Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En protokol til produktion af Integrase-mangelfuld Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-medieret gen Knockout i dividere celler

Published: December 12, 2017 doi: 10.3791/56915
Automatic Translation
1, 1
1Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine

Summary

Vi beskrive produktion strategien integrase-mangelfuld lentiviral vektorer (IDLVs) som køretøjer til at levere CRISPR/Cas9 til cellerne. Med en evne til at mægle, hurtig og robust gen redigering i celler, IDLVs præsentere et sikrere og lige så effektive vektor platform for gen levering i forhold til integrase-kompetente vektorer.

Abstract

Lentiviral vektorerne er et ideelt valg til at levere gen-redigering komponenter til celler på grund af deres evne til stabilt transducing en bred vifte af celler og mægle høje niveauer af genekspression. Men deres evne til at integrere i vært celle genom øger risikoen for pattedyrsceller mutagenicitet og dermed giver anledning til sikkerhedsmæssige betænkeligheder og begrænser deres anvendelse i kliniske indstillinger. Yderligere, den vedvarende udtryk for gen-redigering komponenter leveret af disse integration-kompetente lentiviral vektorer (ICLVs) øger sandsynligheden for promiskuøs gen målretning. Som et alternativ, er blevet udviklet en ny generation af integrase-mangelfuld lentiviral vektorer (IDLVs), der omhandler mange af disse bekymringer. Her produktion protokollen af en ny og forbedret IDLV platform for CRISPR-medieret gen redigering og listen trin involveret i rensning og koncentrationen af disse vektorer er beskrevet og deres transduktion og gen-redigering effektivitet ved hjælp af HEK-293T celler blev demonstreret. Denne protokol er let skalerbar og kan bruges til at generere høj titer IDLVs, der er i stand til at transducing celler in vitro og in vivo. Desuden, denne protokol kan nemt tilpasses til produktion af ICLVs.

Introduction

Præcise gen redigering udgør hjørnestenen i store biomedicinsk forskud, der vedrører udviklingen af nye strategier til at tackle genetiske sygdomme. På forkant med gen-redigering teknologier er den metode, der er afhængige af brugen af clustered regularly -jegnterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / Cas9 system, der var i første omgang identificeret som en komponent af bakteriel immunitet mod invasionen af viral genetiske materiale (gennemgik i referencer1,2). En stor fordel af ordningen med CRISPR/Cas9 over andre gen-redaktion værktøj, såsom zink-finger nukleaser (ZFNs) og transkription aktivere-lignende effektor nukleaser (TALENs) (gennemgik i reference3), er den relative enkelhed af plasmid design og opførelse af CRISPR komponenter — en funktion, der har drevet udvidelse af gen-redigering fra nogle få specialiserede laboratorier til en meget bredere forskning samfund. Derudover har enkelhed af CRISPR/Cas9 programmering og dets evne til at multiplex mål anerkendelse yderligere næret sin popularitet som en omkostningseffektiv og nem at bruge teknologi. Blandt de forskellige metoder til rådighed for forskerne til at levere sådanne gen-redigering komponenter til celler, stadig virale vektorer langt den mest populære og effektive system.

Lentiviral vektorer (LVs) er dukket op som køretøjet af valg til at levere komponenter i CRISPR/Cas9 system i vivo for forskellige applikationer4,5,6,7. Flere nøglen egenskaber gør LVs et populært valg for denne proces, herunder deres evne til at inficere både delende og ikke-dividere celler, lav immunogenicitet og minimal cellulære toksicitet (gennemgik i reference8). Som et resultat, har LV-medieret genterapi været ansat i behandlinger af smitsomme sygdomme, såsom HIV-1, HBV og HSV-1, og korrektion af fejl underliggende menneskelige arvelige sygdomme som cystisk fibrose og neo-kar makuladegeneration 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Desuden, LVs har ændret effektivt for at udføre multiplex gen redigering på særskilte genomisk loci ved hjælp af en enkelt vektor system12.

Men den iboende egenskab af LVs at integrere i host-genom kan være mutagene og ofte handicap for deres nytte som transgen levering køretøjer, især i klinisk indstillinger. Desuden, da stabilt integreret LVs udtrykke deres transgener på bæredygtigt høje niveauer, dette system er dårligt egnet til levering af gen-redigering komponenter som CRISPR/Cas9; overekspression af Cas9-guide RNA (gRNA) og lignende proteiner som ZFNs, er forbundet med forhøjede niveauer af off-target effekter, som omfatter uønskede mutationer13,14,15,16 , 17 og kan potentielt forbedre cytotoksicitet18. For at opnå præcise gen-redigering med minimal off target effekter, er det derfor afgørende, at design-systemer, der giver mulighed for den forbigående udtryk af genet redigering komponenter.

