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Biochemistry

एक व्यापक Immunoprecipitation संवर्धन प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक अंतर्जात पद-अनुवाद लक्ष्य प्रोटीन के लिए संशोधन प्रोफ़ाइल की पहचान

Published: January 8, 2018 doi: 10.3791/56912
Automatic Translation
1, 1, 1
1R&D Department, Cytoskeleton Inc.

Summary

एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए एकाधिक, अंतर्जात पोस्ट-शोधों संशोधनों की जांच करना बेहद चुनौतीपूर्ण हो सकता है । तकनीक यहां वर्णित एक अनुकूलित lysis बफर और फ़िल्टर विशिष्ट PTM-लक्ष्यीकरण, संबध मैट्रिक्स के साथ विकसित प्रणाली का उपयोग acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, और एक लक्ष्य के लिए tyrosine फास्फारिलीकरण संशोधनों का पता लगाने के लिए प्रोटीन एक एकल, सुव्यवस्थित प्रणाली का उपयोग कर ।

Abstract

अब यह अच्छी तरह से सराहना की है कि बाद अनुवाद संशोधन (PTMs) एक प्रोटीन की संरचना और समारोह है, जो एक दिया है प्रोटीन की भूमिका दोनों शारीरिक और रोग के लिए आवश्यक हो सकता है विनियमित में एक अभिंन भूमिका निभाते हैं । PTMs के संवर्धन अक्सर आवश्यक है जब एक लक्ष्य प्रोटीन की PTM स्थिति की जांच, क्योंकि PTMs अक्सर क्षणिक और अपेक्षाकृत कम बहुतायत में हैं । कई नुकसान का सामना कर रहे है जब एक लक्ष्य प्रोटीन की एक PTM के लिए समृद्ध, ऐसे बफर असंगति के रूप में, लक्ष्य प्रोटीन एंटीबॉडी आईपी संगत नहीं है, PTM संकेत की हानि, और दूसरों । कठिनाई की डिग्री बढ़ाया है जब acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 की तरह कई PTMs की जांच, और tyrosine फास्फारिलीकरण एक दिया लक्ष्य प्रोटीन के लिए । इन PTMs का एक संयोजन का अध्ययन आवश्यक हो सकता है, के रूप में PTMs के बीच crosstalk प्रचलित है और प्रोटीन विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है । अक्सर, इन PTMs अलग lysis बफ़र्स में और अद्वितीय अवरोध करनेवाला रचनाओं के साथ अध्ययन कर रहे हैं. इस प्रक्रिया को सरल बनाने के लिए, एक अद्वितीय denaturing lysis प्रणाली विकसित की गई थी जो इन चार PTMs को प्रभावी ढंग से अलग और संरक्षित करती है; इस प्रकार, एक एकल lysis प्रणाली में संभावित crosstalk की जांच को सक्षम करने के । एक अनूठा फिल्टर प्रणाली lysate से दूषित जीनोमिक डीएनए को दूर करने के लिए इंजीनियर था, जो एक समस्याग्रस्त द्वारा-उत्पाद denaturing बफ़र्स है । मजबूत संबध मैट्रिक्स लक्ष्यीकरण चार PTMs में से प्रत्येक के लिए इन चार PTMs के अंतर्जात राज्यों के संवर्धन और पता लगाने को अधिकतम करने के लिए बफर प्रणाली के साथ संगीत कार्यक्रम में विकसित किया गया । यह व्यापक PTM डिटेक्शन toolset एक प्रोटीन एक या अधिक इन PTMs के द्वारा संशोधित किया गया है कि क्या के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्राप्त करने की प्रक्रिया को सरल ।

Introduction

बाद अनुवाद संशोधन (PTMs) अत्यधिक एक प्रोटीन के लिए परिवर्तन विनियमित रहे हैं, जिससे संशोधन जोड़ा है या एक विशिष्ट तरीके से हटा दिया । PTMs अक्सर गतिशील हैं, परिवर्तनीय परिवर्तन है कि काफी प्रोटीन की संरचना को बदलने, साथी प्रोटीन के साथ बातचीत, और स्थानिक स्थानीयकरण, और अंत में प्रोटीन को सक्षम करने के लिए विशिष्ट कार्य प्रदर्शन1,2 , 3 , 4. PTMs इतनी प्रचुर मात्रा में है कि वे लगभग ३०,००० जीन उत्पादों से अद्वितीय प्रोटीन रूपों (या proteoforms) की संख्या में वृद्धि एक लाख proteoforms5,6से अधिक है । पहचान PTMs और एक लक्ष्य प्रोटीन पर उनके प्रभाव को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है प्रोटीन शारीरिक और रोग कार्यों को समझने की7,8,9,10, 11,12,13,14. tubulin, p53, और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (EGFR) जैसे चुनिंदा प्रोटीन पर काम PTMs15,16,17की विनियामक भूमिकाओं का आविर्भाव हुआ है । इन अध्ययनों से तथ्य यह है कि इन प्रोटीन का विनियमन कई PTMs द्वारा होता है उजागर, और कई मामलों में इन संशोधनों संगीत कार्यक्रम में काम करने के लिए एक विशिष्ट समारोह को बढ़ावा देने के । नए अध्ययनों से पता चला है कि दोनों सहकारी और नकारात्मक PTM crosstalk कई अलग प्रोटीन पर हो सकता है18,19,20,21,22, 23,24,25. हालांकि, प्रोटीन के बहुमत के PTM प्रोफाइल कई अध्ययनों कि विभिंन मॉडलों और अद्वितीय शर्तों का इस्तेमाल किया है से निर्मित कर रहे हैं । एक अनुकूलित प्रणाली के बाद एक प्रणाली में कई PTMs की जांच करने के लिए अत्यधिक संभावित PTM crosstalk में एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए अंतर्दृष्टि हासिल लाभप्रद होगा ।

एक ही सिस्टम में PTMs जांच के साथ एक चुनौती है कि विशिष्ट PTMs अलग lysis बफ़र्स का उपयोग कर जांच कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, RIPA या NP-४० जो सामान्यतः फास्फारिलीकरण या ubiquitination जाँच के लिए उपयोग किए जाते हैं जैसे बफ़र्स का उपयोग छोटे PTM जैसे संशोधक (सुमो) ubiquitin26की तरह एक labile ylation का अध्ययन करने के लिए अपर्याप्त हो सकता है । साथ ही, गैर-denaturing बफ़र्स dissociating प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए अपर्याप्त हैं, और गलत धनात्मक PTM पहचान के लिए लीड कर सकते हैं27। एक denaturing lysis बफर में PTMs की जांच पसंद किया जा सकता है, के रूप में यह काफी बेहतर है सभी सेलुलर डिब्बों से प्रोटीन अलग करने में28, अलग सबसे प्रोटीन बातचीत करेंगे, और रोकना होगा कि इस तरह के रूप में बदल PTM राज्यों, deSUMOylases 26; हालांकि, denaturing बफ़र्स जैसे ubiquitin बाइंडिंग डोमेन-आधारित उपकरण27विशिष्ट समानता reagents की अक्षतता compromise हो सकता है । एक denaturing की तरह lysis प्रणाली का विकास एक समानता एजेंट में एक प्रोटीन के कई PTMs अध्ययन संगत प्रणाली PTM crosstalk जांच के लिए अत्यधिक लाभकारी होगा ।

