Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

Published: December 12, 2017 doi: 10.3791/56915
Automatic Translation
1, 1
1Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine

Summary

İntegrase-eksik lentiviral vektörler (IDLVs) üretim stratejisinin CRISPR/Cas9 hücrelere teslim etmek için Araçlar açıklanmaktadır. Hücrelerde hızlı ve sağlam gen düzenleme arabuluculuk için bir yetenek ile IDLVs bir daha güvenli sunmak ve eşit derecede etkili vektör platformu'gen dır integrase yetkili vektörlerinin karşılaştırıldığında.

Abstract

Lentiviral vektörel çizimler stabil geniş bir hücre aralığı transducing ve gen ekspresyonu yüksek düzeyde arabuluculuk için kendi kapasitesi nedeniyle hücrelere gen düzenleme bileşenleri teslim etmek için ideal bir seçim vardır. Ancak, konak hücre genomu entegre yeteneğini insertional mutagenisitesinin riskini artırır ve böylece güvenlik endişeleri yükseltir ve bunların kullanım klinik ayarları sınırlar. Ayrıca, gen düzenleme bileşenleri kalıcı ifade bu entegrasyon yetkili lentiviral vektörler (ICLVs) artışlar tarafından promiscuous gen hedefleme olasılığı teslim. Alternatif olarak, integrase-eksik lentiviral vektörler (IDLVs) yeni nesil birçok bu kaygıları gideren geliştirilmiştir. Burada CRISPR-aracılı gen düzenleme ve liste için yeni ve geliştirilmiş IDLV platform üretim protokolünden adımları arıtma yer ve konsantrasyon gibi vektörlerin anlatılan ve iletim ve gen Düzenleme verimliliği HEK-293T kullanarak hücreleri gösterdi. Bu iletişim kuralı kolayca ölçeklenebilir ve hücre içinde vitro ve içinde vivotransducing yeteneğine sahip yüksek titresi IDLVs oluşturmak için kullanılabilir. Ayrıca, bu iletişim kuralını ICLVs üretimi için kolayca adapte edilebilir.

Introduction

Kesin gen düzenleme genetik hastalıklar mücadele için yeni strateji geliştirme dahil önemli Biyomedikal gelişmeler dönüm noktası oluşturur. At gen düzenleme teknolojileri ön planda olduğunu lustered c regularly -ınterspaced short palindromic repeats (CRISPR) kullanımı hakkında güvenerek yöntemi / başlangıçta tespit edildi Cas9 sistemi Bakteriyel bağışıklık (başvurular1,2' gözden) viral genetik materyal işgali karşı bir bileşeni olarak. Çinko-parmak enzimler (ZFNs) ve (başvuru3gözden geçirme), transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs) gibi diğer gen düzenleme araçları üzerinde büyük bir avantaj CRISPR/Cas9 sisteminin göreli basitliğidir plazmid tasarım ve İnşaat CRISPR bileşenlerinin — gen düzenleme birkaç özel laboratuvarları üzerinden daha geniş bir araştırma topluluk sadece bir genişleme powered bir özellik. Ayrıca, CRISPR/Cas9 programlama sadeliği ve çoğaltılmış hedef tanıma kapasitesini daha da popülaritesini düşük maliyetli ve kolay kullanımlı teknoloji olarak yol açtı. Araştırmacılar bu tür gen düzenleme bileşenleri hücrelere sunmak için kullanabileceği çeşitli yöntemler arasında viral vektörler farkla en popüler ve etkili sistem kalır.

Lentiviral vektörel çizimler (LVs) CRISPR/Cas9 sistem vivo içinde çeşitli uygulamalar4,5,6,7için bileşenleri sunmak için Seçim aracı olarak ortaya çıkmıştır. Birkaç temel özellikleri LVs hücrelerin bölünmesi ve sigara bölen, düşük immünojenisite hem en az hücresel toksisite (başvuru8' gözden) bulaştırmak onların da dahil olmak üzere bu işlem için popüler bir seçimdir. Sonuç olarak, LV-aracılı gen tedavisi tedaviler HIV-1, HBV ve HSV-1, gibi bulaşıcı hastalıkların yanı sıra insan kalıtsal hastalıklar, Kistik fibrozis ve neo-vasküler makula dejenerasyonu gibi temel hataları düzeltme istihdam edilmiştir 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Ayrıca, LVs etkili bir şekilde değiştirilmiş bir tek vektör sistemi12kullanarak farklı genomik loci multiplex gen düzenleme işlemleri yapmak için.

Ancak, ana bilgisayar genom entegre LVs doğal özellik ve mutajenik olabilir sık sık onların programı transgene teslim araçlarda, özellikle klinik ayarları olarak yetersizlik. LVs stabil entegre sürdürülebilir yüksek düzeylerde onların transgenes hızlı, Ayrıca, bu sistem kötü CRISPR/Cas9 gibi gen düzenleme bileşenlerinin teslimatlar için uygun olduğu için; overexpression Cas9-guide RNA (gRNA) ve ZFNs gibi benzer proteinler yüksek seviyede istenmeyen mutasyonlar13,14,15,16 dahil hedef kapalı etkileri ile ilişkili , 17 ve potansiyel olarak sitotoksisite18geliştirebilirsiniz. Bu nedenle, kesin ulaşmak için gen düzenleme ile en az hedef sonuç, bu geçici Ifade gen bileşenlerinin düzenlenmesine izin tasarım sistemleri için zorunludur.