I de seneste år, er blevet udviklet en række forskellige leveringsplatforme forbigående udtrykke CRISPR/Cas9 i celler16,19,20,21 (gennemgik i reference22). Disse omfatter metoder, der er baseret på direkte at indføre renset Cas9 sammen med passende guide RNA'er i celler, som viste sig at være mere effektive på målrettede gen-redigering i forhold til plasmid-medieret Transfektion16. Undersøgelser har vist, at ribonucleoprotein (RNP) komplekser bestående af guide RNA/Cas9 partikler er hurtigt vendt efter mægle DNA kavalergang på deres mål, tyder på, at kortsigtede udtryk for disse komponenter er tilstrækkelige til at opnå robust gen redigering16. Tænkes, ikke integrere viral vektor platforme såsom adeno-associeret virale vektorer (AAVs) kan give et rentabelt alternativ for at levere gen-redigering maskiner til cellerne. Desværre, AAV capsids besidder betydeligt lavere emballage kapacitet end LVs (< 5kb), der alvorligt hæmmer deres evne til at pakke den multi-komponent CRISPR toolkit inden for en enkelt vektor (gennemgik i reference8). Det er værd at bemærke, at tilsætning af stoffer, der hæmmer Histon deacetyltransferase (f.eks., natrium butyrat23) eller hindre cellecyklus (fx, koffein24) har vist sig at øge lentiviral titers. Trods de seneste fremskridt, er forbigående udtryk systemer udviklet hidtil stadig hæmmet af flere mangler, såsom lavere produktionseffektivitet, hvilket fører til nedsat viral titers og lav transduktion effektivitet af vira genereret gennem sådanne tilgange25.

Integrase-mangelfuld lentiviral vektorer (IDLVs) repræsenterer et stort fremskridt i udviklingen af gen-levering køretøjer, som de kombinerer den emballage kapacitet af LVs med den ekstra fordel af AAV-lignende episomal vedligeholdelse i celler. Disse funktioner hjælpe IDLVs i vid udstrækning omgå de store spørgsmål i forbindelse med integration af vektorer, vis-à-vis kontinuerlig overekspression af potentielt genotoksiske elementer og integration-medieret mutagenicitet. Tidligere blev det påvist, at IDLVs kan ændres med held til at forbedre episomal gen expression26,27. Med hensyn til IDLV-medieret CRISPR/Cas9 levering begrænser lav produktion titers og lavere udtryk af episome-bårne genomer i forhold til integrase-dygtige lentiviral systemer deres nytte som Bonafide værktøjer til leverer genom-redigering transgene konstruktioner. Vi har for nylig vist, at både transgen udtryk og viral titers tilknyttet IDLV produktion er betydeligt forbedret ved inddragelse af bindende websteder for transkriptionsfaktor Sp1 inden for viral udtryk kassette28. De modificerede IDLVs understøttes håndfast CRISPR-medieret gen redigering både in vitro- (i HEK-293T celler) og i vivo (i post mitotiske hjernen neuroner), mens inducerende minimal off target mutationer i forhold til de tilsvarende ICLV-medieret systemer28. Samlet set udviklede vi en roman, kompakt, All-in-one CRISPR toolkit transporteres på en IDLV platform og skitseret de forskellige fordele ved at bruge sådanne fremføringsmiddel for forbedret gen redigering.

Her, er produktion protokol af IDLV-CRISPR/Cas9-systemet beskrevet, herunder de forskellige trin involveret i montage, rensning, koncentration og titrering af IDLVs, samt strategier til at validere gen-redigering effekten af disse vektorer. Denne protokol er let skalerbar til at opfylde behovene hos forskellige efterforskere og er designet til at kunne generere LV vektorer med titers i rækken af 1 x 1010 transducing enheder (TU) / mL. Vektorer genereres via denne protokol kan udnyttes til at effektivt inficere flere forskellige celletyper, herunder vanskeligt at transduce embryonale stamceller, hæmatopoietisk celler (T-celler og makrofager) og kulturperler og in vivo- injiceres neuroner. Derudover er protokollen lige så velegnet til produktion af integrase-kompetente lentiviral vektorer i lignende mængder.

Figure 1
Figur 1: IDLV emballage. (a) skematisk af vildtype integrase protein (b) den modificerede plasmid stammer fra psPAX2 (Se metoder, plasmid konstruktion for detaljer). Repræsentant Agarosen gel billede af kloner screenet for muterede integrase kloner. DNA-prøver udarbejdet ved hjælp af en standard plasmid DNA isoleret mini kit blev analyseret af fordøjelse med EcoRV og SphI. Korrekt fordøjet klon (nummer 5, stiplet rød boks) blev yderligere bekræftet ved direkte (Sanger) sekventering substitutionsrelevante D64E i INT. Integrase-mangelfuld emballage kassette blev opkaldt pBK43. (c) skematisk af forbigående Transfektion protokol ansat til at generere IDLV-CRISPR/Cas9 vektorer, viser 293T celler transfekteret med VSV-G, emballage og transgen kassetter (Sp1-CRISPR/Cas9 All-in-one plasmid). Viruspartikler, der bud ud fra cellens membran indeholder den fuld længde RNA af vektoren (udtrykt fra transgene kassette). Den anden generation af IDLV-emballagesystem blev brugt, som omfatter de lovgivningsmæssige proteiner Tat og rev Rev udtryk er yderligere suppleres fra en separat kassette (RSV-REV-plasmid). Kongerige: LTR-lang-terminal gentage, VSV-G, vesikulær stomatitis virus G-protein, pCMV-cytomegalovirus promotor; Rous sarkom virus (RSV) promotor; RRE-(Rev svar Element). Andre regulerende elementer på udtryk kassette omfatter Sp1-bindingssteder, Rev Response element (RRE), Woodchuck Hepatitis Virus posttranskriptionelle regulerende Element (WPRE), en kerne-brudforlængelse faktor 1α promotor (EFS-NC), vektor emballage element ψ (psi), menneskelige Cytomegalovirus (hCMV) promotor og menneskelige U6 promotor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. dyrkning HEK-293T celler og såning celler for Transfektion

