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Genetics

Un protocolo para la producción de vectores lentivirales integrasa deficientes para CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout en dividir las células

doi: 10.3791/56915 Published: December 12, 2017

Summary

Describimos la estrategia de producción de vectores lentivirales integrasa deficientes (IDLVs) como vehículos para la entrega de CRISPR/Cas9 a las células. Con una capacidad para mediar la edición rápido y robusto gene en células, IDLVs actualmente un seguro y plataforma igualmente eficaz vector de genes en comparación con vectores competentes integrasa.

Abstract

Vectores lentivirales son una opción ideal para la entrega de componentes de edición de genes a las células debido a su capacidad para estable transducción de una amplia gama de células y mediadores altos niveles de expresión génica. Sin embargo, su capacidad para integrarse en el genoma de la célula huésped aumenta el riesgo de mutagénesis de insertional plantea preocupaciones de seguridad y limita su uso en contextos clínicos. Además, la expresión persistente de los componentes gene-edición había entregada por estos aumentos de vectores lentivirales integración competente (ICLVs) la probabilidad de promiscuo gene targeting. Como alternativa, se ha desarrollado una nueva generación de vectores lentivirales integrasa deficientes (IDLVs) que se ocupa de muchas de estas preocupaciones. Aquí el protocolo de producción de una plataforma IDLV nueva y mejorada para la edición de genes mediada por CRISPR y lista los pasos involucrados en la purificación y concentración de tales vectores se describe su transducción y eficacia gene-edición usando HEK-293T células fue demostrada. Este protocolo es fácilmente escalable y puede usarse para generar IDLVs de alto título que son capaces de transducción de las células in vitro y en vivo. Además, este protocolo puede ser fácilmente adaptado para la producción de ICLVs.

Introduction

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Edición precisa gen constituye la piedra angular de los avances biomédicos importantes que implican el desarrollo de nuevas estrategias para hacer frente a enfermedades genéticas. En la vanguardia de las tecnologías de edición de gene es el método apoyándose en el uso de la clustered regularly -nterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / sistema de Cas9 que inicialmente fue identificado como un componente de inmunidad bacteriana contra la invasión de material genético viral (revisado en las referencias1,2). Una ventaja importante del sistema CRISPR/Cas9 sobre otras herramientas de edición de gen, como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y nucleasas de efectores como activador de transcripción (TALENs) (revisadas en la referencia3), es la relativa simplicidad del diseño de plásmido y construcción de componentes CRISPR — una característica que ha impulsado la expansión de la edición de genes de unos laboratorios especializados a una comunidad de investigación mucho más amplia. Además, la sencillez de programación CRISPR/Cas9 y su capacidad de reconocimiento de destino multiplexado más han alimentado su popularidad como una tecnología rentable y fácil de usar. Entre los diversos métodos disponibles para los investigadores entregar dichos componentes de edición de gen a las células, vectores virales siguen siendo por lejos el sistema más popular y eficiente.

Vectores lentivirales (LVs) han surgido como el vehículo de elección para entregar los componentes de CRISPR/Cas9 sistema en vivo para diversas aplicaciones4,5,6,7. Varias características claves hacen LVs una opción popular para este proceso, incluyendo su capacidad para infectar células divisorias y no dividir, inmunogenicidad baja y mínima toxicidad celular (revisado en la referencia8). Como resultado, la terapia génica mediada por LV se ha empleado en tratamientos de enfermedades infecciosas, como VIH-1 y HBV HSV-1, así como en la corrección de los defectos subyacentes humanas enfermedades hereditarias, como fibrosis quística y degeneración macular neo-vascular 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Además, LVs han sido efectivamente modificados para realizar edición de multiplex gen en distintos lugares geométricos genomic usando un vector único sistema12.

Sin embargo, la propiedad inherente de LVs para integrar en el genoma del anfitrión puede ser mutagénica y desventajas a menudo su utilidad como transgen vehículos de entrega, especialmente en contextos clínicos. Por otra parte, puesto que LVs estable integrado expresan sus transgenes sosteniblemente altos niveles, este sistema es inadecuados para la entrega de los componentes gene-edición como CRISPR/Cas9; sobreexpresión de Cas9-guía RNA (gRNA) y proteínas similares como ZFNs, están asociados con niveles elevados de efectos off-target, que incluyen mutaciones indeseables13,14,15,16 , 17 y potencialmente puede aumentar la citotoxicidad18. Por lo tanto, para lograr precisa edición de genes con efectos mínimos de fuera de objetivo, es imperativo el diseño de sistemas que permiten la expresión transitoria del gen editar componentes.