Son yıllarda, farklı platformlarda teslim geliştirilmiştir geçici hücreleri16,19,20,21 (başvuru22gözden) CRISPR/Cas9 ifade etmek için. Bunlar doğrudan uygun Kılavuzu RNA'lar ile birlikte saf Cas9 hücrelere, hangi hedeflenen gen düzenleme plazmid aracılıklı transfection16ile karşılaştırıldığında, daha etkili olduğu gösterilmiştir tanıtımı üzerinde itimat yöntemleri içerir. Çalışmalar bu Ribonükleoprotein (RNP) göstermiştir oluşan komplekslerin rehberlik RNA/Cas9 parçacıklar hızla devre DNA bölünme bu bileşenlerin kısa vadeli ifade ulaşmak için yeterli olduğunu düşündüren hedeflerine, arabuluculuk sonra sağlam gen16düzenleme. Makul, entegre adeno ilişkili viral vektörel çizimler (AAVs) gibi viral vektör platformlar hücrelere gen düzenleme makine sunmak için bir alternatif sağlayabilir. Ne yazık ki, önemli ölçüde daha düşük ambalaj yeteneği LVs daha AAV capsids sahip (< 5kb), hangi ciddi çok bileşenli CRISPR toolkit (başvuru8' gözden) tek bir vektör içinde paketlemek için yeteneklerini engellemektedir. Histon uyku (örneğin, sodyum bütrat23) inhibe veya hücre döngüsü (örneğin, kafein24) engel bileşikler ilavesi lentiviral titreleri artırmak için gösterilmiş olduğunu fazlalaştı. Son rağmen defa geliştirilen geçici ifade sistemleri hala azaltılmış viral titreleri ve düşük iletim verimliliği ile oluşturulan virüslerin yol birkaç eksiklikler, daha düşük üretim verimliliği gibi tarafından engellemiştir Böyle25yaklaşıyor.

AAV benzeri episomal bakım hücrelerdeki yararı ile LVs ambalaj kapasitesini AEI Integrase-eksik lentiviral vektörler (IDLVs) gen teslim araçların geliştirilmesinde önemli bir ilerleme temsil eder. Bu özellikler IDLVs büyük ölçüde vektörel çizimler, vis-à-vis sürekli overexpression olası genotoksik öğeleri ve entegrasyon-aracılı mutagenisitesinin entegre ile ilişkili önemli sorunları aşmak yardımcı olur. Daha önce IDLVs başarıyla episomal gen ifade26,27geliştirmek için değiştirilebilir gösterilmiştir. IDLV-aracılı CRISPR/Cas9 teslim açısından düşük üretim titreleri ve episome kaynaklı genleri integrase usta lentiviral sistemleri göre alt ifade sınırlar genom düzenleme teslim etmek için bona fide araçları olarak onların yardımcı programı transgenik yapıları. Biz son zamanlarda transgene ifade ve viral titreleri IDLV üretimle ilişkili önemli ölçüde siteleri viral ifade kaset28içinde transkripsiyon faktörü Sp1 için bağlama dahil tarafından geliştirilmiş olduğunu gösterdi. Değiştirilmiş IDLVs sağlam CRISPR-aracılı gen (HEK-293T hücrelerdeki) vitro ve in vivo (içinde sonrası Mitotik beyin sinir hücreleri), ICLV-aracılı ilgili karşılaştırıldığında çok az hedef kapalı mutasyonlar inducing düzenleme desteklenen sistemleri28. Genel olarak, bir roman geliştirdiğimiz, kompakt, tüm-içinde-bir CRISPR toolkit bir IDLV platformu üzerinde taşınan ve gelişmiş gen düzenleme gibi teslim araç kullanmanın çeşitli yararları sıraladı.

Burada, IDLV-CRISPR/Cas9 sisteminin üretim protokolü, derleme, arıtma, konsantrasyon ve titrasyon IDLVs, hem de stratejileri bu vektörel çizimler gen düzenleme etkinliğini doğrulamak için çeşitli adımlar da dahil olmak üzere tanımlanır. Bu iletişim kuralı farklı müfettişler ihtiyaçlarını karşılamak için kolayca ölçeklenebilir ve başarıyla birimleri (TU) transducing 1 x 1010 aralıkta titreleri ile LV vektörel çizimler oluşturmak için tasarlanmıştır / mL. Bu protokolü ile oluşturulan vektörel çizimler verimli bir şekilde birkaç farklı hücre tipleri, zor transduce embriyonik kök hücreler, hematopoetik hücreler (T-hücreleri ve makrofajlar) dahil olmak üzere ve kültürlü ve içinde vivobulaştırmak için kullanılması gereken- enjekte nöronlar. Ayrıca, protokol eşit integrase yetkili lentiviral vektörler benzer miktarlarda üretimi için uygundur.

Figure 1
Şekil 1: IDLV ambalaj. (a) şeması değiştirilmiş plazmid psPAX2 elde edilen vahşi türü integrase protein (b) (bkz: yöntemleri, plazmid inşaat detayları için). Mutasyona uğramış integrase klonlar için ekranlı klonlar temsilcisi özel jel görüntüsü. Bir standart plazmid DNA izolasyon Mini kit kullanılarak hazırlanan DNA örnekleri sindirim EcoRV ve SphI tarafından analiz edildi. Doğru sindirmek klon (sayı 5, kesik çizgili kırmızı kutu) daha fazla doğrudan (Sanger) sıralama INTD64E değişimi için tarafından doğrulandı. İntegrase-eksik ambalaj kaset pBK43 seçildi. (c) 293T hücre transfected VSV-G, ambalaj ve transgene kaset (Sp1-CRISPR/Cas9 tüm-içinde-bir plazmid) ile gösterilen IDLV-CRISPR/Cas9 Vektörler, üretmek için şematik geçici transfection Protokolü'nün istihdam. Hücre zarının bud viral parçacıkların (transgene kaset ifade edilir) vektör tam uzunlukta RNA içerir. Tat düzenleyici proteinler içeren IDLV paket yönetim sistemi ikinci nesil kullanıldı ve Rev Rev ifade daha da bir ayrı kaset (RSV-REV-plazmid) desteklenmiştir. ABBREV: soldan sağa-uzun-terminal tekrar ediyorum, VSV-G, vesicular Stomatit virüs G-protein, pCMV-Sitomegalovirüs organizatörü; Rous sarkomu (RSV) virüs organizatörü; RRE-(Rev yanıt öğesi). Diğer düzenleyici elemanlarının ifade kasetin Sp1 bağlayıcı siteleri, Rev Response öğesi (RRE), dahil Dağ sıçanı hepatit virüsü Posttranscriptional düzenleyici eleman (WPRE), bir çekirdek-uzama faktör 1α organizatörü (EFS-NC), vektör ambalaj öğe ψ (PSI), insan Sitomegalovirüs (hCMV) organizatörü ve insan U6 organizatörü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kültür HEK-293T hücreleri ve hücre Transfection için tohum