Bemærk: Menneskelige embryonale nyre 293T (HEK-293T) celler dyrkes i DMEM, høje glukose media suppleret med 10% kvæg kalveserum suppleret med jern og vækst initiativtagere og 1 x antibiotikum-antimykotikum løsning (100 x opløsning indeholder 10.000 enheder penicillin 10 mg streptomycin og 25 µg amphotericin B pr. mL). Medierne er også suppleret med 1 x natrium pyruvat, 1 x ikke-essentiel aminosyre mix og 2 mM L-glutamin (stock 200 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptid i 0,85% NaCl). Celler er kulturperler i 100 mm vævskultur plader (omtrentlige vækst areal er 55 cm²). En sub dyrkning forholdet 1:10 er brugt sub dyrkning hver 2-3 dage. Trypsin-EDTA 0,05% bruges til dissociation af cellerne mellem passager. For at bevare sammenhængen mellem eksperimenter, vi anbefaler test kalv sera, når du skifter til et nyt lot/batch og overvåge eventuelle ændringer i cellevækst, Transfektion effektivitet, og vektor produktion.

  1. Start en ny kultur ved hjælp af lav passage celler (det anbefales ikke at bruge celler efter passage 15 eller hvis vækst bremser) ved såning i en 10-cm vævskultur plade. Brug DMEM suppleret med 10% serum for cellevækst. Vokse celler ved 37 ° C med 5% CO2 i en standard cellekultur inkubator. Brug en standard hemocytometer til at tælle celler for alle efterfølgende trin.
  2. Når cellerne kommer til 90-95% sammenflydende vækst, reseed til 15 cm vævskultur plader (nedenfor, trin 1,3 - 1,5).
  3. For at reseed, aspirat medier fra sammenflydende plade og skylles forsigtigt med sterilt 1 x PBS. Celler med 2 mL af dissociation reagens (f.eks.Trypsin-EDTA) der inkuberes ved 37 ° C i 3-5 min. tilføje 8 mL af medier indeholdende serum for at inaktivere dissociation reagens, og hakkede 10 - 15 gange med 10 mL serologisk pipette til at oprette en enkelt celle suspension. Resuspend celler i dyrkningsmedier til at opnå en celle massefylde på ca 4 x 106 celler/mL.
  4. For at fremme overholdelsen til underlaget, pre pels 15 cm plader med 0,2% gelatine, tilføjer 8 mL af gelatine pr. plade. Fordelt jævnt på overfladen af pladen, Inkuber ved stuetemperatur i 10 min, og sifon fra væsken.
  5. Bringe den samlede mængde af hver plade til 25 mL med varme (37 ° C) HEK-293 T media (Se Note under trin 1) og seed pladerne ved at tilføje 2,5 mL af celler (samlede ~ 1 x 107 celler/plade). Inkuber plader ved 37 ° C med 5% CO2 natten over eller indtil 70-80% confluency er nået.
    Bemærk: Op til seks 15 cm plader kan bruges til produktion. Justere lydstyrken af medier pr. plade til ~ 20-22 mL, når du bruger mere end fire plader (Se trin 5 i protokollen om rationale).

2. transfecting HEK-293T celler ved hjælp af en Calcium fosfat-baseret protokol

  1. Transfektion reagenser
    1. For at forberede 2 x BES-buffered løsning BBS (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4), kombinerer 16.36 g NaCl, 10.65 g af BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-amino-ethanesulfonic syre), og 0.21 g Na2HPO4. Tilføje dobbeltdestilleret H2O (dd-H2O) op til 900 mL. Opløses, titreres til pH 6.95 med 1 M NaOH, og bringe volumen til 1 L. Filter via 0,22 µM filterenhed. Opbevares ved-20 ° C.
    2. Forberede 1M CaCl2. Filtrer løsning via et 0,22 µM filter. Opbevares ved 4 ° C.
  2. Overholde de plader, der var seedet en dag forud. Celler er klar til Transfektion, når de når 70-80% confluency.
  3. Opsug gamle medier fra pladerne og forsigtigt tilføje frisklavede medier uden serum.
    Bemærk: Se Supplerende fil 1-plasmider for detaljer om de valgte plasmider og deres forberedelse.
  4. Forberede plasmid mix af aliquoting fire plasmider i en 15 mL konisk slange. For en enkelt 15-cm parabol forberedelse, bruge 37,5 µg af den CRISPR/Cas9-transfer vektor (pBK198 eller pBK189), 25 µg for pBK43 (psPAX2-D64E), 12,5 µg pMD2.G og 6,25 µg af pREV (figur 1 c).
  5. Tilføj 312.5 µL 1M CaCl2 til plasmid mix. Dette, tilføje op til 1,25 mL sterilt dd-H20.
  6. Langsomt (Dråbevist) tilsættes 1,25 mL 2 x BBS mens vortexing mix. Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur.
  7. Tilføje Transfektion blandingen dråbevis til hver 15-cm plade (2,5 mL pr. plade). Swirl pladerne forsigtigt og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 for 2-3 h. Derefter tilføje 2,5 mL (10%) serum pr. plade og fortsætte inkubering natten over (12-18 h).
    Bemærk: Nogle labs anvender 3% CO2 inkubatorer til at stabilisere media pH. Dog overholder vi ikke nogen forskel i Transfektion effektivitet mellem 3% og 5% CO2. Også, størrelsen af CaPO4 udfældes er afgørende for Transfektion effektivitet; Transfektion mix har at blive klar før dets tilsætning på cellerne. Hvis blandingen bliver overskyet under inkubation, forberede frisk 2 x BBS (pH = 6.95).