हालांकि denaturing बफ़र्स PTMs की जांच के लिए गैर-denaturing बफ़र्स पर मुख्य लाभ है, वे कम सामांयतः उनके महत्वपूर्ण कमियां, जैसे पारंपरिक प्रोटीन परख के साथ असंगति के रूप में उपयोग किया जाता है, महत्वपूर्ण जीनोमिक deoxyribonucleic एसिड (DNA) संदूषण, और व्यवधान immunoprecipitation (IP) के लिए29। ये कमियां विस्तारित तैयारी के समय और संभावित नुकसान में परिणाम कर सकते है प्रोटीन लक्ष्य जब जीनोमिक डीएनए कतरनी । दो आमतौर पर इस्तेमाल किया कतरनी डीएनए के तरीके सिरिंज lysis और sonication29शामिल हैं । दोनों तरीकों व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता है और अक्सर सटीक reproducibility कमी । जीनोमिक डीएनए को हटाने के लिए वैकल्पिक तरीकों DNAses के अलावा शामिल हैं; हालांकि, यह अतिरिक्त ऑप्टिमाइज़ेशन और बफ़र संरचना में परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है । अंततः, एक सरल और प्रतिलिपि विधि जीनोमिक डीएनए संदूषण को दूर करने के लिए फायदेमंद होगा जब PTM जांच के लिए denaturing lysis बफ़र्स के साथ काम कर रहा है ।

इस तकनीक के लक्ष्य को अलग करने और जांच ubiquitination (यूबी), tyrosine फास्फारिलीकरण (pY), SUMOylation 2/3 (सूमो 2/3), और acetylation (Ac) PTMs एक एकल प्रणाली में एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए PTM crosstalk की बेहतर जांच करने के लिए एक प्रणाली विकसित करने के लिए है । इस PTM डिटेक्शन सिस्टम को तेजी से जांचने के लिए उपयोग किया गया था अंतर्जात PTM प्रोफाइल को एक ही सिस्टम में कई टारगेट प्रोटीन्स की । संभावित crosstalk में नई अंतर्दृष्टि30,31की पहचान की थी । कुल मिलाकर, तकनीक यहां वर्णित मौजूदा तरीकों पर सुधार के लिए तीन अलग तरीकों से PTMs और PTM crosstalk की जांच: 1) एक अद्वितीय denaturing बफर विकसित किया गया था कि सभी सेलुलर डिब्बों से प्रोटीन अलग, जबकि अभी भी साथ संगत किया जा रहा PTM संबध रिएजेंट, 2) एक अनूठा फिल्टर प्रणाली विकसित की है कि तेजी से उच्च reproducibility के साथ विकृत lysates से जीनोमिक डीएनए संदूषण निकालता है और कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, और 3) मजबूत संबंध मोती, lysis प्रणाली, और निरोधात्मक रिएजेंट संगत हैं; इस प्रकार, PTM संवर्धन को अधिकतम करने के लिए एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए इन चार PTMs के अलगाव को सरल बनाने, और कुशलता से संभावित crosstalk की जांच ।

Protocol

1. नमूना तैयारी: सेल संस्कृति

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) में A431 कोशिकाओं के ४ १५० mm प्लेट्स बढ़ाएँ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक ।
    1. A431 कोशिकाओं को विकसित करने के लिए ५०% प्रवाह ।
    2. सीरम 24 एच के लिए सीरम मुक्त DMEM के साथ A431 कोशिकाओं की चार प्लेटें प्रतिबंधित ।
    3. A431 कोशिकाओं के दो प्लेटों के साथ इलाज 1 एच के लिए ३३.३ मिलीग्राम/एमएल के एपिडर्मल वृद्धि कारक के लिए अंय दो प्लेट अनुपचारित छोड़ दें ।
      नोट: सेल विकास और उपचार की स्थिति यहां दिखाया एक उदाहरण प्रदान करते हैं; हालांकि, इस पद्धति कई अलग सेल प्रकार और उपचार की स्थिति के लिए लागू है ।
  2. अवरोधकों (तालिका 1) के साथ blastR lysis और कमजोर पड़ने वाले बफ़र्स तैयार करें. tyrosine फॉस्फेट अवरोध करनेवाला के 15 µ एल के साथ blastR lysis बफर के २.८९५ मिलीलीटर का मिश्रण, µ के 30 deubiquitinase एल और deSUMOylase अवरोध करनेवाला, µ citrullinated के 30 deacetylase एल (HDAC) अवरोध करनेवाला, और छेड़ने अवरोधक कॉकटेल के 30 µ एल.
    1. tyrosine फॉस्फेट अवरोध करनेवाला के ५० µ एल के साथ blastR कमजोर पड़ने बफर के ९.६५ मिलीलीटर का मिश्रण, µ और deubiquitinase अवरोध करनेवाला के १०० deSUMOylase एल, µ citrullinated के १०० deacetylase एल (HDAC) अवरोध करनेवाला, और छेड़ने अवरोधक कॉकटेल के १०० µ एल.
      नोट: बफर संरचना और अवरोध करनेवाला जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
  3. संस्कृति मीडिया बंद डालो और बर्फ पर कोशिकाओं जगह है । फिर, दो बार सेल 1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब) के 10 मिलीलीटर के साथ धो लो ।
    1. सेल lysis को अधिकतम करने के लिए blastR lysis बफर को जोड़ने से पहले यथासंभव अधिक से अधिक पंजाबियों को निकालें ।
      नोट: बफ़र संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
  4. प्रत्येक १५० mm प्लेट के लिए blastR lysis बफर के ६०० µ एल जोड़ें । बफ़र की मात्रा अपेक्षित प्रोटीन यील्ड (तालिका 2) पर आधारित है ।
    1. कक्ष स्क्रैपर का उपयोग करके कक्षों को लाइसे । lysate परमाणु lysis के कारण चिपचिपा हो जाएगा ।
  5. क्रूड lysate को एक blastR फिल्टर में ट्रांसफर करने के लिए एक snipped 1 एमएल पिपेट टिप का इस्तेमाल करें जिसे 15 एमएल कलेक्शन ट्यूब (figure 1) में रखा गया है । यहां, एक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब का इस्तेमाल किया जाता है ।
  6. blastR फ़िल्टर को पूरी तरह संपीड़ित करने और 15 मिलीलीटर ट्यूब (चित्र 1) में किसी भी बुलबुले सहित, lysate फ्लो-थ्रू एकत्रित करने के लिए एक प्रदान किए गए फ़िल्टर सवार का उपयोग करें.
  7. वैकल्पिक: स्थानांतरण एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्पष्ट lysate और लगभग १०,००० x g पर 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर lysate केंद्रापसारक ।
    1. एक नया 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब करने के लिए supernatant स्थानांतरण ।
  8. blastR कमजोर पड़ने बफर के साथ स्पष्ट lysate प्रत्येक १५० mm प्लेट के लिए 3 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को पतला । अंतिम मात्रा अपेक्षित प्रोटीन यील्ड (तालिका 2) पर आधारित है ।
    नोट: अंतिम बफ़र संरचना IP प्रतिक्रिया stringency को प्रभावित करेगा के रूप में यह चरण महत्वपूर्ण है ।
  9. Quantitate प्रोटीन एकाग्रता (धारा 2) ।