Not: İnsan embriyonik böbrek 293T (HEK-293T) hücreleri yetiştirilen DMEM, % 10 inek buzağı serum demir ve büyüme rehberleri ve 1 x antibiyotik antimycotic çözüm ile takıma ile desteklenmiş yüksek glikoz medya içinde (100 x çözüm içeren 10.000 adet penisilin 10 mg streptomisin ve 25 µg Amfoterisin B mL başına). Medya da 1 x sodyum pyruvate, 1 x esansiyel olmayan amino asit karışımı ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiştir (stok 200 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptid içinde % 0,85 NaCl). Hücreleri (olan yaklaşık büyüme yüzey alanı 55 cm²) 100 mm doku kültürü levha kültürlü. Bir alt işleme oranı 1:10 2-3 günde bir alt kültür ile kullanılır. Tripsin-EDTA % 0.05 ayrılma hücre arasındaki geçişleri için kullanılır. Deneyler arasında tutarlılık sağlamak için biz farklı bir çok/toplu işlemine geçiş yaparken test buzağı sera tavsiye ve hücre büyüme, transfection verimlilik, değişiklikleri izlemek ve üretim vektör.

  1. Yeni bir kültür 10 cm doku kültürü plaka tohum tarafından düşük geçiş hücreleri (Bu geçit 15 veya büyüme yavaşlar sonra hücreleri kullanmamayı tavsiye edilir) kullanarak başlatın. Hücre büyümesi için % 10 serum ile takıma DMEM kullanın. %5 CO2 standart doku kültürü kuluçka 37 ° C'de hücrelerin büyümesine. Tüm sonraki adımlar için hücreleri saymak için standart bir hemasitometre kullanın.
  2. Hücreleri doku kültürü tabak (aşağıda, adımları 1.3 - 1.5) % 90-95 Konfluent büyüme, 15 cm içine reseed ulaştığında.
  3. Reseed için medya Konfluent plaka Aspire edin ve yavaşça steril 1 x PBS ile durulayın. 3-5 dk. eklemek 8 mL serum ayrılma reaktif devre dışı bırakın ve 10 - 15 kez tek bir hücre oluşturmak için ile bir 10 mL serolojik bir pipet triturate içeren medya için 37 ° C'de bir ayrılma reaktif (örneğin, tripsin-EDTA) 2 mL hücrelerle kuluçkaya süspansiyon. Hücre kültür medya yaklaşık 4 x 106 hücre/mL hücre yoğunluğu elde etmek için resuspend.
  4. Belgili tanımlık substrate bağlılığı geliştirmek için % 0,2 jelatin, jelatin plaka başına 8 mL ekleme ile 15 cm tabak önceden kat. Eşit plaka yüzeyi boyunca yayılmış, 10 min için oda sıcaklığında kuluçkaya ve sıvı sifon.
  5. 25 mL sıcak (37 ° C) (bkz: Not 1. adımda altında) HEK-293 T medya ile her plaka hacmi getirmek ve tabakları hücre (Toplam ~ 1 x 107 hücreler/plaka) 2.5 mL ekleyerek temel olarak belirler. 37 ° c % 5 CO2 tabak gecede veya % 70-80 confluency ulaşılıncaya kadar kuluçkaya.
    Not: En çok altı 15 cm tabak üretimi için kullanılabilir. Medya ~ 20-22 mL plakasına başına dörtten fazla tabak (Adım 5 mantığı için protokolün bakın) kullanırken ses seviyesini.

2. transfecting HEK-293T Kalsiyum fosfat tabanlı bir protokol kullanarak hücreleri

  1. Transfection reaktifler
    1. 2 x BES arabelleğe alınmış çözüm BBS (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4) hazırlamak için 16.36 gram NaCl, BES 10.65 g birleştirmek (N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-amino-ethanesulfonic asit) ve 0,21 g Na2HPO4. Çift distile H2O (dd-H2O) eklemek ilâ 900 mL. Dağıtılması, pH 6,95 1 M NaOH ile titre ve 1 L. filtre 0,22 µM filtre ünitesi üzerinden ses getirmek. -20 ° C'de mağaza
    2. 1 M CaCl2hazırlayın. Eriyik yolu ile 0.22 µM filtre filtre. 4 ° C'de mağaza
  2. Bir gün önceden seribaşı plakaları gözlemlemek. Bir kez onlar uzanmak % 70-80 confluency transfection için hazır hücrelerdir.
  3. Tabakları eski medyadan Aspire edin ve yavaşça serum olmadan taze hazırlanan medya ekleyin.
    Not: Ek dosya 1-plazmid seçilen plazmit ve onların hazırlık hakkında ayrıntılı bilgi için bkz:.
  4. Plazmid mix aliquoting dört plazmid tarafından 15 mL konik tüp içine hazır olun. Bir tek 15 cm çanak hazırlık için CRISPR/Cas9-transfer vektör (pBK198 veya pBK189), 25 µg pBK43, 37.5 µg kullanın (psPAX2-D64E), 12,5 µg pMD2.G ve 6.25 µg önceki (şekil 1 c).
  5. 312,5 µL 1 M CaCl2 plazmid karışıma ekleyin. Bu, en fazla 1,25 mL steril dd-H20 ekleyin.
  6. Yavaş yavaş (drop-wise) 2 x BBS çözüm vortexing mix süre 1,25 mL ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
  7. Transfection karışımı dropwise her 15 cm tabak (plaka başına 2.5 mL) ekleyin. Tabakları yavaşça girdap ve % 5 CO2 için 2-3 h 37 ° C'de kuluçkaya. Bundan sonra 2.5 mL (% 10) serum plaka başına ekleyin ve kuluçka devam geceleme (12-18 h).
    Not: Bazı laboratuar ortam pH stabilize etmek için % 3 CO2 İnkübatörler kullanın. Ancak, herhangi bir transfection verimliliği % 3 ve % 5 CO2arasındaki farkı uygulamıyor. Ayrıca,4 precipitates CaPO boyutunu transfection verimlilik için önemlidir; transfection mix kendi ek hücreleri üzerine önce açık olmak zorunda. Mix kuluçka sırasında bulutlu olursa, taze 2 x BBS hazırlamak (pH 6,95 =).

