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Genetics

CRISPR/Cas9 के लिए Integrase-कमी Lentiviral वैक्टर के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल-विभाजन कोशिकाओं में मध्यस्थता जीन नॉकआउट

Published: December 12, 2017 doi: 10.3791/56915
Automatic Translation
1, 1
1Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine

Summary

हम कोशिकाओं को CRISPR/Cas9 पहुंचाने के लिए वाहनों के रूप में integrase की कमी lentiviral वैक्टर (IDLVs) की उत्पादन रणनीति का वर्णन । कोशिकाओं में त्वरित और मजबूत जीन संपादन मध्यस्थता करने की क्षमता के साथ, IDLVs integrase सक्षम वैक्टर की तुलना में जीन वितरण के लिए एक सुरक्षित और समान रूप से प्रभावी वेक्टर मंच मौजूद.

Abstract

Lentiviral वैक्टर जीन-संपादन घटकों के लिए उनकी क्षमता के कारण छुरा transducing कोशिकाओं की एक व्यापक रेंज के लिए और जीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर मध्यस्थता कोशिकाओं को देने के लिए एक आदर्श विकल्प हैं । हालांकि, उनके मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत करने की क्षमता mutagenicity के जोखिम को बढ़ाता है और इस तरह सुरक्षा चिंताओं को उठाती है और नैदानिक सेटिंग्स में उनके उपयोग की सीमा । इसके अलावा, इन एकीकरण-सक्षम lentiviral वैक्टर (ICLVs) द्वारा दिया जीन-संपादन घटकों की लगातार अभिव्यक्ति संकीर्ण जीन लक्ष्यीकरण की संभावना बढ़ जाती है । एक विकल्प के रूप में, integrase की कमी lentiviral वैक्टर (IDLVs) की एक नई पीढ़ी विकसित किया गया है कि इन चिंताओं के कई पते । यहां CRISPR के लिए एक नया और बेहतर IDLV मंच के उत्पादन प्रोटोकॉल-मध्यस्थता जीन संपादन और सूची में शामिल कदम शुद्धि और ऐसे वैक्टर की एकाग्रता में वर्णित है और उनके transduction और जीन संपादन क्षमता का उपयोग कर HEK-293T कक्षों का प्रदर्शन किया गया । इस प्रोटोकॉल को आसानी से स्केलेबल है और उच्च titer IDLVs है कि इन विट्रो में और vivo मेंtransducing कोशिकाओं में सक्षम है उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल आसानी से ICLVs के उत्पादन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

सटीक जीन संपादन प्रमुख जैव चिकित्सा अग्रिमों कि उपंयास रणनीतियों के विकास के आनुवंशिक रोगों से निपटने के लिए शामिल की आधारशिला रूपों । जीन संपादन प्रौद्योगिकियों के सबसे आगे में सीlustered आरegularly के उपयोग पर निर्भर विधि है-interspaced sप्र॰ palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 प्रणाली है कि शुरू में पहचान की गई थी वायरल आनुवंशिक सामग्री के आक्रमण के खिलाफ बैक्टीरियल प्रतिरक्षा के एक घटक के रूप में (संदर्भ1,2) में समीक्षा की । इस तरह के जस्ता के रूप में अंय जीन संपादन उपकरण, पर CRISPR/Cas9 प्रणाली का एक प्रमुख लाभ फिंगर nucleases (ZFNs) और प्रतिलेखन उत्प्रेरक-जैसे प्रभाव nucleases (TALENs) (संदर्भ में समीक्षित3), प्लाज्मिड डिजाइन के सापेक्ष सादगी है और CRISPR घटकों के निर्माण-एक विशेषता है कि एक बहुत व्यापक अनुसंधान समुदाय के लिए कुछ विशेष प्रयोगशालाओं से जीन संपादन के विस्तार संचालित है । इसके अतिरिक्त, CRISPR/Cas9 प्रोग्रामिंग की सादगी और मल्टीप्लेक्सीय लक्ष्य मांयता के लिए इसकी क्षमता को और अधिक प्रभावी और आसान करने के लिए उपयोग प्रौद्योगिकी के रूप में अपनी लोकप्रियता ईंधन है । विभिंन शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध तरीकों के अलावा ऐसी जीन कोशिकाओं को संपादन घटक देने के लिए, वायरल वैक्टर अब तक का सबसे लोकप्रिय और कुशल प्रणाली रहते हैं ।

Lentiviral वैक्टर (LVs) विविध अनुप्रयोगों4,5,6,7के लिए vivo में CRISPR/Cas9 प्रणाली के घटकों को वितरित करने के लिए पसंद के वाहन के रूप में उभरा है । कई प्रमुख विशेषताएं LVs इस प्रक्रिया के लिए एक लोकप्रिय विकल्प बनाने के लिए दोनों विभाजन और गैर विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित करने की क्षमता सहित, कम immunogenicity, और ंयूनतम सेलुलर विषाक्तता (संदर्भ में समीक्षा की8) । नतीजतन, एल. वी. मध्यस्थता जीन चिकित्सा संक्रामक रोगों के उपचार में कार्यरत किया गया है, जैसे एचआईवी-1, एचबीवी, और एचएसवी-1, और साथ ही मानव वंशानुगत रोगों अंतर्निहित दोषों के सुधार में, जैसे सिस्टिक फाइब्रोसिस और नव संवहनी धब्बेदार अध... 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. इसके अलावा, LVs प्रभावी रूप से अलग जीनोमिक loci पर मल्टीप्लेक्स जीन संपादन प्रदर्शन के लिए एक एकल वेक्टर प्रणाली12का उपयोग कर संशोधित किया गया है ।

हालांकि, LVs के अंतर्निहित संपत्ति मेजबान जीनोम में एकीकृत करने के लिए mutagenic जा सकता है और अक्सर transgene प्रसव के वाहनों के रूप में उनकी उपयोगिता बाधाएं, नैदानिक सेटिंग्स में विशेष रूप से । इसके अलावा, के बाद से छुरा एकीकृत LVs बनाए रखने के उच्च स्तर पर अपने transgenes एक्सप्रेस, इस प्रणाली के बीमार जैसे CRISPR/Cas9 के रूप में जीन संपादन घटकों के वितरण के लिए अनुकूल है; Cas9 के एक्सप्रेस-गाइड आरएनए (gRNA), और ऐसे ZFNs के रूप में इसी तरह के प्रोटीन, बंद लक्ष्य प्रभाव है, जो अवांछनीय उत्परिवर्तनों13,14,15,16 शामिल के ऊंचा स्तर के साथ जुड़े रहे हैं , 17 और संभावित cytotoxicity18में वृद्धि कर सकते हैं । इसलिए, ंयूनतम बंद लक्ष्य प्रभाव के साथ सटीक जीन संपादन को प्राप्त करने के लिए, यह प्रणाली है कि जीन संपादन घटकों के क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए अनुमति डिजाइन करने के लिए आवश्यक है ।

