1 minuut op RT.
- Indien nodig, monsters bij-70 ° C worden opgeslagen en stoppen hier, of gaan met SDS-pagina, overdracht en westelijke vlekkenanalyse (afdeling 4).
4. westelijke vlekkenanalyse: Identificatie van de proteïne van belang
- Afzonderlijke monsters door natrium dodecyl sulfaat van polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en transfer naar een Polyvinylideenfluoride (PVDF) fluoride membraan, volgens standaard laboratorium protocollen32.
- Het gebruiken van een primair antilichaam voor het detecteren van de post-translationally gewijzigde versies van de proteïne van belang. Hier, werd PD-L1 antilichaam gebruikt voor het detecteren van post-translationally gemodificeerde PD-L1.
- Ultrasensitive Chemoluminescentie detectie reagens wordt gebruikt voor detectie.
Opmerking: De chemiluminiscent reagens gebruikt moet worden gebruikt in combinatie met een HRP-gelabeld secundair antilichaam die kunnen detecteren of het primaire antilichaam. - Een volume van 2 mL chemiluminescent reagens wordt gebruikt per mini-gel en middelgrote overdracht membraan (ongeveer 8 x 7 cm) gebruiken.
- Na incubatie met passende secundair antilichaam (60 min op RT wordt aanbevolen), de vlek 6 x 10 min wassen in 30 mL tris-gebufferde zoutoplossing-tween-20 (TBST).
Opmerking: Zie Tabel van materialen voor de samenstelling van de buffer. - Onmiddellijk vóór gebruik, meng 1 mL chemiluminescent reagens A met 1 mL chemiluminescent reagens B (voldoende voor een 8 x 7 cm membraan).
- Voeg chemiluminescent reagens wordt gebruikt aan membraan en incubeer met zachte rockende op RT voor 1-5 min vóór visualisatie van eiwit signaal met x-ray film of charge - coupled apparaat (CCD) camera imaging.
Opmerking: Kortere incubatietijd tijden in het chemiluminescent reagens kunnen nodig zijn voor zeer overvloedig eiwitten zijn.
- Na incubatie met passende secundair antilichaam (60 min op RT wordt aanbevolen), de vlek 6 x 10 min wassen in 30 mL tris-gebufferde zoutoplossing-tween-20 (TBST).
Representative Results
Het vermogen van deze hulpprogramma's te onderzoeken van PTM Overspraak door effectief opsporen van deze 4 PTMs is deels afhankelijk van de unieke lysis buffersysteem. De blastR denatureren buffer isoleert effectief eiwitten uit alle cellulaire compartimenten ook aan andere denatureren buffers, die zorgt voor een compleet eiwit Profiel (figuur 2A). Daarnaast behoudt het zeer labiele PTM signalen zoals SUMO 2/3, die is snel verminderd in niet-denaturering buffers zoals radioimmunoprecipitation assay (RIPA) (figuur 2B). Nog belangrijker is, wanneer op de juiste manier verdund, heeft het geen invloed op de integriteit van de affiniteit reagentia zoals andere denatureren buffers (b.v., Laemmli buffer).
Een belangrijke hindernis bij het werken met denatureren buffers is de mogelijkheid om effectief verwijderen van genomic DNA besmetting. De conventionele methode voor het verminderen van de viscositeit is wilt schuintrekken van het DNA met behulp van een naald van de spuit of sonicating van het monster. Figuur 3A toont genomic DNA besmetting in A431 cel lysate na behandeling met BlastR filter, naald van de spuit of ultrasoonapparaat. Er is bijna volledige verwijdering van genomic DNA met behulp van de filter van de BlastR, die niet het geval is met behulp van een conventionele spuit-naald of ultrasoonapparaat. Genomic DNA besmetting heeft grote invloed op eiwit migratie door middel van een SDS-acrylamide gel; behandeling met het BlastR-filter verwijdert echter genomic DNA, resulterend in goede eiwit migratie (figuur 3B). Gewijzigde migratie veroorzaakt door genomic DNA besmetting kan aanzienlijk beïnvloeden interpretatie western blots; bijvoorbeeld kan het vlekkerig EGFR patroon gezien in de ongefilterde lysate worden onnauwkeurig geïnterpreteerd als uitdrukking van de toegenomen ten opzichte van het gefilterde monster (Figuur 3 c).