Figure 2
Şekil 2: konsantrasyon çift-Sükroz degrade protokolünü kullanarak viral parçacıkların. Viral parçacıkların süpernatant (SN) toplanan degrade Sükroz degrade yüklenir. % 70, % 60, % 30 ve % 20 Sükroz çözümler gradyan oluşturmak için kullanılır. Santrifüjü, % 30-60 Sükroz kesirler toplanan parçacıklar daha fazla % 20 Sükroz yastık yüklenir ve çöktürülmüş. Arıtılmış viral parçacıkların içeren son Pelet 1 x PBS için daha fazla kullanım içinde resuspended (metin daha ayrıntılı bilgi için bakınız). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. gün Transfection sonra

  1. Onlar % 100 confluency bu noktada az hiçbir hücre ölümü ile yaklaşıyor sağlamak için hücre gözlemlemek. Ortamı her plaka için 25 mL taze DMEM + % 10 serum ekleyerek değiştirin. Ek bir 48 saat için % 5 CO2 ile 37 ° C'de kuluçka devam edin.
    Not: Eğer fazla altı 15 cm tabak (bkz. Adım 5.2, Not) kullanarak adım 3.1 medyada seviyesini ayarlamak.

4. hasat virüs

  1. Dikkatle süpernatant bir doku kültürü pipet steril 10 mL ve 50 mL santrifüj tüpleri havuzda kullanarak transfected hücreleri içeren tüm doku kültürü plakaları toplamak.
  2. Süspansiyon Santrifüjü 400-450 x g 10 dk bir masa üstü santrifüj kullanarak için de temizleyin. Süpernatant 0,45 µm vakum filtre ünitesi aracılığıyla filtre.
    Not: Filtre uygulanmış süpernatant konsantrasyon, işlemine devam etmeden önce 4 güne kadar 4 ° C'de depolanan veya bölünmemeli ve-80 ° C'de depolanmış olabilir IDLV-Sp1-CRISPR/Cas9 (konsantre olmayan) viral hazırlıklar beklenen titreleri-meli var olmak 2 ~ 10 x7 TU/mL (adım 6 titresi belirlenmesi için bakınız). Ancak, buz gibi ve fonksiyonel titreleri % 10-20 kaybına sonuçlarında çözdürme her turda olarak birden çok donma-çözülme çevrimleri için viral hazırlıklar tabi kaçının.

5. konsantrasyonu ultrasantrifüj tarafından Viral parçacıkların

Not: Biz bir çift-Sükroz yöntemi iki adımdan oluşur arınma kullanmaktadır: Sükroz degrade adım ve sukroz yastık adım (Şekil 2).

  1. Konik ultrasantrifüj tüpler Sükroz gradyan oluşturmak için aşağıdaki sırayla yükleyin: 0.5 mL % 70 sukroz (çözünmüş 1 x PBS), 0,5 mL % 60 sukroz (DMEM içinde çözünmüş), 1 mL % 30 sukroz (DMEM içinde çözünmüş) ve 2 mL % 20 sukroz (1 x PBS içinde çözünmüş).
  2. Virüs içeren süpernatant dikkatle degradeye ekleyin. Hacmi dört 15 cm tabak üzerinden süpernatant 100 mL olduğu için altı ultrasantrifüj tüpler spin başına süpernatant virüs tam hacmi işlemek için kullanın.
    1. Bu adım için kullanılan her ultrasantrifüj tüp ilâ 30 mL (sukroz hacmi de dahil olmak üzere) birim kapasitesi, viral süpernatant eşit tüpler, bırakarak en az % 10 arasında dağıtmak headspace dökülmeyi önlemek için.
    2. Böylece havuza alınan viral süpernatant son hacmi rahatça altı ultrasantrifüj tüpler içinde kalabileceği kültür ~ 20-22 ml plaka başına dörtten fazla 15 cm tabak her deneme için kullanırken ses seviyesini.
    3. Dolgu ultrasantrifüj en az üç dörtte için onların toplam birim kapasitesi borular, tüpler kırılma Santrifüjü mümkün kaybı örnek ve/veya ekipman hasar ile sonuçlanan, aksi takdirde gerçekleşebileceğini.
  3. 1 x 17 ° c 2 h için 70.000 x g de PBS ve santrifüj örnekleri tüplerini denge ( Tablo reçetesi rotor Ayrıntılar için bakınız).
    Not: hızlanma sırasında Sükroz katmanın kesinti önlemek için rotor için 200 d/d spin ilk 3 dk sırasında yavaş yavaş hızlandırmak için ultracentrifuge ayarlayın. Benzer şekilde, yavaş yavaş rotor 200 rpm 0 rpm 3 dk spin sonunda yavaşlatmak için ultracentrifuge olarak ayarlayın.
  4. Dikkatle % 30-60 Sükroz kesirler temiz tüpler içine (Şekil 2) toplamak. Soğuk 1 ekleyin PBS havuza alınan kesirler için x ve 100 mL; birime getirmek yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting karıştırın.
  5. Dikkatle viral hazırlık Sükroz yastık üzerinde katman tarafından Sükroz yastık adıma geçin. Bunun için ~ 20-25 mL tüp başına viral çözüm ardından tüp 4 mL % 20 sukroz (içinde 1 x PBS) ekleyin. Tüpler daha az üç dörtte iseniz tam, steril 1 x PBS ile kontör.
  6. Dikkatle denge ve santrifüj kapasitesi 70.000 x g 17 ° C'de 2 h için de örnekleri daha önce olduğu gibi. Süpernatant dökün ve kalan izin sıvı drain kağıt havlu üzerine boruları, ters çevirme.
  7. Kalan damlacıkları tüm sıvı Pelet kaldırmak için Aspire edin. Bu adımda, virüs içeren pellet ancak küçük saydam spot renkleri görünür olmalıdır.
  8. Granül ilk tüp ve iyice süspansiyon pipetting, daha sonra sonraki tüp süspansiyon aktarma ve tüm parçaları resuspended kadar devam etmeden önce gibi karıştırma için 1 x PBS 70 µL ekleyerek resuspend.
  9. Durulama soğuk 1 x PBS ve karışımı bir ek 50 µL tüplerini daha önce olduğu gibi. Son süspansiyon kombine hacmi ~ 120 µL ve biraz sütlü görünür emin olmak; Santrifüjü 10.000 x g 30 de tarafından açıkça bir masa üstü microcentrifuge s.
  10. Süpernatant taze microfuge tüp aktarın, 10 µL aliquots yapmak ve onları-80 ° C'de depolayın
    Not: tekrarlanan donma-çözülme döngüsü lentiviral örnekleri üzerinde performans kaçının. Santrifüjü gerekli olduğunda dışında çabaları doku kültürü davlumbaz kalan adımları gerçekleştirmek için yapılmış veya uygun Biyogüvenlik önlemleri (konuya bakın) kullanarak doku kültürü odaları özel içilir.

6. Viral titreleri tahmini

  1. p24 -enzim-bağlantılı immunosorbent assay (ELISA) yöntemi
    Not: Tahlil HIV-1 p24 NIH AIDS aşı programının talimatlarını başına antijen yakalama tahlil Kit gibi (bkz. Tablo reçetesi) değişiklikler29ile yüksek-bağlama 96-şey plakaları kullanarak gerçekleştirilir.
    1. Ertesi gün, wells üç kez 200 µL % 0.05 ile yıkayın ara 20 dakika soğuk PBS (PBS-T çözüm) içinde. Monoklonal anti-p24 antikor 1:1500 1 x PBS, seyreltme, 100 µL plakalı ceket ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya
    2. Non-spesifik bağlama ortadan kaldırmak için PBS 200 µL % 1 BSA ile plaka engellemek; üç kez 200 µL % 0.05 ile yıkama ara 20 dakika sonra soğuk PBS (PBS-T çözüm) oda sıcaklığında en az 1 h için.
    3. Hazırlamak örnekleri: Örnek 1 µL 100-fold konsantre vektör hazırlıkları seyreltik dd-H20 ile 10 µL Triton X-100 (son konsantrasyonu % 10), 89 µL ekleyerek. Sigara konsantre hazırlıkları panolarında seyreltilmiş örnekleri (dd-H20 ile 10 µL Triton X-100 (son konsantrasyonu % 10), 80 µL örnek 10 µL eklemek) hazırlayın.
      Not: Örnekleri bu aşamada-20 ° C'de daha sonra kullanım için zaman uzun bir süre saklanabilir.
    4. HIV-1 standartları (ile başlangıç konsantrasyonu 5 ng/mL) logosuna 2 kat bir seri seyreltme uygulayarak hazırlayın.
    5. RPMI 1:10, 000, kurmak için % 0,2 ara 20 ve % 1 BSA ile desteklenmiş 1640 yılında (1: 100 önceden seyreltilmiş hisse senetleri) konsantre örnekleri seyreltik 1:50, 000 ve 1:250,000 dilutions. Sigara konsantre örnekleri seyreltik (1:10 önceden hisse senetleri seyreltilmiş) RPMI 1:500, 1: 2500 ve 1:12,500 dilutions kurmak için % 0,2 ara 20 ve % 1 BSA ile desteklenmiş 1640 yılında.
    6. Triplicates plaka üzerinde örnekleri uygulamak ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya
    7. Ertesi gün, altı kez kuyuları yıkama ve 37 ° c 100 µL poliklonal tavşan anti-p24 antikor, seyreltilmiş 1: 1000 RPMI 1640, %10 FBS, % 0.25 BSA ve % 2 normal fare serum (NMS) ile 4 h için kuluçkaya.
    8. Altı kez yukarıdaki gibi yıkama ve 37 ° c için 1 h keçi Anti-tavşan horseradish peroksidaz ile seyreltilmiş IgG 1:10,000 RPMI %2 NMS, % 0.25 BSA ve % 0,01 ile % 5 normal keçi serum 1640 yılında kuluçkaya ara 20.
    9. Yukarıdaki gibi tabak yıkama ve TMB peroksidaz substrat 15 dakika oda sıcaklığında ile kuluçkaya.
    10. Reaksiyon 1 N HCL 100 µL ekleyerek durdurmak. Ölçmek örnek Absorbans 450 nm Absorbans kullanarak plaka okuyucu.
  2. Floresan muhabir yoğunluğu ölçümü
    1. FACS yöntemi
      Not: GFP sinyal tükenmesi hücrelerdeki ölçüde doğru Akış Sitometresi ile transduced hücrelerin ortalama Floresans yoğunluğu ölçerek tahmin edilebilir. Son kağıt 28 FACS veri analizi, sunum ve yorumu için başvurun. İletişim kuralı aşağıdaki gibi tanımlanır.
      1. Viral hazırlık (10-1 10-5) üzerinden hazırlanması panolarında bir seri seyreltme 1 x PBS içinde olun.
      2. Her şey iyi başına 2 mL son bir hacim içinde 6-şey plaka yaklaşık 5 x 105 293T hücrelerde tohum. Her viral seyreltme 10 µL hücrelere ekleme ve hücreleri için 48 h 37 ° C'de kuluçkaya.
      3. Hücreleri FACS çözümleme için aşağıdaki gibi hasat: 200 µL % 0.05 tripsin-EDTA çözüm ekleyin ve 5 dakika süreyle Ekle 2 mL tam bir DMEM medya 37 ° C'de hücreler kuluçkaya ve 15 mL konik tüpler içine örnekleri toplamak.
      4. Hücreleri tarafından Santrifüjü 400 x g 4 ° c de cips ve Pelet soğuk 1 x PBS 500 µL içinde resuspend.
      5. Fiksasyon için bu süspansiyon için % 4 formaldehit çözümün eşit bir birim eklemek ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
      6. Sabit hücreleri cips ve 1 mL 1 x PBS resuspend. Ortinski ve ark. içinde açıklandığı gibi GFP ifade bir FACS enstrüman kullanarak analiz 28 kısaca, virüs fonksiyonel titresi belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın:
        Equation 1
        Not: Burada Tg dikkate; GFP pozitif hücre sayısı = TN toplam sayısı dikkate; = N = toplam transduced; hücre sayısı V iletimi için kullanılan birim (içinde µL) =. Örneğin: 1 x 106 hücreler virüs 10 µL ile transduced, 2 x 104 hücre sayılan ve 5 x 103 GFP-pozitif, fonksiyonel titresi olurdu Yukarıdaki denklem üzerinde dayalı idi:
        Equation 2
    2. GFP pozitif Hücre sayımı
      1. Enfeksiyon (MOI) iletimi için kullanılan çokluğu hesaplayın. Bir geniş aralığı, MOIs (1-10), daha yüksek bir iletim verimliliği kaynaklanan MOIs artan ile sınayın.
      2. Transfection önce yaklaşık 3-4 şey başına 105 hücre x 6-şey plakalı tohum. Hücreleri ulaştıktan sonra > % 90 confluency (genellikle içinde 24 h), transduce önceden belirlenmiş MOIs, saflaştırılmış virüsüyle.
      3. Plaka %5 CO2 standart bir doku kültürü ile 37 ° C'de ve monitör hücrelerin düzenli aralıklarla GFP sinyal değişiklikleri için 1-7 gün kuluçkaya.
      4. Floresan mikroskop GFP pozitif hücreleri saydırmak (PLAN 4 X amaç, 0.1 N.A, 40 X büyütme) GFP filtre seti (uyarma dalga boyu-470 nm, emisyon dalga boyu-525 nm) ile donatılmış nüfus ayarlamak için saf (un transduced) hücreleri kullanma GFP negatif ve pozitif hücrelerinin.
      5. Son titresi seyreltme faktörü ve aşağıdaki formülü kullanarak birimi için ayarlayarak tahmin:
        Equation 3
        Not: Burada, N GFP pozitif hücreleri, D = seyreltme faktörü, M = büyütme katsayısı (genellikle 20 X), V = iletimi için kullanılan virüs hacmi =. Örneğin, 10-4 (1:10, 000) 20 X 10 µL örnekteki (V) seyreltme, sayılan 20 GFP pozitif hücreler (N) için büyütme (M) (D), (20 x 104) (10) x x işlevsel bir titresi x (20) neden olacaktır (100 *) = 4 x 108 TU/mL.
        (* mL ayarlamak için)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

IDLV-CRISPR/Cas9 vektörler nakavt verimliliğini doğrulama
CRISPR/Cas9-aracılı gen nakavt etkinliğini doğrulamak için bir model olarak GFP ifade 293T hücreleri kullanılır. GFP + hücreleri iletim pLenti-GFP (vBK201a) adlı bir MOI 0,5 (şekil 3b, "Hayır-virüs" paneli) içeren hücrelerin HEK-293T tarafından oluşturulan. SgRNA-için-GFP/Cas9 tüm-içinde-bir vektör kaset IDLV veya ICLV parçacıklar halinde paketlenmiş ve üretim verimliliği p24 tarafından ELISA (bkz. yukarıda; ve 3a rakam) değerlendirildi. Sp1 bağlayıcı siteleri (aşağıdaki konsantrasyon) içeren vektörel çizimler titreleri 10 aralığında bulundu10 TU/mL. Biz o zaman GFP nakavt floresan mikroskobu (şekil 3b) kullanarak verimliliği değerlendirildi. Bu amaçla, 5 x 105 GFP ifade 293T hücre 6-şey plaka numaralı seribaşı ve biz onları 24 saat sonra ile IDLV - veya ICLV-CRISPR/Cas9 MOIs 1 ve 5 (şekil 3b), transduced. Hangi sonra kültür orta değiştirildi ve hücreleri 24 h, tabakları denemenin sonraki gün reseeding önce bir ek 48 h için inkübe için hücreleri inkübe.

Son bir çalışmada, ICLV/CRISPR veya Akış Sitometresi28ile IDLV/CRISPR bileşenleri ile transduced GFP + hücrelerin ortalama Floresans yoğunluğu ölçülür. 21 gün pt hem örnekleri 14 gün sonrası iletim (pt) (% 2-4 sinyal tükenmesi), hem de hemen hemen aynı GFP tükenmesi karşılaştırılabilir GFP tükenmesi gördük (> % 99 sinyal tükenmesi)28. Biz önceki gözlemleri ile uyum içinde gözlenen bir ~ GFP pozitif sayısı kat azalma hücreleri iletim ile ardından 14 gün nk (veri gösterilmez) tarafından gözlenen bir neredeyse tam sinyal tükenmesi ile 7 gün pt (şekil 3), gibi erken Her iki ICLV - ve IDLV-CRISPR/Cas9 sistemi. Sinyal kaybı tedavi ve saf GFP pozitif hücrelerinin toplam sayısı sonra GFP pozitif kaldı hücre oranı olarak değerlendirilmiştir. Bu sonuçlar açıkça CRISPR/Cas9 yapıları IDLVs tarafından teslim bu hücre bölünmesi hızlı, sağlam ve sürekli gen düzenleme arabuluculuk için yeteneklerini entegre karşılıkları tarafından teslim ile karşılaştırılabilir olduğunu gösteriyor.

Figure 3
Şekil 3: viral titreleri değerlendirilmesi. (a) tarafından p24-ELISA tahlil. Titreleri konsantre Sp1-IDLV-CRISPR/Cas9 (siyah bar) ve SP1'i-ICLV-CRISPR/Cas9 (beyaz çubuğu) için değerlendirildi. 1 burada mL, başına kopya rakamlarla sonuçları kaydedildi ng p24-gag 1 x 104 viral parçacıkların =. Çubuk grafik veri ortalama ± SD onaylatılacak deneylerden temsil eder. (b) CRISPR değer biçmek-aracılı GFP-nakavt verimlilik. GFP sinyal tükenmesi ICLV-CRISPR/Cas9 - ve IDLV-CRISPR/Cas9-transduced 293T GFP + hücreleri MOIs 1 ile 5 arasında karşılaştırıldı. Un transduced ("virüs" panelinde şekil) GFP pozitif hücre denetimleri kullanılmıştır. Görüntüleri 7 gün mesaj iletim, 40 X büyütme, floresan mikroskop kullanarak elde. ABBREV: RRE: Rev Response eleman, EFS-NC: çekirdek-uzama faktör 1α organizatörü, ψ (PSI): vektör paketleme elemanı, hU6: insan U6 organizatörü, Puro: puromisindir-direnç kaset, WPRE: Dağ sıçanı hepatit virüsü Posttranscriptional düzenleyici Öğe, soldan sağa: Uzun-terminal işlemi yineleyin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 1: plazmid Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

IDLVs seçim aracı vivo içinde gen-düzenleme, özellikle içinde belgili tanımlık bağlam teslim platformlar22 tümleştirmek için karşılaştırıldığında bu vektörel çizimler ile ilişkili mutagenesis düşük riski büyük ölçüde nedeniyle, genetik hastalıkların ortaya çıkmaya başladı , 28. geçerli yazının son zamanlarda bizim laboratuvar28geliştirilmiştir geliştirilmiş tüm-içinde-bir IDLV-CRISPR/Cas9 sistem üretimi ile ilişkili Protokolü detay istedi.

Değişiklikler mevcut platformlar
Bu yöntemle, IDLV-CRISPR/Cas9 ve ICLV-CRISPR/Cas9 vektörler titreleri, 1 x 1010 TU/mL (şekil 3a) aralığında oluşturmak başardık. Bu geliştirme, üretim verimliliği Sp1-bağlama sitesi yanı sıra tüm-içinde-bir CRISPR/Cas9 vektör kaset içine bağlanabilir. Nitekim, biz son zamanlarda IDLV - ve ICLV-CRISPR/Cas9 vektörler ambalaj verimliliğini o dahil ~2.5-fold artış Sp1 sonuçlarının rapor ve bir ~ genel olarak fonksiyonel titreleri 7-fold artış. Sp1 vahşi tipi HIV-130,31,32,33,34,35 anahtar bir düzenleyici vurgulama çeşitli gruplardan daha önceki çalışma ile anlaşma bu sonuçları. .

Kritik adımlar ve sorun giderme
Yukarıda, SP1'i-IDLVs taşıyan belirttiği gibi CRISPR/Cas9 transgenes titreleri civarında 1 x 1010 TU/mL başına ~ 5 x 107 yapımcı hücre üretme yeteneğine sahip. Titreleri bunlar düşük üretim sürecinde hataları göstergesidir bu çok önemli şu durumda Puan titresi iyileştirilmesi için düşünülmelidir: 1) Üretici hücreler tercihen değiştirilmesi ile düşük geçiş sayının olması önerilir ≥15 geçişleri ve/veya ne zaman daha yavaş büyüme görülmektedir sonra. 2) seçtiğiniz hücre ortam bileşenleri bir üretim verimliliği açısından önemlidir. Örneğin, yaygın olarak kullanılan fetal sığır serum yerine, kozmik buzağı Serum kullanımını sürekli hücre büyümesi ve aynı zamanda düşük maliyetli olurken viral üretim geliştirilmiş bulmak. 3) farklı HEK satırlarını üretim fitness dikkatle değerlendirilmelidir. Örneğin, bulduğumuz bir ~ üç aşamalı viral üretim verim arasındaki farkı 293T hücreleri 293-FT (bkz. Tablo reçetesi) (veri gösterilmez) hücreleri. 4) o zaman onlar kabaca % 70-80 birleşmesi, erken hücre ölümü viral toksisite nedeniyle sonuçlanan düşük hücre yoğunluğu ve belirgin bir düşüş ortaya çıkan üretim verimliliği daha yüksek yoğunlukları ile hücreleri transfected önerilir. Pratik bir kural olarak, biz bir geçmesi hücreleri hücre bölünmesi sonrası transfection, yuvarlak ek sağlar bir hücre yoğunluğu için muhasebe öneririz. 5) son olarak, transfection verimliliği yüksek, tam olarak 6,95 için ideal transfection, muhafaza edilmesi için 2 x BBS, pH bağımlıdır. Bu nedenle 2 x BBS her yeni toplu iş iş bir pilot-transfection ölçekte kontrol edilmesi önerilir.

Vektör işleme ve güvenlik
IDLV ve ICLV vektörler bu iletişim kuralı ile üretimi sırasında birkaç önemli güvenlik konuları vardır. Birincisi, biyo-güvenlik düzeyi II kapsama lentiviruses ile çalışma gerektirir. GÜNAH vektörel çizimler tarafından tanınan güvenlik özellikleri rağmen günah vektörel çizimler kalan transkripsiyon aktivitesinden bildirilen36oldu. Ayrıca, bu önceki çalışma göstermiştir IDLV ve ICLV genleri verimli HIV-127tarafından kurtarıldı. Bu nedenle, özellikle yoğun lentiviruses kullanılan37olan zaman çoğaltma yeterlilik deneyleri (RCA), yapılması önerilir. İçin güvenlik prosedürleri ile ilgili olarak lentiviral vektör hazırlıkları, Biyogüvenlik təhlillər ve Biyomedikal hastalık kontrolü (online38bulunan CDC için), merkezleri tarafından Yayınlanan laboratuvarları, 4 edition, bkz. Aynı kayda göre üçüncü nesil paketleme sistemleri39 gelişmiş Biyogüvenlik özellikleri ile IDLVs ve ICLVs, paketlemek için ikinci nesil sistem daha düşük verimlilik de olsa ile kullanılabilir.