2. प्रोटीन Quantitation परख

नोट: एक मानक वर्णमिति प्रोटीन quantitation परख का उपयोग करने के लिए प्रोटीन quantitation निर्धारित करते हैं । यहां, प्रोटीन quantitation परिशुद्धता लाल उंनत प्रोटीन परख का उपयोग निर्धारित किया जाता है ।

  1. दो 1 मिलीलीटर cuvettes में से प्रत्येक के लिए प्रेसिजन लाल उंनत प्रोटीन परख रिएजेंट के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. blastR lysis बफर और ४० µ एल के 10 µ एल मिश्रण एक साफ १.५ एमएल blastR ट्यूब में बर्फ पर microcentrifuge कमजोर पड़ने बफर की ।
    नोट: यह खाली प्रोटीन नमूना पढ़ने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  3. lysis/कमजोर पड़ने बफर मिश्रण के 20 µ l जोड़ें (२.२ कदम से) पहले cuvette और दो से तीन बार पलटने से मिश्रण.
  4. पतला सेल lysate के 20 µ एल जोड़ें (प्रयोग से) दूसरी cuvette के लिए, ऊपर के रूप में मिश्रण ।
  5. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए गर्मी के नमूने ।
  6. lysis/कमजोर पड़ने बफर मिश्रण नमूना के साथ खाली spectrophotometer (२.३ कदम से) ।
  7. lysate नमूना के अवशोषण उपाय (२.४ कदम से) ६०० एनएम पर ।
  8. निम्नानुसार lysate प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण;
    नमूना पढ़ना आयुध डिपो६०० x 5 = मिलीग्राम/एमएल में प्रोटीन एकाग्रता
    नोट: ०.०५ या ०.५ से ऊपर के आयुध डिपो रीडिंग प्रोटीन परख के रैखिक रेंज क्षमता के करीब हैं । रीडिंग के लिए > 0.5, नमूनों पतला किया जा सकता है । रीडिंग < 0.05 के लिए, अधिक lysate को प्रेसिजन रेड एडवांस्ड प्रोटीन परख रिएजेंट (५० µ l तक) में जोड़ा जा सकता है । spectrophotometer रीडिंग को एमजी/एमएल lysate प्रोटीन एकाग्रता में परिवर्तित करने के लिए गुणकों के लिए तालिका 3 देखें । यदि एक थाली में अपर्याप्त प्रोटीन है, यह आईपी प्रति 2 या अधिक प्लेटों का उपयोग करने की सिफारिश की है । इस मामले में, प्लेटों श्रृंखला में काटा जाएगा, प्लेटों के बीच lysis बफर के मूल ३०० µ एल स्थानांतरित ।
  9. प्रोटीन एकाग्रता के आधार पर, एक बफर मिश्रण के साथ नमूना पतला (1 भाग blastR lysis: 4 भागों blastR कमजोर पड़ने) एक वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए (आमतौर पर 1 मिलीग्राम/एमएल) ।
  10. तुरंत उपयोग नहीं किया जाएगा नमूनों की aliquots स्नैप फ्रीज ।
    1. -७० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान ।
    2. धारा 3 के लिए आगे बढ़ें ।

3. Immunoprecipitation (आईपी) परख

नोट: संबध मनका सांद्रता, lysate सांद्रता, और गर्मी के समय दिशा निर्देशों की सिफारिश कर रहे हैं, और प्रत्येक लक्ष्य प्रोटीन और विशिष्ट PTM जांच की जा रही के लिए अद्वितीय हो सकता है ।