Door gebruik te maken van deze geoptimaliseerde PTM verrijkings- en detectie systeem, kan men snel bepalen als een doel-eiwit wordt gewijzigd door een of meer PTMs. onderzoek van de PD-L1 PTM profiel werd onlangs uitgevoerd met behulp van deze techniek, en de resultaten bleek dat PD-L1 ubiquitinated, geacetyleerd, en tyrosine phosphorylated in reactie op EGF (Figuur 4). Nog belangrijker is, deze gegevens gerapporteerd endogene PD-L1 PTM veranderingen, die vertegenwoordigd een klein percentage van de totale PD-L1 geïdentificeerd.
Figuur 1: genomic DNA van de cel lysate filteren met BlastR filter. (A) afbeelding van BlastR filter. (B) Lysate is geladen in het filter dat werd geplaatst in een tube van 15 mL collectie. (C) de plunjer wordt geplaatst in de spuit en lysate is doorgegeven door het filter van compressie. (D) verzamelen lysate, met inbegrip van alle bubbels door volledige compressie. (E) gefilterd lysate.
Afbeelding 2: vergelijking van BlastR lysis-buffermengsel naar alternatieve lysis buffers. Figuur 2A aangepast van Horita et al. 2017. de de Biosci. Rep. 31 (A) A431 cellen werden lysed met RIPA, mPER, BlastR, IP-lysis, denaturering (1% SDS), en Laemmli lysis buffers. Alle denatureren lysates had genomic DNA verwijderd met behulp van BlastR filter. Isolatie van proteïnen van de membraan, cytoplasmatische, mitochondriaal, en nucleaire markeringen werden bepaald met behulp van antilichamen tegen de respectieve compartiment marker proteïnen. (B) de A431 cellen werden met BlastR, RIPA en 1% SDS denatureren buffer lysed. Lysates waren immunoprecipitated met SUMO 2/3 of besturingselement IgG affiniteit kralen. Monsters werden gescheiden door SDS-PAGE en geanalyseerd door westelijke vlek met behulp van een SUMO 2/3-horseradish peroxidase (HRP) antilichaam. Vertegenwoordiger vlekken van N≥3 onafhankelijke experimenten worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: BlastR lysis filter is effectief in het verwijderen van genomic DNA. (A) A431 cellen werden lysed met een denatureren lysis-buffermengsel. Genomic DNA werd verwijderd of schuingetrokken met BlastR filter, naald van de spuit of ultrasoonapparaat 5, 10, 20 of 30 seconden. 2% van de lysate werd geanalyseerd door ethidiumbromide, agarose gelelektroforese. (B) Lysate uit A431 cellen lysed met een denatureren buffer was ofwel ongefilterd of hierop wilt filteren met de filter van de BlastR. Monsters werden gescheiden met SDS-pagina en gevisualiseerd met behulp van Coomassie vlek. (C) duplicaat monsters uit B werden gescheiden door SDS-PAGE, overgedragen aan PVDF, en EGFR eiwit werd onderzocht met behulp van een antilichaam EGFR. Representatieve blots uit N ≥3 onafhankelijke experimenten worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: detectie