हाल के वर्षों में, कई प्रसव प्लेटफार्मों के लिए विकसित किया गया है क्षणिक एक्सप्रेस CRISPR/Cas9 कोशिकाओं में16,19,20,21 (संदर्भ में समीक्षा की22) । इन तरीकों है कि सीधे कोशिकाओं में उपयुक्त गाइड RNAs के साथ शुद्ध Cas9 शुरू करने पर भरोसा शामिल है, जो दिखाया गया था और अधिक प्रभावी जीन प्लाज्मिड की तुलना में संपादन-अभिकर्मक की मध्यस्थता के लिए16. अध्ययनों से पता चला है कि ribonucleoprotein (RNP) गाइड आरएनए से मिलकर परिसरों/Cas9 कणों तेजी से अपने लक्ष्य पर डीएनए दरार मध्यस्थता के बाद बदल रहे हैं, सुझाव है कि इन घटकों की अल्पकालिक अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है मजबूत जीन संपादन16. adeno-जुड़े वायरल वैक्टर (AAVs) के रूप में गर्भ धारण, गैर एकीकृत वायरल वेक्टर प्लेटफार्मों कोशिकाओं को जीन संपादन मशीनरी देने के लिए एक व्यवहार्य विकल्प प्रदान कर सकते हैं । दुर्भाग्यवश, AAV capsids LVs (< 5kb) की तुलना में काफी कम पैकेजिंग क्षमता रखते हैं, जो किसी एकल सदिश के भीतर बहु-घटक CRISPR टूलकिट को पैकेज करने की क्षमता को गंभीर रूप से बाधित करती है (संदर्भ8में) । यह ध्यान देने योग्य है कि यौगिकों कि हिस्टोन deacetylases (जैसे, सोडियम butyrate23) को बाधित या कोशिका चक्र में बाधा के अलावा (जैसे, कैफीन24) lentiviral titers बढ़ाने के लिए दिखाया गया है । हाल ही में प्रगति के बावजूद, क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणालियों अब तक विकसित अब भी कम उत्पादन क्षमता है, जो कम वायरल titers के लिए सीसा, और के माध्यम से उत्पंन वायरस की कम transduction क्षमता के रूप में कई कमियों, द्वारा बाधित कर रहे है इस तरह के दृष्टिकोण25।

Integrase की कमी lentiviral वैक्टर (IDLVs) जीन प्रसव के वाहनों के विकास में एक प्रमुख उंनति का प्रतिनिधित्व करते हैं, के रूप में वे कोशिकाओं में AAV की तरह episomal रखरखाव के अतिरिक्त लाभ के साथ LVs की पैकेजिंग क्षमता गठबंधन । इन सुविधाओं IDLVs काफी हद तक संभावित genotoxic तत्वों और एकीकरण-मध्यस्थता mutagenicity की तुलना लगातार व्यक्त वैक्टर घालमेल के साथ जुड़े प्रमुख मुद्दों को दरकिनार मदद करते हैं । यह पहले से प्रदर्शित किया गया है कि IDLVs सफलतापूर्वक episomal जीन अभिव्यक्ति26,27बढ़ाने के लिए संशोधित किया जा सकता है । साथ IDLV के संबंध में मध्यस्थता CRISPR/Cas9 वितरण, कम उत्पादन titers और episome-integrase-कुशल lentiviral प्रणालियों के सापेक्ष वहन जीनोम के कम अभिव्यक्ति के जीनोम-संपादन देने के लिए बोना के रूप में अपने उपयोगिता को सीमित उपकरण ट्रांसजेनिक construction. हम हाल ही में प्रदर्शित किया है कि दोनों transgene अभिव्यक्ति और वायरल IDLV उत्पादन के साथ जुड़े titers वायरल अभिव्यक्ति की कैसेट28के भीतर प्रतिलेखन कारक Sp1 के लिए बाध्यकारी साइटों के शामिल किए जाने से काफी बढ़ा रहे हैं । संशोधित IDLVs मजबूती से समर्थित CRISPR-मध्यस्थता जीन संपादन दोनों इन विट्रो में (HEK-293T कोशिकाओं में) और vivo में (पोस्ट-mitotic मस्तिष्क न्यूरॉन्स में), जबकि संगत ICLV की तुलना में कम लक्ष्य उत्परिवर्तन उत्प्रेरण-मध्यस्थता सिस्टम28। कुल मिलाकर, हम एक उपंयास, कॉंपैक्ट, सभी में एक CRISPR toolkit एक IDLV मंच पर किया और बढ़ाया जीन संपादन के लिए इस तरह के एक प्रसव के वाहन का उपयोग करने के विभिंन लाभों को रेखांकित विकसित की है ।

यहां, IDLV-CRISPR/Cas9 प्रणाली के उत्पादन प्रोटोकॉल विभिंन विधानसभा में शामिल कदम, शुद्धि, एकाग्रता, और IDLVs के अनुमापन, साथ ही साथ रणनीतियों इन वैक्टर के जीन संपादन प्रभावकारिता को मांय करने सहित वर्णित है । इस प्रोटोकॉल को आसानी से विभिंन जांचकर्ताओं की जरूरतों को पूरा करने के लिए स्केलेबल है और सफलतापूर्वक 1 x 1010 transducing इकाइयों (TU) की श्रेणी में titers के साथ LV वैक्टर उत्पंन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है/mL. इस प्रोटोकॉल के माध्यम से उत्पंन वैक्टर कुशलतापूर्वक कई विभिंन प्रकार के सेल को संक्रमित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, मुश्किल से transduce भ्रूण स्टेम सेल, टेम कोशिकाओं (टी कोशिकाओं और मैक्रोफेज), और संस्कृति और vivo मेंशामिल- इंजेक्ट न्यूरॉन्स । इसके अलावा, प्रोटोकॉल समान रूप से अच्छी तरह से integrase के उत्पादन के लिए अनुकूल है-सक्षम lentiviral वैक्टर इसी तरह की मात्रा में ।

Figure 1
चित्र 1: IDLV पैकेजिंग (क) जंगली प्रकार integrase प्रोटीन की योजनाबद्ध (ख) संशोधित प्लाज्मिड psPAX2 से व्युत्पंन (तरीकों देखें, विवरण के लिए प्लाज्मिड निर्माण) था । प्रतिनिधि agarose जेल रूपांतरित integrase क्लोन के लिए स्क्रीन क्लोन की छवि । डीएनए नमूने एक मानक प्लाज्मिड डीएनए अलगाव मिनी किट का उपयोग कर तैयार EcoRV और SphI के साथ पाचन द्वारा विश्लेषण किया गया । सही ढंग से पचा क्लोन (संख्या 5, लाल बॉक्स धराशायी) आगे INTमें D64E प्रतिस्थापन के लिए प्रत्यक्ष (सैंज) अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किया गया था । integrase की कमी वाली पैकेजिंग कैसेट का नाम pBK43 था. (ग) IDLV-CRISPR/Cas9 वैक्टर उत्पन्न करने के लिए कार्यरत क्षणिक अभिकर्मक प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध, 293T के साथ transfected कोशिकाओं को दिखा-जी, पैकेजिंग, और VSV कैसेट्स (Sp1-transgene/CRISPR ऑल-इन-वन Cas9). वायरल कणों कि कोशिका झिल्ली से बाहर कली सदिश की पूरी लंबाई आरएनए होते है (transgene कैसेट से व्यक्त) । IDLV-पैकेजिंग प्रणाली की दूसरी पीढ़ी है, जो विनियामक प्रोटीन जैसे और rev. rev अभिव्यक्ति आगे एक अलग कैसेट (RSV-rev-प्लाज्मिड) से पूरक है शामिल किया गया था । Abbrev: लीटर लंबी टर्मिनल दोहराने, VSV-जी, vesicular stomatitis वायरस जी प्रोटीन, pCMV-cytomegalovirus प्रवर्तक; रोस सार्कोमा वायरस (RSV) प्रवर्तक; RRE-(Rev प्रतिक्रिया तत्व) । अभिव्यक्ति कैसेट पर अंय विनियामक तत्वों Sp1-बाध्यकारी साइटों, Rev प्रतिक्रिया तत्व (RRE), Woodchuck हेपेटाइटिस वायरस Posttranscriptional विनियामक तत्व (WPRE), एक कोर-बढ़ाव कारक 1α प्रमोटर (EFS-नेकां), वेक्टर पैकेजिंग शामिल तत् ψ (psi), ह्यूमन Cytomegalovirus (hCMV) प्रवर्तक, और मानव U6 प्रवर्तक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Protocol

