Summary
在这里 , 我们描述了一种使用高通量 rna 干扰筛选的协议 , 以发现宿主目标可以作来增强溶瘤病毒治疗 , 特别是 rhabodvirus 和痘苗病毒治疗 , 但它可以很容易地适应其他溶瘤病毒平台或发现宿主基因, 通常调制病毒复制。
Abstract
高通量全基因组 rna 干扰 (RNA 干涉) 筛选技术已被广泛用于发现影响病毒复制的宿主因素。在这里, 我们提出了这项技术的应用, 以揭露宿主目标, 专门调节复制的马拉巴病毒, 溶瘤 rhabdovirus, 和痘苗病毒的目的是加强治疗。虽然该协议已测试用于溶瘤马拉巴病毒和溶瘤痘苗病毒, 这种方法适用于其他溶瘤病毒, 也可以用来确定主机目标, 调节病毒复制的哺乳动物细胞在秘书长.本议定书介绍了哺乳动物细胞高通量 rna 干扰筛查的研究进展和验证, 主要的考虑因素和准备步骤对进行一次高通量的 rna 干扰屏幕, 以及一步一步指南为进行一次高通量的 rna 干扰屏幕;此外, 它概括地概述了进行二次屏幕验证和三级验证研究的方法。高通量 rna 干扰筛选的好处是, 它允许一个人以一种广泛而无偏见的方式对病毒复制的任何方面进行分类, 这些因素可以开发出一种体外检测方法, 如传染性、爆裂大小、和细胞毒性。它有能力揭露 biotherapeutic 的目标, 根据目前的知识。
Introduction
高通量全基因组 rna 检测已被证明是一个宝贵的工具, 以揭示生物洞察力在不同的研究领域, 包括病毒生物学。在过去的十年左右, 许多团体进行了基于细胞的大规模 rna 干扰筛查, 以广泛识别调节病毒复制的宿主基因 (在1,2,3,4,5,6, 7). 有趣的是, 大量的这些屏幕已经进行了癌症细胞和一些病毒, 目前溶瘤病毒候选包括痘苗病毒 8, 9, 10, 粘液瘤病毒11, 单纯疱疹病毒12, 水泡口炎病毒13,14和马拉巴病毒15。虽然大多数研究的重点是确定影响病毒复制的某些方面的宿主因素, 而不是确定增强溶瘤病毒治疗的 biotherapeutic 目标, 但有价值的数据可以从这些数据集中挖掘出来。这方面。很明显 , 确定可纵以加强溶瘤病毒治疗的宿主目标的强大潜力尚未得到充分利用。
目前, 大量的溶瘤病毒平台在临床前和临床研究中被测试, 其中包括单纯疱疹病毒、呼肠病毒和痘苗病毒, 这些都在后期试验中取得了明显的成功。对于大多数的这些平台, 已经致力于改变病毒基因组, 以加强治疗。例如, 为了增加肿瘤特异性, 特定的病毒基因已被删除或变异, 以显著限制病毒复制在正常细胞, 但不是在肿瘤细胞。在某些情况下, 转基因已被添加如 GM-脑脊液 (粒细胞巨噬素集落刺激因子), 以事实免疫应答或 NIS (碘化钠转运体), 使体内成像和细胞 radioiodide 吸收治疗目的.然而, 很少有工作专注于操纵宿主/肿瘤基因和探索宿主/肿瘤基因对溶瘤病毒复制的影响。随着高通量筛选技术的出现, 现在可以在基因组范围内探测宿主病毒相互作用, 并破译操作宿主基因组以增强溶瘤病毒治疗的机会 (16, 17,18)。
我们报告的第一项研究表明, 使用高通量基因筛选的概念证明, 以确定宿主目标, 可以操纵, 以加强溶瘤病毒治疗。为了发现调节马拉巴病毒裂癌的宿主基因, 该溶瘤 rhabdovirus 目前正在第一阶段和第二期试验中进行测试, 我们在三种不同的肿瘤细胞系中进行了全基因组 rna 检测, 并与 siRNA (短干扰 RNA) 重复。图书馆目标18120基因15。通过对筛查发现的通路进行分析, 揭示了 ER (内质网) 应力响应通路的富集。我们在这些路径中选择了10次命中, 以便使用 siRNA 与主屏幕中不同的目标序列进行二级验证。作为三级验证的一部分, 我们进行了 IRE1α (肌醇要求酶1α) 的抢救实验, 以确认命中目标。体外和体内使用 IRE1α的小分子抑制剂进行测试, 从而显著提高了溶瘤的功效。
Workenhe et 。12还使用一个聚集的慢病毒载体 shRNA (短发夹 RNA) 库对16056个基因进行了全基因组的 rna 干扰筛查, 以确定限制人疱疹病毒1型 (HSV-1) 突变体 KM100-mediated 裂癌的宿主因素癌细胞。在主屏幕上, 他们确定了343个基因的击倒, 导致 KM100-infected 细胞对模拟感染细胞的细胞毒性增强;他们选择了24这些基因进行二次验证。在24种基因中, 有8个基因在二次筛中被证实, 其中之一是 SRSF2 (丝氨酸/精氨酸-富含剪接因子 2), 随后在三级验证中使用基因抢救实验证实。该小组接着确定了一种 DNA 拓扑异构酶抑制剂化疗, 减少了 SRSF2 的磷酸化, 并表明 HSV-1 KM100 与此抑制剂的联合治疗导致了吐蕃肿瘤小鼠的延长生存。
在上述研究中, 遵循了类似的工作流程。每一个都是从一个主要的全基因组的 rna 干扰屏幕开始, 其次是在主屏幕上确定的点击次数中的辅助屏幕。其次是三级验证研究, 其中包括确认命中是在目标通过执行基因抢救实验在体外通过操纵目标基因产品在体内进行最终验证。在本文中, 我们首先提供了一个用于开发和验证高通量 siRNA 筛选试验的通用协议, 它涉及确定最佳转染条件、病毒数量和感染长度。我们还提供了一个详细的协议, 用于进行一个主要的高通量 siRNA 屏幕, 以及对执行次屏幕验证和三级验证的方法的总体描述。
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Protocol
1. 高通量 siRNA 筛选试验的开发和验证
注: 对于所有实验, 请使用适合每个单元格线的 Hepes 缓冲生长介质。有关从分析优化到第三级验证的工作流概述, 请参见图 1 。
- 最佳转染条件的确定
- 选择肿瘤细胞系或理想的多肿瘤细胞系以优化转染条件 (例如786 O、NCI-H226、SF268、U373、OVCAR-8、U20S; 有关单元格线选择的更多内容, 请参阅讨论)。
- 选择转染试剂或多个测试。可能有必要测试几种转染试剂, 因为有些可能比某一特定细胞系中的其他有毒或效率更高。此外, 请记住, 一些可能会影响病毒感染或可能产生高背景信号后, 成像。
- 确定阳性 [e. g. siRNA 靶向保良局朱正贤-1 (马球样激酶 1) mRNA, 它诱导细胞死亡] 和负转染控制(例如非靶向 siRNA)。