voor het EGF-geïnduceerde posttranslationele modificaties voor PD-L1. Figuur overgenomen van Horita et al. 2017. neoplasia30(A). Serum-beperkte A431 cellen werden beide ongestimuleerde (UT) of gestimuleerd met EGF gedurende één uur voorafgaand aan cellysis met BlastR lysis-buffermengsel. WVA werd geanalyseerd voor PD-L1 niveaus (rijstroken 1,2). Ubiquitin bindende kralen (UBA01) werden gebruikt om IP-ubiquitinated eiwitten (rijstroken 3,4). Phosphotyrosine bindende kralen (APY03) werden gebruikt om IP-tyrosine-phosphorylated eiwitten (rijstroken 5,6). SUMO 2/3 bindende kralen (ASM24) werden gebruikt om IP-SUMOylated 2/3 eiwitten (rijstroken 7,8). Acetyl lysine bindende kralen (AAC01) werden gebruikt om IP-geacetyleerd eiwitten (rijstroken 9,10). IgG bindende controle kralen werden gebruikt om IP-aspecifieke bindende proteïnen (rijstroken 11,12). Monsters werden gescheiden door SDS-PAGE en geanalyseerd door westelijke vlek met behulp van een antilichaam PD-L1. Een representatieve vlek uit N ≥3 onafhankelijke experimenten wordt weergegeven. Witte sterretjes werden gebruikt voor het markeren van PD-L1 pY en Ac eiwit bands. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Berekeningen voor BlastR lysis-buffermengsel | ||||
| 1,0 mL | 2,0 mL | 5,0 mL | 10,0 mL | |
| BlastR Lysis buffer | 965 ΜL | 1930 ΜL | 4.825 mL | 9.650 mL |
| Tyrosine fosfatase Inhibitor | 5 ΜL | 10 ΜL | 25 ΜL | 50 ΜL |
| de-ubiquitinase/de-sumoylase-remmer | 10 ΜL | 20 ΜL | 50 ΜL | 100 ΜL |
| HDAC-inhibitor | 10 ΜL | 20 ΜL | 50 ΜL | 100 ΜL |
| Proteaseinhibitor cocktail | 10 ΜL | 20 ΜL | 50 ΜL | 100 ΜL |
| Berekeningen voor BlastR verdunning buffer | ||||
| 4,0 mL | 8.0 mL | 20,0 mL | 40.0 mL | |
| BlastR Lysis buffer | 3.86 mL | 7.72 mL | 19.3 mL | 38.6 mL |
| Tyrosine fosfatase Inhibitor | 20 ΜL | 40 ΜL | 100 ΜL | 200 ΜL |
| de-ubiquitinase/de-sumoylase-remmer | 40 ΜL | 80 ΜL | 200 ΜL | 400 ΜL |
| HDAC-inhibitor | 40 ΜL | 80 ΜL | 200 ΜL | 400 ΜL |
| Proteaseinhibitor cocktail | 40 ΜL | 80 ΜL | 200 ΜL | 400 ΜL |
Tabel 1: Lysis en verdunning Buffer voorbereiding grafiek. Grafiek verstrekken van concentraties van remmers toe te voegen voor een bepaalde lysis en verdunning buffervolume bij de voorbereiding van buffers voor lysis van de cel.
| Gehalte aan andere melkeiwitten plaat | De aanbevolen BlastR Lysis-buffermengsel volume | Aanbevolen BlastR verdunning buffervolume |
| < 1 mg | Combineren van eiwit uit meerdere platen | Te maken van 1,5 mL eindvolume |
| 1-2 mg | 300 ΜL | Te maken van 1,5 mL eindvolume |
| 2-4 mg | 600 ΜL | 3 mL eindvolume maken |
| 4-6 mg | 900 ΜL | Om het eindvolume 4.5 mL |
Tabel 2: BlastR Lysis/verdunning Buffer grafiek. Verstrekken van grafiek aanbevolen lysis en verdunning buffer volumes bij het verkrijgen van lysate.