Figure 2
Figur 2: koncentration af virale partikler ved hjælp af dobbelt-saccharose gradient protokol. Viruspartikler indsamlet fra supernatanten (SN) er lastet på gradient saccharose gradient. 70%, 60%, 30% og 20% saccharose løsninger bruges til at oprette gradient. Efter centrifugering, Partiklerne indsamles fra 30-60% saccharose fraktioner er yderligere læsset på en 20% saccharose pude og udfældet. Den endelige pellet, der indeholder renset viruspartikler er genopslemmes i 1 x PBS for yderligere forbrug (Se tekst for yderligere detaljer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

3. dagen efter Transfektion

  1. Iagttage cellerne til at sikre, at de nærmer sig 100% confluency på dette punkt med lidt at ingen celledød. Erstatte medier ved at tilføje 25 mL frisk DMEM + 10% serum til hver plade. Fortsætte inkubation ved 37 ° C med 5% CO2 for en yderligere 48 h.
    Bemærk: Justere mængden af medier i trin 3.1 Hvis bruger mere end seks 15 cm plader (Se trin 5.2, Bemærk).

4. høst Virus

  1. Omhyggeligt indsamle supernatanten fra alle vævskultur plader der indeholder de transfected celler ved hjælp af en steril 10 mL vævskultur pipette og pool i 50 mL centrifugeglas.
  2. Ryd suspensionen ved centrifugering ved 400-450 x g i 10 min. ved hjælp af en bordplade centrifuge. Filtrer supernatanten gennem et 0,45 µm vakuum filterenhed.
    Bemærk: Den filtrerede supernatanten kan opbevares ved 4 ° C i op til 4 dage før du går videre med koncentration, eller aliquoted og opbevares ved-80 ° C. De forventede titers IDLV-Sp1-CRISPR/Cas9 (ikke-koncentreret) viral præparater bør være ~ 2 x 107 TU/mL (Se trin 6 for titer bestemmelse). Undgå dog underkaste de virale præparater til flere fryse-tø cykler, som hver runde af nedfrysning og optøning resulterer i en 10-20% tab i funktionelle titers.

5. koncentrering af virale partikler af ultracentrifugering

Bemærk: Vi benytter en dobbelt-saccharose metode til rensning, der indebærer to trin: en saccharose gradient skridt og en saccharose pude trin (figur 2).

  1. Indlæse konisk ultracentrifugering rør i følgende rækkefølge til at oprette en graduering, saccharose: 0,5 mL 70% saccharose (opløst 1 x PBS), 0,5 mL 60% saccharose (opløst i DMEM), 1 mL 30% saccharose (opløst i DMEM) og 2 mL 20% saccharose (opløst i 1 x PBS).
  2. Tilføje virus-holdige supernatanten omhyggeligt til gradient. Som den samlede mængde af supernatanten fra fire 15 cm plader er 100 mL, bruge seks ultracentrifugering rør pr. spin til at behandle den fuld volumen af virussen supernatanten.
    1. Hver ultracentrifugering rør anvendes til dette trin har et volumen kapacitet på op til 30 mL (herunder mængden af saccharose), distribuere viral supernatanten ligeligt mellem rør, forlader mindst 10% headspace at undgå spild.
    2. Justere kultur lydstyrken til ~ 20-22 mL pr. plade når du bruger mere end fire 15 cm plader til hvert eksperiment, således at endelige mængden af poolede viral supernatanten kan nemt rummes inden for seks ultracentrifugering rør.
    3. Fyld ultracentrifugering rør til mindst tre fjerdedele deres samlede kapacitet, ellers knækker af rør kan forekomme under centrifugering, resulterer i mulige tab af prøven og/eller udstyr skader.
  3. Balance rør med 1 x PBS og centrifugeres prøver på 70.000 x g i 2 timer ved 17 ° C (Se Tabel af materialer til rotoren detaljer).
    Bemærk: For at undgå forstyrrelser af saccharose lag under acceleration, indstille ultracentrifuge til langsomt fremskynde rotoren til 200 rpm i løbet af de første 3 min af spin. Tilsvarende, indstille ultracentrifuge til langsomt aftage rotoren fra 200 rpm til 0 rpm over 3 min i slutningen af spin.
  4. Omhyggeligt indsamle 30-60% saccharose fraktioner i ren rør (figur 2). Tilføje koldt 1 x PBS til de poolede fraktioner og opdrage volumen på 100 mL; mix af pipettering op og ned flere gange.
  5. Fortsæt til saccharose pude trin af omhyggeligt lagdeling af viral forberedelse på en saccharose pude. For dette, 4 mL 20% saccharose (i 1 x PBS) tilsættes til rør, efterfulgt af ~ 20-25 mL af viral pr tube. Hvis rør er mindre end tre fjerdedele fuld, top op med sterilt 1 x PBS.
  6. Nøje afveje og centrifugeres prøver på 70.000 x g i 2 timer ved 17 ° C, som før. Hæld supernatanten og tillade de resterende væske kan løbe af invertere rør på papirservietter.
  7. Opsug resterende dråber for at fjerne alle væske fra toerstoffet. På dette trin bør de virus-holdige piller være knapt synlige som små gennemsigtige pletter.
  8. Resuspend pellets ved at tilføje 70 µL 1 x PBS til første tube og grundigt pipettering suspension, efterfølgende overføre suspension til det næste rør og blanding som før, fortsætter indtil alle pellets er genopslemmes.
  9. Skyl rør med en yderligere 50 µL koldt 1 x PBS og mix som før. Sikre, at den kombinerede mængde af den endelige suspension er ~ 120 µL, og virker lidt mælkehvid; klare det ved centrifugering ved 10.000 x g for 30 s på en bordplade microcentrifuge.
  10. Overføre supernatanten til en frisk mikrofuge tube, gøre 10 µL delprøver, og opbevar dem ved-80 ° C.
    Bemærk: Undgå at udføre gentagne fryse-tø cykler på de lentiviral prøver. Undtagen når centrifugering er påkrævet, bør indsats være lavet til at udføre de resterende trin i vævskultur emhætter, eller udpeget vævskultur rum ved hjælp af passende biosikkerhed foranstaltninger (Se diskussion).