- 按照反向转染协议的特定转染试剂, 但改变转染试剂 (例如0.05, 0.1, 0.15 和 0.2 ul/油井) 和细胞播种密度 (例如625, 1250, 2500 细胞/井) 的数量。包括以下条件的复制: 未经处理的细胞, 模拟转染的细胞 (即细胞加转染试剂), 以及用正向和负向染化控制 siRNA 的细胞 (见图 2A的样本板布局)。
- 一般来说, 准备80毫微米稀释每 siRNA 为最后的集中在10毫微米 (取决于图书馆, 可能需要更高的集中 siRNA)。除另有规定外, 用转染试剂稀释剂稀释 siRNA。制备转染试剂的稀释。
- 吸管 5 ul siRNA 每井跟随 5 ul 稀释转染试剂。为了促进这一步骤, 沿一列的 U 底部96井板, siRNA 混合和 siRNA 稀释剂单独 (为未经处理和模拟转染细胞)。单独分布在第二柱上, 稀释转染试剂和转染试剂稀释剂 (用于未经处理的细胞)。
- 使用电子吸管, 吸管 5 ul/井的第一列的内容, 其中包含 siRNA 或 siRNA 稀释剂进入相应井的384井板后 5 ul/井稀释转染试剂或转染试剂稀释剂从第二列。
- 将板材在室温下离心 1026 x g 1 分钟, 并在为转染试剂规定的时间内孵化 (例如5-20 分钟)。
- 当板块孵化时, 准备不同密度的细胞悬浮液。吸管 30 ul 的细胞悬浮每井。在把盘子放进孵化器之前, 让盘子在室温下坐45-60 分钟, 以使细胞的均匀沉降为19。
注: 如果 siRNA 的转染试剂的潜伏期短, 则在孵化前准备细胞悬浮液。 - 孵化48到72小时取决于所需的击倒长度为屏幕选择。
- 准备一个固定和染色解决方案, 包括甲醛, 赫斯特33342和 PBS (磷酸盐缓冲盐水) 的最终浓度在每个井4% 甲醛和5微克/毫升的赫斯特33342。如有需要, 请尝试更高 (例如7.5 ug/ml) 或较低浓度 (例如2 ug/ml) 的赫斯特, 如果信号太弱或太强, 则分别。
- 将固定和染色溶液的 30 ul 直接分配到所有井中。在37摄氏度孵育30分钟的盘子。把盘子存放在4摄氏度。如果使用非共焦显微镜, 用平板垫圈清洗平板;在大多数情况下, 在使用共焦显微镜时, 洗涤是不必要的。
- 开发一个脚本来量化每个井的单元数。
注意: 有几个软件套件可用于这一目的, 虽然它们各自可能有不同的生成脚本的方式, 但它们通常都有一种方法来识别原子核、单元和感兴趣的区域以及计算强度和形态学性质。在开发筛选脚本时, 重要的是要考虑每板运行脚本所需的时间, 也许只包括必要的度量, 以最小化处理时间。例如, 要量化细胞数, 你可以计算出比指定强度高得多的赫斯特面积;为了量化病毒的传播, 你可以计算出 GFP (绿色荧光蛋白) 的面积高于指定的强度。"精简" 脚本将需要与更复杂的脚本进行比较, 以确保没有丢失基本信息。 - 分析结果以确定最佳转染条件, 即转染试剂量和细胞播种密度, 导致显著细胞死亡 (0-30% 细胞存活), 对细胞毒性最小 (例如90-100%细胞生存)。注意: 在细胞系中观察细胞死亡表型的时间长倍, 可能需要较长的时间。有关具有代表性的结果, 请参见图 2B和2C 。另外, 确保转染非靶向 siRNA 的细胞在固定时间大约为90-100% 汇合, 稍后你会想感染这种融合的细胞。
- 病毒最佳数量和感染长度的测定
- 执行与上文所述相同的反向转染步骤 (见1.1.4.1 到 1.1.4.4);但是, 仅使用最佳转染条件 (参见 1.1.8) (例如用于 786 O 细胞: 1500 个细胞/井和 0.05 ul/RNAiMAX), 此外, 还包括额外的水井感染病毒 [例如水井与未经处理的细胞, 模拟转染的细胞, 转染非靶向 siRNA 的细胞, 以及转染阳性病毒控制的细胞 (即siRNA 以抑制或增强复制为目标的宿主基因)]。
- 有关示例板布局, 请参见图 3A 。孵育48-72 小时。
- 使用溶瘤病毒感染额外的病毒水井, 表达荧光报告蛋白 (例如 GFP), 多样性感染范围 (mois 》杂志 ) (例如0.001 到 10;选择的范围将取决于细胞系的电阻或易感性程度。也包括未感染的水井。吸管 40 ul 每个病毒稀释每井为 80 ul 的最后容量。在室温下, 离心机每片 400 x 克, 30 分钟。
- 继感染后, 图像细胞以高含量、自动显微镜固定间隔生活 (例如每4-8 小时)。请参阅图 3B 和 3C。
- 开发一个用于量化病毒传播的脚本 (例如每个井的 GFP 区域) (见 1.1.7)。分析图像并选择一个时间点和一个语言, 以便检测传播的增加和减少。确保时间点和教学语言在线性范围内, 以方便发现传播的小变化。估计给定时间点和语言的 z 因子 (或 z)。
注: 估计 Z 因子 = 1-3 (σp + σn)/| μp-μn|, 其中σp是阳性病毒控制的样本标准偏差, σn是阴性病毒的样本标准偏差控件;而μp是正则病毒控件的样本平均值, 以及负值控件的样本平均值的μn 。估计的 Z 因子 0.5-1.0 被认为是一个优秀的检测, 适合筛选20,21。 - 确认阴性病毒控制 siRNA 对病毒复制没有影响, 通过与模拟转染和未经处理的水井进行比较。通常需要测试多个负控件, 因为某些负 siRNA 控件可能会影响病毒复制。
- 执行与上文所述相同的反向转染步骤 (见1.1.4.1 到 1.1.4.4);但是, 仅使用最佳转染条件 (参见 1.1.8) (例如用于 786 O 细胞: 1500 个细胞/井和 0.05 ul/RNAiMAX), 此外, 还包括额外的水井感染病毒 [例如水井与未经处理的细胞, 模拟转染的细胞, 转染非靶向 siRNA 的细胞, 以及转染阳性病毒控制的细胞 (即siRNA 以抑制或增强复制为目标的宿主基因)]。
- 高通量筛选试验的最终验证
- 重复步骤1.2.1 和1.2.2 以上, 但只有这一次感染细胞与最佳的语言。而不是实时成像, 修复和染色板 (如1.1.5 和 1.1.6) 在最佳的时间点 (见 1.2.4)。
- 图像的盘子。使用将用于屏幕的相同脚本分析结果 (请参见1.1.7 和 1.2.4)。确认转染条件 (即好的击倒在转染的井中, 在反向转染控制的井中, 对其进行了负向染控和最小毒性)。估计 Z 因子以确定检测的鲁棒性 (见 1.2.4)。