Önemi ve gelecekteki yol tarifi
Genel olarak, IDLVs CRISPR/Cas9 için üretim Protokolü - aracılı gene burada açıklanan düzenleme hızla bölen hücrelerde bu sistemin verimliliği ilk değerlendirmesini temsil eder. GFP pozitif HEK-293T hücreleri kullanarak, SP1'i-CRISPR/Cas9 IDLVs tarafından teslim verimli ve hızlı bir şekilde GFP ICLVs olarak benzer Kinetik ile bu hücrelerde düzenleyebilirsiniz gösterdi. Bu gözlemler geniş gen non-viral transfection yöntemlerle düzenleme için Ribonükleoprotein kompleksleri (Cas9 RNPs) kullanarak daha önceki çalışma sonuçları ile uyumludur. Bu yeni platform daha fazla gen düzenleme bileşenlerinin teslimatlar ve diğer moleküler gönderileri hücrelere için sürekli genişleyen araç zenginleştiriyor.

Daha önce lentiviral tabanlı gen-dağıtım sistemleri, geliştirme son işlemde rağmen anlatıldığı gibi azdır için yüksek-titresi viral vektörler hızlı, geçici ve hedeflenen gen için sürdürülebilir üretim izin platformları için seçenekleri yoktur manipülasyon. Motifler transgene ifade kaset içinde son derece ifade transkripsiyon faktörü için bağlama birleşme, aynı anda bu sorunların çoğunu çözmek başardık. Bu basit ama kritik manipülasyon bir dizi benzer teslim platformlar geliştirmek için yollar açılır. Transgene ifade çok sayıda kopya aynı bağlama motifi, ya da diğer transkripsiyon faktörleri için siteleri binding ile Sp1 motifi çoğullama eklenmesi ile gelişmiş olabilir test için özellikle yararlı olacaktır. Bizim emrinde böyle araçlarıyla o nispeten zayıf doku özel rehberleri bu ifadeden spekülasyon için cazip olduğunu, insan Synapsin yönelik olanlar gibi ben (hSyn) ve fare kalsiyum/calmodulin-bağımlı protein kinaz II (CaMKII),-ebil var olmak önemli ölçüde vitro ve içinde vivogeliştirilmiş.

Geçerli çalışma prensip olarak IDLV teslim CRISPR/Cas9, gen devirme yeteneğini test için sınırlı iken, sistemimiz çok yönlülük mükellef olanlar catalytically-etkin olmayan güvenerek gibi çeşitli gen düzenleme uygulamaları için olurdu dCas940. Son olarak, SaCas941 ve Cpf142, gibi daha küçük endonucleases ile birlikte bu çalışmada açıklanan platformu zaman, nispeten kısa bir sürede sistemlerinde yüksek verimli AAV alan gen-teslim kurulması doğru kabul edilebilir hangi lentiviral vektörlerinin karşılaştırıldığında düşük immünojenisite avantajı sağlayacaktır. Tabii ki, bu tür yaklaşımlar roman, verimli, geliştirilmesi yolunda olumlu bir adım ve klinik olarak güvenli viral vektörler olurdu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Patent USC-499-P (1175) tarafından University of South Carolina bu el yazması açıklanan çalışma ile ilgili olarak Filed under.

Acknowledgments

Duke Üniversitesi Tıp Okulu ve Dekanlık temel bilim, Duke Üniversitesi Nörobiyoloji bölümü teşekkür etmek istiyorum. Biz Ayrıca el yazması üzerinde üye Duke Viral vektör çekirdek yorum için teşekkür ederiz. Plazmid pLenti CRISPRv2 Feng Zhang (Broad Enstitüsü) hediye etmişti. Plazmid psPAX2 de dahil olmak üzere LV-ambalaj, VSV-G, pMD2.G ve pRSV-Rev sistemiydi Didier Trono (EPFL, İsviçre) bir tür hediye. University Of South Carolina Tıp Fakültesi tarafından bu iş için mali destek sağlanan RDF18080-E202 (B.K) verin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
xMark Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
BD FACS Becton Dickinson 338960
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor Beckman Coulter 369650
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
High-binding 96-well plates Corning 3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Tissue culture pipettes, 5 mL Corning 4487
Tissue culture pipettes, 10 mL Corning 4488
Tissue culture pipettes, 25 mL Corning 4489
Hemacytometer with cover slips Cole-Parmer UX-79001-00
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
DMEM, high glucose media Gibco 11965
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) Sigma Aldrich B9879 - BES
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
pRSV-Rev Addgene 12253
lentiCRISPR v2 Addgene 52961
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsrGI New England Biolabs R0575S
BsmBI New England Biolabs R0580S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  2. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).
  3. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  4. Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).
  5. Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
  6. Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146 (2016).
  7. Wang, W., et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9 (12), e115987 (2014).
  8. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv Genet. 87, 125-197 (2014).
  9. Lebbink, R. J., et al. A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape. Sci Rep. 7, 41968 (2017).
  10. Xu, L., et al. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. , (2017).
  11. Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).
  12. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), e147 (2014).
  13. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).
  14. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  15. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  16. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
  17. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  18. Schaefer, K. A., et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).
  19. Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  21. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  22. Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).
  23. Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors. Virol J. 3, 27 (2006).
  24. Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
  25. Hoban, M. D., et al. Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).
  26. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  27. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  28. Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).
  29. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).
  30. Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).
  31. Gomez-Gonzalo, M., et al. The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter. J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).
  32. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  33. Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength. J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).
  34. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  35. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  36. Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors. Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).
  37. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations. , Available from: https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf (2017).
  38. CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2017).
  39. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  40. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  41. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  42. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).

Tags

Genetik sorunu 130 Viral-aracılı gen transferi HEK-293T hücreleri integrase-eksik lentiviral Vektörler düzenleme sistemi p24 ELISA sukroz-gradient ultrasantrifüj FACS CRISPR/Cas9 gen
Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A… More

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter