Summary
Undersøke flere, kan endogen post-translasjonell endringer for et mål protein være svært utfordrende. Teknikkene her utnytte en optimalisert lysis buffer og filter system utviklet med bestemte PTM målretting, affinitet matriser til å oppdage acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 og tyrosin fosforylering endringene for et mål protein med en enkelt, strømlinjeformet system.
Abstract
Det er nå godt verdsatt at post-translasjonell endringer (PTMs) spiller en vesentlig rolle i å regulere et protein struktur og funksjon, som kan være avgjørende for et gitt protein rolle både fysiologisk og patologisk. Anriking av PTMs er ofte nødvendig når undersøke PTM statusen for et protein som mål, fordi PTMs er ofte midlertidig og relativt lav i overflod. Mange fallgruvene oppdages når berikende en PTM til en protein er målet, som buffer uforlikelighet, målet protein antistoffer er ikke IP-kompatible, tap av PTM signal og andre. Vanskelighetsgraden er forstørret når undersøke flere PTMs som acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 og tyrosin fosforylering for et gitt mål protein. Studere en kombinasjon av disse PTMs kan være nødvendig som crosstalk mellom PTMs er utbredt og kritisk protein regulering. Disse PTMs er ofte studerte i forskjellige lysis buffere og med unik hemmer komposisjoner. For å forenkle prosessen, et unikt denaturing lysis system ble utviklet som effektivt isolerer og beholder disse fire PTMs; dermed muliggjør undersøkelse av potensielle crosstalk i et enkelt lysis system. En unik filtersystem ble utviklet for å fjerne forurensende genomisk DNA fra lysate, som er et problematisk biprodukt av denaturing buffere. Robust affinitet matriser målretting hver av de fire PTMs ble utviklet sammen med bufferen systemet å maksimere berikelse og gjenkjenning av endogene tilstandene til disse fire PTMs. Denne omfattende PTM gjenkjenning verktøysett strømlinjeformer prosessen med å få viktig informasjon om hvorvidt et protein er endret av en eller flere av disse PTMs.
Introduction
Post-translasjonell modifikasjoner (PTMs) er sterkt regulert endringer en protein, der endringen er lagt til eller fjernet på en bestemt måte. PTMs er ofte dynamisk, forbigående endringer som betydelig endre protein's struktur, samhandlinger med partner proteiner, romlig lokalisering og til slutt aktivere protein utføre forskjellige funksjoner1,2 , 3 , 4. PTMs er så rikelig at de øker antall unike protein skjemaer (eller proteoforms) fra rundt 30.000 genet produkter til over en million proteoforms5,6. Identifisere PTMs og definere deres effekt på et mål protein er kritiske mot forståelse protein's fysiologiske og patologiske funksjoner7,8,9,10, 11,12,13,14. Fungerer på Velg proteiner som tubulin, p53 og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) har belyst PTMs15,16,17regulatoriske rollene. Disse studiene avdekket at regulering av disse proteinene skjer ved flere PTMs, og i mange tilfeller disse endringene jobber sammen for å fremme en bestemt funksjon. Nye studier har vist at både felles og negative PTM crosstalk kan oppstå på flere ulike proteiner18,19,20,21,22, 23,24,25. Men er PTM profiler til flertallet av proteiner bygget fra flere studier som har brukt ulike modeller og unike forholdene. Å ha en optimalisert system å undersøke flere PTMs i ett system ville være svært nyttig for å få innsikt i potensielle PTM crosstalk for et mål protein.
En utfordring med å undersøke PTMs i ett enkelt system er at spesifikke PTMs er undersøkt ved hjelp av forskjellige lysis buffere. For eksempel kan bruk av buffere som RIPA eller NP-40 som er brukt for fosforylering eller ubiquitination undersøkelsene være utilstrekkelig for å studere en labil PTM som små ubiquitin som modifikator (SUMO) ylation26. I tillegg ikke denaturing buffere er utilstrekkelig for dissociating protein interaksjoner, og kan føre til falsk positiv PTM identifikasjon27. Undersøker PTMs i en denaturing lyseringsbuffer kan bli foretrukket, som det er vesentlig bedre på å isolere proteiner fra alle mobilnettet rom28, vil distansere de fleste protein interaksjoner og vil hemme proteaser endre PTM stater, som deSUMOylases 26; men kan denaturing buffere kompromittere integriteten til spesifikk affinitet reagenser som ubiquitin bindende domene-basert verktøy27. Utvikle en denaturing-lignende lysis system å studere flere PTMs av et protein i en affinitet reagens-kompatibelt system ville være svært gunstig for PTM crosstalk undersøkelser.
Selv om denaturing buffere har hovedfordelene over ikke-denaturing buffere for å undersøke PTMs, de er færre vanligvis anvendt på grunn av sin betydelige ulemper, som inkompatibilitet med konvensjonelle protein analyser, betydelig genomisk deoksyribonukleinsyre (DNA) forurensning og avbrudd i immunoprecipitation (IP) reagenser29. Disse ulempene kan resultere i lengre Forberedelsestid og skader målet proteiner når klipping genomisk DNA. To vanlige metoder for å skråstille DNA omfatter sprøyte lyse og sonication29. Begge metodene krever omfattende optimalisering og ofte mangler presis reproduserbarhet. Alternative metoder for å fjerne genomisk DNA inkludere tillegg av DNAses; Dette kan imidlertid kreve ytterligere optimalisering og endringer i bufferen komposisjon. Til slutt ville en enkel og reproduserbar metode å fjerne genomisk DNA forurensning være gunstig når du arbeider med denaturing lysis buffere for PTM undersøkelser.
Målet med denne teknikken er å utvikle et system for å isolere og undersøke ubiquitination (Ub), fosforylering tyrosin (pY), SUMOylation 2/3 (SUMO 2/3) og acetylation (Ac) PTMs i ett enkelt system bedre undersøke PTM crosstalk for et mål protein. Denne PTM deteksjon system ble benyttet for å raskt undersøke endogene PTM profilen til flere mål proteiner i ett enkelt system. Ny innsikt i potensielle crosstalk var identifisert30,31. Samlet teknikken beskrevet her forbedrer eksisterende metoder for å undersøke PTMs og PTM crosstalk på tre forskjellige måter: 1) en unik denaturing buffer ble utviklet som isolerer proteiner fra alle mobilnettet avdelinger, samtidig som kompatibel med PTM affinitet reagenser, 2) en unik filtersystem ble utviklet som raskt fjerner genomisk DNA forurensning fra denaturert lysates med høy reproduserbarhet og krever ingen spesialisert utstyr og 3) robust affinitet perler, lyse system, og inhibitory reagenser er kompatible; dermed forenkle isolering av disse fire PTMs for et protein som mål å maksimere PTM berikelse, og effektivt undersøke mulige crosstalk.
Protocol
1. sample forberedelse: Cellekultur
- Vokse fire 150 mm plater av A431 celler i Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum.
- Vokse A431 cellene til 50% confluency.
- Serum begrense fire plater A431 celler med serum-free DMEM 24 h.
- Behandle to plater av A431 celler med 33.3 mg/mL epidermal vekstfaktor for 1 h. la de andre to platene ubehandlet.
Merk: Celle vekst og behandling forhold vises her gi et eksempel; Denne metoden er imidlertid mange ulike celletyper og behandling forhold.
- Forberede blastR lyse og fortynning buffere med hemmere (tabell 1). Kombiner 2.895 mL blastR lyseringsbuffer med 15 µL av tyrosin fosfatase hemmer, 30 µL av deubiquitinase og deSUMOylase inhibitor, 30 µL av histone deacetylase (HDAC) hemmer og 30 µL av protease hemmer cocktail.
- Kombiner 9.65 mL blastR fortynning bufferen med 50 µL av tyrosin fosfatase hemmer, 100 µL deubiquitinase og deSUMOylase inhibitor, 100 µL av histone deacetylase (HDAC) hemmer og 100 µL av protease hemmer cocktail.
Merk: Se Tabell for materiale for bufferen sammensetning og hemmer.
- Kombiner 9.65 mL blastR fortynning bufferen med 50 µL av tyrosin fosfatase hemmer, 100 µL deubiquitinase og deSUMOylase inhibitor, 100 µL av histone deacetylase (HDAC) hemmer og 100 µL av protease hemmer cocktail.
- Hell av kultur media og plasserer cellene på is. Deretter vaskes cellene to ganger med 10 mL 1 x fosfat bufret saltvann (PBS).
- Fjerne så mye PBS som mulig før du legger blastR lyseringsbuffer å maksimere celle lysis.
Merk: Se Tabell for materiale for bufferen komposisjon.
- Fjerne så mye PBS som mulig før du legger blastR lyseringsbuffer å maksimere celle lysis.
- Legge til 600 µL av blastR lyseringsbuffer for hver 150 mm plate. Hvor mye buffer er basert på forventet protein avkastning (tabell 2).
- Lyse cellene med cellen skraper. Den lysate vil bli tyktflytende på grunn av kjernefysiske lysis.
- Bruke et snipped 1 mL pipette tips for å overføre råoljen lysate i et blastR-filter som er plassert i et 15 mL samling rør (figur 1). Her, brukes en 15 mL falcon rør.
- Bruk en medfølgende filter stempelet å komprimere blastR filteret og samle den lysate gjennomflytsenhet, inkludert bobler, en 15 mL tube (figur 1).
- Valgfritt: Overføring avklart lysate 1,5 mL microcentrifuge rør og sentrifuge lysate omkring 10 000 x g for 1 min på 4 ° C.
- Overføre nedbryting til en ny 15 mL falcon tube.
- Fortynne den avklart lysate med blastR fortynning buffer til et endelig antall 3 mL for hver 150 mm plate. Det siste bindet er basert på forventet protein avkastning (tabell 2).
Merk: Dette trinnet er viktig som endelig buffer sammensetningen påvirker IP reaksjon stringens. - Quantitate protein konsentrasjon (inndeling 2).
2. protein kvantifisering analysen
Merk: Bruke en standard kolorimetrisk protein kvantifisering analysen for å bestemme protein kvantifisering. Her, bestemmes protein kvantifisering ved hjelp av presisjon røde avanserte protein analysen.
- Legge 1 mL av presisjon røde avanserte protein analysen reagens til hver av to 1 mL cuvettes.
- Bland 10 µL blastR lyseringsbuffer og 40 µL blastR fortynning bufferen i et rent 1,5 mL microcentrifuge rør på is.
Merk: Dette vil bli brukt for lesing tom protein prøven. - Legge til 20 µL av lyse/fortynning buffer mix (fra trinn 2.2) til den første cuvette og blanding av invertere to til tre ganger.
- Legge til 20 µL av utvannet cellen lysate (fra eksperimentet) til den andre cuvette, blande som ovenfor.
- Inkuber prøver for 1 min ved romtemperatur.
- Tom spektrofotometer med lyse/fortynning buffer blanding prøven (fra trinn 2.3).
- Måle absorbansen på lysate utvalget (fra trinn 2.4) på 600 nm.
- Bestemme lysate protein konsentrasjonen som følger;
eksempel lesing OD600 x 5 = protein konsentrasjon i mg/mL
Merk: OD målinger under 0,05 eller over 0,5 er nær lineære utvalg kapasiteten til protein analysen. For avlesninger > 0,5 prøver kan bli utvannet. For avlesninger < 0,05, mer lysate kan legges til presisjon røde avanserte protein analysen reagensen (opptil 50 µL). Se tabell 3 for multiplikatorer konvertere spektrofotometer målinger til mg/mL lysate protein konsentrasjon. Hvis det er utilstrekkelig protein i en plate, anbefales det å bruke 2 eller flere plater per IP. I dette tilfellet vil plater bli høstet i serien, overføre den opprinnelige 300 µL av lyseringsbuffer mellom platene. - Basert på protein konsentrasjon, fortynne prøve med en buffer blanding (1 del blastR lysis: 4 deler blastR fortynning) til en ønsket endelige konsentrasjon (vanligvis 1 mg/mL).
- Fest fryse dele prøver som ikke skal brukes umiddelbart.
- Lagre prøver på-70 ° C.
- Videre til del 3.
3. Immunoprecipitation (IP) analysen
Merk: Affinitet perle konsentrasjoner, lysate konsentrasjoner og inkubasjon ganger anbefales retningslinjer, og kan være unikt for hvert mål protein og bestemte PTM blir undersøkt.
- Inverter lager reagens rør som inneholder Ub affinitet perler, pY affinitet perler, SUMO 2/3 affinitet perler og Ac affinitet perler flere ganger at er perlene helt resuspended i røret.
- For hver IP analysen, aliquot perle suspensjon i separate 1,5 mL microcentrifuge rør på is (IP rør). Her legge til 20 µL av ubiquitin affinitet perler, 30 µL av phosphotyrosine affinitet perler, 40 µL av SUMOylation 2/3 affinitet perler eller 50 µL av acetylation affinitet perler i enkelte 1,5 mL microcentrifuge rør på is.
Merk: Se Tabell 4 for den anbefalte mengden perle suspensjon bruke for hver affinitet perle. - Inverter lager reagens rør som inneholder ubiquitination IP kontroll perler og IgG kontroll perler flere ganger at er perlene helt resuspended i røret.
- Aliquot kontroll perler per kontroll reaksjonen å avgjøre ikke-spesifikk binding (kontroll IP rør). Her legge til 20 µL av Ub kontroll perler, 30 µL av pY kontroll perler, 40 µL av SUMO 2/3 kontroll perler eller 50 µL av Ac kontroll perler i enkelte 1,5 mL microcentrifuge rør på is.
Merk: Se Tabell 4 for den anbefalte mengden perle suspensjon bruke for hver affinitet perle. - Lagre en liten mengde lysate (20 µL) til å kjøre som en western blot inngang lysate kontroll. Legg 5 µL 5 x prøve bufferen og kok til 95 ° C i 5 minutter.
Merk: Se Tabell for materiale for bufferen komposisjon. - Legge til lysate for hver IP rør og kontroll IP rør. Her, ble 1 mg av lysate brukt per IP og kontroll reaksjon, noe som resulterer i totalt 8 IP reaksjoner.
Merk: 1.0 mg lysate per analysen anbefales som utgangspunkt. Hvor mye lysate nødvendig vil variere avhengig av endret mål protein. - Inkuber rør på en over-gjennomgående roterende plattform ved 4 ° C i 2 timer. Her ble en ATR tube rotator brukt på hastighet 22.
- Samle perler med sentrifugering 3,000-5,000 x g for 1 min på 4 ° C.
- Sug opp av nedbryting så mye som mulig uten å forstyrre perler.
- Vask perler i 1 mL blastR vaskebuffer (hemmere ikke er nødvendig på dette stadiet) i 5 min på en 4 ° C roterende plattform.
- Samle perler med sentrifugering 3,000-5,000 x g for 1 min på 4 ° C.
- Sug opp av nedbryting så mye som mulig uten å forstyrre perler.
- Gjenta vask trinnet (trinn 3.10-3.12) to ganger.
- Etter siste vask, fjerne buffer nedbryting. Minimalt avbrudd av perle pellets er akseptabelt (opptil 5% tap). Fjern gjenværende nedbryting med en fin bar protein lasting tips.
- Legg 30 µL av perle elueringsbufferen, og resuspend perler ved å forsiktig trykke/sveipe siden av røret. IKKE bruk en pipette på dette stadiet.
Merk: Se Tabell for materiale for bufferen komposisjon. - Inkuber ved romtemperatur for 5 min.
- Forsiktig overføre hver perle suspensjon til en 1,5 mL microcentrifuge spinn kolonne som er plassert i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
Merk: Det anbefales å bekkasin slutten av overføring pipette spissen for mildere overføring. - Sentrifuge 9000-10.000 x g for 1 min ved romtemperatur å samle IP prøven.
- Legg 2 µL av 2-mercaptoethanol til hvert utvalg og bland godt.
Merk: Det er praktisk å ta lokket av kolonnen spinn og bruke dette cap samling rør for videre behandling. - Sett prøvene i en 95 ° C vannbad for 5 min. samle prøven ved sentrifugering 10.000 x g for 1 min på RT.
- Eventuelt lagre prøver-70 ° c og stoppe her, eller fortsette å kjøre SDS side, overføring og western blot analyse (del 4).
4. Western Blot analyse: Identifikasjon av Protein av interesse
- Separate prøver av natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) og overføre til en polyvinylidene fluor (PVDF) membran, ifølge standard laboratorium protokoller32.
- Bruk en primær antistoff for å oppdage de post-translationally modifiserte versjonene av protein av interesse. Her ble PD-L1 antistoff brukt til å oppdage post-translationally endret PD-L1.
- Bruk ultrasensitive chemiluminescence gjenkjenning reagens for gjenkjenning.
Merk: Chemiluminescent reagensen bør brukes sammen med et HRP-merket sekundære antistoff stand til å oppdage primære antistoffer. - Bruk et volum på 2 mL chemiluminescent reagens per mini-gel-størrelse forflytning membran (ca 8 x 7 cm).
- Etter inkubasjon med passende sekundære antistoff (60 min på RT anbefales), vaske blot 6 x 10 minutter i 30 mL tris-bufret saltoppløsning med tween-20 (TBST).
Merk: Se Tabell for materiale for bufferen komposisjon. - Umiddelbart før bruk, bland 1 mL av chemiluminescent reagens A med 1 mL av chemiluminescent reagens B (tilstrekkelig for en 8 cm x 7 cm membran).
- Legg chemiluminescent reagens til membranen og ruge med milde rocking på RT for 1-5 minutter før visualisering av protein signal x-ray film eller kostnad - sammen enhet (CCD) kameraet bildebehandling.
Merk: Kortere inkubasjon ganger i chemiluminescent reagensen kan være nødvendig for svært rikelig proteiner.
- Etter inkubasjon med passende sekundære antistoff (60 min på RT anbefales), vaske blot 6 x 10 minutter i 30 mL tris-bufret saltoppløsning med tween-20 (TBST).
Representative Results
Evne til disse verktøyene for å undersøke PTM crosstalk ved å effektivt oppdage disse 4 PTMs er delvis avhengig av unike lysis bufferen systemet. BlastR denaturing bufferen isolerer effektivt proteiner fra alle mobilnettet rom på samme måte som andre denaturing buffere, som sikrer en komplett protein profil (figur 2A). I tillegg bevarer det svært labil PTM signaler som SUMO 2/3, som er raskt redusert i ikke-denaturing buffere som radioimmunoprecipitation analysen (RIPA) (figur 2B). Viktigere, når fortynnet riktig, påvirker det ikke integritet affinitet reagensene som andre denaturing buffere (f.eks Laemmli buffer).
En betydelig hinder når du arbeider med denaturing buffere er muligheten til å effektivt fjerne genomisk DNA forurensning. Konvensjonelle metodikken å redusere viskositet er å skråstille DNA ved hjelp av en sprøyte nål eller sonicating prøven. Figur 3A viser genomisk DNA forurensning i A431 celle lysate etter behandling med BlastR filter, sprøytenålen eller sonication. Det er nesten fullstendig fjerning av genomisk DNA ved hjelp av BlastR-filteret, som ikke er tilfelle med en konvensjonell sprøyte nål eller sonication. Genomic DNA forurensning påvirker betydelig protein migrasjon gjennom en SDS-akrylamid gel; behandling med BlastR filteret fjerner imidlertid genomisk DNA, noe som resulterer i riktig protein overføring (figur 3B). Endret migrasjon forårsaket av genomisk DNA forurensning kan påvirke tolkning av vestlige blots; for eksempel kan smurte EGFR mønsteret sett i den ufiltrerte lysate feilaktig tolkes som økt uttrykk i forhold til filtrerte prøven (Figur 3 c).
Ved å benytte denne optimalisert PTM berikelse og oppdagelsen system, kan en raskt avgjøre hvis et mål protein er endret av en eller flere PTMs. undersøkelse av PD-L1 PTM profilen ble nylig utført bruker denne teknikken, og resultatene viste at PD-L1 var ubiquitinated, acetylated, og tyrosin fosforylert svar på EGF (Figur 4). Viktigere, rapportert disse data endogene PD-L1 PTM endringer, som representerte en liten prosentandel av den totale PD-L1 identifisert.
Figur 1: filtrering genomisk DNA fra celle lysate BlastR filteret. (A) bilde av BlastR filteret. (B) Lysate er lastet inn i filteret ble plassert i en 15 mL samling rør. (C) stempelet plasseres i sprøyten og lysate er passert gjennom filteret ved komprimering. (D) samler inn lysate, inkludert bobler gjennom komplette komprimering. (E) filtrert lysate.
Figur 2: sammenligning av BlastR lyseringsbuffer til alternative lysis buffere. Figur 2A tilpasset fra Horita et al. 2017. Biosci. Rep. 31 (A) A431 celler var lysed med BlastR, RIPA, mPER, IP lysis, Denaturing (1% SDS), og Laemmli lyse buffere. Alle denaturing lysates hadde genomisk DNA ved hjelp BlastR-filteret. Isolering av proteiner fra membran, cytoplasmatiske, mitokondrie, og kjernefysiske markører var bestemmes ved hjelp av antistoffer mot respektive kupé markør proteiner. (B) A431 celler var lysed med BlastR, RIPA og 1% SDS denaturing buffer. Lysates var immunoprecipitated med SUMO 2/3 eller kontroll IgG affinitet perler. Prøvene var atskilt med SDS side og analysert ved western blot bruke en SUMO 2/3-pepperrotperoksidase (HRP) antistoff. Representant blotter fra N≥3 uavhengig eksperimenter vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: BlastR lysis filteret er effektive i å fjerne genomisk DNA. (A) A431 celler ble lysed med en denaturing lyseringsbuffer. Genomic DNA ble fjernet eller skåret med BlastR filter, sprøytenålen eller sonication i 5, 10, 20 eller 30 sekunder. 2% av den lysate ble analysert av ethidium bromide, agarose gel geleelektroforese. (B) Lysate fra A431 celler lysed med en denaturing buffer var enten ufiltrert eller filtrere BlastR-filteret. Ble skilt med SDS-side og visualisert ved hjelp Coomassie flekken. (C) kopiere eksempler fra B var atskilt med SDS-side, overført til PVDF, og EGFR protein ble undersøkt ved hjelp av et EGFR antistoff. Representant blots fra N ≥3 uavhengig eksperimenter vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: påvisning av EGF-indusert post-translasjonell endringer PD-L1. Figur tilpasset fra Horita et al. 2017. neoplasi30(A). Serum-begrenset A431 celler var enten unstimulated (UT) eller stimulert med EGF en time før lysis med BlastR lyseringsbuffer. WCL ble analysert for PD-L1 nivåer (baner 1,2). Ubiquitin binding perler (UBA01) ble brukt IP ubiquitinated proteiner (baner 3,4). Phosphotyrosine binding perler (APY03) ble brukt IP tyrosin-fosforylert proteiner (baner 5,6). SUMO 2/3 bindende perler (ASM24) ble brukt IP SUMOylated 2/3 proteiner (baner 7,8). Acetyl lysin bindende perler (AAC01) ble brukt IP acetylated proteiner (baner 9,10). IgG bindende kontroll perler ble brukt IP uspesifisert bindende proteiner (baner 11,12). Prøvene var atskilt med SDS side og analysert ved western blot bruke en PD-L1 antistoff. En representant klatt fra N ≥3 uavhengig eksperimenter vises. Hvite stjerner ble brukt til å markere PD-L1 pY og Ac protein band. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Beregningene av BlastR lyseringsbuffer | ||||
| 1,0 mL | 2.0 mL | 5.0 mL | 10,0 mL | |
| BlastR lyseringsbuffer | 965 ΜL | 1930 ΜL | 4.825 mL | 9.650 mL |
| Tyrosin fosfatase Inhibitor | 5 ΜL | 10 ΜL | 25 ΜL | 50 ΜL |
| de-ubiquitinase/de-sumoylase hemmer | 10 ΜL | 20 ΜL | 50 ΜL | 100 ΜL |
| HDAC hemmer | 10 ΜL | 20 ΜL | 50 ΜL | 100 ΜL |
| Protease hemmer cocktail | 10 ΜL | 20 ΜL | 50 ΜL | 100 ΜL |
| Beregningene av BlastR fortynning buffer | ||||
| 4.0 mL | 8.0 mL | 20.0 mL | 40,0 mL | |
| BlastR lyseringsbuffer | 3.86 mL | 7.72 mL | 19,3 mL | 38,6 mL |
| Tyrosin fosfatase Inhibitor | 20 ΜL | 40 ΜL | 100 ΜL | 200 ΜL |
| de-ubiquitinase/de-sumoylase hemmer | 40 ΜL | 80 ΜL | 200 ΜL | 400 ΜL |
| HDAC hemmer | 40 ΜL | 80 ΜL | 200 ΜL | 400 ΜL |
| Protease hemmer cocktail | 40 ΜL | 80 ΜL | 200 ΜL | 400 ΜL |
Tabell 1: Lyse og fortynning Buffer forberedelse diagrammet. Diagram gir konsentrasjoner av hemmere legge for et gitt lyse og fortynning buffer volum når forbereder buffere for cellen lysis.
| Plate proteininnhold | Anbefalte BlastR lyseringsbuffer volum | Anbefalte BlastR fortynning Buffer volum |
| < 1 mg | Kombinere protein fra flere plater | Å gjøre 1.5 mL siste volum |
| 1-2 mg | 300 ΜL | Å gjøre 1.5 mL siste volum |
| 2-4 mg | 600 ΜL | Å gjøre 3 mL siste volum |
| 4-6 mg | 900 ΜL | Å gjøre 4,5 mL siste volum |
Tabell 2: BlastR Lysis/fortynning Buffer diagrammet. Diagrammet gir anbefalt lyse og fortynning buffer volumer når skaffe lysate.
| Volumet av celle lysate til 1 ml av presisjon Red Protein analysen reagens (µL) | Multiplikator bruke med prøve lesing OD600 |
| 10 | 10 |
| 20 | 5 |
| 30 | 3.3 |
| 40 | 2.5 |
| 50 | 2 |
Tabell 3: Multiplikatorer konvertere spektrofotometer målinger til mg/mL Lysate. Diagram gir konverteringsantall til aide beregne protein konsentrasjon.
| affinitet perler | volumet av perle slurry/IP (mL) |
| Ubiquitination | 20 |
| Phosphotyrosine | 30 |
| SUMOylation 2/3 | 40 |
| Acetylation | 50 |
| kontroll perler | volumet av perle slurry/IP (mL) |
| Ubiquitination kontroll perler | 20 |
| Phosphotyrsoine kontroll perler | 30 |
| SUMOylation 2/3 kontroll perler | 40 |
| Acetylation kontroll perler | 50 |
Tabell 4: Anbefalt antall perler/IP diagrammet. Diagrammet gir anbefalte mengder affinitet perler å bruke per IP reaksjon.
Discussion
Første tilnærminger til å bestemme om et mål protein er endret av en PTM utføres med målet protein spesifikke antistoffer for IP, etterfulgt av western blot med et PTM antistoff (f.eks., anti-acetyl lysin), eller ved å bruke et PTM antistoff for IP, fulgte ved western blot med de mål protein spesifikke antistoff30,31,33. Mens begge tilnærminger teoretisk arbeid, har utnytte en mål-protein-spesifikke antistoffer flere potensielle fallgruver, som antistoffer ikke IP kompatibel, eller store PTM modifikasjoner kan blokkere området antistoff anerkjennelse på målet protein34 ,35. Fordelen med PTM affinitet perlene er at antistoff eller bindende domenene spesifikt gjenkjenne PTM steder. dermed bør endringer målet protein ikke endre anerkjennelse av affinitet perler. Som et eksempel, PD-L1 Ub ble identifisert med teknikken beskrevet her, og både endogene mono - og poly-Ub ble observert (Figur 4). En fersk publikasjon av Lim et al. benyttet i vitro Ub teknikker for å undersøke PD-L1 Ub, og resultatet var svært lik resultatene som vises i Figur 436. Interessant, de har også utført IP med et PD-L1 antistoff å berike PD-L1 fra celle lysate, der Ub var overexpressed og MG-132 ble lagt til forbedre signalet. Ub mønsteret var ikke robust og svært forskjellig fra den i vitro Ub mønsteret. Undersøkelse av endogene PD-L1 Ub i celle kultur modeller ble ikke utført i Lim et al. rapporten til å klargjøre forskjellen mellom deres kultur og i vitro celledata.
Undersøker om et protein er endret av en PTM kan være utfordrende, p.g.a. lav overflod og forbigående Art37,38, og ofte krever berikelse gjennom IP. Effektiv IP av PTMs krever optimalisering av flere viktige trinn og reagenser, som lysis buffere og affinitet reagenser. Når undersøke flere PTMs av et mål protein, øker kreves sannsynlige optimalisering. Bruker blastR lysis systemet er et viktig skritt i denne protokollen, som den opprettholder robust IP evne, mens PTM oppdagelsen av pY, SUMO 2/3, Ub og Ac PTMs i ett enkelt system. Denne teknikken optimaliserer tid og ressursene som kreves for å avgjøre om et bestemt mål protein er endret av disse fire PTMs, og potensielt gir et bedre bilde av PTM crosstalk i forhold til sammenligning PTM resultatene utført ved hjelp av flere lysis systemer. Undersøkelse av blastR lyse systemets kompatibilitet med alternative PTMs, som glykosylering, ble utført; men har det ikke blitt undersøkt grundig for alle typer PTMs.
Store genomisk DNA kan forstyrre protein mål med enten kolorimetrisk nanodrop metoder, påvirke overføringen av proteiner i en SDS akrylamid gel og hindre protein og affinitet matrix interaksjon under IP analyser. Metoden beskrevet her benytter et spesialisert filter for å effektivt fjerne genomisk DNA forurensning, som er et viktig skritt i denne protokollen. For å markere dette punktet, viskositet testene ble utført før og etter blastR filter behandling, og resultatene viste en reduksjon fra en høy viskositet for viskositeten vann (data ikke vist). Denne endringen i viskositet ble støttet av resultatene i Figur 3viser nesten alle genomic DNA var fjernet. Viktigere, er DNA ikke skåret med denne metoden, som noen skåret DNA ikke vil bli fanget av filteret (data ikke vist). Dette verktøyet er bedre enn konvensjonelle metoder, som sonication eller sprøyte-DNA-klipping, fordi den krever ingen spesialisert utstyr, svært reproduserbare, og fjerner DNA i stedet for å klippe den. Videre, det vil ikke nedverdige protein i den lysate, som kan oppstå med konvensjonelle metoder29. Bruker filteret tar 5-30 sekunder per prøve sammenlignet med alternative metoder hvor effektiv sammenbrudd av DNA kan ta flere minutter (dvs., sprøyte klipping) og kan resultere i prøven heterogenitet som DNA forurensninger forblir i den lysate. Omfattende analyse av lysate pre- og post blastR filtreringen ble utført, og ingen observerbare forskjell i protein profilen ble observert av Coomassie, målet-spesifikke vest, eller total og mål-spesifikke PTM analyser; dermed integriteten til protein profilen ikke kan ha vært påvirket ved å filtrere ut genomisk DNA. Til slutt, dette filtersystemet er gunstig for western eller IP søknad der genomisk DNA finnes og kan påvirke tolkning av protein analyse.
Det er viktig å merke seg at det er potensial for false negativ oppdagelsen utnytte denne teknikken, som kan skyldes delvis til affinitet perle metning, bindende nettsted forstyrrelser eller PTM maskering. For eksempel kan en bestemt målenheten protein endres av Ac på svært lave nivåer; Dermed kan det ikke bli isolert av pan-acetyl lysin affinitet perler som blitt mettet av mer rikelig Ac-endret mål proteiner. Pågående studier utføres for å vurdere oppdagelsen grensene for affinitet reagensene benyttet i denne protokollen, men en nylig publikasjon antyder en svært robust oppdaging grense. Dataene viser at denne teknikken kan identifisere så lite som 17 acetylated målet protein molekyler per celle31. Likevel bestemte omstendigheter som cellen skriver spesifisitet, forbigående PTMs svar på bestemte stimuli, eller maskering av PTMs på grunn av protein samhandling kan alle føre til falske negative resultater. Dette er potensialet fallgrubene denne teknikken, som de fleste PTM IP-metodene. Derfor er det anbefalt å bekrefte resultatene ved hjelp av flere metoder.
Endringer som glykosylering og fosforylering har vist seg å konkurrere om lignende aminosyrer39,40, og andre PTMs som ubiquitination og fosforylering har vist å arbeide fortløpende for å regulere et protein funksjonen17,41. Siste arbeidet med neuropathological protein Tau understreket viktigheten av PTM crosstalk der Tau hyper-fosforylering og Tau SUMOylation forbedret hverandre42. Dessuten, denne gruppen viste at SUMOylation av Tau hindret poly-Ub og påfølgende Tau fornedrelse, muligens fører til aggregering. Dette er bare ett av mange eksempler på regulatoriske PTM crosstalk, og nytten av denne teknikken vil bidra til å belyse betydningen av PTMs og deres crosstalk i å regulere viktige proteiner i helse og sykdom.
Disclosures
H.H. og Al er ansatte i Cytoskeleton Inc. km er grunnlegger av Cytoskeleton Inc.
Acknowledgments
Vi takker Cytoskeleton Inc. forskere og Dr. Brian Hoover og Ashley Davis for deres kritisk gjennomgang, redigering og fruktbart diskusjoner på manuskriptet. I tillegg takker vi Dr. Robert Hom for hans bidrag under produksjonen av video manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Cytoskeleton Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis/genomic DNA removal and analysis | |||
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | common buffer | Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 | |
| BlastR lysis buffer | Cytoskeleton Inc. | BLST01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) | common buffer | Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal | |
| Mammalian protein extraction reagent (mPER) | Thermofisher | 78503 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Immunoprecipitation (IP) Lysis | Pierce | 87787 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer | common buffer | Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA | |
| Laemmli | common buffer | Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue | |
| BlastR dilution buffer | Cytoskeleton Inc. | BDB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cytoskeleton Inc. | PIC02 | |
| N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) | Cytoskeleton Inc. | NEM09BB | |
| Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide | Cytoskeleton Inc. | TSA01 | |
| Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Cytoskeleton Inc. | PYI01 | |
| cell scrapers | Costar | 3008 | |
| BlastR Filter | Cytoskeleton Inc. | BLR02 | |
| BD Insulin syringe needle | BD | 08290-3284-11 | |
| sonicator (Branson Sonifier) | Branson | Sonifier 450 | |
| Precision Red Advanced Protein Reagent | Cytoskeleton Inc. | ADV02 | |
| 1 mL cuvettes | Fisher | 14955127 | |
| Spectrophotometer (Genesys20) | Thermofisher | 4001 | Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration |
| Agarose | Fisher | BP1356-500 | |
| 1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder | NEB | N3232L | |
| DNA gel box | Thermofisher | 7312 B1A | |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | common buffer | Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA | |
| PTM Immunoprecipitation | |||
| Phosphotyrosine beads | Cytoskeleton Inc. | APY03-beads | |
| Ubiquitination beads | Cytoskeleton Inc. | UBA01-beads | |
| SUMOylation 2/3 beads | Cytoskeleton Inc. | ASM24-beads | |
| Acetylation beads | Cytoskeleton Inc. | AAC04-beads | |
| Phosphotyrosine control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
| Ubiquitination control beads | Cytoskeleton Inc. | CUB02-beads | |
| SUMOylation 2/3 control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
| Acetylation control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG02-beads | |
| BlastR wash buffer | Cytoskeleton Inc. | BWB02 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| Bead elution buffer | Cytoskeleton Inc. | BEB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
| microcentrifuge | Eppendorf | 5417 | Other microcentrifuges can be used |
| tube rotator | ATR | RKVSD | Other end-over-end tube rotators can be used |
| protein loading tips | VWR | 37001-150 | |
| spin columns | Cytoskeleton Inc. | SPN22 | |
| heat block 95 °C | Benchmark | BSH1002 | |
| SDS-PAGE/Transfer/Western analysis | |||
| 5x sample buffer | common buffer | recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl | |
| novex wedge well 4-20% Tris-gly gels | Invitrogen | XP04200BOX | The large wedgewells are excellent for loading large volumes |
| 1x Running buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS | |
| seeblue protein ladder | Life Technologies | LC5625 | |
| electrophoresis cell | Invitrogen | Xcell surelock electrophoresis cell | Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels |
| power supply | Biorad | PowerPac HC | Other power supplies can be used |
| 1x Transfer buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl, glycine, methanol | |
| Transfer cell | Biorad | mini trans-blot cell | Other transfer cells can be used |
| Immobilon- P membranes (PVDF) | millipore | IPVH 304F0 | |
| non-fat milk | thrive | 813503015095 | |
| Tris buffered saline with tween (TBST) | common buffer | recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20 | |
| Chemiluminescent Detection Reagent | Cytoskeleton Inc. | CLRA/CLRB | |
| Cell growth and treatment | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum | ATLAS | F-0500-A | |
| Epidermal growth factor | Cytoskeleton Inc. | CN02-A | |
| 150 mm cell culture plates | Corning | 430599 |
References
- Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
- Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Res. 26 (4), 399-422 (2016).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Hunter, T. The genesis of tyrosine phosphorylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (5), 1-15 (2014).
- International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431 (7011), 931-945 (2004).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 8 (1), 33-41 (2004).
- Pellegrino, S., Altmeyer, M. Interplay between Ubiquitin, SUMO, and Poly(ADP-Ribose) in the Cellular Response to Genotoxic Stress. Front Genet. 7 (63), 1-8 (2016).
- Liddy, K. A., White, M. Y., Cordwell, S. J. Functional decorations: post-translational modifications and heart disease delineated by targeted proteomics. Genome Med. 5 (2), 20 (2013).
- Margolin, D. H., Kousi, M., Chan, Y. M., Lim, E. T., Schmahmann, J. D., Hadjivassiliou, M., Hall, J. E., Adam, I., Dwyer, A., Plummer, L., et al. Ataxia, dementia, and hypogonadotropism caused by disordered ubiquitination. N Engl J Med. 368 (21), 1992-2003 (2013).
- Droescher, M., Chaugule, V. K., Pichler, A. SUMO rules: regulatory concepts and their implication in neurologic functions. Neuromolecular Med. 15 (4), 639-660 (2013).
- Anbalagan, M., Huderson, B., Murphy, L., Rowan, B. G. Post-translational modifications of nuclear receptors and human disease. Nucl Recept Signal. 10 (e001), 1-13 (2012).
- Kim, M. Y., Bae, J. S., Kim, T. H., Park, J. M., Ahn, Y. H. Role of transcription factor modifications in the pathogenesis of insulin resistance. Exp Diabetes Res. 2012 (716425), 1-16 (2012).
- West, A. C., Johnstone, R. W. New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment. J Clin Invest. 124 (1), 30-39 (2014).
- Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. Am J Transl Res. 3 (2), 166-179 (2011).
- Gu, B., Zhu, W. G. Surf the post-translational modification network of p53 regulation. Int J Biol Sci. 8 (5), 672-684 (2012).
- Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. J Cell Biol. 206 (4), 461-472 (2014).
- Nguyen, L. K., Kolch, W., Kholodenko, B. N. When ubiquitination meets phosphorylation: a systems biology perspective of EGFR/MAPK signalling. Cell Commun Signal. 11 (52), 1-15 (2013).
- Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Mol Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
- Butler, P. L., Staruschenko, A., Snyder, P. M. Acetylation stimulates the epithelial sodium channel by reducing its ubiquitination and degradation. J Biol Chem. 290 (20), 12497-12503 (2015).
- Wang, Y., Wang, Y., Zhang, H., Gao, Y., Huang, C., Zhou, A., Zhou, Y., Li, Y. Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation. Mol Biol Cell. 27 (2), 410-420 (2016).
- Guo, Z., Kanjanapangka, J., Liu, N., Liu, S., Liu, C., Wu, Z., Wang, Y., Loh, T., Kowolik, C., Jamsen, J., et al. Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell-cycle progression. Mol Cell. 47 (3), 444-456 (2012).
- Cui, W., Sun, M., Zhang, S., Shen, X., Galeva, N., Williams, T. D., Staudinger, J. L. A SUMO-acetyl switch in PXR biology. Biochim Biophys Acta. 1859 (9), 1170-1182 (2016).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
- Siuti, N., Kelleher, N. L. Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry. Nat Methods. 4 (10), 817-821 (2007).
- Mischerikow, N., Heck, A. J. Targeted large-scale analysis of protein acetylation. Proteomics. 11 (4), 571-589 (2011).
- Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nat Protoc. 9 (4), 896-909 (2014).
- Emmerich, C. H., Cohen, P. Optimising methods for the preservation, capture and identification of ubiquitin chains and ubiquitylated proteins by immunoblotting. Biochem Biophys Res Commun. 466 (1), 1-14 (2015).
- Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of proteins: the importance of lysis buffer choice. Methods Mol Biol. 1312, 49-60 (2015).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods Enzymol. 463, 285-303 (2009).
- Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton. Neoplasia. 19 (4), 346-353 (2017).
- Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. A simple toolset to identify endogenous post-translational modifications for a target protein: a snapshot of the EGFR signaling pathway. Biosci Rep. 37 (4), 1-14 (2017).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Li, C. L., Sathyamurthy, A., Oldenborg, A., Tank, D., Ramanan, N. SRF phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 promotes axon growth in hippocampal neurons. J Neurosci. 34 (11), 4027-4042 (2014).
- Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
- Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
- Lim, S. O., Li, C. W., Xia, W., Cha, J. H., Chan, L. C., Wu, Y., Chang, S. S., Lin, W. C., Hsu, J. M., Hsu, Y. H., et al. Deubiquitination and Stabilization of PD-L1 by CSN5. Cancer Cell. 30 (6), 925-939 (2016).
- Wu, R., Haas, W., Dephoure, N., Huttlin, E. L., Zhai, B., Sowa, M. E., Gygi, S. P. A large-scale method to measure absolute protein phosphorylation stoichiometries. Nat Methods. 8 (8), 677-683 (2011).
- Ordureau, A., Munch, C., Harper, J. W. Quantifying ubiquitin signaling. Mol Cell. 58 (4), 660-676 (2015).
- Lefebvre, T., Ferreira, S., Dupont-Wallois, L., Bussiere, T., Dupire, M. J., Delacourte, A., Michalski, J. C., Caillet-Boudin, M. L. Evidence of a balance between phosphorylation and O-GlcNAc glycosylation of Tau proteins--a role in nuclear localization. Biochim Biophys Acta. 1619 (2), 167-176 (2003).
- Wang, X., Li, D., Wu, G., Bazer, F. W. Functional Roles of Fructose: Crosstalk between O-Linked Glycosylation and Phosphorylation of Akt-TSC2-MTOR Cell Signaling Cascade in Ovine Trophectoderm Cells. Biol Reprod. 9 (5), 1-17 (2016).
- Levkowitz, G., Waterman, H., Zamir, E., Kam, Z., Oved, S., Langdon, W. Y., Beguinot, L., Geiger, B., Yarden, Y. c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor. Genes Dev. 12 (23), 3663-3674 (1998).
- Luo, H. B., Xia, Y. Y., Shu, X. J., Liu, Z. C., Feng, Y., Liu, X. H., Yu, G., Yin, G., Xiong, Y. S., Zeng, K., et al. SUMOylation at K340 inhibits tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (46), 16586-16591 (2014).