En los últimos años, han desarrollado una variedad de plataformas para expresar transitoriamente CRISPR/Cas9 de las células16,19,20,21 (revisado en la referencia22). Estos incluyen métodos que dependen directamente introducir Cas9 purificada junto con las guía apropiada RNAs en las células, que mostró ser más eficaz en el objetivo gene-edición en comparación con la transfección mediada por plásmido16. Los estudios han demostrado eso ribonucleoproteína (RNP) guían de complejos de RNA/Cas9 partículas rápidamente turned over después de mediar el clivaje de ADN en sus objetivos, lo que sugiere que la expresión a corto plazo de estos componentes es suficiente para lograr gene robusto edición16. Concebible, no integrando plataformas de vector viral como vectores virales adeno-asociado (AAVs) pueden proporcionar una alternativa viable para ofrecer maquinaria edición de genes a las células. Desafortunadamente, cápsida AAV posee menor capacidad de envasado de LVs (< 5kb), que dificulta seriamente su capacidad para empaquetar el toolkit CRISPR varios componente dentro de un único vector (revisado en la referencia8). Cabe destacar que además de compuestos que inhiben la histona desacetilasas (p. ej., sodio butirato23) o impedir el ciclo de la célula (por ejemplo, cafeína24) han demostrado aumentar títulos lentivirales. A pesar del progreso reciente, los sistemas de expresión transitoria desarrollados hasta ahora son aún obstaculizados por varias deficiencias, como la baja eficiencia de la producción, que conducen a títulos virales reducción y eficiencia de transducción de la baja de los virus generados a través de tales enfoques25.

Integrasa-deficientes vectores lentivirales (IDLVs) representan un gran avance en el desarrollo de vectores de genes, ya que la capacidad de envasado de LVs con la ventaja añadida de AAV-como mantenimiento episomal en las células. Estas características ayudan a IDLVs en gran medida evadir los problemas principales asociados con integración de vectores, sobreexpresión continua vis-á-vis de potencialmente genotóxicos elementos y mutagenicidad mediada por la integración. Se demostró previamente que IDLVs pueden ser modificadas con éxito para mejorar la expresión de gene episomal26,27. Con respecto a la entrega mediada por IDLV CRISPR/Cas9, títulos de baja producción y menor expresión de los genomas episome transmitidas en relación con sistemas lentivirales integrasa dominio limita su utilidad como herramientas de bona fide para la entrega de la edición del genoma construcciones transgénicas. Recientemente hemos demostrado que la expresión del transgen y títulos virales asociados con la producción de IDLV son mejorados significativamente por la inclusión de sitios para el factor de transcripción Sp1 dentro de la expresión viral cassette28de Unión. Las IDLVs modificadas sólidamente apoyado CRISPR-mediated gene edición en vitro (en células HEK-293T) tanto en vivo (en las neuronas del cerebro del poste-mitotic), mientras que la inducción de mutaciones de objetivo mínimo en comparación con la correspondiente ICLV-mediada sistemas28. En general, hemos desarrollado una novela, toolkit CRISPR compacto, todo-en-uno había llevado en una plataforma IDLV y había descrito las ventajas de la utilización de un vehículo de entrega para la edición de genética mejorada.

Aquí, el protocolo de producción del sistema IDLV-CRISPR/Cas9 se describe, incluyendo los distintos pasos involucrados en la Asamblea, purificación, concentración y valoración de IDLVs, así como estrategias para validar la eficacia de edición génica de estos vectores. Este protocolo es fácilmente escalable para satisfacer las necesidades de los diferentes investigadores y está diseñado para generar con éxito vectores del LV con los títulos en el rango de 1 x 1010 transducing unidades (TU) / mL. Los vectores generados a través de este protocolo pueden ser utilizados para infectar eficientemente varios diferentes tipos de células, incluso difícil de transducir las células madre embrionarias, las células hematopoyéticas (las células T y macrófagos) y cultivadas y en vivo- neuronas inyectadas. Además, el protocolo es igualmente adecuado para la producción de vectores lentivirales integrasa competente en cantidades similares.

Figure 1
Figura 1: embalaje de IDLV. (a) diagrama esquemático del tipo salvaje integrasa proteína (b) el plásmido modificado fue derivado de psPAX2 (vea métodos, construcción de plásmidos para más detalles). Imagen de gel agarosa representante de clones para clones mutados integrasa. Se analizaron muestras de ADN preparadas con el equipo Mini de aislamiento estándar plásmido ADN por digestión con EcoRV y SphI. El clon correctamente digeridos (número 5, caja roja discontinua) más se verificó por la secuencia directa (Sanger) para la sustitución de D64E en INT. El casete de la integrasa-deficiente embalaje fue nombrado pBK43. (c) esquema del Protocolo de la transfección transitoria empleada para generar vectores IDLV-CRISPR/Cas9, mostrando las células 293T transfectadas con VSV-G, embalaje y cintas de transgenes (Sp1-CRISPR/Cas9 plásmido de all-in-one). Partículas virales que bud hacia fuera de la membrana de la célula contienen el RNA integral del vector (expresado del cassette de transgen). Se utilizó la segunda generación del sistema IDLV-embalaje, que incluye las proteínas reguladoras Tat y expresión de Reverendo Rev además se complementa de un cassette independiente (RSV-REV-plásmido). Abreviatura: virus de estomatitis vesicular de repetición, VSV-G, LTR-largo-terminal G proteína, promotor de citomegalovirus pCMV; Promotor de Rous sarcoma virus (RSV); RRE-(elemento de respuesta Rev). Otros elementos regulatorios en los cassettes de expresión incluyen sitios de unión de Sp1, elemento de la Rev Response (RRE), marmota Hepatitis Virus postranscripcional regulador elemento (WPRE), núcleo-alargamiento factor 1α promotora (EFS-NC), el paquete del vector elemento ψ (psi), promotor de citomegalovirus (hCMV) humano y humano promotor U6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

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1. cultivo de células HEK-293T y siembra para transfección

Nota: Riñón embrionario humano 293T (HEK-293T) las células son cultivadas en DMEM, medios de comunicación de alta glucosa suplementado con suero de ternera 10% suplementado con promotores de crecimiento y hierro y solución de antibiótico-antimicótico 1 x (100 x solución contiene penicilina unidades 10.000 estreptomicina 10 mg y 25 μg de anfotericina B por mL). Los medios de comunicación también se complementa con piruvato de sodio x 1, mezcla de aminoácidos no esenciales 1 x y 2 mM L-glutamina (dipéptido stock 200 mM L-Alanil-L-glutamina en 0,85% NaCl). Las células se cultivan en placas de cultivo de tejidos de 100 mm (superficie de crecimiento aproximado es de 55 cm²). Una relación de sub-cultivo de 1:10 se utiliza con el cultivo cada 2-3 días. Tripsina-EDTA 0.05% se utiliza para la disociación de células entre pasajes. Para mantener la coherencia entre experimentos, recomendamos prueba sera de becerro al cambiar a un lote diferente y monitorear los cambios en el crecimiento celular, eficiencia de transfección y producción de vectores.

  1. Iniciar una nueva cultura mediante células de paso bajo (se recomienda no utilizar las células después de paso 15 o si disminuye el crecimiento) por la siembra en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm. Uso DMEM suplementado con 10% de suero de crecimiento de la célula. Crecen las células a 37 ° C con 5% CO2 en una incubadora estándar de cultivo de tejidos. Utilizar un hemocitómetro estándar para contar las células de todos los pasos posteriores.
  2. Una vez que las células alcanzan 90-95% crecimiento confluente, resembrar en 15 cm las placas de cultivo de tejidos (abajo, pasos 1.3 - 1.5).
  3. Para contaminar, aspirar los medios de comunicación de la placa confluente y enjuague suavemente con PBS estéril 1 x. Incubar las células con 2 mL de un reactivo de disociación (por ejemplo, tripsina-EDTA) a 37 ° C durante 3-5 min añadir 8 mL de medio con suero para inactivar el reactivo de disociación y triturate 10 - 15 veces con una pipeta serológica de 10 mL para crear una sola celda suspensión. Resuspender las células en los medios de cultivo para obtener una densidad celular de aproximadamente 4 x 106 células/mL.
  4. Para mejorar la adherencia al sustrato, la capa de las placas de 15 cm con gelatina de 0.2%, agregar 8 mL de gelatina por placa. Repartidos uniformemente en la superficie de la placa, incubar a temperatura ambiente durante 10 min y succionar el líquido.
  5. El volumen total de cada placa a 25 mL con caliente (37 ° C) media T HEK-293 (ver nota en paso 1) y las placas de la semilla, añadir 2,5 mL de células (total ~ 1 x 107 células/placa). Incube las placas a 37 ° C con 5% CO2 durante la noche o hasta que se alcanza el 70-80% de confluencia.
    Nota: Hasta seis placas de 15 cm puede usarse para la producción. Ajustar el volumen de medio por placa de ~ 20-22 mL cuando se utilizan más de cuatro placas (ver paso 5 del Protocolo de justificación).

2. HEK-293T transfectar las células usando un protocolo basado en fosfato de calcio

  1. Reactivos de transfección
    1. Para preparar 2 x solución tampón BES municiones 50 mM (BES, 280 mM NaCl, 1, 5 mM Na2HPO4), combinar 16,36 g de NaCl, 10,65 g de BES (N, N-bis (2-hidroxietil) -2-amino-ácido (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido) y 0,21 g de Na2HPO4. Añadir agua destilada doble H2O (dd-H2O) hasta 900 mL. Disolver, valorar pH 6.95 con 1 M NaOH y llevar el volumen a 1 L. filtro por unidad de filtro de 0,22 μm. Almacenar a-20 ° C.
    2. Preparar 1M CaCl2. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 μm. Almacenar a 4 ° C.
  2. Observar las placas que sembraron a un día antes. Las células están listas para transfección una vez que llegue a 70-80% de confluencia.
  3. Aspirar viejos medios de comunicación de las placas y añadir suavemente los medios recién preparados sin suero.
    Nota: Consulte el Archivo complementario 1-plásmidos para obtener más información acerca de la plásmidos solicitada y su preparación.
  4. Preparar la mezcla de plásmido por plásmidos Alicuotar los cuatro en un tubo cónico de 15 mL. Para la preparación de un plato único de 15 cm, uso 37.5 μg el CRISPR/Cas9-transferencia vector (pBK198 o pBK189), 25 μg de pBK43 (psPAX2-D64E), pMD2.G μg 12.5 y 6.25 μg de atrás (figura 1C).
  5. Añadir 312.5 μL 1M CaCl2 a la mezcla de plásmido. A esto, añadir hasta 1,25 mL de estéril dd-H20.
  6. Lentamente (mediante goteo) Añadir 1,25 mL de solución x BBS 2 mientras Vortex la mezcla. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  7. Agregue la mezcla de transfección gota a gota a cada placa 15 cm (2,5 mL por placa). Agitar suavemente las placas e incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 2-3 h. Después de eso, añadir 2,5 mL (10%) de suero por placa y continuar la incubación durante la noche (12-18 h).
    Nota: Algunos laboratorios usan 3% CO2 incubadoras para estabilizar el pH de los medios de comunicación. Sin embargo, no observamos ninguna diferencia en eficacia de transfección entre 3% y 5% CO2. Además, el tamaño del CaPO4 precipita es crucial para la eficacia de transfección; la mezcla de transfección tiene que tener claro antes de su incorporación en las células. Si la mezcla se convierte en turbia durante la incubación, preparar fresco 2 x BBS (pH = 6,95).

Figure 2
Figura 2: concentración de las partículas virales utilizando protocolo gradiente de sacarosa doble. Partículas virales obtenidas el sobrenadante (SN) se cargan en gradiente gradiente de sacarosa. soluciones de sacarosa de 70%, 60%, 30% y 20% se utilizan para crear el gradiente. Tras centrifugación, las partículas recogidas de las fracciones de sacarosa de 30-60% son cargadas en un colchón de sacarosa 20% más y se precipitó. El final precipitado que contiene partículas virales purificadas se resuspendió en PBS 1 x para el uso posterior (véase texto para más detalles). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. día después de la transfección

  1. Observar las células para asegurar que ellos están a punto de confluencia del 100% en este momento con poca o sin muerte celular. Sustituir los medios de comunicación mediante la adición de 25 mL de DMEM fresco + 10% de suero a cada placa. Continuar la incubación a 37 ° C con 5% CO2 para un 48 h adicional.
    Nota: Ajustar el volumen de los medios de comunicación en el paso 3.1 si utilizan más de seis placas de 15 cm (ver paso 5.2, nota).

4. cosecha de Virus

  1. Recoger cuidadosamente el sobrenadante de todas las placas de cultivo de tejidos que contienen las células transfected con una piscina en tubos de centrífuga de 50 mL y pipeta de cultivo de tejido estéril de 10 mL.
  2. Claro la suspensión por centrifugación a 400-450 x g durante 10 minutos utilizando una centrífuga de mesa. Filtrar el sobrenadante a través de una unidad de vacío del filtro de 0.45 μm.
    Nota: El sobrenadante filtrado puede ser almacenados a 4 ° C hasta 4 días antes de proceder con la concentración, o alícuotas y almacenados a-80 ° C. Los esperados títulos de IDLV-Sp1-CRISPR/Cas9 las preparaciones virales (no concentrada) deben ser de ~ 2 x 107 TU/mL (refiérase al paso 6 para la determinación del título). Sin embargo, no someter las preparaciones virales a múltiples ciclos de hielo-deshielo, como cada ronda de congelación y descongelación resulta en una pérdida de 10-20% en títulos funcionales.

5. concentración de partículas virales por ultracentrifugación

Nota: Utilizamos un método de doble-sacarosa de purificación que consiste en dos pasos: un paso de gradiente de sacarosa y un paso de colchón de sacarosa (figura 2).

  1. Cargar los tubos cónicos ultracentrifugación en el siguiente orden para crear un gradiente de sacarosa: 0,5 mL 70% de sacarosa (disuelto 1 x PBS), 0,5 mL 60% de sacarosa (disuelto en DMEM) sacarosa al de 30% 1 mL (disuelto en DMEM) y 2 mL 20% de sacarosa (disuelta en PBS 1 x).
  2. Añadir cuidadosamente el sobrenadante que contiene el virus para el gradiente. Como el volumen de sobrenadante de cuatro placas de 15 cm es de 100 mL, utilizar seis tubos de ultracentrifugación por giro para procesar el volumen completo del virus del sobrenadante.
    1. Cada tubo de ultracentrifugación utilizado para este paso tiene una capacidad de volumen de 30 mL (incluido el volumen de sacarosa), distribuir sobrenadante viral igualmente entre los tubos, dejando al menos 10% espacios vacíos para evitar derrames.
    2. Ajustar el volumen de cultivo a ~ 20-22 mL por placa cuando se utilizan más de cuatro placas de 15 cm para cada experimento, para que el volumen final del sobrenadante viral combinado se puede acomodar fácilmente en seis tubos de ultracentrifugación.
    3. Relleno ultracentrifugación tubos a por lo menos tres cuartas partes de su capacidad de volumen total, de lo contrario puede ocurrir rotura de tubos durante la centrifugación, dando por resultado la pérdida de muestra y/o equipo de daños.
  3. Equilibrar los tubos de 1 x PBS y centrifugar las muestras a 70.000 x g durante 2 h a 17 ° C (véase Tabla de materiales para detalles de rotor).
    Nota: Para evitar la interrupción de la capa de sacarosa durante la aceleración, defina la ultracentrífuga para acelerar lentamente el rotor a 200 rpm durante los primeros 3 minutos de la vuelta. Asimismo, establece la ultracentrífuga desacelere lentamente el rotor de 200 rpm a 0 rpm durante 3 min en el final de la vuelta.
  4. Cuidadosamente recoger fracciones de sacarosa de 30-60% en tubos limpios (figura 2). Añadir frío 1 x PBS a las fracciones agrupadas y llevar el volumen a 100 mL; mezclar mediante pipeteo arriba y abajo varias veces.
  5. Continuar con el paso de amortiguador de sacarosa por capas cuidadosamente la preparación viral sobre un cojín de sacarosa. Para ello, añadir 4 mL de sacarosa al 20% (en PBS 1 x) en el tubo, seguido de ~ 20-25 mL de la solución viral por el tubo. Si los tubos son menos de tres cuartos completo, rellenar con estéril de 1 x PBS.
  6. Cuidadosamente el balance y centrifugar las muestras a 70.000 x g durante 2 h a 17 ° C, como antes. Retirar el sobrenadante y deje el resto líquido drene invirtiendo los tubos sobre papel absorbente.
  7. Aspirar las gotitas restantes para quitar todo el líquido de la pelotilla. En este paso, los gránulos que contienen el virus deben ser apenas visibles como pequeñas manchas translúcidas.
  8. Resuspender el pellet al añadir 70 μl de PBS 1 x al primer tubo bien pipetear la suspensión, posteriormente transferir la suspensión al siguiente tubo y mezcla como antes, continuando hasta que el pellet se resuspendió.
  9. Enjuague los tubos con un adicional 50 μl de frío 1 x PBS y mezcla como antes. Asegúrese que el volumen combinado de la suspensión final ~ 120 μl y aparece ligeramente lechoso; claro por centrifugación a 10.000 x g durante 30 s en una microcentrífuga de sobremesa.
  10. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco, hacer 10 alícuotas μl y almacenarlos a-80 ° C.
    Nota: Evite realizar ciclos repetidos de congelación y descongelación de las muestras lentivirales. Excepto cuando se requiere centrifugación, esfuerzos deben ser hechos para llevar a cabo los pasos restantes en campanas de cultivo de tejidos o señalados salas de cultivo de tejidos con las medidas de bioseguridad adecuadas (ver discusión).

6. estimación de títulos virales

  1. p24 -enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) método
    Nota: El ensayo se realiza mediante enlace de alta placas de 96 pocillos como por las instrucciones del programa NIH SIDA vacuna para VIH-1 p24 análisis de captura de antígeno Kit (véase Tabla de materiales) con modificaciones29.
    1. Al día siguiente, lave los pocillos tres veces con 200 μL 0,05% Tween 20 en frío PBS (solución de PBS-T). Cubra la placa con 100 μl del anticuerpo monoclonal anti-p24 a una dilución de 1:1500 en PBS 1 x e incubar durante una noche a 4 ° C.
    2. Para eliminar el atascamiento no específico, bloquear la placa con 200 μL 1% de BSA en PBS; lavar tres veces con 200 μL 0,05% Tween 20 en frío PBS (solución de PBS-T) por al menos 1 h a temperatura ambiente.
    3. Preparación de las muestras: Para las preparaciones de vector concentrado, diluir 1 μl de la muestra 100-fold agregando 89 μl de dd-H20 y 10 μl de Tritón X-100 (concentración final de 10%). Para los preparados no concentrados, preparar muestras diluidas diez veces (añadir 80 μl de dd-H20 y 10 μl de Tritón X-100 (concentración final de 10%) a 10 μl de la muestra).
      Nota: Las muestras pueden almacenarse a-20 ° C en este paso para un largo período de tiempo para su uso posterior.
    4. Preparar normas de VIH-1 mediante la aplicación de una dilución seriada 2 veces (con una partida concentración de 5 ng/mL).
    5. Diluir las muestras concentradas (de existencias previamente diluida 1: 100) en RPMI 1640 suplementado con 0.2% Tween 20 y 1% de BSA para establecer 1:10, 000, 1:50, 000 y las diluciones de 1: 250,000. Diluir las muestras no concentrados (de 1:10 diluido previamente acciones) en RPMI 1640 suplementado con 0.2% Tween 20 y 1% BSA establecer diluciones de 1: 500, 1:2500 y 1:12,500.
    6. Aplicar las muestras en la placa en triplicado e incubar durante una noche a 4 ° C.
    7. Al día siguiente, lave los pocillos seis veces e incubar a 37 ° C durante 4 h con 100 μl policlonal conejo anti-p24 del anticuerpo, diluido 1: 1000 en RPMI 1640, 10% FBS, 0.25% de BSA y suero de ratón normal 2% (NMS).
    8. Lavar seis veces como arriba e incubar a 37 ° C durante 1 h con la peroxidasa de cabra anti-conejo IgG diluido 1: 10,000 en RPMI 1640 suplementado con suero de cabra normal 5% 2% NMS, 0.25% de BSA y 0.01% Tween 20.
    9. Lave la placa, como la anterior e incubar con sustrato de peroxidasa TMB a temperatura ambiente durante 15 minutos.
    10. Detener la reacción añadiendo 100 μl de HCL N 1. Medir la absorbancia de la muestra a 450 nm usando la absorbancia placa lector.
  2. Medición de intensidad de reportero fluorescente
    1. Método de FACS
      Nota: El grado de disminución de señal GFP en células se puede estimar con precisión mediante la medición de intensidad de fluorescencia media de células transduced por citometría de flujo. Por favor consulte el documento reciente 28 para análisis de datos FACS, presentación e interpretación. El protocolo se describe a continuación.
      1. Hacer una dilución seriada diez veces de la preparación (de 10-1 a 10-5) de la preparación viral en PBS 1 x.
      2. Semilla de aproximadamente 5 x 105 293T células en cada pozo de una placa de 6 pozos en un volumen final de 2 mL por pozo. Añadir 10 μl de cada dilución viral a las células e incubar las células a 37 ° C durante 48 h.
      3. Cosecha de células para el análisis FACS como sigue: agregar 200 μL de solución de tripsina-EDTA 0.05% incubar las células a 37 ° C por 5 min agregar 2 mL de un medio DMEM completo y recoger las muestras en tubos cónicos de 15 mL.
      4. Pellet de células por centrifugación a 400 x g a 4 ° C y resuspender el precipitado en 500 μl de PBS 1 x fría.
      5. Para la fijación, añadir un volumen igual de solución de formaldehído 4% a esta suspensión e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
      6. Las células fijas de pellets y resuspender en 1 mL de PBS 1 x. Analizar la expresión de GFP utilizando un instrumento de la FACS, como se describe en Ortinski et al. 28 brevemente, utilice la siguiente fórmula para determinar el título funcional del virus:
        Equation 1
        Nota: Aquí Tg = número de células GFP-positivas contado; TN = número total de células contadas; N = número total de células transduced; V = volumen (en μL) utilizado para la transducción. Por ejemplo: Si 1 x 106 células fueron transduced con 10 μl de virus, 2 x 104 células fueron contadas y 5 x 103 GFP-positivas, basado en la ecuación anterior el título funcional sería:
        Equation 2
    2. Conteo células GFP-positivas
      1. Calcular la multiplicidad de infección (MOI) utilizada para la transducción. Prueba una gama amplia de MOIs (1-10), con el aumento de MOIs resultando en una mayor eficiencia de la transducción de señales.
      2. Antes de la transfección, la semilla una placa de 6 pozos con aproximadamente 3-4 x 105 células por pocillo. Una vez que las células alcancen > 90% de confluencia (generalmente dentro de 24 h), transduce con el virus purificado en MOIs determinados.
      3. Incubar la placa a 37 ° C con 5% CO2 en un cultivo estándar de tejidos y células de monitor a intervalos regulares para 1-7 días para cambios en la señal de la GFP.
      4. Contar el número de células GFP-positivas con un microscopio de fluorescencia (PLAN 4 X objetivo, N.A 0.1, aumento X 40) equipado con un sistema de filtro GFP (excitación longitud de onda 470 nm, longitud de onda-525 nm de emisión), utilizando células (sin transduced) ingenuo para fijar la población de células GFP-negativo y positivo.
      5. Calcular la concentración final ajustando por el factor de dilución y el volumen, utilizando la siguiente fórmula:
        Equation 3
        Nota: Aquí, N = número de células GFP-positivas, D = factor de dilución, M = factor de aumento (generalmente 20 X), V = volumen de virus utilizado para la transducción. Por ejemplo, para 20 GFP-positivas las células (N) en una dilución de 10-4 (1:10, 000) en una muestra de 10 μl (V) a 20 X magnificación (M) (D) daría como resultado un título funcional de (20 x 104) x (20) x (10) x (100 *) = 4 x 108 TU/mL.
        (* para ajustar por mL)

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Representative Results

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Validación de la eficacia de nocaut de vectores IDLV-CRISPR/Cas9
Utilizamos células 293T GFP-expresando como un modelo para validar la eficacia de knockout de genes CRISPR/Cas9-mediada. Las células GFP + fueron generadas por transducción de células HEK-293T con pLenti-GFP (vBK201a) en una MOI de 0.5 (figura 3b, el panel "no virus"). El cassette sgRNA-GFP/Cas9 todo-en-uno vector fue empaquetado en partículas IDLV o ICLV y p24 ELISA (ver más arriba; y figura 3a) evaluaron la eficiencia de producción. Los títulos de los vectores que contienen sitios de unión a Sp1 (concentración siguiente) fueron encontrados para estar en el rango de 1010 TU/mL. Luego se evaluó la eficacia de nocaut GFP utilizando microscopía fluorescente (figura 3b). Para ello, 5 x 105 expresando GFP 293T células fueron sembradas en una placa de 6 pozos y nos les transduced 24 h más tarde con IDLV - o ICLV-CRISPR/Cas9 en MOIs de 1 y 5 (figura 3b). Las células fueron incubadas por 24 h, después de que el medio de cultivo fue reemplazado y las células fueron incubadas durante 48 h adicional, antes de volver a sembrar las placas para posteriores días del experimento.

En un reciente estudio, medimos la intensidad de fluorescencia media de células GFP + transduced con ICLV/CRISPR o componentes IDLV/CRISPR mediante citometría de flujo28. Vimos comparable GFP-agotamiento en tanto muestras días 14 post-transducción de señales (pt) (agotamiento de la señal de 2-4%) y el agotamiento casi idéntico de GFP 21 días pt (> agotamiento de señal 99%)28. En concordancia con las observaciones anteriores, se observó un ~ cinco reducción en el número de GFP-positivas las células tan pronto como 7 días pt (figura 3), con una merma de casi completa de la señal observada por 14 días pt (datos no mostrados) después de transducción de señales con ambos sistemas de ICLV - y IDLV-CRISPR/Cas9. La pérdida de señal se evaluó como la proporción de las células que permanecieron GFP-positivas después del tratamiento y el número total de células GFP-positivas de ingenuo. Estos resultados demuestran claramente que CRISPR/Cas9 construcciones por IDLVs son comparables a los entregados por sus contrapartes integrando en su capacidad para mediar gene rápido, robusto y sostenido de edición en la división de las células.

Figure 3
Figura 3: evaluación de títulos virales. (a) por p24-ensayo ELISA. Se evaluaron los títulos para el Sp1-IDLV-CRISPR/Cas9 (barra negra) y Sp1-ICLV-CRISPR/Cas9 (barra blanca). Los resultados se registran en números de copia por mL, donde 1 ng p24-gag = 1 x 104 partículas virales. Datos de gráfico de barras representan la media ± SD de experimentos por triplicado. (b) eficiencia de GFP-octavos de final evaluación de CRISPR-mediada. Agotamiento de señal GFP se comparó entre ICLV-CRISPR/Cas9 - y IDLV-CRISPR/Cas9-transduced 293T GFP + células en MOIs de 1 y 5. No-transduced (panel "no virus" en la figura) como controles se utilizaron células GFP-positivas. Se adquirieron imágenes mediante un microscopio de fluorescencia a 40 aumentos 7 días post transducción. Abreviatura: RRE: Rev Response elemento, EFS-NC: promotor de base-alargamiento factor 1α, ψ (psi): elemento de vector packaging, hU6: humano promotor U6, Puro: cassettes de resistencia a puromicina, WPRE: marmota Hepatitis Virus regulación postranscripcional Elemento, LTR: Repetición terminal larga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: plásmidos Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

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IDLVs han comenzado a emerger como el vehículo de elección en vivo gene-la edición, especialmente en el contexto de enfermedades genéticas, debido en gran parte al bajo riesgo de mutagénesis asociado con estos vectores respecto a la integración de las plataformas de entrega22 , 28. en el manuscrito actual, intentamos detallar el protocolo asociado con la producción del todo-en-uno IDLV-CRISPR/Cas9 sistema mejorado que se desarrolló recientemente en nuestro laboratorio28.

Modificaciones en las plataformas existentes
Con este método, hemos sido capaces de generar IDLV-CRISPR/Cas9 y vectores de la ICLV-CRISPR/Cas9 a concentraciones en el rango de 1 x 1010 TU/mL (figura 3a). Esta mejora en la eficiencia de la producción se puede atribuir a la adición del sitio de unión de Sp1 en cassette de vector CRISPR/Cas9 all-in-one. De hecho, nos informó recientemente que la inclusión de Sp1 se traduce en un aumento de ~2.5-fold en la eficiencia de embalaje de IDLV - y de ICLV-CRISPR/Cas9 vectores y un ~ 7-fold aumento en los títulos funcionales global. Estos resultados concuerdan con trabajos anteriores de diversos grupos destacando Sp1 como un regulador clave de tipo VIH-130,31,32,33,34,35 .

Pasos críticos y solución de problemas
Como señalado anteriormente, Sp1-IDLVs llevar CRISPR/Cas9 transgenes fueron capaces de generar títulos en las cercanías de 1 x 1010 TU/mL por ~ 5 x 107 células de productor. Inferior de estos títulos serían indicativos de errores en el proceso de producción, en cuyo caso la siguiente crucial puntos deben considerarse para la mejora de la titulación: 1) se recomienda que las células del productor preferentemente del número de paso bajo, con el reemplazo después de ≥15 pasajes o cuando se observa un crecimiento más lento. 2) la elección de los componentes de los medios de comunicación de la célula es importante en términos de eficiencia de producción. Por ejemplo, en lugar de lo habituales suero fetal bovino, encontramos que el uso de suero de cósmico constantemente mejorado crecimiento celular y la producción viral, siendo rentable a la vez. 3) la capacidad de producción de las diferentes líneas HEK debe ser evaluada cuidadosamente. Por ejemplo, encontramos un ~ triple diferencia en rendimiento de producción viral entre las células 293T y 293-FT (véase Tabla de materiales) de las células (datos no mostrados). 4) es aconsejable que las células se transfected cuando son aproximadamente 70-80% confluente, con menores densidades de célula resultando en muerte celular prematura debido a toxicidad viral y densidades más altas, resultando en una marcada baja en la eficiencia de producción. Como regla general, sugerimos que representa una densidad de célula que permite a las células a una adicional alrededor de la transfección de la división celular. 5) por último, la eficiencia de la transfección es altamente dependiente en el pH de 2 x BBS, que debe ser mantenido en exactamente 6.95 para transfección ideal. Por lo tanto es muy recomendable que cada nuevo lote de 2 x BBS medirse en una escala piloto-transfección.

Seguridad y manejo de vectores
Hay varias consideraciones importantes de seguridad durante la producción de vectores IDLV y ICLV con este protocolo. En primer lugar, trabajar con lentivirus requiere contención de bioseguridad nivel II. A pesar de las características de seguridad que ofrece vectores de pecado, residual actividad transcripcional de vectores de pecado ha sido reportado36. Además, el trabajo previo ha demostrado que IDLV y ICLV genomas pueden rescatar productivamente por VIH-127. Por lo tanto, se recomienda que sea realizado ensayos de capacidad de replicación (RCA), especialmente cuando lentiviruses concentrados están siendo usados37. Para los procedimientos de seguridad en cuanto a manejo de preparaciones de vectores lentivirales, ver Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4ª edición, publicado por los centros para el Control de enfermedades (CDC) que pueden encontrarse en línea38. En la misma nota, tercera generación embalaje sistemas39 con características de mayor seguridad de la biotecnología puede utilizarse para el paquete de IDLVs y ICLVs, aunque con menor eficiencia que el sistema de segunda generación.

Importancia y futuro
General, el protocolo de producción para IDLVs de CRISPR/Cas9 - mediada gen edición descrito aquí representa la primera evaluación de la eficacia de este sistema en rápidamente dividir las células. Usando las células HEK-293T GFP-positivas, hemos demostrado que Sp1-CRISPR/Cas9 por IDLVs puede editar GFP en estas células, con una cinética similar como ICLVs eficaz y rápida. Estas observaciones son ampliamente consistentes con los resultados de trabajos anteriores con complejos de ribonucleoproteína (Cas9 RNPs) para la edición de genes mediante métodos de transfección no viral. Esta nueva plataforma más enriquece la caja de herramientas cada vez mayor para la entrega de los componentes gene-edición y otras cargas moleculares a las células.

Como comentamos antes, a pesar de los recientes avances en el desarrollo de sistemas lentivirales base gene-entrega, hay pocos que no hay opciones para plataformas que permitan la producción sostenible de vectores virales alto-título para gen rápida, transitoria y específica manipulación. A través de la incorporación de motivos para un factor de transcripción altamente expresada en el casete de expresión del transgen de enlace, hemos sido capaces de abordar simultáneamente varios de estos temas. Esta manipulación sencilla pero crítica abre un número de avenidas para el desarrollo de plataformas de distribución similares. Sería especialmente útil comprobar si la expresión del transgen puede mejorarse a través de ya sea la adición de numerosas copias del mismo motivo de Unión, o por el motivo de Sp1 con sitios para otros factores de transcripción de unión de la multiplexación. Con estas herramientas a nuestra disposición, es tentador especular que la expresión de promotores específicos de tejido relativamente débiles, como los de Synapsin humano I (hSyn) y ratón dependiente de calcio/calmodulina proteína kinasa II (CaMKII), podría ser significativamente mejorado tanto in vitro como in vivo.

Mientras que el estudio actual se limita a probar la capacidad precipitación del gene de IDLV entregado CRISPR/Cas9, en principio, la versatilidad de nuestro sistema podrían prestarse a diversas aplicaciones de edición de genes, tales como confiar en el catalítico inactivo dCas940. Por último, combinado con endonucleasas más pequeñas, como SaCas941 y42de Cpf1, la plataforma descrita en este estudio puede ser adoptada hacia el establecimiento de sistemas altamente eficientes basados en AAV gene-entrega en un lapso relativamente corto de tiempo, que ofrecería la ventaja de baja inmunogenicidad en comparación con vectores lentivirales. No hace falta decirlo, estos enfoques sería un paso positivo hacia el desarrollo de la novela, eficiente y vectores virales clínicamente seguros.

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Disclosures

USC-499-P de la patente (1175) fue presentada por la Universidad de Carolina del sur en relación con el trabajo descrito en este manuscrito.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer al Departamento de Neurobiología, Duke University School of Medicine y del Decanato de ciencias básicas, Universidad de Duke. También agradecemos a los miembros de la base de Vector Viral de duque para comentarios sobre el manuscrito. Plásmido pLenti CRISPRv2 fue regalo Feng Zhang (Broad Institute). El sistema LV-packaging incluyendo el psPAX2 de plásmidos, VSV-G, pMD2.G y pRSV-Rev fue un amable regalo de Didier Trono (EPFL, Suiza). Apoyo financiero para este trabajo fue proporcionado por la Universidad de Carolina del sur Facultad de medicina, conceder RDF18080-E202 (B.K).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
xMark Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
BD FACS Becton Dickinson 338960
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor Beckman Coulter 369650
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
High-binding 96-well plates Corning 3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Tissue culture pipettes, 5 mL Corning 4487
Tissue culture pipettes, 10 mL Corning 4488
Tissue culture pipettes, 25 mL Corning 4489
Hemacytometer with cover slips Cole-Parmer UX-79001-00
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
DMEM, high glucose media Gibco 11965
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) Sigma Aldrich B9879 - BES
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
pRSV-Rev Addgene 12253
lentiCRISPR v2 Addgene 52961
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsrGI New England Biolabs R0575S
BsmBI New England Biolabs R0580S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

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References

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Un protocolo para la producción de vectores lentivirales integrasa deficientes para CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout en dividir las células
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Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).More

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).

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