| Volume van cel lysate toegevoegd aan 1 ml reagens Precision Red eiwit Assay (µL) | Multiplier te gebruiken met monster lezen OD600 |
| 10 | 10 |
| 20 | 5 |
| 30 | 3.3 |
| 40 | 2.5 |
| 50 | 2 |
Tabel 3: Multiplicatoren spectrofotometer lezingen omzetten in mg/mL Lysate. Grafiek conversie getallen te verlenen aan aide met berekening van de eiwitconcentratie.
| affiniteit kralen | volume van de kraal drijfmest/IP (mL) |
| Ubiquitination | 20 |
| Phosphotyrosine | 30 |
| SUMOylation 2/3 | 40 |
| Acetylation | 50 |
| controle kralen | volume van de kraal drijfmest/IP (mL) |
| Ubiquitination controle kralen | 20 |
| Phosphotyrsoine controle kralen | 30 |
| SUMOylation 2/3 controle kralen | 40 |
| Acetylation controle kralen | 50 |
Tabel 4: Aanbevolen Volume van kralen/IP grafiek. Verstrekken van grafiek aanbevolen hoeveelheden van affiniteit parels te gebruiken per IP-reactie.
Discussion
Eerste benaderingen gebruikt om te bepalen of een doel-proteïne is gewijzigd door een PTM kunnen worden uitgevoerd met behulp van het doel eiwit specifieke antilichaam voor IP, gevolgd door westelijke vlek met een antilichaam PTM (bv., anti-acetyl lysine), of met behulp van een antilichaam PTM voor IP, gevolgd door westelijke vlek met de doelgroep eiwit specifiek antilichaam30,31,33. Hoewel beide benaderingen theoretisch werken, heeft gebruik makend van een doel-eiwit-specifieke antilichaam meer potentiële valkuilen, zoals het antilichaam niet IP compatibel worden kan of grote PTM wijzigingen de antilichaam erkenning site op het doel eiwit34 blokkeren kunnen ,35. Het voordeel van de PTM affiniteit kralen is dat het antilichaam of bindende domeinen specifiek de PTM van belang herkennen; Dus, aangebrachte wijzigingen in het doel-eiwit moeten niet meer wijzigen erkenning door de affiniteit kralen. Als voorbeeld, PD-L1 Ub werd geïdentificeerd met de hier beschreven techniek, en zowel endogene mono - en poly-Ub werd waargenomen (Figuur 4). Een recente publicatie door Lim et al. in vitro Ub technieken om te onderzoeken PD-L1 Ub gebruikt, en het resultaat was erg vergelijkbaar met de resultaten die worden weergegeven in Figuur 436. Interessant, traden ze ook IP met een antilichaam PD-L1 te verrijken PD-L1 uit cel lysate, waar Ub was overexpressie en MG-132 is toegevoegd aan het verbeteren van het signaal. De Ub-patroon was niet robuust en zeer verschillend zijn van het in vitro Ub patroon. Onderzoek van endogene PD-L1 Ub in cel cultuur modellen werd niet in de Lim et al.uitgevoerd. verslag aan het verschil tussen hun cultuur en in vitro celgegevens verduidelijken.
Onderzoeken of een eiwit is gewijzigd door een PTM kan lastig zijn, vanwege de lage overvloed en38van de37,van voorbijgaande aard, en vaak vereist verrijking via IP. Effectieve IP van PTMs vereist optimalisatie van verschillende belangrijke stappen en reagentia, zoals lysis buffers en affiniteit reagentia. Bij het onderzoeken van meerdere PTMs van een doel-eiwit, verhoogt de vereiste optimalisatie waarschijnlijk. Met behulp van het systeem van de lysis van de blastR is een cruciale stap in dit protocol, zoals het onderhoudt robuuste IP-vermogen, terwijl het toelaten van PTM detectie van de pY, SUMO 2/3, Ub en Ac PTMs in één systeem. Deze techniek wordt geoptimaliseerd voor de tijd en middelen vereist om te bepalen of een specifiek streefcijfer proteïne is gewijzigd door deze vier PTMs en potentieel geeft een beter beeld van PTM Overspraak ten opzichte van het vergelijken van PTM resultaten uitgevoerd met behulp van meerdere lysis van de systemen. Onderzoek van het blastR systeem van de lysis van de compatibiliteit met alternatieve PTMs, zoals glycosylatie, werd uitgevoerd; echter, het is niet onderzocht uitputtend voor alle soorten PTMs.