- 进行高通量筛选的进一步测试和考虑因素
- 测试微量滴定板的耐久性, 因为有些板块在离心过程中可能会开裂, 特别是当盖子被保留, 并且同时离心多个盘子时。为了减少开裂, 离心机没有盖子 (如果有密封板), 或减少每桶离心板的数量。
- 测试转染试剂组合在一段时间内的稳定性。一旦将转染试剂添加到板材中, 在添加细胞之前可能有明显的延迟;因此, 了解转染试剂组合将保持有效的时间段是很重要的。对于屏幕, 可能需要提前准备细胞添加转染试剂混合到板材。
- 准备使用液体分配器。确定分配转染试剂、电池、病毒和修复程序所需的卷, 同时考虑到油管所持的体积、丢失的预配药量 (如果单位有此功能), 以及用于配药.
- 设置和测试将用于分配转染试剂、细胞和病毒的程序。为了尽量减少转染试剂的损耗, 如果可能, 请限制预置的数量。建立了液体分配器检定规程, 并对其精度和精度进行了测试。
- 制备转染试剂、细胞和病毒的散装配药
- 首先确定一个批次中要处理的板数, 考虑到可以同时 trypsinized 的单元格数量, 微量滴定板的数量, 可以立即离心, 处理一批的时间长短带液体分配器的盘子, 还有成像所需的时间。注: 一般情况下, 一次处理大约30个板材是相当可行的, 并且处理3批次板材在一天是可管理的。
- 对处理一组板材所需的转染试剂量进行实证检验。通过在一个板块上多次分配 5 ul 的蒸馏水来测试这个体积是否足够, 这相当于处理一个批次所需的次数。
- 为了保证细胞的均匀分布, 估计出在一组板块上分配细胞所需的时间。准备一个瓶子, 其中包含批次所需的单元格体积, 并在同一时间间隔内将单元格分成多个列, 并将其分配到批处理板上。测试需要多长时间来混合细胞, 以维持均匀分布的细胞。
- 为了确保病毒的均匀分布, 请重复上述相同的步骤 (见 1.4.4.3), 但这次将病毒分配到汇合井。如果病毒不均匀分布, 考虑准备在锥形管的病毒, 并涡流每管前配药。
- 跟踪单元格的增长以确定为屏幕增加足够的单元格的时间线。另外, 确定在日志阶段生长的单元格中每板块可以收获的平均单元数, 以便能够估计屏幕所需的数字。
- 高通量筛选的最后准备步骤
- 在开始筛查前一个月, 确定屏幕所需的所有材料。订购任何必需的试剂 (见材料)。确保所需的病毒数量在手边 (最好是使用在优化过程中使用的同一库存)。
- 在开始筛查前的两个星期内, 解冻和成长为屏幕所需的细胞。确保离心机和方形离心机桶的可用性。
- 在开始筛查前的一周内, 为反向转染和感染准备培养基瓶, 70% 乙醇、2X 转染试剂稀释剂 (例如2X 的最适内存), 如有必要 (如, 如果 siRNA 库被稀释在RNase 水, 一个将需要使用2X 到染细胞), 和整除数的病毒 (每一批板)。验证单元格的条件。
- 准备赫斯特33342染色 (例如5 毫克/毫升) 的库存解决方案。准备一个平衡板, 如果一个将需要离心。
- 确保板垫圈工作正常, 如果将使用。确保液体分配器正确精确地校准和分配。另外, 确保在液体分配器上正确设置了程序。
2. 进行主高通量屏幕
注: 在开始进行干扰筛网之前, 微量滴定板 (例如384井板) 需要与 siRNA 库和筛选控件一起排列.以下步骤最好由两个人 (即人 A) 进行, 主要负责将转染试剂和电池在盘子上配药, 第二人称 (即B) 负责离心在转染和准备细胞之前立即将其印上。括号中包含的一些细节用于处理一组33个板 (即库的一半) 与 786 O 单元格线。
- 反向转染的准备
- 人 A: 放置足够的媒介, 胰蛋白酶和 PBS 需要处理一批次板材在37°c 水浴。可选: 胰蛋白酶处理一个单元格, 并计算每个板块的单元数, 以提供对每批所需的板数的实时估计。
- 从冷冻柜中获得一批板材 (例如33 版), 等待20-30 分钟, 使板材解冻。当板块解冻时, 请继续执行以下步骤。
- 人 A: 吸管成50毫升圆锥管处理一批板材所需的转染试剂稀释剂 (例如2 x 37.125 毫升), 并将它们放在37摄氏度的水浴中。用70% 乙醇 (例如250-500 毫升瓶) 填充两个瓶子。用 PBS 和蒸馏水填充两个50毫升锥形管。
- 人 A: 将液体分配器的油管浸入一瓶70% 乙醇中。如果所有的提示将不用于配药转染试剂 (如, 如果没有使用板的外部水井), 首先分离不必要的油管。在油管周围放置一块遮罩胶带, 以标明以下点, 油管可以被认为是无菌的。质数与大约25毫升。将额外的乙醇倒入瓶子中以取代丢失的体积。让油管在乙醇中坐至少5分钟。
- 人 B: 准备胰蛋白酶处理细胞。用70% 乙醇喷雾组织培养 (TC) 罩。喷雾和放置必要的滴管, 小贴士, 瓶子和离心管, 以准备细胞在引擎盖 (见2.2.1.1 和 2.2.1.2)。在室温下将 1026 x g 的密封板离心成2分钟。从 TC 罩中的盘子中取下盖子, 如果先前确定在将盖子放在上面时, 盘子可能会开裂 (见 1.4.1)。
- 人 A: 从盘子里取下封条。在清除密封件之前、期间或之后 (取决于所需的孵化时间), 吸管所需量的转染试剂 (例如375 ul/管, 最终集中 0.05 ul 的 RNAiMAX/井) 进入锥形管含有预热转染试剂稀释剂 (例如37.125 毫升/管)。
- 混合吹打上下10次。在室温下孵化被使用的转染试剂所规定的时间 (例如0-10 分钟)。
- 反向转染
- 让人 B 完成以下任务。
- 开始 trypsinizing 单元格 (例如3 个 786 O 型电池板)。从每个盘子中抽出介质。用9毫升的 PBS 冲洗。吸管每片3毫升的胰蛋白酶。孵育在37°c 大约5分钟并用重悬细胞与22毫升的媒介。吸管10次。
- 将细胞悬浮液从每个组织培养板组合成无菌瓶。通过反转来混合细胞悬浮液。吸管1毫升整除数细胞悬浮成两个独立的离心管。从每个离心管中取出一个样本, 并计算这些单元格数。计算所需密度所需的细胞悬浮量 (例如1500 细胞/井), 并准备足够的稀释细胞悬浮 (例如500 毫升), 以免除一组板块。
- 与人 B 并行完成以下任务。
- 将乙醇的液体分配器管清空。主要油管与大约25毫升 PBS, 然后清空油管。在处理油管时要小心, 以确保将浸入转染试剂中的屏蔽胶带下面的油管部分保持不育。设置分离板, 可以安全地做一个锥形管转染试剂溶液。
- 吸管转染试剂溶液上下10次。用转染试剂溶液将油管进行质数。为了尽量减少转染试剂的损失, 素数只用足够的溶液就能勉强清除小费。在液体分配器上选择正确的程序, 每井分配 5 ul 的转染试剂。
注意: 密切监控转染试剂的水平, 使其在耗尽前得到补充。完成的板块分开, 应该提供一个提示, 添加更多的转染试剂解决方案。 - 在室温下将 1026 x g 的板材离心为1分钟。这一次盖子将上, 因此可能有必要在一次离心较少板材防止开裂 (例如每桶2个板材)。在室温下孵化出被使用的转染试剂所规定的时间 (例如10-20 分钟)。
- 在孵化过程中, 清空转染试剂溶液的导管, 并将其放入一个包含 PBS 的全50毫升锥形管中。用大约25毫升的 PBS 冲洗油管, 通过启动和排空。
- 如果更多的提示将用于配药细胞比用于配药转染试剂, 重新连接未使用的油管, 并重新消毒所有油管与70% 乙醇, 然后冲洗油管与 PBS (见 2.1.2.2)。
- 将含有电池悬浮液的瓶子混合, 一旦准备好。将油管放置在细胞悬浮液中, 并将其放到足够的位置, 以确保每个尖端都正确分配。分配 30 ul 每井的细胞悬浮在所有板块。如有必要, 应定期将细胞悬浮液混合, 以避免沉降。
注意: 有时含有介质的悬浮液会粘在尖端的两侧。当观察到这种情况时, 应尽快吸吸或用70% 乙醇浸泡的无皮棉组织擦拭。 - 清空细胞悬浮管。用大约25毫升的 PBS 冲洗油管, 然后约50毫升蒸馏水。
- 在将盘子退回到孵化器之前, 允许盘子在室温下从细胞播种的时间里坐45-60 分钟。在未受干扰的孵化器中孵化出所需的基因沉默长度 (例如48 h) (见 1.1.4.5)。
- 让人 B 完成以下任务。
- 感染
- 为了节省时间, 在感染细胞之前的前一天, 吸管成无菌瓶, 需要大量的介质来感染包括未感染水井的介质 (例如2 x 350 毫升和 2 x 50 毫升33版)。此外, 测试液体分配器的精度和准确性, 并在必要时重新校准。
- 将介质加热37摄氏度。将两瓶70% 乙醇, 两个50毫升圆锥管与 PBS 和一个与蒸馏水。验证离心机是否在室温下。
- 用70% 乙醇消毒油管, 用 PBS 冲洗, 如前所述 (见2.1.2.2 和 2.2.2.1)。当油管坐在乙醇, 吸管的确切数量的病毒所需的瓶子中包含的媒体以前准备感染 (见 2.3.1)。用25毫升的启动, 然后排空, 用 PBS 冲洗油管。
- 把盘子从孵化器中取出, 放到 TC 罩里。将油管与介质一起使用。将 40 ul 的媒体分发到未感染的控制井中。清空介质导管, 用25毫升 PBS 冲洗。(请参阅2.2.2.5 的警告)
- 混合病毒后, 将油管放入含有病毒的瓶子中。在盘子上分配 40 ul 的病毒。在室温下将板材离心30分钟, 400 x 克。把盘子还给孵化器。为先前确定的时间长度 (例如24 h) 孵化板块 (见 1.2.4)。
- 固定和染色细胞
- 为节省时间, 在修复前的前一天, 准备一瓶固定和染色溶液, 其中含有甲醛和 pbs (例如179 毫升37% 甲醛和270毫升的 pbs 为最终浓度为4% 甲醛) 为每批板材, 但省略了赫斯特染色。存放在易燃的橱柜远离光线。
- 用70% 乙醇和 PBS 冲洗油管, 如前所述 (见2.1.2.2 和 2.2.2.1)。将所需的赫斯特 (e. g) 添加到2.5 毫升的5毫克/毫升的赫斯特中, 最终集中在7.5 微克/毫升的井中, 以达到固定和染色溶液的混合。
- 在所有板块上分配 30 ul 的固定和染色溶液。把盘子放在孵化器里30分钟。孵化后, 将密封件应用到板材上, 并将印版保存在4°c 保护下免受光照。必要时洗盘子 (见 1.1.6)。
- 成像和图像分析
- 用一个自动化的, 高含量的显微镜来成像盘子。使用以前确定的设置, 但首先测试设置, 以确保不需要进行任何调整。
- 使用以前开发的脚本量化 GFP (或其他荧光记者) 区域和赫斯特区域 (见 1.3.2)。先用一小部分板测试脚本, 以确定在批分析所有板块之前是否需要进行任何细微的修改。
- 识别命中。注: 鲁棒 Z 分数/MAD (中位绝对偏差) 方法是通常用于此目的的方法。通常, 分数 > 2 或 <-2 被设置为切断。当 siRNA 样本随机分布在板上而不是按函数分组时, 最好使用此方法, 因为示例被用作事实上的负控件。过滤出细胞毒性 siRNAS, 因为这些将被期望非特别减少病毒传播 (参见讨论进一步细节过滤出细胞毒命中)。
3. 对与真相与和解委员会 (rna 干扰联盟) shRNA 图书馆的命中进行二次屏幕验证
注: 有关选择二次验证和可能的筛选技术的命中的详细信息, 请参阅讨论。如果选择 siRNA 技术进行二次验证, 则可以使用与主屏幕相同的检测开发和验证协议 (见 1)。
- 获得一个自定义的真相与和解委员会 shRNA 图书馆针对的候选基因的兴趣作为甘油股票。
- 从甘油库存中制备转染质粒 DNA。注: 详细的协议 (即"shRNA/sgRNA/ORF 甘油和质粒 DNA 制剂") 可以在这里找到: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols。
- 产生慢病毒表达 shRNA 靶向基因的兴趣与 DNA 质粒。注:96 井板慢病毒北疆生产的详细协议[即 shRNA/sgRNA/ORF 高通量病毒生产 (96 井)] 在这里可以找到: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols。
- 用慢病毒感染细胞。注: 在 http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download？dirpath=protocols/production & filename=TRC%20viral 在线上可获得96井板 (即"慢病毒载体感染") 中慢病毒载体感染的详细协议%20infection%20200909. pdf。
- 感染溶瘤病毒的细胞, 无论是以下嘌呤霉素选择 (见3.4 为选择协议) 成功转基因细胞或紧接转导 (没有嘌呤霉素选择)。要确定病毒的最佳数量和与病毒一起孵化的时间长度, 请使用与主屏幕相同的方法。
4. 三级验证
注意: 三级验证的目的是主要确认命中目标, 肿瘤特异性, 并增强效能在体内.你也可以测试它是否调节传播跨一系列肿瘤细胞系
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确认候选基因的击倒在目标上
- 首先确认表型与基因沉默之间存在相关性。使用为屏幕开发的相同的检测方法, 或对其进行6井格式的修改以评估更大格式的传播的增强或抑制。进行一个时间-路线与转染的细胞 siRNA 目标的基因 (s) 的兴趣加和减号病毒。
- 对含有病毒感染细胞的水井进行图像采集, 并在正常时间间隔内从未感染的水井中收集细胞裂解物。确定基因沉默与增强或抑制传播之间是否存在相关性。通过定量聚合酶链反应 (qPCR) 和/或西方印迹评估基因沉默。
- 进行基因抢救实验以确认命中目标。注: 在一个典型的抢救实验中, 候选基因被击倒与 rna 干扰, 同时细胞被转染瞬时与抗干扰 cDNA (例如直系同源基因) 表达候选基因确定是否基因表型恢复或 "获救"。稳定的细胞系 overexpressing 对候选基因感兴趣的 rna 抗干扰 cDNA 也可以使用。
- 或者, 代替基因拯救实验, 使用多种正交检测来确认命中是在目标上 [例如确定在目标基因的击倒时是否获得了相同的表型, 而多 siRNAs目标基因在多个稳定细胞系表达 shRNA 对靶基因, 并在淘汰赛与 CRISPR (聚集定期 interspaced 短回文重复)-Cas9 技术在多个细胞系。
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确认命中是肿瘤特异性的, 并调节传播跨一系列肿瘤细胞系
- 在4.1.1 中进行类似的化验, 但与正常细胞以及其他肿瘤细胞株进行相似的检测。
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确认候选基因的操纵增强了功效在体内
注: 下面描述的是三种可能的方法来操纵基因靶在体内。- 找到一种药物来操纵基因靶。如果有一种药物, 如小分子抑制剂, 针对同一基因, 管理它与溶瘤病毒在体内。确定用药的最佳时机是很重要的。
- 根据一个人是否想要抑制或增强基因目标, 对病毒进行抑制或过度表达 tshr 基因靶的设计。为了抑制基因, 工程师溶瘤病毒表达显性阴性的基因或表达 shRNA 靶向基因。为了提高基因靶的表达, 克隆溶瘤病毒与转基因 overexpressing 的基因。
- 用 shRNA 或 CRISPR-Cas9 技术分别进行细胞系的基因击倒或敲出。植入工程细胞线和野生型细胞线在体内, 随后感染溶瘤病毒。注意: 这种方法是一种原则证明, 可以帮助确定是否投入额外的时间和资源来开发一种药物来操纵基因在体内, 例如, 是值得的。
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Representative Results
在图 1中介绍了用于识别宿主目标以增强溶瘤病毒治疗的工作流的概述。
如图 1所示, 进行高通量干扰屏幕的关键第一步是检测开发。图 2A提供了用于转染优化分析的样板布局。图 2B由预期结果的代表性图像组成,图 2C是预期结果的代表性图。继 siRNA 击倒 PLK-1, 一个基因, 诱发细胞死亡, 并可作为一个积极的控制, 以监测 siRNA 的效率, 人们预计细胞存活率在0-30% 之间, 除非细胞线有一个长倍的时间, 在这种情况下, 它将采取 longer 观察细胞死亡表型。非靶向 siRNA 也应对与未处理细胞具有相似生存性的细胞毒性最小。
检测发展的另一个关键因素是确定感染细胞的方法和感染的时间长短。图 3A提供了一个用于确定病毒数量和与病毒一起孵化的时间的样本板布局。图 3B描述了在各种 mois 》杂志中, 786 O 细胞感染 vvDD-eGFP (溶瘤痘苗病毒, 表达增强 GFP 与胸苷激酶和痘苗生长因子基因删除) 的实时过程的结果。图 3C中显示了在0.05 语言中感染 vvDD-eGFP 细胞的代表性图像。根据在图 3B中绘制的结果, 可以选择0.05 的教学语言和21小时的感染长度, 因为这将使检测到传播的增加和减少, 因为这个时间点在一个线性范围内, 估计的 Z 因子在这个 ti我指的是0.6 的人, 增加和减少蔓延的群体。作为验证这一检测的一部分, 你将需要修复这个语言和时间点的细胞, 并计算 Z 因子。
在描述的协议之后, 我们在三个不同的肿瘤细胞系 (例如OVCAR-8、U373、NCI-H226) 上进行了全基因组的 rna 干扰筛, 并与 siRNA 库靶向18120基因15进行了重复。使用 MAD 方法, 我们确定了3个癌细胞线中至少2个共有1008个命中 (图 4A)。在屏幕上发现的命中的通路分析显示, 对普遍定期审议 (展开蛋白反应) 和 ERAD (内质网相关蛋白降解) 途径的成员富集 (图 4A)。我们在这些路径中选择了10次命中, 以便使用 siRNA 与主屏幕中的不同目标序列 (图 4B) 进行辅助验证。作为三级验证的一部分, 我们进行了 IRE1α和 ATF6α (激活转录因子 6 alpha) 的基因拯救实验, 以确认这些命中目标 (图 4C)。
图 1: 用于确定宿主目标以增强溶瘤病毒治疗的工作流示意图。第一步是开发和验证高通量 rna 干扰筛选的检测方法, 包括优化转染条件, 将 siRNA 引入细胞, 确定最佳病毒数量 (即语言) 以感染细胞和与病毒孵育的长度。第二步是进行高通量的全基因组屏幕。一个 siRNA 的图书馆针对整个基因组的基因在微量滴定板块上排列。然后用 siRNA 库反向转染单元格。经过48-72 小时的潜伏期, 以允许基因沉默, 细胞感染的最佳数量的病毒。在病毒孵化的最佳长度后, 细胞被固定和染色, 随后用高含量显微镜成像。随后的图像和数据分析将有助于确定显著调节病毒复制的基因, 这被称为 "命中"。对从主屏幕上选择命中的次验证屏幕通常使用 siRNA 或 shRNA 与不同的种子区域进行。进行三级验证实验, 以确认命中目标, 肿瘤特异性和增强功效在体内。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 高通量 rna 干扰筛选试验的转染条件优化。(a)用两个不同的单元格线优化转染条件的样本板布局。(B)具有 786 O 细胞 (1500 个细胞/井) 的代表性图像, 用转染试剂稀释剂单独 (即未处理) 染成了72小时的赫斯特 33342, 并与转染试剂和稀释液 (即模拟转染), 与非靶向 siRNA 和 siRNA 目标 PLK-1。(C)具有代表性的结果是转染优化实验显示, 22% 的存活细胞 PLK-1 siRNA (n=24) 和94% 的细胞存活, 而非靶向 siRNA (n=8)。误差条 = * SD, 标准偏差;刻度条 = 200 微米。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 用于高通量 rna 干扰筛选试验的病毒数量和孵化时间的测定.(A)用于优化病毒数量和病毒孵化时间的样本板布局。列1和24包含转染控制, 未感染。列2到23包含未经处理的细胞, 模拟转染的细胞和转染阳性和阴性病毒控制的细胞都感染了一系列的 mois 》杂志开始没有病毒的列2和3。(B) 786 O 细胞被反向转染为非靶向 siRNA, 孵化为48小时。他们随后感染了 vvDD-GFP 在 mois 》杂志表明和成像8小时间隔开始在5小时后感染 (hpi)。计算每个时间点 (n=12) 的平均 GFP 面积, 并绘制在图上。在点 A 和 B 之间计算的 z 因子为 0.6, 在点 B 和 C 之间计算的 z 因子为0.6。(C)代表在所指出的时间点上感染了0.05 语言的良好的现场图像。放大倍数, 10x;9个领域/井;刻度条 = 200 微米。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 全基因组屏幕将 ER 应力响应封锁确定为 Rhabdovirus 介导的裂癌的有效增敏剂。(A)维恩图概述了3肿瘤细胞系中高通量干扰筛网的重叠命中次数, 以及表 (+, 合成致死;-, 无交互) 和示意图 (按红色列出的命中), 说明了普遍定期审议和 ERAD 中的关键命中情况。途径.(B) EC50移位 (黑色条, 左 y 轴) 被确定为 U373 细胞治疗马拉巴病毒 (48 小时) 后治疗与 siRNA (72 h) 针对一系列普遍定期/ERAD 命中从屏幕上。siRNA 击倒 (72 小时) 后的每种基因的相对 mRNA 表达均以白色 (右 y 轴) 描述。(C)细胞生存能力检测在马拉巴病毒感染后进行48小时, U373 细胞 ectopically 表达小鼠 ATF6α (或控制 GFP) siRNA 靶向人类ATF6α (或非靶向 [NT] 控制; 左面板) 或人类 XBP1 (或控制) siRNA 瞄准人类的IRE1α (或控制; 右面板)。揭示了基因沉默和异位基因表达的西方印迹。EC50移位 = 杀死50% 细胞所需的病毒剂量的变化;错误条 = ±SD;XBP1 (s) = X 盒结合蛋白 1 (拼接);在 (B) 中, 执行单向 ANOVAs, 然后进行 Bonferroni 多比较的后点测试以导出 p 值;在 (C) 中, 对学生进行 t 检验以得出 p 值;* p < 0.05;#p < 0.05。(此数字已从茉莉et al修改, 201115)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们提出了一个使用高通量 rna 干扰筛选的协议, 以确定宿主目标, 可以操作, 以加强溶瘤病毒治疗。这已成功地通过溶瘤马拉巴病毒和溶瘤痘苗病毒进行了测试, 但是, 正如所指出的, 它可以适应其他溶瘤病毒或其他病毒的使用, 通常用于识别调节病毒复制的宿主基因。该筛选协议还旨在确定增加或减少传播的基因, 但它可以很容易地修改其他读数。例如, 我们的马拉巴病毒的屏幕被设计用来识别基因调制裂癌利用一个简单的刃天青的重要染料化验来评分细胞的生存能力 (参见图 4)15。在这些屏幕上, 随着病毒的孵化, 而不是固定细胞与甲醛和染色的赫斯特, 我们配发刃天青染料到每个井 (最终浓度20微克/毫升), 并在6小时孵化后, 我们测量吸收 (573 nm) 与平板阅读器。我们也可以使用基于赫斯特染色的细胞数作为读数。在这个屏幕上, 使用代理记者来监视病毒复制是不必要的, 一个带有报告蛋白的病毒, 特别是荧光蛋白, 可以促进屏幕优化, 例如, 监视病毒复制的实况;此外, 具有报告蛋白的病毒比使用抗体染色病毒抗原更不繁琐和昂贵, 但有可能筛查没有一个。此外, 还可以对该化验进行进一步的修改, 以调查影响传染性、爆裂大小的寄主因素, 甚至更详细的亚型, 如免疫细胞死亡。在每种情况下, 都将遵循类似的检测开发协议、筛选策略和二级和三级验证方法。
在该协议中, 我们建议优化转染条件理想的多肿瘤细胞系。优化多单元格线至少有两个原因。原因之一是, 并非每一个细胞线都适合高通量筛查, 因为有些可能很难染, 或者可能不太好, 但关键的原因是为了避免细胞内在的偏差, 需要多细胞系进行筛查。细胞系的选择在很大程度上取决于一个人的目标。你可以选择专注于某种特定的癌症类型, 或者选取不同的癌症类型来覆盖更广泛的光谱。或者 , 你可能希望把重点放在肿瘤细胞株上 , 抵抗识别宿主因子 , 这些因素可以纵 , 使肿瘤细胞株对溶瘤病毒感染的抵抗力降低。
除了选择细胞线, 选择阳性和阴性的病毒控制是一个重要考虑的任何屏幕。在某些情况下, 可能不知道或限制复制所需的病毒基因, 或者, 如果已知, 它们可能是特定于单元格的。因此, 我们仍然可以使用代理控制来确定检测的近似鲁棒性和动态范围。例如, 你可以使用未感染的细胞或细胞感染低的语言作为替代品的积极控制, 以确定基因, 减少蔓延后, 击倒。为了识别在击倒时增强传播的基因, 人们可以用稀释系列病毒感染细胞, 并使用最大信号的水井作为替代品阳性控制。
选择辅助屏幕验证的命中和要使用的技术类型是另一个需要仔细考虑的问题。候选者通常被选为基于命中幅度的二级屏幕验证, 关于它们是否显著调节多种癌细胞系的传播 (如果主要屏幕是在多个细胞线进行) 和生物兴趣。诸如 DAVID22、23、豹24、字符串25和 PINdb26等生物信息学工具可以帮助隔离路径和生物兴趣的命中。美世et 等。8描述了开放源码图像分析软件的使用, 并提供了一种用于可视化和分析命中的算法。在解释结果时要考虑的一个因素是, 基因沉默可能会产生不同的影响, 这取决于正在调查的病毒生命周期的阶段。例如, 在生命周期的早期对基因的击倒可能会抑制病毒复制, 而在稍后阶段击倒可能会增加复制。通常, 次要屏幕是进行与 siRNA 从不同的供应商不同的种子区域与多个 siRNAs 每个基因。然而, 针对候选基因的补充技术可以使用, 如 CRISPR-Cas9 或慢病毒北疆载体表达 shRNA。
分析方法也是一个重要的考虑因素。我们建议使用健壮的 Z 分数或疯狂的20,27建议的切断呼叫 > 2 或 <-2。根据焦点是消除更多的误报还是捕获更多的假底片, 可以增加或减少切割量。例如, 在最近的高通量屏幕中, 使用了痘苗病毒9, 较低的截止量设置为-1.5 (没有对上部切口进行描述, 因为重点是确定在击倒时扩散的基因是否减少)。还有其他方法可以使用, 包括 z 分数, SSMD (严格标准化的平均差), 和 B 评分20,28,29,30。手推车等.31比较由 sum 秩、MAD、z 分数和 SSMD 生成的命中列表, 并发现每个分析方法都导致不同的命中列表。在托托中, 没有完美的方法或中断。最终, 二次屏幕验证和三级验证研究将确认真正的命中。
还必须考虑滤除细胞毒性命中的方法。一种方法是在平行加号或减号病毒中进行主屏幕。这允许检测 siRNAs 的细胞毒性。这是我们的方法在我们的马拉巴病毒屏幕15;然而, 这并不经常是切实可行的。也许一个更实用的方法, 除了健壮, 是确定的命中是细胞毒性作为辅助屏幕验证的一部分, 特别是如果一个人的重点是确定命中减少复制后, 击倒。例如, 在整个基因组主屏幕与粘液瘤病毒, Teferi et al。11确定了在击倒时减少病毒复制的 1588 siRNAs。为筛选出细胞毒性 siRNAs, 他们进行了二次细胞毒性筛查这些 siRNAs;他们用刃天青细胞活力测定法测定细胞活性72小时后转染。细胞毒性 siRNAs 是根据1.96 的 Z 评分确定的。另一种方法是简单地从主要筛选数据中筛选出细胞毒性 siRNAs, 这是基于某种百分比的减少, 例如, 减少 > 50% 斯万et 。9, 或者基于特定的分数, 如李et 。14;在研究水泡性口炎病毒复制所需的宿主因素时, 他们排除了通过 > 3.0 标准偏差降低细胞活力的 siRNA 命中。根据细胞细胞核的赫斯特染色确定细胞的平均数量, 尽管没有明确说明, 平均每板的计算都是以每片为基础, 因为它清楚地表明, 平均 GFP 信号是以每个板块为依据的。
任何高通量的干扰屏幕的限制是频繁的高数量的误报和底片, 这可能是由于化验设计, 技术使用或通过系统的错误。例如, 蛋白质可能会显著地影响病毒的复制, 但由于蛋白质的半衰期, 由于检测设计的缘故, 基因沉默所选择的时间可能太短, 从而发现它的作用导致假阴性。确定不完全击倒和 siRNA 技术的非目标效应, 也可以引入假阳性和阴性。系统错误 (如边缘效果32) 也可能产生误导性的结果。在这里, 板块外井的信号可能系统地高于或低于板块的其余部分, 因为蒸发。有一些策略可以解决其中的一些问题, 例如: 减少 siRNA 的浓度以减少目标效果33, 重新配置板块布局, 用介质填充外部井, 以减轻边缘效应, 或使用已开发用于检测和反系统错误的计算方法, 如边缘效果32、34、35。处理误报的一般方法是在主屏幕后执行辅助屏幕。作为处理假底片的一种方法, 你可以放松打呼呼叫的截割, 并包括潜在的假底片进行二次筛查。当然, 这不会捕捉到低于截止值的假底片。主屏幕也应进行重复或三个, 以限制虚假结果。最终, 无论使用哪种策略, 高通量屏幕都不会详尽地识别所有真正的命中, 但它可以提供一个宝库, 其中一个很可能会挖掘出一些有价值的命中, 这些数据可以被大写。
在本协议中, 我们描述了阵列 siRNA 和 shRNA 技术的使用, 但另一种选择是使用汇集的 shRNA 和 CRISPR-Cas9 库。在 Workenhe et中使用了一个汇集的 shRNA 库。介绍中概述的12研究。汇集的 CRISPR-Cas9 技术已被用来进行基因组规模的屏幕, 以确定病毒复制所需的主机因素, 如 Zika 病毒36, 西尼罗河病毒37,38, 登革病毒39和肝炎C 病毒39。使用汇集库的好处是, 它们的购买成本较低, 不需要专门的基础结构 (例如液体处理设备、高含量显微镜和机器人设备), 也没有高成本的操作和维护这个基础设施, 他们需要更少的消耗品。缺点是读数的类型比较有限。在大多数情况下, 如果不是所有汇集库宿主病毒交互屏幕到目前为止, 读数是细胞的生存能力或缺乏;人们不能轻易地探索更复杂的表型。格式的选择取决于被问及的生物学问题。
在过去几十年中, 基因筛选技术的进步, 首先使细菌和酵母的屏幕, 现在人类细胞的基因组规模屏幕已经打开了门广泛的发现在不同的领域的研究。这些基因屏幕不仅让我们回答了基本的生物学问题, 而且给了我们解开发展和改善 biotherapeutics 的洞察力的钥匙。虽然仍有经验教训和要克服这一技术的挑战, 但迄今取得的成果令人振奋。随着新的筛选技术 (包括 CRISPR-Cas9 库、微流体和体内筛选技术) 的不断成熟, 这些发现可能会更大.
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了安大略省癌症研究研究所、加拿大创新基金会、渥太华区域癌症基金会和特里福克斯研究所的资助。K.J.A. 得到了加拿大 Vanier 研究生奖学金、加拿大卫生研究所硕士奖和安大略省研究生奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
| Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
| Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
| Water | Sigma | W4502 | |
| siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
| AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
| siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
| HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
| Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
| DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
| Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
| Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
| 500 ml bottles | Corning | 430282 | |
| Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
| Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
| BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
| BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
| Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
| KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
| Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
| JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
| Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
| Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |
References
- Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions? Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
- Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
- Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
- Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
- Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
- Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
- Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
- Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
- Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
- Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).
- Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
- Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
- Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
- Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
- Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
- Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
- Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
- Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
- Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
- Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
- Luc, P. -V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
- Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
- Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
- Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
- Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
- Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
- Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
- Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
- Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
- Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
- Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