6. vurdering af Viral Titers

  1. p24 -enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) metode
    Bemærk: Analysen er udført ved hjælp af high-bindende 96-brønd plader som pr instruktioner af NIH AIDS Vaccine Program for HIV-1 p24 Antigen Capture Assay Kit (Se Tabel af materialer) med ændringer29.
    1. Den næste dag, brøndene vaskes tre gange med 200 µL 0,05% Tween 20 i kolde PBS (PBS-T løsning). Pels plade med 100 µL monoklonalt anti-p24 antistof på en fortynding af 1:1500 i 1 x PBS og inkuberes natten over ved 4 ° C.
    2. For at fjerne ikke-specifik binding, blokere pladen med 200 µL 1% BSA i PBS; vaskes tre gange med 200 µL 0,05% Tween 20 i kolde PBS (PBS-T løsning) i mindst 1 time ved stuetemperatur.
    3. Forberede prøverne: For koncentreret vektor præparater, fortyndes 1 µL af prøven 100 ved at tilføje 89 µL af dd-H20 og 10 µL af Triton X-100 (endelig koncentration på 10%). For ikke-koncentreret præparater, forberede billeddetaljerne fortyndede prøver (tilføje 80 µL af dd-H20 og 10 µL af Triton X-100 (endelig koncentration på 10%) til 10 µL af prøven).
      Bemærk: Prøver kan opbevares ved-20 ° C på dette trin i en længere periode af tid til senere brug.
    4. Forberede HIV-1 standarder ved at anvende en 2-fold seriel fortynding (med en begyndende koncentration 5 ng/mL).
    5. Fortynd koncentreret prøver (fra 1: 100 forud fortyndede bestande) i RPMI 1640 suppleret med 0,2% Tween 20 og 1% BSA at etablere 1:10, 000, 1:50, 000, og 1:250,000 fortyndinger. Fortynd ikke-koncentreret prøver (fra 1:10 forud fortyndet bestande) i RPMI 1640 suppleret med 0,2% Tween 20 og 1% BSA at etablere 1: 500, 1: 2500 og 1:12,500 fortyndinger.
    6. Anvende prøver på plade i tre og inkuberes natten over ved 4 ° C.
    7. Den næste dag, brøndene vaskes seks gange og inkuberes ved 37 ° C i 4 timer med 100 µL polyklonale kanin anti-p24 antistof, fortyndet 1:1000 i RPMI 1640, 10% FBS, 0,25% BSA og 2% normal mus serum (nye medlemsstater).
    8. Vaske seks gange som ovenfor og inkuberes ved 37 ° C i 1 time med ged anti-kanin peberrodsperoxidase IgG fortyndet 1:10,000 i RPMI 1640 suppleret med 5% normal ged serum, 2% NMS, 0,25% BSA og 0,01% Tween 20.
    9. Vaske pladen, som ovenfor, og inkuberes med TMB peroxidase substrat ved stuetemperatur i 15 min.
    10. Reaktionen standses ved at tilføje 100 µL 1 N HCL. Måle prøve absorbans ved 450 nm ved hjælp af absorbansen plade læser.
  2. Måling af fluorescerende reporter intensitet
    1. FACS metode
      Bemærk: Omfanget af normal god landbrugspraksis signal iltsvind i celler kan anslås nøjagtigt ved måling betyde fluorescens intensiteten af de transduced celler via flowcytometri. Henvises til den nylige papir 28 for FACS dataanalyse, præsentation og tolkning. Protokollen er beskrevet som følger.
      1. Gøre en billeddetaljerne seriel fortynding af forberedelse (fra 10-1 til 10-5) af den virale forberedelse i 1 x PBS.
      2. Seed ca 5 x 105 293T celler i hver brønd med en 6-godt plade i en endelige mængden af 2 mL pr. brønd. Tilføje 10 µL af hver viral fortynding til cellerne og inkuberes celler ved 37 ° C i 48 timer.
      3. Høste celler til FACS analyse som følger: tilføje 200 µL 0,05% Trypsin-EDTA-opløsning og inkuberes celler ved 37 ° C i 5 min. Tilføj 2 mL af en komplet DMEM medier og indsamle prøver i 15 mL konisk rør.
      4. Pellet celler ved centrifugering ved 400 x g ved 4 ° C, og resuspenderes i 500 µL koldt 1 x PBS.
      5. Til fiksation, tilføje et lige saa stort volumen af 4% formaldehyd løsning til denne suspension og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur.
      6. Pellet fast celler og resuspend i 1 mL af 1 x PBS. Analysere normal god landbrugspraksis udtryk ved hjælp af en FACS instrument, som beskrevet i Ortinski et al. 28 kort, bruge følgende formel til at bestemme den virus' funktionelle titer:
        Equation 1
        Bemærk: Her Tg = antallet af normal god landbrugspraksis-positive celler tælles; TN = total antal celler tælles; N = totalt antal af celler transduced; V = volumen (i µL) anvendes til transduktion. For eksempel: Hvis 1 x 106 celler blev transduced med 10 µL af virus, 2 x 104 celler var optalte, og 5 x 103 var normal god landbrugspraksis-positive, baseret på de ovenstående ligning funktionelle titer ville være:
        Equation 2
    2. Tælle normal god landbrugspraksis-positive celler
      1. Beregne mangfoldighed af infektion (MOI) anvendes til transduktion. Teste en bred vifte af MOIs (1-10), med stigende MOIs resulterer i en højere transduktion effektivitet.
      2. Før Transfektion, frø en 6-godt plade med ca 3-4 x 105 celler pr. brønd. Når cellerne kommer til > 90% confluency (normalt inden for 24 timer), transduce med virussen renset på forhånd fastlagte MOIs.
      3. Inkuber plade ved 37 ° C med 5% CO2 i en standard vævskultur og monitor celler med jævne mellemrum i 1-7 dage for ændringer i normal god landbrugspraksis signal.
      4. Tæl antallet af normal god landbrugspraksis-positive celler med en fluorescerende mikroskop (PLAN 4 X mål, 0,1 Nielsen, 40 X forstørrelse) udstyret med en normal god landbrugspraksis filtersæt (excitation bølgelængde-470 nm, emission bølgelængde-525 nm), ved hjælp af naive (un-transduced) celler til at sætte befolkningen af normal god landbrugspraksis-negative og positive celler.
      5. Vurdere den endelige titer ved at justere for fortyndingsfaktoren og diskenhed ved hjælp af følgende formel:
        Equation 3
        Bemærk: Her, N = antallet af normal god landbrugspraksis-positive celler, D = fortyndingsfaktoren, M = forstørrelse faktor (normalt 20 X), V = volumen af virus, som benyttes til transduktion. For eksempel, for 20 normal god landbrugspraksis-positive celler (N) tælles på en fortynding af 10-4 (1:10, 000) i en 10 µL prøve (V) på 20 X forstørrelse (M) (D) ville resultere i en funktionel titer (20 x 10,4) x (20) x (10) x (100 *) = 4 x 108 TU/mL.
        (* til at tilpasse sig pr. mL)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering af IDLV-CRISPR/Cas9 vektorer knockout-effektivitet
Vi brugte normal god landbrugspraksis-udtrykker 293T celler som en model til at validere effektiviteten af CRISPR/Cas9-medieret gen knockout. Normal god landbrugspraksis + celler blev genereret af transduktion af HEK-293T celler med pLenti-NGL (vBK201a) på et MOI af 0,5 (figur 3b, "no-virus" panel). SgRNA-til-normal god landbrugspraksis/Cas9 All-in-one vektor kassette var pakket ind i IDLV eller ICLV partikler og produktionseffektivitet blev vurderet af p24 ELISA (se ovenfor, og figur 3a). Titers vektorer der indeholder Sp1-bindingssteder (følgende koncentration) fandtes for at være i rækken af 1010 TU/mL. Vi derefter vurderes effektiviteten af normal god landbrugspraksis knockout ved hjælp af fluorescerende mikroskopi (figur 3b). Med henblik herpå, 5 x 105 normal god landbrugspraksis-udtrykker 293T celler var seedet til en 6-godt plade og vi transduced dem 24 timer senere med IDLV - eller ICLV-CRISPR/Cas9 på MOIs 1 og 5 (figur 3b). Cellerne blev udruget for 24 timer, hvorefter næringssubstratet blev udskiftet og celler blev udruget for en yderligere 48 h, før sædekorn pladerne for efterfølgende dage af eksperimentet.

I en nylig undersøgelse målte vi gennemsnitlige fluorescens-intensiteten af normal god landbrugspraksis + celler transduced med ICLV/CRISPR eller IDLV/CRISPR komponenter via flow flowcytometri28. Vi så sammenlignelige normal god landbrugspraksis-iltsvind i både prøver 14 dage efter transduktion (pt) (2-4% signal udtynding), og næsten identiske normal god landbrugspraksis udtynding 21 dage pt (> 99% signal udtynding)28. I overensstemmelse med tidligere bemærkninger, vi observeret en ~ fem gange reduktion i antallet af normal god landbrugspraksis-positive celler så tidligt som 7 dage pt (figur 3), med en næsten komplet signal udtynding observeret af 14 dage pt (data ikke vist) efter transduktion med både ICLV - og IDLV-CRISPR/Cas9 systemer. Signaltab blev evalueret som forholdet mellem de celler, der forblev normal god landbrugspraksis-positive efter behandling og det samlede antal naive normal god landbrugspraksis-positive celler. Disse resultater viser tydeligt, at CRISPR/Cas9 konstruktioner leveret af IDLVs er sammenlignelige med dem, der leveres af deres integration modparter i deres evne til at mægle, hurtig, robust og vedvarende gen redigering i dividere celler.

Figure 3
Figur 3: evaluering af viral titers. a af p24-ELISA assay. Titers for koncentreret Sp1-IDLV-CRISPR/Cas9 (sorte bjælke) og Sp1-ICLV-CRISPR/Cas9 (hvid kolonne) blev evalueret. Resultaterne registreres i kopi numre pr. mL, hvor 1 ng Pedersen24-gag = 1 x 104 virale partikler. Søjlediagrammet data repræsenterer gennemsnit ± SD fra tredobbelt eksperimenter. (b) vurdering af CRISPR-medieret normal god landbrugspraksis-knockout effektivitet. Udtynding af normal god landbrugspraksis signal blev sammenlignet mellem ICLV-CRISPR/Cas9 - og IDLV-CRISPR/Cas9-transduced 293T normal god landbrugspraksis + celler på MOIs 1 og 5. Un-transduced ("ingen virus" panel i figur) NGL-positive celler blev brugt som kontrol. Billeder blev erhvervet ved hjælp af et fluorescens mikroskop på 40 X forstørrelse på 7 dage post transduktion. Kongerige: RRE: Rev Response Element, EFS-NC: core-brudforlængelse faktor 1α promotor, ψ (psi): vektor emballage element, hU6: menneskelige U6 promotor, Puro: Puromycin-modstand kassette, WPRE: Woodchuck Hepatitis Virus posttranskriptionelle regulerende Element, LTR: Long-terminal gentagelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1: plasmider Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

IDLVs begyndt at dukke op som køretøjet af valg til i vivo gen-redigering, især i forbindelse med genetiske sygdomme, i vid udstrækning på grund af lav risiko for mutagenese forbundet med disse vektorer i forhold til at integrere levering platforme22 , 28. i det aktuelle manuskript, søgte vi at detalje den protokol, der er forbundet med produktionen af den forbedrede All-in-one IDLV-CRISPR/Cas9 system, der var for nylig udviklet i vores laboratorium28.

Ændringer til eksisterende platforme
Med denne metode var vi i stand til at generere IDLV-CRISPR/Cas9 og ICLV-CRISPR/Cas9 vektorer på titers i rækken af 1 x 1010 TU/mL (figur 3a). Denne forbedring i produktionseffektivitet kan tilskrives tilsætning af Sp1-bindingssted i All-in-one CRISPR/Cas9 vektor kassette. Ja, vi for nylig rapporteret at optagelsen af Sp1 resultater i en ~2.5-fold stigning i emballage effektivitet af IDLV - og ICLV-CRISPR/Cas9 vektorer og en ~ 7-fold stigning i de samlede funktionelle titers. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere arbejde fra forskellige grupper fremhæve Sp1 som en vigtig regulator af vildtype HIV-130,31,32,33,34,35 .

Kritiske trin og fejlfinding
Som påpeget ovenfor, Sp1-IDLVs med var CRISPR/Cas9 transgener i stand til at generere titers omkring 1 x 1010 TU/mL pr. ~ 5 x 107 producent celler. Titers lavere end disse ville være et tegn på fejl i produktionsprocessen, i hvilket tilfælde afgørende følgende punkter bør overvejes for titer forbedring: 1) anbefales det, at producer celler helst være lav passage nummer, med udskiftning efter ≥15 passager-og/eller Hvornår langsommere vækst er observeret. 2) valget af celle medier komponenter er vigtige med hensyn til produktionseffektivitet. For eksempel, i stedet for den anvendte føtal bovint serum finder vi, at brugen af kosmiske kalveserum konsekvent forbedret cellevækst og viral produktionen, mens at være omkostningseffektive på samme tid. 3) de forskellige HEK linjer produktion egnethed bør vurderes omhyggeligt. For eksempel, fandt vi en ~ tredobbelt forskel på viral produktion udbytte i 293T celler og 293-FT (Se Tabel af materialer) celler (data ikke vist). 4) Det anbefales, at celler være transfekteret når de er omkring 70-80% sammenflydende, med lavere celle tætheder resulterer i for tidlig celledød som følge af viral toksicitet og højere tætheder resulterer i et markant fald i produktionseffektivitet. Som en tommelfingerregel foreslår vi tegner sig for en celle tæthed, der tillader celler til at gennemgå en ekstra runde af celledeling efter Transfektion. 5) Endelig er Transfektion effektivitet stærkt afhængige af pH-værdien af 2 x BBS, som opretholdes på præcis 6.95 for ideel Transfektion. Det er derfor stærkt anbefales, at hver ny batch af 2 x BBS kontrolleres på en pilot-Transfektion skala.

Vektor håndtering og sikkerhed
Der er flere vigtige sikkerhedsovervejelser i forbindelse med produktionen af IDLV og ICLV vektorer med denne protokol. Det første kræver arbejde med lentiviruses Bio-sikkerhed niveau II indeslutning. Trods de sikkerhedsfunktioner, der ydes af synd vektorer, har resterende transcriptional aktivitet fra synd vektorer været rapporteret36. Desuden tidligere arbejde har vist, at IDLV og ICLV genomer kan være produktivt reddet af HIV-127. Derfor anbefales det kraftigt at replikering kompetence assays (RCA) udføres, især når koncentreret lentiviruses bliver brugt37. For sikkerhedsprocedurer vedrørende håndtering af lentiviral vektor præparater, se biosikkerhed i mikrobiologiske og biomedicinske laboratorier, 4. udgave, udgivet af Centers for Disease Control (CDC), der kan findes online38. På samme notat, kan tredje generation emballage systemer39 med øget biosikkerhed funktioner bruges til at pakke IDLVs og ICLVs, omend med lavere energieffektivitet end den anden-generations system.