  1. के साथ यूबी संबध मोती, pY संबध मोती, सूमो 2/3 संबध मोती, और एसी संबध मोतियों युक्त उल्टा स्टॉक रिएजेंट ट्यूबों सुनिश्चित करें कि मोती पूरी तरह से ट्यूब में reसस्पैंड कर रहे हैं करने के लिए कई बार ।
  2. प्रत्येक आईपी परख के लिए, बर्फ पर अलग १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में aliquot मनका निलंबन (आईपी ट्यूब) । यहां, ubiquitin संबध मोती के 20 µ एल जोड़ने के लिए, phosphotyrosine संबध मोती के 30 µ एल, µ 2/3 संबध मोतियों की ४० SUMOylation एल, या ५० µ acetylation संबध मोती के एल व्यक्तिगत १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों बर्फ पर ।
    नोट: प्रत्येक संबध मनका के लिए उपयोग करने के लिए मनका निलंबन की सिफारिश की मात्रा के लिए तालिका 4 देखें ।
  3. ubiquitination आईपी नियंत्रण मोती और आईजीजी नियंत्रण मोतियों युक्त उल्टा स्टॉक एजेंट ट्यूबों कई बार मोती पूरी तरह से ट्यूब में reसस्पैंड कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए ।
  4. Aliquot नियंत्रण प्रति नियंत्रण मोतियों की प्रतिक्रिया गैर विशिष्ट बाध्यकारी (नियंत्रण आईपी ट्यूब) निर्धारित करने के लिए । यहां, यूबी नियंत्रण मोती के 20 µ एल जोड़ें, pY नियंत्रण मोतियों की 30 µ एल, सूमो 2/3 नियंत्रण मोतियों की ४० µ एल, या ५० µ एल के एसी नियंत्रण मोती के व्यक्तिगत १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों बर्फ पर ।
    नोट: मनका निलंबन के प्रत्येक प्रकार के संबंध मनका के लिए उपयोग करने की सिफारिश की मात्रा के लिए तालिका 4 देखें ।
  5. एक पश्चिमी दाग इनपुट lysate नियंत्रण के रूप में चलाने के लिए lysate की एक छोटी राशि (20 µ एल) सहेजें । 5x नमूना बफर के 5 µ एल जोड़ें और 5 मिनट के लिए ९५ ° c पर फोड़ा ।
    नोट: बफ़र संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
  6. प्रत्येक आईपी ट्यूब और नियंत्रण आईपी ट्यूब के लिए lysate जोड़ें । यहां, lysate के 1 मिलीग्राम आईपी और नियंत्रण प्रतिक्रिया प्रति इस्तेमाल किया गया था, 8 आईपी प्रतिक्रियाओं की कुल में जिसके परिणामस्वरूप ।
    नोट: १.० परख प्रति lysate के मिलीग्राम एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सिफारिश की है । lysate की राशि की आवश्यकता संशोधित लक्ष्य प्रोटीन की बहुतायत के आधार पर भिंन होगा ।
  7. 2 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंत से अधिक अंत घूर्णन मंच पर ट्यूब मशीन यहां, एक एटीआर ट्यूब रोटेटर गति 22 पर इस्तेमाल किया गया था ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए ३,०००-५,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा मोती ले लीजिए ।
  9. मोतियों को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना supernatant बंद महाप्राण.
  10. धो मोती में 1 मिलीलीटर blastR धो बफर (अवरोधों इस स्तर पर आवश्यक नहीं हैं) एक 4 डिग्री सेल्सियस घूर्णन मंच पर 5 मिनट के लिए ।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए ३,०००-५,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा मोती ले लीजिए ।
  12. मोतियों को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना supernatant बंद महाप्राण.
  13. धो चरण दोहराएं (चरण ३.१०-३.१२) दो बार ।
  14. अंतिम धोने के बाद पूरी तरह से बफर supernatant को हटा दें । मनका गोली के ंयूनतम व्यवधान स्वीकार्य है (एक 5% नुकसान करने के लिए) । अवशिष्ट supernatant एक ठीक बोर प्रोटीन लोड टिप का उपयोग कर निकालें ।
  15. मनका रेफरेंस बफर के 30 µ एल जोड़ें, और धीरे दोहन द्वारा मोतियों को reसस्पेंड/ट्यूब की ओर झाड़ । इस अवस्था में किसी पिपेट का प्रयोग न करें ।
    नोट: बफ़र संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
  16. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  17. धीरे एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge स्पिन कॉलम है कि एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में रखा गया है एक मनका निलंबन हस्तांतरण ।
    नोट: यह gentler स्थानांतरण के लिए स्थानांतरण पिपेट टिप के अंत में गोली चलाना सिफारिश की है ।
  18. ९,०००-१०,००० एक्स जी पर 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक आईपी नमूना इकट्ठा करने के लिए ।
  19. प्रत्येक नमूने के लिए 2-mercaptoethanol के 2 µ एल जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    नोट: यह स्पिन कॉलम से ढक्कन स्नैप और आगे की प्रक्रिया के लिए संग्रह ट्यूब टोपी के लिए इस का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है.
  20. एक ९५ ° c पानी स्नान में नमूने के लिए 5 min. RT पर 1 मिनट के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा नमूना ले लीजिए ।
  21. यदि आवश्यक हो, पर-७० डिग्री सेल्सियस के नमूनों की दुकान और यहां बंद करो, या एसडीएस चलाने के लिए आगे बढ़ना-पृष्ठ, स्थानांतरण, और पश्चिमी दाग विश्लेषण (धारा 4) ।

4. पश्चिमी दाग विश्लेषण: ब्याज के प्रोटीन की पहचान

  1. सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ) और एक polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली को हस्तांतरण द्वारा अलग नमूनों, मानक प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के अनुसार३२.
  2. एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए ब्याज की प्रोटीन के बाद अनुवाद संशोधित संस्करण का पता लगाने । इधर, पीडी-L1 एंटीबॉडी का प्रयोग पोस्ट-ट्रांसलेशन संशोधित पीडी-L1 का पता लगाने के लिए किया गया ।
  3. पता लगाने के लिए ultrasensitive chemiluminescence डिटेक्शन एजेंट का उपयोग करें ।
    नोट: chemiluminescent एजेंट प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने में सक्षम एक एचआरपी-लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए ।
  4. मिनी जेल आकार हस्तांतरण झिल्ली (लगभग 8 x 7 सेमी) के प्रति chemiluminescent रिएजेंट के 2 मिलीलीटर की मात्रा का उपयोग करें ।
    1. उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी (आरटी पर ६० मिनट की सिफारिश की है) के साथ मशीन के बाद, tris के 30 मिलीलीटर में दाग 6 एक्स 10 मिनट धो-20 (TBST) के बीच के साथ खारा बफर ।
      नोट: बफ़र संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
    2. तुरंत उपयोग करने से पहले, मिश्रण 1 chemiluminescent रिएजेंट बी के 1 मिलीलीटर के साथ chemiluminescent रिएजेंट की मिलीलीटर (एक के लिए पर्याप्त 8 सेमी एक्स 7 सेमी झिल्ली) ।
    3. झिल्ली और एक्स-रे फिल्म या आरोप-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा इमेजिंग का उपयोग प्रोटीन संकेत के दृश्य से पहले 1-5 मिनट के लिए आरटी पर कोमल कमाल के साथ गर्मी में chemiluminescent एजेंट जोड़ें ।
      नोट: chemiluminescent एजेंट में कम समय की मशीन अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन के लिए आवश्यक हो सकता है ।

Representative Results

प्रभावी ढंग से इन 4 PTMs का पता लगाने के द्वारा PTM crosstalk की जांच करने के लिए इन उपकरणों की क्षमता आंशिक रूप से अद्वितीय lysis बफर सिस्टम पर निर्भर है । blastR denaturing बफर प्रभावी रूप से सभी सेलुलर डिब्बों से प्रोटीन को अलग करता है इसी प्रकार अन्य denaturing बफ़र्स, जो एक पूर्ण प्रोटीन प्रोफ़ाइल (चित्र 2a) सुनिश्चित करती है । इसके अतिरिक्त, यह सूमो 2/3 जैसे अत्यधिक labile PTM संकेतों को संरक्षित करती है, जो radioimmunoprecipitation की परख (RIPA) (चित्र b) जैसे गैर-denaturing बफ़र्स में तेजी से कम होती है । महत्वपूर्ण बात, जब उचित रूप से पतला, यह अन्य denaturing बफ़र्स (जैसे, Laemmli बफ़र) की तरह समानता रिएजेंट की अखंडता को प्रभावित नहीं करता है ।