1. संवर्धन HEK-293T कोशिकाओं और अभिकर्मक के लिए बीज बोने की कोशिकाओं

नोट: मानव भ्रूण गुर्दे 293T (HEK-293T) कोशिकाओं DMEM में बड़े हो रहे हैं, उच्च ग्लूकोज मीडिया लोहा और विकास प्रवर्तकों के साथ पूरक 10% गोजातीय बछड़ा सीरम के साथ पूरक, और 1x एंटीबायोटिक antimycotic समाधान (100x समाधान शामिल हैं १०,००० इकाइयों पेनिसिलिन , 10 मिलीग्राम streptomycin और 25 µ ग्राम amphotericin बी प्रति मि.). मीडिया भी 1x सोडियम पाइरूवेट, 1x गैर-आवश्यक अमीनो एसिड मिश्रण, और 2 मिमी l-Glutamine (स्टॉक २०० mm l-alanyl-l-Glutamine dipeptide में ०.८५% NaCl) के साथ पूरक है । कोशिकाओं १०० मिमी ऊतक संस्कृति प्लेटों में संस्कृति रहे हैं (अनुमानित वृद्धि सतह क्षेत्र ५५ सेमी ² है). 1:10 के उप-खेती अनुपात उप-संवर्धन हर 2-3 दिनों के साथ प्रयोग किया जाता है । Trypsin-EDTA ०.०५% मार्ग के बीच कोशिकाओं के पृथक्करण के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रयोगों के बीच निरंतरता बनाए रखने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं बछड़ा सीरा परीक्षण जब एक अलग लॉट के लिए स्विचन/बैच और सेल वृद्धि में किसी भी परिवर्तन की निगरानी, अभिकर्मक दक्षता, और वेक्टर उत्पादन.

  1. कम यात्रा कोशिकाओं का उपयोग करके एक नई संस्कृति शुरू (यह 15 बीतने के बाद कोशिकाओं का उपयोग नहीं करने की सिफारिश की है या अगर विकास धीमा) एक 10 सेमी ऊतक संस्कृति की थाली में बोने से । सेल विकास के लिए 10% सीरम के साथ पूरक DMEM का प्रयोग करें । ३७ ° c पर एक मानक ऊतक-संस्कृति मशीन में 5% CO2 के साथ कोशिकाओं बढ़ाएँ. सभी क्रमिक चरणों के लिए कक्षों की गणना करने के लिए कोई मानक hemocytometer का उपयोग करें ।
  2. एक बार कोशिकाओं तक पहुंचने ९०-९५% धाराप्रवाह वृद्धि, 15 सेमी ऊतक संस्कृति प्लेटों में पुनर्बीज (नीचे, चरण १.३-१.५) ।
  3. को पुनर्बीज, धाराप्रवाह प्लेट से महाप्राण मीडिया और धीरे बाँझ 1x पंजाबियों के साथ कुल्ला । 3-5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पृथक्करण रिएजेंट(जैसे, Trypsin-EDTA) के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को तैयार । पृथक्करण रिएजेंट को निष्क्रिय करने के लिए सीरम युक्त मीडिया के 8 मिलीलीटर जोड़ें, और triturate 10-15 बार एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ एक एकल सेल बनाने के लिए निलंबन. संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं को reसस्पेंड लगभग 4 x 106 कोशिकाओं की एक कोशिका घनत्व प्राप्त करने के लिए/
  4. सब्सट्रेट करने के लिए पालन बढ़ाने के लिए, पूर्व कोट ०.२% जिलेटिन के साथ 15 सेमी प्लेटें, प्लेट प्रति जिलेटिन की 8 मिलीलीटर जोड़ने । थाली की सतह भर में समान रूप से फैले, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी, और बंद तरल खाना ।
  5. प्रत्येक थाली की कुल मात्रा को गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) HEK-२९३ टी मीडिया के साथ 25 मिलीलीटर लाने के लिए (चरण 1 के तहत नोट देखें) और कोशिकाओं के २.५ मिलीलीटर जोड़कर प्लेट बीज (कुल ~ 1 x 107 कोशिकाओं/ ३७ ° c पर 5% कं2 रात भर या ७० तक-८०% के साथ मशीन प्रवाह तक पहुंच जाता है ।
    नोट: अप करने के लिए ६ १५ सेमी प्लेट उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्लेट प्रति मीडिया की मात्रा को समायोजित ~ 20-22 मिलीलीटर जब चार से अधिक प्लेट का उपयोग कर (तर्क के लिए प्रोटोकॉल के चरण 5 को देखें) ।

2. Transfecting HEK-293T कोशिकाओं एक कैल्शियम फॉस्फेट-आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग

  1. अभिकर्मक रिएजेंट्स
    1. 2x BES-बफर समाधान किउ तैयार करने के लिए (५० mm BES, २८० mm NaCl, १.५ mM na2HPO4), NaCl का १६.३६ g का मिश्रण, १०.६५ g of BES (n, n-बीआईएस (2-hydroxyethyl) -2-एमिनो-ethanesulfonic एसिड), और ना की ०.२१ g2HPO4. जोड़ें डबल-आसुत एच2ओ (डीडी-एच2ओ) ९०० मिलीलीटर तक । भंग, 1m NaOH के साथ पीएच ६.९५ के लिए अनुमापन, और ०.२२ µ एम फिल्टर इकाई के माध्यम से 1 एल फिल्टर करने के लिए मात्रा लाने के लिए । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    2. 1m CaCl2तैयार । एक ०.२२ µ एम फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  2. प्लेटों है कि एक दिन पहले वरीयता प्राप्त थे निरीक्षण । कोशिकाओं अभिकर्मक के लिए तैयार एक बार वे ७०-८०% प्रवाह तक पहुंच रहे हैं ।
  3. प्लेटों से पुराने मीडिया महाप्राण और धीरे सीरम बिना हौसले से तैयार मीडिया जोड़ें ।
    नोट: चुने हुए Plasmids और उनकी तैयारी के बारे में विवरण के लिए अनुपूरक फ़ाइल 1-Plasmids देखें ।
  4. चार plasmids को 15 एमएल वाले शंकु ट्यूब में aliquoting करके प्लाज्मिड मिश्रण तैयार करें । एक सिंगल 15 सेमी डिश तैयारी के लिए, CRISPR/Cas9-transfer वेक्टर (pBK198 or pBK189), 25 µ g of pBK43 (psPAX2-D64E), १२.५ µ g pMD2. g, और ६.२५ µ g के पीछे (figure 1c) के ३७.५ µ g का उपयोग करें ।
  5. Add ३१२.५ µ l 1m CaCl2 प्लाज्मिड मिक्स । इस के लिए, बाँझ डीडी की १.२५ मिलीलीटर-एच20 जोड़ें ।
  6. धीरे (ड्रॉप वार) 2x किउ समाधान के १.२५ मिलीलीटर जोड़ें, जबकि मिश्रण भंवर । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  7. प्रत्येक 15 सेमी प्लेट (२.५ एमएल प्रति प्लेट) में अभिकर्मक मिक्सचर dropwise डालें । प्लेटें धीरे भंवर और ३७ ° c पर 5% सह के साथ मशीन2 2-3 एच के लिए । इसके बाद, २.५ मिलीलीटर जोड़ें (10%) प्रति थाली सीरम और रात भर की मशीन जारी (12-18 ज) ।
    नोट: कुछ प्रयोगशालाओं 3% सह2 मशीन का उपयोग करने के लिए मीडिया पीएच स्थिर । हालांकि, हम 3% और 5% CO2के बीच अभिकर्मक दक्षता में किसी भी अंतर का पालन नहीं करते । इसके अलावा, CaPO के आकार4 हाला अभिकर्मक दक्षता के लिए महत्वपूर्ण है; अभिकर्मक मिश्रण को कोशिकाओं पर इसके अलावा करने से पहले स्पष्ट हो गया है । यदि मिश्रण मशीन के दौरान बादल छाए रहेंगे, ताजा 2x किउ तैयार (पीएच = ६.९५) ।

Figure 2
चित्रा 2: डबल सुक्रोज ग्रेडिएंट प्रोटोकॉल का उपयोग करके वायरल कणों की एकाग्रता. वायरल supernatant (SN) से एकत्र कणों ढाल सुक्रोज ढाल पर लोड कर रहे हैं । ७०%, ६०%, 30%, और 20% सुक्रोज समाधान ग्रैडिएंट बनाने के लिए उपयोग किए जाते हैं । निंनलिखित केंद्रापसारक, 30-60% सुक्रोज भागों से एकत्र कणों आगे एक 20% सुक्रोज तकिया और उपजी पर लोड कर रहे हैं । अंतिम शुद्ध वायरल कणों युक्त गोली आगे उपयोग के लिए 1x पंजाब में reसस्पैंड है (अधिक जानकारी के लिए पाठ देखें) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

3. अभिकर्मक के बाद दिन

  1. कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे कम नहीं सेल मौत के साथ इस बिंदु पर १००% प्रवाह के पास हैं । प्रत्येक प्लेट के लिए ताजा DMEM + 10% सीरम के 25 मिलीलीटर जोड़कर मीडिया बदलें । ३७ ° c के साथ 5% सह2 के लिए एक अतिरिक्त ४८ एच के लिए जारी रखने की मशीन ।
    नोट: ६ १५ सेमी प्लेट्स से अधिक का उपयोग करते हुए चरण ३.१ में मीडिया का वॉल्यूम समायोजित करें (चरण ५.२, नोट देखें) ।

4. हार्वेस्टिंग वायरस

  1. ध्यान से सभी ऊतक संस्कृति transfected कोशिकाओं एक बाँझ 10 मिलीलीटर ऊतक संस्कृति पिपेट और ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में पूल का उपयोग युक्त प्लेटों से supernatant इकट्ठा ।
  2. ४०० पर केंद्रापसारक द्वारा निलंबन-४५० 10 मिनट के लिए एक्स जी एक तालिका के ऊपर केंद्रापसारक का उपयोग कर स्पष्ट करें । फ़िल्टर supernatant एक ०.४५ µm वैक्यूम फ़िल्टर इकाई के माध्यम से ।
    नोट: फ़िल्टर्ड supernatant को 4 दिनों तक एकाग्रता, या aliquoted के साथ आगे बढ़ने से पहले ४ डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है-८० ° c । अपेक्षित titers of IDLV-Sp1-CRISPR/Cas9 (गैर केंद्रित) वायरल तैयारी ~ 2 x 107 /एमएल (titer निर्धारण के लिए चरण 6 को देखें) होना चाहिए । हालांकि, कई फ्रीज-गल चक्र के लिए वायरल की तैयारी व्यक्तिपरक, कार्यात्मक titers में एक 10-20% नुकसान में ठंड और गल परिणाम के प्रत्येक दौर के रूप में, से बचें ।

5. Ultracentrifugation द्वारा वायरल कणों की एकाग्रता

नोट: हम दो चरणों में शामिल शुद्धिकरण के दोहरे-सुक्रोज विधि का उपयोग करते हैं: एक सुक्रोज ग्रैडिएंट चरण और एक सुक्रोज तकिया चरण (चित्र 2) ।

  1. शंकु ultracentrifugation ट्यूबों को निंन क्रम में लोड एक सुक्रोज ढाल बनाने के लिए: ०.५ एमएल ७०% सुक्रोज (भंग 1x पंजाबियों), ०.५ मिलीलीटर ६०% सुक्रोज (DMEM में भंग), 1 मिलीलीटर 30% सुक्रोज (DMEM में भंग), और 2 मिलीलीटर 20% सुक्रोज (1x पंजाब में भंग) ।
  2. वायरस-युक्त supernatant को ग्रैडिएंट में सावधानीपूर्वक जोड़ें । के रूप में ४ १५ सेमी प्लेटों से supernatant की कुल मात्रा १०० मिलीलीटर है, प्रति स्पिन छह ultracentrifugation ट्यूबों का उपयोग करने के लिए वायरस supernatant की पूरी मात्रा प्रक्रिया ।
    1. इस कदम के लिए इस्तेमाल किया प्रत्येक ultracentrifugation ट्यूब (सुक्रोज की मात्रा सहित) 30 मिलीलीटर तक की एक मात्रा क्षमता है, ट्यूब के बीच समान रूप से वायरल supernatant वितरित, कम से 10% headspace छलकने को रोकने के लिए छोड़ रहा है ।
    2. प्रत्येक प्रयोग के लिए ४ १५ सेमी प्लेट से अधिक का उपयोग करते समय थाली प्रति ~ 20-22 मिलीलीटर के लिए संस्कृति मात्रा समायोजित करें, ताकि परित वायरल supernatant के अंतिम खंड आसानी से छह ultracentrifugation ट्यूबों के भीतर शामिल किया जा सकता है ।
    3. ultracentrifugation ट्यूबों को भरने के लिए कम से तीन-चौथाई उनके कुल मात्रा क्षमता, अंयथा ट्यूबों के टूटना के दौरान हो सकता है, और नमूना के संभावित नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप/
  3. 1x पंजाबियों के साथ ट्यूब संतुलन और 17 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए ७०,००० x g पर नमूने केंद्रापसारक (रोटर विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) ।
    नोट: त्वरण के दौरान सुक्रोज परत के विघटन को रोकने के लिए, ultracentrifuge सेट धीरे स्पिन के पहले 3 मिनट के दौरान २०० rpm के लिए रोटर में तेजी लाने के लिए । इसी तरह, ultracentrifuge सेट धीरे २०० rpm से 0 rpm को 3 मिनट से अधिक स्पिन के अंत में रोटर धीमा ।
  4. ध्यान से साफ ट्यूबों में 30-60% सुक्रोज अंश इकट्ठा(चित्रा 2) । परित भागों में कोल्ड 1x पंजाबियों जोड़ें और १०० मिलीलीटर के लिए मात्रा लाने; कई बार ऊपर और नीचे pipetting करके मिलाएं ।
  5. सावधानी से एक सुक्रोज तकिया पर वायरल तैयारी layering द्वारा सुक्रोज तकिया कदम के लिए आगे बढ़ें । इस के लिए, ट्यूब के लिए 20% सुक्रोज (1x पंजाब में) के 4 मिलीलीटर जोड़ें, ~ ट्यूब प्रति वायरल समाधान के 20-25 मिलीलीटर के बाद । यदि ट्यूबों से कम तीन चौथाई पूर्ण, बाँझ 1x पंजाबियों के साथ ऊपर ऊपर हैं ।
  6. ध्यान से संतुलन और 17 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए ७०,००० x g पर नमूने, पहले के रूप में केंद्रापसारक । supernatant से डालो और शेष तरल कागज तौलिए पर ट्यूब औंधा द्वारा नाली के लिए अनुमति देते हैं ।
  7. महाप्राण शेष बूंदों के क्रम में गोली से सभी तरल को दूर करने के लिए । इस कदम पर, वायरस युक्त छर्रों बमुश्किल छोटे पारदर्शी धब्बे के रूप में दिखाई जानी चाहिए ।
  8. पहले ट्यूब करने के लिए 1x पंजाबियों के ७० µ एल जोड़कर छर्रों reसस्पेंड और अच्छी तरह से निलंबन pipetting, बाद में अगले ट्यूब को निलंबन स्थानांतरित और पहले के रूप में मिश्रण, जब तक सभी छर्रों reसस्पैंड रहे हैं जारी.
  9. ठंड 1x पंजाबियों के एक अतिरिक्त ५० µ एल के साथ ट्यूबों कुल्ला और पहले के रूप में मिश्रण । सुनिश्चित करें कि अंतिम निलंबन की संयुक्त मात्रा ~ १२० µ l है, और थोड़ा दूधिया दिखाई देता है; यह १०,००० x g पर 30 एस के लिए एक तालिका के ऊपर microcentrifuge पर केंद्रापसारक द्वारा स्पष्ट है ।
  10. supernatant एक ताजा microfuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण, 10 µ l aliquots बनाने के लिए, और उन्हें पर स्टोर-८० ° c.
    नोट: lentiviral नमूनों पर दोहराया फ्रीज-गल चक्र प्रदर्शन से बचें । सिवाय जब केंद्रापसारक की आवश्यकता है, प्रयास ऊतक संस्कृति डाकू, या निर्दिष्ट ऊतक-संस्कृति उपयुक्त सुरक्षा उपायों का उपयोग कर कमरे में शेष कदम उठाने के लिए किया जाना चाहिए (चर्चा देखें) ।

6. वायरल Titers का अनुमान

  1. पी24 -एंजाइम-लिंक्ड immunosorbent परख (एलिसा) विधि
    नोट: परख उच्च का उपयोग किया जाता है-९६ बाध्यकारी-NIH एड्स टीका कार्यक्रम के निर्देशों के अनुसार एचआईवी के लिए अच्छी तरह से प्लेटें-1 पी24 प्रतिजन कब्जा परख किट (देखें सामग्री की तालिका) संशोधनों के साथ29।
    1. अगले दिन, कुओं धो तीन बार २०० µ l ०.०५% के साथ ठंड पंजाबियों (पंजाब-टी समाधान) में 20 के बीच । कोट मोनोक्लोनल विरोधी के १०० µ एल के साथ प्लेट 1x पंजाब में 1:1500 के एक कमजोर पड़ने पर पी24 एंटीबॉडी और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में गर्मी ।
    2. गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को समाप्त करने के लिए, पंजाब में २०० µ l 1% BSA के साथ प्लेट को ब्लॉक करें; धो तीन बार के साथ २०० µ एल ०.०५% के बीच 20 ठंडा पंजाबियों (पंजाब-टी समाधान) में कम से 1 कमरे के तापमान पर ज ।
    3. नमूने तैयार करें: केंद्रित सदिश तैयारियों के लिए, नमूना १०० के 1 µ l को पतला करें-८९ µ l को जोड़ने के लिए, डीडी-H20 और 10 µ l का ट्राइटन X-१०० (10% की अंतिम एकाग्रता) । गैर केंद्रित तैयारी के लिए, दस गुना पतला नमूनों तैयार (डीडी के ८० µ एल-एच20 और ट्राइटन एक्स के 10 µ l-१०० (10% की अंतिम एकाग्रता) नमूने के 10 µ l को जोड़ें) ।
      नोट: नमूने बाद में उपयोग के लिए समय की एक विस्तारित अवधि के लिए इस कदम पर-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
    4. एक 2-गुना सीरियल कमजोर पड़ने (एक प्रारंभिक एकाग्रता के साथ 5 एनजी/एमएल) लागू करके एचआईवी-1 मानकों को तैयार करें ।
    5. केंद्रित नमूनों पतला (से 1:100 पूर्व पतला स्टॉक RPMI १६४० में ०.२% के बीच 20 और 1% BSA के साथ पूरक 1:10000, 1:50000, और 1:250000 कमजोर पड़ने की स्थापना । गैर केंद्रित नमूनों पतला (1:10 पूर्व पतला स्टॉक से) RPMI १६४० में ०.२% के बीच 20 और 1% BSA के साथ पूरक 1:500, 1:2500, और 1:12500 कमजोर पड़ने की स्थापना ।
    6. triplicates में प्लेट पर नमूने लागू करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    7. अगले दिन, छह बार कुओं धो और १०० µ एल polyclonal खरगोश विरोधी पी24 एंटीबॉडी, RPMI १६४०, 10% FBS, ०.२५% BSA, और 2% सामान्य माउस सीरम (एनएमएस) में 1:1000 पतला के साथ 4 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
    8. ऊपर के रूप में छह बार धोने और ३७ ° c पर बकरी विरोधी खरगोश सहिजन peroxidase आईजीजी पतला 1:10000 RPMI १६४० में 5% सामांय बकरी सीरम, 2% एनएमएस, ०.२५% BSA, और ०.०१% 20 के बीच के साथ पूरक के लिए 1 ज के लिए मशीन ।
    9. प्लेट धो, ऊपर के रूप में, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर TMB peroxidase सब्सट्रेट के साथ मशीन ।
    10. 1 N HCL के १०० µ l को जोड़कर रिएक्शन रोकें । उपाय ४५० एनएम पर नमूना अवशोषक अवशोषक प्लेट रीडर का उपयोग कर ।
  2. फ्लोरोसेंट रिपोर्टर तीव्रता का मापन
    1. FACS कृती
      नोट: कोशिकाओं में GFP संकेत कमी की हद तक सही प्रवाह cytometry के माध्यम से transduced कोशिकाओं का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के द्वारा अनुमानित किया जा सकता है । कृपया FACS डेटा विश्लेषण, प्रस्तुति, और व्याख्या के लिए हाल ही में पेपर 28 देखें । प्रोटोकॉल निम्नानुसार वर्णन किया गया है ।
      1. 1x पंजाब में वायरल की तैयारी (10-1 से 10-5) के दस गुना सीरियल कमजोर पड़ने बनाओ ।
      2. बीज लगभग 5 x 105 293T कोशिकाओं के प्रत्येक अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से थाली की एक अंतिम मात्रा में 2 मिलीलीटर के प्रति ठीक है । कोशिकाओं के लिए प्रत्येक वायरल कमजोर पड़ने के 10 µ एल जोड़ें और ४८ एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी कोशिकाओं ।
      3. FACS विश्लेषण के लिए फसल की कोशिकाओं निम्नानुसार है: ०.०५% Trypsin-EDTA समाधान और 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी कोशिकाओं के २०० µ एल जोड़ें । एक पूरी DMEM मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में नमूने इकट्ठा ।
      4. 4 डिग्री सेल्सियस पर ४०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं, और ठंड 1x पंजाब के ५०० µ l में गोली reसस्पेंड ।
      5. निर्धारण के लिए, इस निलंबन के लिए 4% formaldehyde समाधान की एक समान मात्रा जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
      6. गोली फिक्स्ड कोशिकाओं और 1x पंजाब के 1 मिलीलीटर में reसस्पेंड । Ortinski एट अल में वर्णित के रूप में एक FACS साधन का उपयोग कर GFP अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें । 28 संक्षेप में, वायरस के कार्यात्मक titer का निर्धारण करने के लिए निंन सूत्र का उपयोग करें:
        Equation 1
        नोट: यहां टीजी = गिनती GFP-सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या; तमिलनाडु = गिने गए कक्षों की कुल संख्या; N = कक्षों की कुल संख्या transduced; वी = मात्रा (µ एल में) transduction के लिए इस्तेमाल किया । उदाहरण के लिए: यदि 1 x 106 कोशिकाओं वायरस के 10 µ एल के साथ transduced थे, 2 x 104 कोशिकाओं और गिना 5 x 103 थे GFP-सकारात्मक, ऊपर समीकरण कार्यात्मक titer के आधार पर किया जाएगा:
        Equation 2
    2. गिनती GFP-सकारात्मक कोशिकाओं
      1. transduction के लिए इस्तेमाल संक्रमण (MOI) की बहुलता की गणना । MOIs की एक विस्तृत श्रृंखला का परीक्षण (1-10), बढ़ती MOIs के साथ एक उच्च transduction दक्षता में जिसके परिणामस्वरूप ।
      2. अभिकर्मक करने से पहले, बीज एक 6 अच्छी तरह से थाली के साथ लगभग 3-4 एक्स10 5 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से । एक बार कोशिकाओं तक पहुंचने > 90% प्रवाह (आमतौर पर 24 घंटे के भीतर), पूर्व निर्धारित MOIs पर शुद्ध वायरस के साथ transduce ।
      3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन एक मानक ऊतक संस्कृति में 5% CO2 के साथ, और GFP संकेत में परिवर्तन के लिए 1-7 दिनों के लिए नियमित अंतराल पर कोशिकाओं की निगरानी ।
      4. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (योजना 4x उद्देश्य, ०.१ एन. ए, 40X इज़ाफ़ा) एक GFP फिल्टर सेट (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य-४७० एनएम, उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य-५२५ एनएम), भोली (अन-transduced) कोशिकाओं का उपयोग कर जनसंख्या निर्धारित करने के साथ सज्जित के साथ GFP की संख्या गिनती के GFP-नकारात्मक और सकारात्मक कोशिकाओं ।
      5. निंन सूत्र का उपयोग करके, कमजोर पड़ने वाले कारक और वॉल्यूम के लिए समायोजित करके अंतिम titer का अनुमान लगाएं:
        Equation 3
        नोट: यहां, N = GFP की संख्या-सकारात्मक कोशिकाओं, डी = कमजोर पड़ने फैक्टर, एम = आवर्धन कारक (आमतौर पर 20X), वी = transduction के लिए इस्तेमाल किया वायरस की मात्रा । उदाहरण के लिए, 20 GFP-धनात्मक कक्षों (N) के लिए 10 की एक कमजोर पड़ने पर गिना-4 (1:10000) में एक 10 µ l नमूना (V) 20X आवर्धन पर (M) (D) एक कार्यशील titer में परिणाम होगा (20 x 104) x (20) x (10) x (१०० *) = 4 x 108 मं/एमएल/
        (* प्रति एमएल करने के लिए समायोजित करने के लिए)

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Representative Results

IDLV-CRISPR/Cas9 वैक्टर की नॉकआउट-दक्षता का सत्यापन
हम एक मॉडल के रूप में GFP-व्यक्त 293T कोशिकाओं का इस्तेमाल किया CRISPR की क्षमता को मांय/Cas9-मध्यस्थता जीन नॉकआउट । GFP + कोशिकाओं ०.५ के एक pLenti पर GFP-vBK201a (MOI) के साथ HEK-293T कोशिकाओं के transduction द्वारा उत्पन्न किया गया (चित्र बी, "नहीं-वायरस" पैनल). sgRNA-to-GFP/Cas9 सभी में एक वेक्टर कैसेट IDLV या ICLV कणों में पैक किया गया था और उत्पादन क्षमता पी द्वारा मूल्यांकन किया गया था24 एलिसा (ऊपर देखें; और आंकड़ा 3ए) । Sp1-बाइंडिंग साइट्स (निम्न एकाग्रता) वाले वैक्टर के titers को 1010 मं/एमएल की श्रेणी में पाया गया । हम तो GFP नॉकआउट की दक्षता का आकलन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (चित्र बी) का उपयोग कर । यह अंत करने के लिए, 5 x 105 GFP-व्यक्त 293T कोशिकाओं एक 6-अच्छी तरह से प्लेट में वरीयता प्राप्त थे और हम उन्हें transduced के साथ 24 ज बाद में IDLV-या ICLV-CRISPR/Cas9 पर MOIs 1 और 5 (चित्र3) । कोशिकाओं को 24 ज, जिसके बाद संस्कृति माध्यम की जगह थी और कोशिकाओं को एक अतिरिक्त ४८ एच के लिए मशीन थे, प्रयोग के बाद के दिनों के लिए प्लेटों reसीडिंग से पहले थे ।

हाल ही के एक अध्ययन में, हमने GFP + कोशिकाओं के साथ transduced के माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा ICLV/CRISPR या IDLV/CRISPR घटकों के माध्यम से प्रवाह cytometry28। हम दोनों नमूनों में तुलनीय GFP-घट को देखा 14 दिनों के बाद transduction (pt) (2-4% संकेत कमी), और लगभग समान GFP घट 21 दिन पीटी (> 99% संकेत घट)28 । पिछले टिप्पणियों के साथ सामंजस्य में, हम एक लगभग पूरा संकेत घट 14 दिन पीटी द्वारा मनाया (आंकड़ा 3) के रूप में GFP की संख्या में कमी-सकारात्मक कोशिकाओं के रूप में 7 दिनों के पीटी के रूप में एक ~ पांच गुना कटौती मनाया (डेटा नहीं दिखाया) के साथ transduction निंनलिखित दोनों ICLV-और IDLV-CRISPR/Cas9 सिस्टम । संकेत हानि कोशिकाओं है कि इलाज के बाद GFP सकारात्मक बने और भोली GFP-सकारात्मक कोशिकाओं की कुल संख्या के अनुपात के रूप में मूल्यांकन किया गया था । इन परिणामों को स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करता है कि CRISPR/Cas9 IDLVs द्वारा दिया निर्माण उनकी क्षमता में उनके घालमेल समकक्षों द्वारा दिया उन के साथ तुलनीय है तेजी से, मजबूत मध्यस्थता, और कोशिकाओं विभाजन में निरंतर जीन संपादन ।

Figure 3
चित्र 3: वायरल titers का मूल्यांकन । (क) द्वारा पी२४-एलिसा परख. केंद्रित sp1 के लिए Titers-IDLV-CRISPR/Cas9 (काली पट्टी) और sp1-ICLV-CRISPR/Cas9 (सफेद पट्टी) मूल्यांकित किए गए थे । परिणाम प्रति मिलीलीटर संख्या में दर्ज कर रहे हैं, जहां 1 एनजी पी24-ढकोसला = 1 x 104 वायरल कणों । बार ग्राफ डेटा तपसिल प्रयोगों से मतलब ± एसडी का प्रतिनिधित्व करता है । (ख) CRISPR की मध्यस्थता GFP-नॉकआउट कुशलता का मूल्यांकन. GFP संकेत की कमी ICLV-CRISPR/Cas9-और IDLV-CRISPR/Cas9-transduced 293T GFP + कोशिकाओं के बीच की तुलना में था 1 और 5 के MOIs पर । अन-transduced ("कोई वायरस" पैनल में चित्रा) GFP-सकारात्मक कोशिकाओं नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । छवियों 40X आवर्धन पर 7 दिनों के बाद transduction में एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे । Abbrev: RRE: Rev प्रतिक्रिया तत्व, EFS-नेकां: कोर-बढ़ाव फैक्टर 1α प्रमोटर, ψ (साई): वेक्टर पैकेजिंग तत्व, hU6: मानव U6 प्रवर्तक, पूरो: Puromycin-प्रतिरोध कैसेट, WPRE: Woodchuck हेपेटाइटिस वायरस Posttranscriptional विनियामक तत्व, बाएं से दाएं: लंबे टर्मिनल दोहराने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक फाइल 1: Plasmids इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

IDLVs के लिए पसंद के वाहन के रूप में उभरने शुरू कर दिया है vivo जीन-संपादन, विशेष रूप से आनुवंशिक रोगों के संदर्भ में, इन वैक्टर के साथ जुड़े mutagenesis के कम जोखिम के लिए मोटे तौर पर वितरण प्लेटफार्मों के घालमेल की तुलना में22 , 28. वर्तमान पांडुलिपि में, हम विस्तार के लिए सभी में सुधार के उत्पादन से जुड़े प्रोटोकॉल की मांग की एक IDLV-CRISPR/Cas9 प्रणाली है कि हाल ही में हमारी प्रयोगशाला में विकसित किया गया था28।

मौजूदा प्लेटफार्मों में संशोधन
इस विधि के साथ, हम IDLV-CRISPR/Cas9 और ICLV-CRISPR/Cas9 वैक्टर 1 x 1010 TU/एमएल (चित्रा 3) की रेंज में पैदा करने में सक्षम थे । उत्पादन क्षमता में यह वृद्धि सभी में एक CRISPR/Cas9 वेक्टर कैसेट में Sp1-बाध्यकारी साइट के अलावा के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । दरअसल, हम हाल ही में एक ~ २.५-IDLV की पैकेजिंग दक्षता में वृद्धि गुना में Sp1 परिणामों के शामिल किए जाने की सूचना-और ICLV-CRISPR/Cas9 वैक्टर और एक ~ 7 समग्र कार्यात्मक titers में गुना वृद्धि हुई है । ये परिणाम विभिंन समूहों से पहले काम के साथ समझौते में है एक मुख्य नियामक के रूप में Sp1 पर प्रकाश डाला जंगली प्रकार एचआईवी-130,31,३२,३३,३४,३५ .

महत्वपूर्ण चरण और समस्या निवारण
के रूप में ऊपर बताया, Sp1-IDLVs ले CRISPR/Cas9 transgenes के आसपास के क्षेत्र में titers पैदा करने में सक्षम थे 1 x 1010 TU/एमएल प्रति ~ 5 x 107 निर्माता कोशिकाओं । Titers कम उत्पादन प्रक्रिया में त्रुटियों का संकेत होगा, जो मामले में निंनलिखित महत्वपूर्ण अंक titer सुधार के लिए विचार किया जाना चाहिए: 1) यह अनुशंसित है कि निर्माता कोशिकाओं अधिमानतः कम बीतने संख्या के प्रतिस्थापन के साथ, ≥ 15 बीतने के बाद और/या जब धीमी वृद्धि मनाया जाता है । 2) सेल मीडिया घटकों का चुनाव उत्पादन क्षमता के मामले में महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, आमतौर पर इस्तेमाल किया भ्रूण गोजातीय सीरम के स्थान पर, हम पाते है कि ब्रह्मांडीय बछड़ा सीरम का उपयोग लगातार सेल विकास और वायरल उत्पादन में सुधार, जबकि एक ही समय में लागत प्रभावी किया जा रहा है । 3) अलग HEK लाइनों के उत्पादन फिटनेस सावधानी से मूल्यांकन किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, हमने 293T कक्षों और २९३-फ़ीट के बीच वायरल उत्पादन प्राप्ति में ~ तिगुना अंतर पाया ( सामग्री की तालिकादेखें) कक्ष (डेटा नहीं दिखाया गया है) । 4) यह अनुशंसित है कि कोशिकाओं transfected जब वे मोटे तौर पर कर रहे है ७०-८०% कम सेल के साथ धाराप्रवाह, समय से पहले कोशिका मौत वायरल विषाक्तता के कारण, और उच्च घनत्व उत्पादन क्षमता में एक के रूप में चिह्नित ड्रॉप में जिसके परिणामस्वरूप । अंगूठे के एक नियम के रूप में, हम सेल के घनत्व के लिए लेखांकन का सुझाव देते हैं जो सेल डिवीजन पोस्ट-अभिकर्मक के एक अतिरिक्त दौर से गुजरने की अनुमति देता है । 5) अंत में, अभिकर्मक की दक्षता 2x किउ, जो आदर्श अभिकर्मक के लिए बिल्कुल ६.९५ पर बनाए रखा जा रहा है के पीएच पर अत्यधिक निर्भर है । यह इसलिए अत्यधिक की सिफारिश की है कि 2x किउ के प्रत्येक नए बैच एक पायलट-अभिकर्मक पैमाने पर जांच की जानी है ।

वेक्टर हैंडलिंग और सुरक्षा
इस प्रोटोकॉल के साथ IDLV और ICLV वैक्टर के उत्पादन के दौरान कई महत्वपूर्ण सुरक्षा विचार कर रहे हैं । सबसे पहले, lentiviruses के साथ काम करने जैव सुरक्षा स्तर द्वितीय रोकथाम की आवश्यकता है । के बावजूद सुरक्षा पाप वैक्टर द्वारा afforded सुविधाओं, पाप वैक्टर से अवशिष्ट transcriptional गतिविधि३६की सूचना दी गई है । इसके अलावा, पिछले काम का प्रदर्शन किया है कि IDLV-और ICLV-जीनोम उत्पादक एचआईवी से बचाया जा सकता है-127। इसलिए, यह दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है कि प्रतिकृति क्षमता परख (आरसीए) प्रदर्शन किया, खासकर जब केंद्रित lentiviruses इस्तेमाल किया जा रहा है३७। lentiviral वेक्टर तैयारी की हैंडलिंग के बारे में सुरक्षा प्रक्रियाओं के लिए, सूक्ष्मजीवविज्ञानी और जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं, 4 संस्करण, रोग नियंत्रण (सीडीसी), जो ऑनलाइन पाया जा सकता है के लिए केंद्र द्वारा प्रकाशित में जैव सुरक्षा३८देखें । एक ही नोट पर, तीसरी पीढ़ी के पैकेजिंग सिस्टम३९ संवर्धित सुरक्षा सुविधाओं के साथ IDLVs और ICLVs पैकेज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि दूसरी पीढ़ी की प्रणाली की तुलना में कम दक्षता के साथ.

महत्व और भविष्य के निर्देश
कुल मिलाकर, CRISPR/Cas9 के लिए IDLVs के लिए उत्पादन प्रोटोकॉल-मध्यस्थता जीन संपादन यहाँ वर्णित तेजी से विभाजित कोशिकाओं में इस प्रणाली की दक्षता का पहला मूल्यांकन का प्रतिनिधित्व करता है. GFP-धनात्मक HEK-293T कक्षों का उपयोग करके, हमने यह दर्शाया है कि Cas9 द्वारा दिया गया Sp1-CRISPR/IDLVs, GFP के समान कैनेटीक्स के साथ, इन कक्षों में ICLVs को कुशलतापूर्वक और त्वरित रूप से संपादित कर सकता है । इन टिप्पणियों मोटे तौर पर गैर वायरल अभिकर्मक तरीकों के माध्यम से जीन संपादन के लिए ribonucleoprotein परिसरों (Cas9 RNPs) का उपयोग कर पिछले काम से परिणाम के साथ संगत कर रहे हैं । यह उपन्यास मंच और कोशिकाओं को जीन संपादन घटकों और अन्य आणविक कार्गो के वितरण के लिए कभी विस्तार toolbox को समृद्ध करती है ।

जैसा कि पहले चर्चा की, lentiviral के विकास में हाल ही में प्रगति के बावजूद जीन वितरण प्रणाली आधारित है, वहां प्लेटफार्मों के लिए कोई विकल्प नहीं है कि उच्च titer वायरल वैक्टर के सतत उत्पादन की अनुमति के लिए तेजी से, क्षणिक, और लक्षित जीन हेरफेर. transgene अभिव्यक्ति कैसेट में एक अत्यधिक व्यक्त प्रतिलेखन कारक के लिए बाध्यकारी रूपांकनों के शामिल के माध्यम से, हम एक साथ इन मुद्दों के कई पते में सक्षम थे । यह सरल अभी तक महत्वपूर्ण हेरफेर समान वितरण प्लेटफार्मों के विकास के लिए रास्ते की एक संख्या को खोलता है । यह विशेष रूप से अगर transgene अभिव्यक्ति एक ही बाध्यकारी आकृति की कई प्रतियां के अलावा या तो के माध्यम से बढ़ाया जा सकता है परीक्षण करने के लिए उपयोगी होगा, या अंय प्रतिलेखन कारकों के लिए बाध्यकारी साइटों के साथ Sp1 आकृति मल्टीप्लेक्स द्वारा । हमारे निपटान में इस तरह के उपकरणों के साथ, यह है कि अपेक्षाकृत कमजोर ऊतक-विशिष्ट प्रमोटरों, जैसे मानव Synapsin मैं (hSyn) और माउस कैल्शियम/calmodulin-निर्भर प्रोटीन कळेनासे द्वितीय (CaMKII) के लिए उन लोगों के रूप में है कि अभिव्यक्ति अटकलें मोहक है, काफी हो सकता है दोनों विट्रो में और vivo मेंसुधार हुआ ।

जबकि वर्तमान अध्ययन IDLV के जीन पछाड़ना क्षमता का परीक्षण करने के लिए सीमित था CRISPR/Cas9, सिद्धांत रूप में, हमारी प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा विविध जीन संपादन अनुप्रयोगों के लिए उत्तरदाई होगा, इस तरह के उत्प्रेरक पर आश्रित-निष्क्रिय dCas9४०. अंत में, छोटे endonucleases, जैसे SaCas9४१ और Cpf1४२के साथ संयोजित, इस अध्ययन में वर्णित प्लेटफ़ॉर्म को समय की अपेक्षाकृत कम अवधि में अत्यधिक कुशल AAV-आधारित जीन-वितरण प्रणालियों की स्थापना की ओर अपनाया जा सकता है, जो lentiviral वैक्टर की तुलना में कम immunogenicity का जोड़ा लाभ प्रदान करेगा । कहने की जरूरत नहीं है, इस तरह के दृष्टिकोण उपंयास, कुशल, और नैदानिक सुरक्षित वायरल वैक्टर के विकास की दिशा में एक सकारात्मक कदम होगा ।

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Disclosures

पेटेंट यूएससी-४९९-P (११७५) दक्षिण कैरोलिना विश्वविद्यालय द्वारा इस पांडुलिपि में वर्णित काम के संबंध में दायर किया गया था ।

Acknowledgments

हम तंत्रिका जीव विज्ञान, ड्यूक यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन के डिपार्टमेंट और डीन के पद बेसिक साइंस, ड्यूक यूनिवर्सिटी के लिए शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । हम भी पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए ड्यूक वायरल वेक्टर कोर के सदस्यों को धंयवाद । प्लाज्मिड pLenti CRISPRv2 को फेंग जांग (ब्रॉड इंस्टिट्यूट) से गिफ्ट किया गया । plasmids psPAX2, VSV-जी, pMD2. जी और pRSV-Rev सहित LV-पैकेजिंग प्रणाली डिडिएर Trono (EPFL, स्विट्जरलैंड) से एक तरह का उपहार था । इस काम के लिए वित्तीय सहायता विश्वविद्यालय के दक्षिण कैरोलिना स्कूल ऑफ मेडिसिन, ग्रांट RDF18080-E202 (बी. के.) द्वारा प्रदान की गई थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
xMark Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
BD FACS Becton Dickinson 338960
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor Beckman Coulter 369650
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
High-binding 96-well plates Corning 3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Tissue culture pipettes, 5 mL Corning 4487
Tissue culture pipettes, 10 mL Corning 4488
Tissue culture pipettes, 25 mL Corning 4489
Hemacytometer with cover slips Cole-Parmer UX-79001-00
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
DMEM, high glucose media Gibco 11965
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) Sigma Aldrich B9879 - BES
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
pRSV-Rev Addgene 12253
lentiCRISPR v2 Addgene 52961
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsrGI New England Biolabs R0575S
BsmBI New England Biolabs R0580S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  2. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).
  3. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  4. Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).
  5. Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
  6. Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146 (2016).
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आनुवंशिकी अंक १३० वायरल मध्यस्थता जीन हस्तांतरण HEK-293T कोशिकाओं integrase की कमी lentiviral वैक्टर CRISPR/Cas9 जीन संपादन प्रणाली पी24 एलिसा सुक्रोज-ढाल ultracentrifugation FACS
CRISPR/Cas9 के लिए Integrase-कमी Lentiviral वैक्टर के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल-विभाजन कोशिकाओं में मध्यस्थता जीन नॉकआउट
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Vijayraghavan, S., Kantor, B. A… More

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).

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