Overvloedige genomic DNA kan interfereren met eiwit metingen met behulp van hetzij colorimetrische of nanodrop methoden, invloed op de migratie van eiwitten in een SDS acrylamide gel en voorkomen van eiwitten en affiniteit matrix interactie tijdens IP-testen. De hier beschreven methode maakt gebruik van een speciale filter om effectief verwijderen van genomic DNA besmetting, dat een andere kritische stap van dit protocol is. Nadruk wordt gelegd op dit punt, viscositeit tests werden uitgevoerd voor en na blastR filter behandeling en de resultaten toonden een vermindering van een hoge viscositeit tot de viscositeit van water (gegevens niet worden weergegeven). Deze verandering in de viscositeit werd gesteund door de resultaten in Figuur 3, waaruit blijkt dat bijna alle van de genomic DNA had verwijderd. Nog belangrijker is, is DNA niet geschoren met deze methode, zoals elke sheared DNA zal niet worden onderschept door het filter (gegevens niet worden weergegeven). Dit hulpprogramma is superieur aan conventionele methoden, zoals ultrasoonapparaat of spuit-DNA-scheren, omdat het vereist geen gespecialiseerde apparatuur, zeer reproduceerbaar, en verwijdert het DNA in plaats van het scheren. Bovendien, het zal niet degraderen eiwit in de lysate, die zich kan voordoen met behulp van conventionele methoden29. Met behulp van het filter duurt 5-30 seconden per monster vergeleken met alternatieve methoden waar effectieve verdeling van DNA kan enige tijd duren (d.w.z., spuit schuintrekken) en kan leiden tot voorbeeld heterogeniteit zoals DNA verontreinigingen in de lysate blijven. Uitgebreide analyse van het filteren van de lysate pre- en post-blastR werd uitgevoerd, en geen waarneembaar verschil in het profiel van eiwit werd waargenomen door Coomassie, doelgroepen gerichte westerse, of totale en doelgroepen gerichte PTM analyses; Dus, de integriteit van het eiwit-profiel kan niet zijn getroffen door de genomic DNA worden uitgefilterd. Uiteindelijk, dit filtersysteem is heilzaam voor een westerse of IP-applicatie waar genomic DNA is aanwezig en kan van invloed zijn op de interpretatie van de eiwit-analyse.
Het is belangrijk op te merken dat er is potentieel voor valse negatieve detectie met behulp van deze techniek, die wijten zijn gedeeltelijk aan affiniteit kraal verzadiging, bindende site interferentie of PTM maskeren te kan. Bijvoorbeeld, kan een bepaald doel-eiwit worden gewijzigd door Ac op een zeer laag niveau; het kan dus niet worden geïsoleerd door pan-acetyl lysine affiniteit kralen die hebben al verzadigd door meer overvloedig doel Ac gemodificeerde eiwitten. Lopende studies worden uitgevoerd voor de beoordeling van de detectiegrenzen van de affiniteit reagentia die in dit protocol wordt gebruikt, maar een recente publicatie suggereert dan ook een zeer robuuste detectiegrens. De gegevens bleek dat deze techniek kon identificeren slechts 17 geacetyleerd doel eiwitmolecules per cel31. Nog steeds, specifieke omstandigheden zoals cell type specificiteit, voorbijgaande PTMs in antwoord op specifieke stimuli, of maskeren van PTMs als gevolg van eiwit interactie kan alle leiden tot vals-negatieve resultaten. Dit zijn de mogelijke valkuilen van deze techniek, evenals de meeste PTM IP methoden. Het is dus aangeraden resultaten met behulp van meerdere benaderingen te bevestigen.
Wijzigingen zoals glycosylatie en fosforylering is gebleken om te concurreren voor soortgelijke aminozuren39,40, en andere PTMs zoals ubiquitination en fosforylering is aangetoond dat ze werken achter elkaar om te regelen van een eiwit functie17,41. Recent werk op de neuropathologische eiwit Tau gewezen op het belang van PTM Overspraak, waar-hyper Tau fosforylatie en Tau SUMOylation elkaar42 versterkt. Bovendien, deze groep toonde dat SUMOylation van Tau voorkomen poly-Ub en latere Tau aantasting, eventueel leiden tot samenvoeging. Dit is enkel één van vele voorbeelden van regelgevende PTM overspraak en het nut van deze techniek voor het verlichten van het belang van PTMs en hun Overspraak bij het reguleren van de belangrijke eiwitten in gezondheid en ziekte zal helpen.
Disclosures
H.H. en A.L. zijn werknemers van cytoskelet Inc. K.M. is een van de oprichters van cytoskelet Inc.
Acknowledgments
We bedanken cytoskelet Inc. onderzoekswetenschappers en Drs. Brian Hoover en Ashley Davis voor hun kritische recensie, bewerken en vruchtbare discussies over het manuscript. Bovendien, danken wij Dr. Robert Hom voor zijn bijdrage tijdens de productie van de video manuscript. Dit werk werd gesteund door financiële middelen van het cytoskelet Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis/genomic DNA removal and analysis | |||
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | common buffer | Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 | |
| BlastR lysis buffer | Cytoskeleton Inc. | BLST01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) | common buffer | Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal | |
| Mammalian protein extraction reagent (mPER) | Thermofisher | 78503 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Immunoprecipitation (IP) Lysis | Pierce | 87787 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer | common buffer | Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA | |
| Laemmli | common buffer | Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue | |
| BlastR dilution buffer | Cytoskeleton Inc. | BDB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cytoskeleton Inc. | PIC02 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) | Cytoskeleton Inc. | NEM09BB | |
| Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide | Cytoskeleton Inc. | TSA01 | |
| Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Cytoskeleton Inc. | PYI01 | |
| cell scrapers | Costar | 3008 | |
| BlastR Filter | Cytoskeleton Inc. | BLR02 | |
| BD Insulin syringe needle | BD | 08290-3284-11 | |
| sonicator (Branson Sonifier) | Branson | Sonifier 450 | |
| Precision Red Advanced Protein Reagent | Cytoskeleton Inc. | ADV02 | |
| 1 mL cuvettes | Fisher | 14955127 | |
| Spectrophotometer (Genesys20) | Thermofisher | 4001 | Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration |
| Agarose | Fisher | BP1356-500 | |
| 1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder | NEB | N3232L | |
| DNA gel box | Thermofisher | 7312 B1A | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | common buffer | Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA | |
| PTM Immunoprecipitation | |||
| Phosphotyrosine beads | Cytoskeleton Inc. | APY03-beads | |
| Ubiquitination beads | Cytoskeleton Inc. | UBA01-beads | |
| SUMOylation 2/3 beads | Cytoskeleton Inc. | ASM24-beads | |
| Acetylation beads | Cytoskeleton Inc. | AAC04-beads | |
| Phosphotyrosine control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
| Ubiquitination control beads | Cytoskeleton Inc. | CUB02-beads | |
| SUMOylation 2/3 control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
| Acetylation control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG02-beads | |
| BlastR wash buffer | Cytoskeleton Inc. | BWB02 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Bead elution buffer | Cytoskeleton Inc. | BEB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| microcentrifuge | Eppendorf | 5417 | Other microcentrifuges can be used |
| tube rotator | ATR | RKVSD | Other end-over-end tube rotators can be used |
| protein loading tips | VWR | 37001-150 | |
| spin columns | Cytoskeleton Inc. | SPN22 | |
| heat block 95 °C | Benchmark | BSH1002 | |
| SDS-PAGE/Transfer/Western analysis | |||
| 5x sample buffer | common buffer | recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl | |
| novex wedge well 4-20% Tris-gly gels | Invitrogen | XP04200BOX | The large wedgewells are excellent for loading large volumes |
| 1x Running buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS | |
| seeblue protein ladder | Life Technologies | LC5625 | |
| electrophoresis cell | Invitrogen | Xcell surelock electrophoresis cell | Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels |
| power supply | Biorad | PowerPac HC | Other power supplies can be used |
| 1x Transfer buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl, glycine, methanol | |
| Transfer cell | Biorad | mini trans-blot cell | Other transfer cells can be used |
| Immobilon- P membranes (PVDF) | millipore | IPVH 304F0 | |
| non-fat milk | thrive | 813503015095 | |
| Tris buffered saline with tween (TBST) | common buffer | recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20 | |
| Chemiluminescent Detection Reagent | Cytoskeleton Inc. | CLRA/CLRB | |
| Cell growth and treatment | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum | ATLAS | F-0500-A | |
| Epidermal growth factor | Cytoskeleton Inc. | CN02-A | |
| 150 mm cell culture plates | Corning | 430599 |
References
- Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
- Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Res. 26 (4), 399-422 (2016).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Hunter, T. The genesis of tyrosine phosphorylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (5), 1-15 (2014).
- International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431 (7011), 931-945 (2004).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 8 (1), 33-41 (2004).
- Pellegrino, S., Altmeyer, M. Interplay between Ubiquitin, SUMO, and Poly(ADP-Ribose) in the Cellular Response to Genotoxic Stress. Front Genet. 7 (63), 1-8 (2016).
- Liddy, K. A., White, M. Y., Cordwell, S. J. Functional decorations: post-translational modifications and heart disease delineated by targeted proteomics. Genome Med. 5 (2), 20 (2013).
- Margolin, D. H., Kousi, M., Chan, Y. M., Lim, E. T., Schmahmann, J. D., Hadjivassiliou, M., Hall, J. E., Adam, I., Dwyer, A., Plummer, L., et al. Ataxia, dementia, and hypogonadotropism caused by disordered ubiquitination. N Engl J Med. 368 (21), 1992-2003 (2013).
- Droescher, M., Chaugule, V. K., Pichler, A. SUMO rules: regulatory concepts and their implication in neurologic functions. Neuromolecular Med. 15 (4), 639-660 (2013).
- Anbalagan, M., Huderson, B., Murphy, L., Rowan, B. G. Post-translational modifications of nuclear receptors and human disease. Nucl Recept Signal. 10 (e001), 1-13 (2012).
- Kim, M. Y., Bae, J. S., Kim, T. H., Park, J. M., Ahn, Y. H. Role of transcription factor modifications in the pathogenesis of insulin resistance. Exp Diabetes Res. 2012 (716425), 1-16 (2012).
- West, A. C., Johnstone, R. W. New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment. J Clin Invest. 124 (1), 30-39 (2014).
- Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. Am J Transl Res. 3 (2), 166-179 (2011).
- Gu, B., Zhu, W. G. Surf the post-translational modification network of p53 regulation. Int J Biol Sci. 8 (5), 672-684 (2012).
- Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. J Cell Biol. 206 (4), 461-472 (2014).
- Nguyen, L. K., Kolch, W., Kholodenko, B. N. When ubiquitination meets phosphorylation: a systems biology perspective of EGFR/MAPK signalling. Cell Commun Signal. 11 (52), 1-15 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Mol Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
- Butler, P. L., Staruschenko, A., Snyder, P. M. Acetylation stimulates the epithelial sodium channel by reducing its ubiquitination and degradation. J Biol Chem. 290 (20), 12497-12503 (2015).
- Wang, Y., Wang, Y., Zhang, H., Gao, Y., Huang, C., Zhou, A., Zhou, Y., Li, Y. Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation. Mol Biol Cell. 27 (2), 410-420 (2016).
- Guo, Z., Kanjanapangka, J., Liu, N., Liu, S., Liu, C., Wu, Z., Wang, Y., Loh, T., Kowolik, C., Jamsen, J., et al. Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell-cycle progression. Mol Cell. 47 (3), 444-456 (2012).
- Cui, W., Sun, M., Zhang, S., Shen, X., Galeva, N., Williams, T. D., Staudinger, J. L. A SUMO-acetyl switch in PXR biology. Biochim Biophys Acta. 1859 (9), 1170-1182 (2016).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
- Siuti, N., Kelleher, N. L. Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry. Nat Methods. 4 (10), 817-821 (2007).
- Mischerikow, N., Heck, A. J. Targeted large-scale analysis of protein acetylation. Proteomics. 11 (4), 571-589 (2011).
- Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nat Protoc. 9 (4), 896-909 (2014).
- Emmerich, C. H., Cohen, P. Optimising methods for the preservation, capture and identification of ubiquitin chains and ubiquitylated proteins by immunoblotting. Biochem Biophys Res Commun. 466 (1), 1-14 (2015).
- Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of proteins: the importance of lysis buffer choice. Methods Mol Biol. 1312, 49-60 (2015).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods Enzymol. 463, 285-303 (2009).
- Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton. Neoplasia. 19 (4), 346-353 (2017).
- Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. A simple toolset to identify endogenous post-translational modifications for a target protein: a snapshot of the EGFR signaling pathway. Biosci Rep. 37 (4), 1-14 (2017).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Li, C. L., Sathyamurthy, A., Oldenborg, A., Tank, D., Ramanan, N. SRF phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 promotes axon growth in hippocampal neurons. J Neurosci. 34 (11), 4027-4042 (2014).
- Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
- Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
- Lim, S. O., Li, C. W., Xia, W., Cha, J. H., Chan, L. C., Wu, Y., Chang, S. S., Lin, W. C., Hsu, J. M., Hsu, Y. H., et al. Deubiquitination and Stabilization of PD-L1 by CSN5. Cancer Cell. 30 (6), 925-939 (2016).
- Wu, R., Haas, W., Dephoure, N., Huttlin, E. L., Zhai, B., Sowa, M. E., Gygi, S. P. A large-scale method to measure absolute protein phosphorylation stoichiometries. Nat Methods. 8 (8), 677-683 (2011).
- Ordureau, A., Munch, C., Harper, J. W. Quantifying ubiquitin signaling. Mol Cell. 58 (4), 660-676 (2015).
- Lefebvre, T., Ferreira, S., Dupont-Wallois, L., Bussiere, T., Dupire, M. J., Delacourte, A., Michalski, J. C., Caillet-Boudin, M. L. Evidence of a balance between phosphorylation and O-GlcNAc glycosylation of Tau proteins--a role in nuclear localization. Biochim Biophys Acta. 1619 (2), 167-176 (2003).
- Wang, X., Li, D., Wu, G., Bazer, F. W. Functional Roles of Fructose: Crosstalk between O-Linked Glycosylation and Phosphorylation of Akt-TSC2-MTOR Cell Signaling Cascade in Ovine Trophectoderm Cells. Biol Reprod. 9 (5), 1-17 (2016).
- Levkowitz, G., Waterman, H., Zamir, E., Kam, Z., Oved, S., Langdon, W. Y., Beguinot, L., Geiger, B., Yarden, Y. c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor. Genes Dev. 12 (23), 3663-3674 (1998).
- Luo, H. B., Xia, Y. Y., Shu, X. J., Liu, Z. C., Feng, Y., Liu, X. H., Yu, G., Yin, G., Xiong, Y. S., Zeng, K., et al. SUMOylation at K340 inhibits tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (46), 16586-16591 (2014).