एक महत्वपूर्ण बाधा जब denaturing बफ़र्स के साथ काम करने के लिए प्रभावी रूप से जीनोमिक डीएनए संदूषण को दूर करने की क्षमता है । पारंपरिक पद्धति चिपचिपाहट को कम करने के लिए एक सिरिंज सुई का उपयोग कर या नमूना sonicating द्वारा डीएनए कतरनी है । चित्रा 3 ए BlastR फिल्टर, सिरिंज सुई, या sonication के साथ उपचार के बाद A431 सेल lysate में जीनोमिक डीएनए संदूषण से पता चलता है । वहां जीनोमिक डीएनए के लगभग पूरा हटाने BlastR फिल्टर है, जो एक पारंपरिक सिरिंज सुई या sonication का उपयोग कर मामला नहीं है का उपयोग कर रहा है । जीनोमिक डीएनए संदूषण एक एसडीएस-acrylamide जेल के माध्यम से प्रोटीन माइग्रेशन को काफी प्रभावित करता है; हालांकि, BlastR फिल्टर के साथ उपचार जीनोमिक डीएनए, उचित प्रोटीन माइग्रेशन (चित्र बी) में जिसके परिणामस्वरूप निकालता है । बदल जीनोमिक डीएनए दूषण की वजह से प्रवास काफी पश्चिमी दाग की व्याख्या को प्रभावित कर सकते हैं; उदाहरण के लिए, अनफ़िल्टर्ड lysate में देखा गया EGFR प्रतिमान गलत तरीके से फ़िल्टर किए गए नमूने के सापेक्ष बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के रूप में व्याख्या की जा सकती है (चित्र 3 c) ।

इस अनुकूलित PTM संवर्धन और जांच प्रणाली का उपयोग करके, एक तेजी से अगर एक लक्ष्य प्रोटीन एक या एक से अधिक PTMs द्वारा संशोधित किया जाता है निर्धारित कर सकते हैं । पीडी-L1 PTM प्रोफाइल की जांच हाल ही में इस तकनीक का उपयोग करते हुए, और परिणाम पता चला कि पीडी-L1 था ubiquitinated, acetylated, और tyrosine phosphorylated के जवाब में EGF (चित्रा 4) । महत्वपूर्ण बात यह है कि इन आंकड़ों में पीडी-L1 PTM परिवर्तन अंतर्जात, जो कुल पीडी-L1 की पहचान का एक छोटा प्रतिशत दर्शाया गया है ।

Figure 1
चित्र 1: BlastR फ़िल्टर के साथ सेल lysate से जीनोमिक डीएनए फ़िल्टरिंग. (A) BlastR फ़िल्टर की छवि । (ख) Lysate फ़िल्टर है कि एक 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में रखा गया था में भरी हुई है । (ग) सवार सिरिंज में रखा गया है और lysate संपीड़न द्वारा फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया है. (घ) पूर्ण संपीड़न के माध्यम से किसी भी बुलबुले सहित lysate, इकट्ठा । (ङ) छान lysate.

Figure 2
चित्र 2: BlastR lysis बफ़र की तुलना करने के लिए वैकल्पिक lysis बफ़र्स. चित्रा 2a Horita एट अल से अनुकूलित । २०१७ Biosci । प्रतिनिधि 31 (क) A431 कोशिकाओं को BlastR, RIPA, ंपर, आईपी lysis, Denaturing (१% एसडीएस), और Laemmli lysis बफ़र्स के साथ लीजड किया गया. सभी denaturing lysates ने BlastR फिल् मों का इस् तेमाल जीनोमिक डीएनए निकाला था । झिल्ली, cytoplasmic, mitochondrial, और परमाणु मार्कर से प्रोटीन का अलगाव संबंधित डिब्बे मार्कर प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर निर्धारित किया गया । (ख) A431 कोशिकाओं को BlastR, RIPA, और 1% एसडीएस denaturing बफर के साथ लीजड गया । Lysates सूमो 2/3 या नियंत्रण आईजीजी संबध मोतियों के साथ immunoprecipitated थे । नमूने एसडीएस द्वारा अलग-पृष्ठ और पश्चिमी दाग द्वारा विश्लेषण किया गया एक सूमो 2/3-सहिजन peroxidase (एचआरपी) एंटीबॉडी का उपयोग कर । एन ≥ से प्रतिनिधि दाग ३ स्वतंत्र प्रयोग दिखाए गए हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: BlastR lysis फिल्टर जीनोमिक डीएनए को हटाने में प्रभावी है । (a) A431 कक्षों को denaturing lysis बफ़र के साथ लीजड किया गया था । जीनोमिक डीएनए हटा दिया गया था या BlastR फिल्टर, सिरिंज सुई, या sonication के साथ 5, 10, 20, या 30 सेकंड के लिए कतरनी । lysate के 2% ethidium ब्रोमाइड, agarose जेल ट्रो द्वारा विश्लेषण किया गया था । (B) किसी denaturing बफ़र के साथ लीजड A431 कक्षों से Lysate या तो अनफ़िल्टर्ड या BlastR फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर किया गया था । नमूने एसडीएस-पृष्ठ और Coomassie दाग का उपयोग कर visualized के साथ अलग किया गया । (ग) बी से डुप्लिकेट नमूने एसडीएस-पृष्ठ, PVDF को हस्तांतरित द्वारा अलग किया गया है, और EGFR प्रोटीन एक EGFR एंटीबॉडी का उपयोग कर जांच की थी । एन ≥ से प्रतिनिधि दाग ३ स्वतंत्र प्रयोग दिखाए गए हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: पीडी-L1 के लिए EGF-प्रेरित पोस्ट-शोधों के संशोधनों का पता लगाना. चित्रा Horita एट अल से अनुकूलित । २०१७. Neoplasia30(अ). सीरम प्रतिबंधित A431 कोशिकाओं या तो उत्तेजित (यूटी) थे या BlastR lysis बफर के साथ lysis करने से पहले एक घंटे के लिए EGF के साथ उत्तेजित । वेकोलि पीडी-L1 के स्तर (लेन 1, 2) के लिए विश्लेषण किया गया था । Ubiquitin बंधन मोती (UBA01) आईपी ubiquitinated प्रोटीन (लेन 3, 4) के लिए इस्तेमाल किया गया । Phosphotyrosine बंधन मोती (APY03) आईपी tyrosine-phosphorylated प्रोटीन (लेन 5, 6) के लिए इस्तेमाल किया गया । सूमो 2/3 बंधन मोती (ASM24) आईपी SUMOylated 2/3 प्रोटीन (गलियाँ 7, 8) के लिए इस्तेमाल किया गया । एसिटाइल lysine बंधन मोती (AAC01) आईपी acetylated प्रोटीन (गलियाँ 9, 10) के लिए इस्तेमाल किया गया । आईजीजी बाइंडिंग नियंत्रण मोती आईपी गैर विशिष्ट बाध्यकारी प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया गया (लेन 11, 12) । नमूने एसडीएस द्वारा अलग-पृष्ठ और एक पीडी-L1 एंटीबॉडी का उपयोग कर पश्चिमी दाग से विश्लेषण किया गया । एन ≥ 3 स्वतंत्र प्रयोगों से एक प्रतिनिधि दाग दिखाया गया है । पीडी-L1 pY और एसी प्रोटीन बैंड्स को हाइलाइट करने के लिए सफेद तारक का प्रयोग किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

BlastR lysis बफ़र के लिए परिकलन
१.० एमएल २.० एमएल ५.० एमएल १०.० एमएल
BlastR Lysis बफर ९६५ µ l १९३० µ l ४.८२५ एमएल ९.६५० एमएल
Tyrosine फॉस्फेट अवरोधक 5 µ l 10 µ l 25 µ l ५० µ l
de-ubiquitinase/de-sumoylase अवरोधक 10 µ l 20 µ l ५० µ l १०० µ l
HDAC अवरोधक 10 µ l 20 µ l ५० µ l १०० µ l
छेड़ने वाला अवरोधक कॉकटेल 10 µ l 20 µ l ५० µ l १०० µ l
BlastR कमजोर पड़ने बफर के लिए गणना
४.० एमएल ८.० एमएल २०.० एमएल ४०.० एमएल
BlastR Lysis बफर ३.८६ एमएल ७.७२ एमएल १९.३ एमएल ३८.६ एमएल
Tyrosine फॉस्फेट अवरोधक 20 µ l ४० µ l १०० µ l २०० µ l
de-ubiquitinase/de-sumoylase अवरोधक ४० µ l ८० µ l २०० µ l ४०० µ l
HDAC अवरोधक ४० µ l ८० µ l २०० µ l ४०० µ l
छेड़ने वाला अवरोधक कॉकटेल ४० µ l ८० µ l २०० µ l ४०० µ l

तालिका 1: Lysis और कमजोर पड़ने बफर तैयारी चार्ट. सेल lysis के लिए बफ़र्स की तैयारी करते समय एक दिया lysis और कमजोर पड़ने बफर मात्रा के लिए जोड़ने के लिए अवरोधकों की सांद्रता प्रदान चार्ट.

प्लेट प्रोटीन सामग्री अनुशंसित BlastR Lysis बफ़र वॉल्यूम अनुशंसित BlastR कमजोर पड़ने बफर मात्रा
< 1 mg कई प्लेटों से प्रोटीन जुडा १.५ मिलीलीटर अंतिम मात्रा बनाने के लिए
1-2 मिलीग्राम ३०० µ l १.५ मिलीलीटर अंतिम मात्रा बनाने के लिए
2-4 मिलीग्राम ६०० µ l 3 मिलीलीटर अंतिम मात्रा बनाने के लिए
4-6 मिलीग्राम ९०० µ l ४.५ मिलीलीटर अंतिम मात्रा बनाने के लिए

तालिका 2: BlastR Lysis/कमजोर पड़ने बफर चार्ट । lysate प्राप्त करने पर अनुशंसित lysis और कमजोर पड़ने वाले बफ़र वॉल्यूम प्रदान चार्ट ।

सेल lysate की मात्रा प्रेसिजन लाल प्रोटीन परख रिएजेंट (µ एल के 1 मिलीलीटर के लिए जोड़ा) नमूना पठन ओडी के साथ उपयोग करने के लिए गुणक६००
10 10
20 5
30 ३.३
४० २.५
५० 2

तालिका 3: Spectrophotometer रीडिंग को mg/एमएल Lysate में बदलने के लिए गुणक । प्रोटीन एकाग्रता की गणना के साथ सहयोगी को रूपांतरण संख्या प्रदान चार्ट ।

आत्मीयता मोती मनका घोल की मात्रा/
Ubiquitination 20
Phosphotyrosine 30
SUMOylation 2/3 ४०
Acetylation ५०
नियंत्रण मोती मनका घोल की मात्रा/
Ubiquitination नियंत्रण मोती 20
Phosphotyrsoine नियंत्रण मोती 30
SUMOylation 2/3 नियंत्रण मोती ४०
Acetylation नियंत्रण मोती ५०

तालिका 4: मोतियों की अनुशंसित मात्रा/ चार्ट प्रदान संबंध मोतियों की सिफारिश की मात्रा आईपी प्रतिक्रिया प्रति उपयोग करने के लिए ।

Discussion

प्रारंभिक यदि एक लक्ष्य प्रोटीन एक PTM द्वारा संशोधित किया गया है निर्धारित करने के लिए उपयोग लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है आईपी, एक PTM एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी दाग के बाद (उदा, विरोधी एसिटाइल lysine), या ip के लिए एक PTM एंटीबॉडी का उपयोग करके, लक्ष्य प्रोटीन के साथ पश्चिमी दाग के बाद विशिष्ट एंटीबॉडी30,31,३३। हालांकि दोनों दृष्टिकोण सैद्धांतिक रूप से काम करते हैं, एक लक्ष्य का उपयोग-प्रोटीन-विशिष्ट एंटीबॉडी अधिक संभावित नुकसान है, जैसे एंटीबॉडी आईपी संगत नहीं हो सकता है, या बड़े PTM संशोधनों लक्ष्य पर एंटीबॉडी मांयता साइट ब्लॉक कर सकते है प्रोटीन३४ ,३५. PTM संबध मोतियों का लाभ यह है कि एंटीबॉडी या बंधन डोमेन विशेष रूप से ब्याज की PTM पहचान; इस प्रकार, लक्ष्य प्रोटीन के संशोधन समानता मोतियों द्वारा मांयता बदल नहीं करना चाहिए । उदाहरण के तौर पर यहां वर्णित तकनीक के साथ पीडी-L1 यूबी की पहचान की गई, और दोनों अंतर्जात मोनो-और पॉली-यूबी को देखा गया (चित्रा 4) । लिम एट अलद्वारा हाल ही में एक प्रकाशन । इन विट्रो यूबी तकनीक में उपयोग पीडी-L1 यूबी की जांच करने के लिए, और परिणाम बहुत चित्रा 4३६में दिखाया परिणाम के समान था । दिलचस्प है, वे भी एक पीडी-L1 एंटीबॉडी के साथ आईपी प्रदर्शन सेल lysate से पीडी-L1 को समृद्ध करने के लिए, जहां यूबी व्यक्त किया गया था और एमजी-१३२ संकेत बढ़ाने के लिए जोड़ा गया था. यूबी पैटर्न दमदार नहीं था और इन विट्रो यूबी पैटर्न में से बहुत अलग है । सेल कल्चरल मॉडल्स में अंतर्जात पीडी-L1 यूबी की जांच स् लिम एट अलमें नहीं की गई । अपने सेल कल्चर और इन विट्रो डेटा के बीच अंतर को स्पष्ट करने के लिए रिपोर्ट करें ।

जांच कर रहा है कि क्या एक प्रोटीन एक PTM द्वारा संशोधित किया गया है चुनौतीपूर्ण हो सकता है, इसकी कम बहुतायत और क्षणिक प्रकृति के कारण३७,३८, और अक्सर आईपी के माध्यम से संवर्धन की आवश्यकता है । PTMs के प्रभावी IP कई प्रमुख चरणों और reagents, जैसे lysis बफ़र्स और संबध reagents के ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता है । जब एक लक्ष्य प्रोटीन के कई PTMs की जांच, आवश्यक अनुकूलन की संभावना बढ़ जाती है । blastR lysis प्रणाली का उपयोग इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है, के रूप में यह मजबूत आईपी क्षमता का कहना है, जबकि pY, सूमो 2/3, यूबी, और एक एकल प्रणाली में एसी PTMs के PTM का पता लगाने को सक्षम करने से । इस तकनीक का समय और अगर एक विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन इन चार PTMs द्वारा संशोधित किया गया है निर्धारित करने के लिए आवश्यक संसाधनों का अनुकूलन, और संभावित PTM परिणामों की तुलना में एकाधिक lysis प्रणालियों का उपयोग कर प्रदर्शन के सापेक्ष crosstalk PTM की एक बेहतर तस्वीर प्रदान करता है । ग्लाइकोसिलेशन की तरह वैकल्पिक PTMs के साथ blastR lysis प्रणाली की अनुकूलता की जांच की गई; हालांकि, सभी प्रकार के PTMs के लिए exhaustively की जांच नहीं की गई है ।

प्रचुर जीनोमिक डीएनए या तो वर्णमिति या nanodrop तरीकों का उपयोग प्रोटीन माप के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, एक एसडीएस acrylamide जेल में प्रोटीन के प्रवास को प्रभावित, और आईपी परख के दौरान प्रोटीन और संबध मैट्रिक्स बातचीत को रोकने के । विधि यहां वर्णित एक विशेष फिल्टर का इस्तेमाल प्रभावी ढंग से जीनोमिक डीएनए संदूषण, जो इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम है हटाने के लिए । इस बिंदु को हाइलाइट करने के लिए, चिपचिपापन परीक्षण से पहले और blastR फिल्टर उपचार के बाद प्रदर्शन किया गया, और परिणाम पानी की चिपचिपाहट के लिए एक उच्च चिपचिपापन से एक कमी दिखाया (डेटा नहीं दिखाया गया है) । चिपचिपापन में यह परिवर्तन चित्रा 3में परिणाम के द्वारा समर्थित किया गया था, लगभग सभी जीनोमिक डीएनए दिखा हटा दिया गया था । महत्वपूर्ण बात, डीएनए इस विधि के साथ कतरनी नहीं है, के रूप में किसी भी कतरनी डीएनए फिल्टर द्वारा कब्जा नहीं किया जाएगा (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इस उपकरण के पारंपरिक तरीकों से बेहतर है, sonication या सिरिंज-डीएनए-बाल काटना की तरह, क्योंकि यह कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, अत्यधिक प्रतिलिपि है, और डीएनए के बजाय यह कतरनी निकालता है । इसके अलावा, यह lysate में प्रोटीन नीचा नहीं है, जो पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर सकते है29हो जाएगा । फिल्टर का उपयोग नमूना प्रति 5-30 सेकंड लेता है वैकल्पिक तरीकों की तुलना में जहां डीएनए के प्रभावी टूटने कई मिनट लग सकते हैं(अर्थात, सिरिंज बाल काटना) और डीएनए विविधता में परिणाम के रूप में lysate में रहना कर सकते हैं । lysate पूर्व और पोस्ट-blastR फ़िल्टरिंग का व्यापक विश्लेषण किया गया था, और प्रोटीन प्रोफ़ाइल में कोई चौकस अंतर Coomassie, लक्ष्य विशेष पश्चिमी, या कुल और लक्ष्य विशेष PTM विश्लेषण द्वारा मनाया गया; इस प्रकार, प्रोटीन प्रोफ़ाइल की अखंडता बाहर जीनोमिक डीएनए को छानने से प्रभावित नहीं किया गया है हो सकता है । अंततः, इस फिल्टर प्रणाली किसी भी पश्चिमी या आईपी आवेदन जहां जीनोमिक डीएनए मौजूद है और प्रोटीन विश्लेषण की व्याख्या को प्रभावित कर सकते है के लिए फायदेमंद है ।

यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि वहां झूठी नकारात्मक इस तकनीक है, जो भाग में संबंध मनका संतृप्ति, बाध्यकारी साइट हस्तक्षेप, या PTM मास्किंग के कारण हो सकता है का उपयोग पता लगाने के लिए क्षमता है । उदाहरण के लिए, एक विशेष लक्ष्य प्रोटीन बहुत कम स्तर पर एसी द्वारा संशोधित किया जा सकता है; इस प्रकार, यह पैन द्वारा अलग नहीं किया जा सकता है-एसिटाइल lysine संबंध मोती है कि और अधिक प्रचुर मात्रा में एसी संशोधित लक्ष्य प्रोटीन द्वारा संतृप्त किया गया है । चल रहे अध्ययन के लिए इस प्रोटोकॉल में उपयोग संबध रिएजेंट का पता लगाने की सीमा का आकलन किया जा रहा है, लेकिन हाल ही में एक प्रकाशन एक बहुत मजबूत पता लगाने की सीमा का पता चलता है । आंकड़ों से पता चला है कि इस तकनीक के रूप में कुछ के रूप में 17 acetylated लक्ष्य प्रति सेल31प्रोटीन अणुओं की पहचान सकता है । फिर भी, विशिष्ट उत्तेजनाओं के रूप में कोशिका प्रकार विशिष्टता, क्षणिक PTMs, या प्रोटीन बातचीत के कारण PTMs के मास्किंग के रूप में विशिष्ट परिस्थितियों में सभी परिणाम गलत नकारात्मक परिणाम हो सकता है । ये इस तकनीक का संभावित नुकसान कर रहे हैं, साथ ही साथ सबसे PTM आईपी तरीकों । इस प्रकार, यह एकाधिक दृष्टिकोण का उपयोग कर परिणामों की पुष्टि की सिफारिश की है ।

ग्लाइकोसिलेशन और फास्फारिलीकरण तरह संशोधनों के लिए इसी तरह अमीनो एसिड के लिए प्रतिस्पर्धा दिखाया गया है३९,४०, और ubiquitination और फास्फारिलीकरण जैसे अंय PTMs के लिए क्रमिक रूप से काम करने के लिए एक प्रोटीन को विनियमित दिखाया गया है समारोह17,४१। neuropathological प्रोटीन तौ पर हाल ही में काम PTM crosstalk के महत्व पर प्रकाश डाला, जहां ताऊ हाइपर-फास्फारिलीकरण और ताऊ SUMOylation एक दूसरे को बढ़ाकर४२। इसके अलावा, इस समूह से पता चला कि ताऊ के SUMOylation ने पाली-यूबी और उसके बाद ताऊ के क्षरण को रोका, संभवत: एकत्रीकरण में अग्रणी । यह सिर्फ नियामक PTM crosstalk के कई उदाहरणों में से एक है, और इस तकनीक की उपयोगिता के स्वास्थ्य और रोग में प्रमुख प्रोटीन को विनियमित करने में PTMs और उनके crosstalk के महत्व को रोशन करने में मदद मिलेगी ।

Disclosures

एच. and अल Cytoskeleton इंक एम के कर्मचारी है Cytoskeleton इंक के एक संस्थापक है

Acknowledgments

हम धंयवाद Cytoskeleton इंक अनुसंधान वैज्ञानिकों और डीआरएस । ब्रायन हूवर और एशले डेविस उनके महत्वपूर्ण समीक्षा, संपादन, और पांडुलिपि पर उपयोगी विचार विमर्श के लिए । इसके अतिरिक्त, हम वीडियो पांडुलिपि के उत्पादन के दौरान उनके योगदान के लिए डॉ रॉबर्ट Hom धंयवाद । यह काम Cytoskeleton इंक से फंडिंग द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell lysis/genomic DNA removal and analysis
1x phosphate buffered saline (PBS) common buffer Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4
BlastR lysis buffer Cytoskeleton Inc. BLST01 Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) common buffer Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal
Mammalian protein extraction reagent (mPER) Thermofisher 78503 Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Immunoprecipitation (IP) Lysis Pierce 87787 Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer common buffer Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA
Laemmli common buffer Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue
BlastR dilution buffer Cytoskeleton Inc. BDB01 Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Protease Inhibitor Cocktail Cytoskeleton Inc. PIC02
N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) Cytoskeleton Inc. NEM09BB
Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide Cytoskeleton Inc. TSA01
Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Cytoskeleton Inc. PYI01
cell scrapers Costar 3008
BlastR Filter Cytoskeleton Inc. BLR02
BD Insulin syringe needle BD 08290-3284-11
sonicator (Branson Sonifier) Branson Sonifier 450
Precision Red Advanced Protein Reagent Cytoskeleton Inc. ADV02
1 mL cuvettes Fisher 14955127
Spectrophotometer (Genesys20) Thermofisher 4001 Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration
Agarose Fisher BP1356-500
1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder NEB N3232L
DNA gel box Thermofisher 7312 B1A
Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer common buffer Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA
PTM Immunoprecipitation
Phosphotyrosine beads Cytoskeleton Inc. APY03-beads
Ubiquitination beads Cytoskeleton Inc. UBA01-beads
SUMOylation 2/3 beads Cytoskeleton Inc. ASM24-beads
Acetylation beads Cytoskeleton Inc. AAC04-beads
Phosphotyrosine control beads Cytoskeleton Inc. CIG01-beads
Ubiquitination control beads Cytoskeleton Inc. CUB02-beads
SUMOylation 2/3 control beads Cytoskeleton Inc. CIG01-beads
Acetylation control beads Cytoskeleton Inc. CIG02-beads
BlastR wash buffer Cytoskeleton Inc. BWB02 Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Bead elution buffer Cytoskeleton Inc. BEB01 Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
microcentrifuge Eppendorf 5417 Other microcentrifuges can be used 
tube rotator ATR RKVSD Other end-over-end tube rotators can be used 
protein loading tips VWR 37001-150
spin columns Cytoskeleton Inc. SPN22
heat block 95 °C Benchmark BSH1002
SDS-PAGE/Transfer/Western analysis
5x sample buffer common buffer recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl
novex wedge well 4-20% Tris-gly gels Invitrogen XP04200BOX The large wedgewells are excellent for loading large volumes
1x Running buffer common buffer recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS
seeblue protein ladder Life Technologies LC5625
electrophoresis cell Invitrogen Xcell surelock electrophoresis cell Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels 
power supply Biorad PowerPac HC Other power supplies can be used 
1x Transfer buffer common buffer recipe: Tris-HCl, glycine, methanol
Transfer cell Biorad mini trans-blot cell Other transfer cells can be used 
Immobilon- P membranes (PVDF) millipore IPVH 304F0
non-fat milk thrive 813503015095
Tris buffered saline with tween (TBST) common buffer recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20
Chemiluminescent Detection Reagent Cytoskeleton Inc. CLRA/CLRB
Cell growth and treatment
Dulbecco's Modified Eagle's medium  ATCC 30-2002
Fetal bovine serum ATLAS  F-0500-A 
Epidermal growth factor Cytoskeleton Inc. CN02-A
150 mm cell culture plates Corning 430599

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जैव रसायन अंक १३१ पद-शोधों में संशोधन PTM डिटेक्शन Acetylation Ubiquitination फास्फारिलीकरण SUMOylation जीनोमिक डीएनए रिमूवल denaturing lysis बफर immunoprecipitation PTM आईपी प्रोटोकॉल
एक व्यापक Immunoprecipitation संवर्धन प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक अंतर्जात पद-अनुवाद लक्ष्य प्रोटीन के लिए संशोधन प्रोफ़ाइल की पहचान
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Horita, H., Law, A., Middleton, K.… More

Horita, H., Law, A., Middleton, K. Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins. J. Vis. Exp. (131), e56912, doi:10.3791/56912 (2018).

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