Betydning og fremtidige retninger
Samlet, produktion protokol for IDLVs for CRISPR/Cas9 - medieret gen redigering beskrevet her repræsenterer den første evaluering af effektiviteten af dette system i hurtigt dividere celler. Anvendelse af normal god landbrugspraksis-positive HEK-293T celler, viste vi at Sp1-CRISPR/Cas9 leveret af IDLVs kan effektivt og hurtigt redigere normal god landbrugspraksis i disse celler med lignende kinetik som ICLVs. Disse bemærkninger er stort set i overensstemmelse med resultaterne fra tidligere arbejde ved hjælp af ribonucleoprotein komplekser (Cas9 RNPs) til gen redigering gennem ikke-virale Transfektion metoder. Denne nye platform yderligere beriger den stadigt voksende værktøjskasse til levering af gen-redigering komponenter og andre Molekylær laster til cellerne.

Som omtalt tidligere, trods de seneste fremskridt i udviklingen af lentiviral-baserede gen-levering systemer, er der få til ingen muligheder for platforme, der giver mulighed for en bæredygtig produktion af high-titer virale vektorer for hurtige, forbigående og målrettede gen manipulation. Gennem inkorporering af bindende motiver for en stærkt udtrykt transskription faktor i transgene udtryk kassette, kunne vi samtidig løse flere af disse spørgsmål. Denne enkle, men kritisk manipulation åbner en række muligheder for at udvikle lignende leveringsplatforme. Det ville være særdeles nyttigt at teste, hvis Transgenets udtryk kan forbedres gennem enten tilsætning af mange kopier af den samme bindende motiv eller ved multiplexing Sp1 motiv med bindende websteder for andre transkriptionsfaktorer. Med sådanne værktøjer til vores rådighed, det er fristende at spekulere dette udtryk fra relativt svage væv-specifikke initiativtagere, som dem for menneskelige Synapsin jeg (hSyn) og mus calcium/calmodulin-afhængige protein kinase II (CaMKII), kunne være betydeligt forbedret både in vitro- og in vivo.

Mens den aktuelle undersøgelse var begrænset til afprøvning gen knockdown evne til IDLV leveret CRISPR/Cas9, i princippet, ville alsidigheden i vores system være åbne over for forskellige gen-redigering applikationer, såsom dem afhængige af katalytisk inaktive dCas940. Endelig, kombineret med mindre endonucleases, som SaCas941 og Cpf142, den platform, der er beskrevet i denne undersøgelse kan vedtages mod etablering af højeffektive AAV-baserede gen-levering systemer i et relativt kort tidsrum, som giver den ekstra fordel af lave immunogenicitet i forhold til lentiviral vektorer. Unødvendigt at sige ville sådanne metoder være et positivt skridt hen imod udviklingen af roman, effektiv, og klinisk sikker virale vektorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Patent USC-499-P (1175) blev indgivet af University of South Carolina i forhold til det arbejde, der er beskrevet i dette håndskrift.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke afdeling neurobiologi, Duke University School of Medicine og Dekansekretariatet for grundlæggende videnskab, Duke University. Vi takker også medlemmerne af hertug Viral vektor kerne for kommentarer på manuskriptet. Plasmidet pLenti CRISPRv2 var gave fra Feng Zhang (Broad Institute). LV-emballage system herunder plasmider psPAX2, var VSV-G, pMD2.G og pRSV-Rev en slags gave fra Didier Trono (EPFL, Schweiz). Finansiel støtte til dette arbejde blev leveret af universitetet i South Carolina School Of Medicine, give RDF18080-E202 (B.K).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
xMark Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
BD FACS Becton Dickinson 338960
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor Beckman Coulter 369650
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
High-binding 96-well plates Corning 3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Tissue culture pipettes, 5 mL Corning 4487
Tissue culture pipettes, 10 mL Corning 4488
Tissue culture pipettes, 25 mL Corning 4489
Hemacytometer with cover slips Cole-Parmer UX-79001-00
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
DMEM, high glucose media Gibco 11965
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) Sigma Aldrich B9879 - BES
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
pRSV-Rev Addgene 12253
lentiCRISPR v2 Addgene 52961
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsrGI New England Biolabs R0575S
BsmBI New England Biolabs R0580S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  2. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).
  3. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  4. Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).
  5. Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
  6. Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146 (2016).
  7. Wang, W., et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9 (12), e115987 (2014).
  8. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv Genet. 87, 125-197 (2014).
  9. Lebbink, R. J., et al. A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape. Sci Rep. 7, 41968 (2017).
  10. Xu, L., et al. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. , (2017).
  11. Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).
  12. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), e147 (2014).
  13. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).
  14. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  15. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  16. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
  17. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  18. Schaefer, K. A., et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).
  19. Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  21. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  22. Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).
  23. Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors. Virol J. 3, 27 (2006).
  24. Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
  25. Hoban, M. D., et al. Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).
  26. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  27. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  28. Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).
  29. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).
  30. Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).
  31. Gomez-Gonzalo, M., et al. The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter. J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).
  32. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  33. Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength. J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).
  34. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  35. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  36. Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors. Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).
  37. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations. , Available from: https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf (2017).
  38. CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2017).
  39. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  40. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  41. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  42. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).

Tags

Genetik spørgsmålet 130 Viral-medieret genoverførsel HEK-293T celler integrase-mangelfuld lentiviral vektorer CRISPR/Cas9 gen redigering system p24 ELISA saccharose-gradient ultracentrifugering FACS
En protokol til produktion af Integrase-mangelfuld Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-medieret gen Knockout i dividere celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A… More

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter