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Genetics

Un protocole pour la Production de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient pour CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout dans les cellules en Division

Published: December 12, 2017 doi: 10.3791/56915
Automatic Translation
1, 1
1Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine

Summary

Nous décrivons la stratégie de production de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient (IDLVs) comme des véhicules de livraison CRISPR/Cas9 aux cellules. Avec une capacité de médiation rapide et robuste de gène d’édition dans les cellules, IDLVs présentent une plus sûre et plateforme vector tout aussi efficaces pour la livraison de gène par rapport aux vecteurs capables d’intégrase.

Abstract

Vecteurs LENTIVIRAUX sont un choix idéal pour la prestation des modules d’édition de gène aux cellules en raison de leur capacité pour stablement transduction une vaste gamme de cellules et de médiation de hauts niveaux d’expression de gène. Cependant, leur capacité à s’intégrer dans le génome de la cellule hôte augmente le risque de mutagénicité insertional soulève des questions de sécurité et limite leur utilisation en milieu clinique. En outre, l’expression persistante de gène-montage de composants livrés par ces hausses de vecteurs LENTIVIRAUX capables d’intégration (ICLVs) la probabilité de ciblage de gènes ubiquistes. Comme alternative, une nouvelle génération de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient (IDLVs) a été développée qui aborde un grand nombre de ces préoccupations. Le protocole de production d’une plateforme jusque nouvel et améliorée pour les gènes CRISPR montage et liste les étapes de la purification et de concentration de ces vecteurs est décrite ici transduction et leurs efficacité édition de gène à l’aide de HEK-293 t cellules a été démontrée. Ce protocole est facilement évolutif et peut être utilisé pour générer des IDLVs de titre élevé qui sont capables de faire des cellules in vitro et in vivo. En outre, le présent protocole peut être facilement adapté pour la production de ICLVs.

Introduction

Gène précis édition constitue la pierre angulaire des grandes avancées biomédicales qui impliquent le développement de nouvelles stratégies pour lutter contre les maladies génétiques. À l’avant-garde des technologies de modification génétique est la méthode en s’appuyant sur l’utilisation de la clustered regularly -jenterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / système de Cas9 qui a été initialement identifié dans le cadre de l’immunité contre l’invasion virale matériel génétique (révisé dans les références1,2) bactérienne. Un avantage majeur du système CRISPR/Cas9 autres gène-montage des outils, tels que les nucléases de doigt de zinc (ZFNs) et les nucléases d’effecteur comme activateur de transcription (TAPS) (révisés en référence3), est la relative simplicité de conception de plasmide et construction des composants de CRISPR — une caractéristique qui a alimenté l’expansion du gène-montage de quelques laboratoires spécialisés à une communauté de recherche beaucoup plus large. En outre, la simplicité de programmation CRISPR/Cas9 et sa capacité de reconnaissance de cible multiplexé ont alimenté plus sa popularité comme une technologie rentable et facile à utiliser. Parmi les diverses méthodes disponibles aux chercheurs de livrer ces composantes de l’édition de gène aux cellules, vecteurs viraux demeurent de loin le plus populaire et efficace système.

Vecteurs LENTIVIRAUX (LVs) sont apparus comme le véhicule de choix pour fournir les composants de CRISPR/Cas9 système in vivo pour diverses applications4,5,6,7. Les principales fonctionnalités font LVs un choix populaire pour ce processus, y compris leur capacité à infecter des cellules en division et non de division, faible immunogénicité tant minime toxicité cellulaire (revu en référence8). Ainsi, la thérapie génique induite par le LV a été employée dans le traitement de maladies infectieuses comme le VIH-1 et HSV-1, HBV, ainsi que dans la correction des défauts sous-jacents des maladies héréditaires humaines, telles que la fibrose kystique et la dégénérescence maculaire neo-vasculaire 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. par ailleurs, LVs ont été effectivement modifiées pour effectuer des retouches de gène multiplex locus génomiques distincts à l’aide d’un vecteur unique système12.

Cependant, la propriété inhérente de LVs à intégrer dans le génome hôte peut être mutagène et handicape souvent leur utilité comme vecteurs de transgène, notamment dans les milieux cliniques. En outre, depuis intégrée de façon stable LVs expriment leur transgènes durablement élevés, ce système est inadapté pour la livraison de gène-montage de composants tels que les CRISPR/Cas9 ; la surexpression de l’ARN Cas9-guide (gRNA) et des protéines semblables tels que ZFNs, sont associées à des niveaux élevés d’effets hors cible, incluent des mutations indésirables13,14,15,16 , 17 et peut potentiellement améliorer la cytotoxicité18. Par conséquent, pour atteindre précis édition de gène avec des effets minimes hors cible, il est impératif de concevoir des systèmes qui permettent l’expression transitoire du gène montage des composants.

Ces dernières années, une variété de plates-formes de diffusion ont été développés pour exprimer transitoirement CRISPR/Cas9 dans cellules16,19,20,21 (revu en référence22). Il s’agit de méthodes qui dépendent directement introduire Cas9 purifiée ainsi que le guide approprié ARN dans des cellules, qui s’est avéré plus efficace à l’édition de gène ciblé par rapport à médiation plasmidique transfection16. Des études ont démontré que la ribonucléoprotéine (RNP) complexes comprenant guident RNA/Cas9 particules sont rapidement remis après médiation de clivage de l’ADN à leurs cibles, ce qui suggère que l’expression à court terme de ces composants est suffisante pour atteindre gène robuste édition16. En théorie, sans intégration des plates-formes de vecteurs viraux tels que les vecteurs viraux adéno-associés (AAVs) peuvent fournir une alternative viable pour livrer les machines édition de gène aux cellules. Malheureusement, les capsides AAV possèdent significativement plus faible capacité de l’emballage que LVs (< 5 Ko), qui entrave gravement leur aptitude pour empaqueter le toolkit CRISPR multicomposants au sein d’un unique vecteur (revu en référence8). Il est à noter qu’ajout de composés qui inhibent les histones désacétylases (p. ex., le butyrate de sodium23) ou entraver le cycle cellulaire (p. ex., caféine24) ont été montré pour augmenter des titres des gènes. Malgré les progrès récents, les systèmes d’expression transitoire développés jusque sont encore entravés par plusieurs défauts, tels que l’efficacité de la production plus faible, conduisant à des titres viraux réduits et efficacité faible transduction des vicitimes du virus ces approches25.

Vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient (IDLVs) représentent une avancée majeure dans le développement de véhicules de livraison-gène, car ils combinent la capacité de l’emballage de LVs avec l’avantage supplémentaire d’entretien épisomiques AAV-comme dans les cellules. Ces fonctionnalités permettent IDLVs de contourner en grande partie les principaux enjeux rattachés à l’intégration des vecteurs, surexpression continue vis-àvis des éléments potentiellement génotoxiques et mutagénicité induite par l’intégration. Il a été précédemment démontré que IDLVs peuvent être modifiées avec succès pour améliorer l’expression de gène épisomiques26,27. En ce qui concerne la livraison de médiation jusque CRISPR/Cas9, titres de production faible et plus faible expression des génomes épisomes-la charge par rapport aux systèmes des gènes intégrase-proficient limite leur utilité comme outils de bona fide pour la livraison du génome-montage constructions transgéniques. Nous avons récemment démontré que transgene expression tant des titres viraux associés à production jusque sont considérablement renforcés par l’inclusion de sites pour le facteur de transcription Sp1 dans l’expression virale cassette28de liaison. Les IDLVs mis à jour le fermement appuyé gènes CRISPR édition aussi bien in vitro (dans les cellules HEK-293 t) et in vivo (dans les neurones du cerveau post-mitotiques), tout en induisant des mutations hors cible minimales par rapport à la médiation ICLV correspondant 28de systèmes. Dans l’ensemble, nous avons développé un roman, compact, tout-en-un toolkit CRISPR exploite une plateforme jusqu’et décrit les divers avantages d’utiliser un tel véhicule de livraison pour l’édition de gène amélioré.

Ici, le protocole de production du système jusque-CRISPR/Cas9 est décrit, y compris les différentes étapes impliquées dans l’Assemblée, purification, concentration et titrage de IDLVs, ainsi que des stratégies pour valider l’efficacité de gène-édition de ces vecteurs. Ce protocole est facilement évolutif pour répondre aux besoins des différents enquêteurs et est conçu pour générer avec succès les vecteurs LV avec des titres dans l’ordre de 1 x 1010 unités (TU) de transduction / mL. Les vecteurs des vicitimes du présent protocole peuvent être utilisés pour infecter efficacement plusieurs types de cellules différentes, y compris de difficile-à-transduce les cellules souches embryonnaires, les cellules hématopoïétiques (les cellules T et les macrophages) et mis en culture et en vivo- neurones injectés. En outre, le protocole est également bien adapté pour la production de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase-compétente en quantités similaires.

Figure 1
Figure 1 : emballage jusque. (a) schéma du type sauvage intégrase protéine (b) le plasmide modifié a été dérivé de psPAX2 (voir méthodologie, construction plasmidique pour plus de détails). Image de gel d’agarose représentant des clones sélectionnés pour les clones de l’intégrase muté. Des échantillons d’ADN préparés à l’aide d’un mini-kit isolement ADN plasmidique standard ont été analysés par digestion avec EcoRV et SphI. Le clone correctement digérés (numéro 5, boîte rouge en pointillés) a été davantage vérifié par séquençage direct (Sanger) pour la substitution de D64E en INT. La cassette de l’intégrase déficients en emballage s’appelait pBK43. (c) schéma du protocole de transfection transitoire utilisées pour générer des vecteurs jusque-CRISPR/Cas9, montrant des cellules 293 t transfectées avec VSV-G, emballage et cassettes transgène (Sp1-CRISPR/Cas9 tout-en-un plasmide). Les particules virales qui bourgeonnent en dehors de la membrane cellulaire contiennent l’ARN pleine longueur du vecteur (exprimé de la cassette du transgène). La deuxième génération du système d’emballage jusqu’a été utilisée, qui comprend les protéines régulatrices Tat et expression Rev Rev. est complétée d’une cassette séparée (RSV-REV-plasmide). ABBREV: virus de répéter, VSV-G, la stomatite vésiculeuse LTR-Long-terminal G-protéine, promoteur du CMVp-cytomégalovirus ; Promoteur de sarcome de Rous de virus (VRS) ; RRE-(élément de réponse de Rev). Autres éléments régulateurs sur la cassette d’expression comprennent des sites de liaison du Sp1, élément Rev Response (RRE), Woodchuck Hepatitis Virus post-transcriptionnel réglementation élément (WPRE), un promoteur de 1α facteur core-élongation (EFS-NC), l’emballage de vecteur élément ψ (lb/po2), promoteur de cytomégalovirus (hCMV) humain et humain promoteur U6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Protocol

1. mise en culture des cellules HEK-293 t et l’ensemencement pour la Transfection de cellules

NOTE : Rein embryonnaires humaines 293 t (HEK-293 t) cellules croissent en DMEM, médias de forte concentration de glucose additionné de sérum de veau 10 % additionné de promoteurs de croissance et de fer et 1 x solution antibiotique-antimycosiques (100 x solution contient 10 000 pénicilline unités streptomycine 10 mg et 25 µg amphotéricine B par mL). Les médias sont également additionné de pyruvate de sodium 1 x, 1 x acide aminé non essentiel mix et 2 mM de L-Glutamine (dipeptide stock 200 mM L-alanyl-L-glutamine à 0,85 % NaCl). Les cellules sont cultivées en plaques de culture de tissu de 100 mm (superficie approximative de croissance est de 55 cm²). Un ratio de culture secondaire de 01:10 est utilisé avec la culture sous tous les 2-3 jours. La trypsine-EDTA 0,05 % est utilisé pour la dissociation des cellules entre les passages. Pour maintenir la cohérence entre les expériences, nous recommandons test sérum de veau lors du passage d’un lot/lot différent et surveiller tout changement dans la croissance cellulaire, l’efficacité de transfection et vector production.

  1. Démarrez une nouvelle culture en utilisant des cellules de passage bas (il est recommandé de ne pas utiliser de cellules après passage 15 ou si la croissance ralentit) par semis dans une plaque de culture de tissu de 10 cm. Utilisez DMEM additionné de 10 % de sérum pour la croissance cellulaire. La croissance de cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2 dans un incubateur de culture de tissus standard. Utilisez un hémocytomètre standard pour compter les cellules pour toutes les étapes subséquentes.
  2. Une fois les cellules atteignent 90-95 % croissance confluente, réensemencer en 15 cm plaques de culture de tissus (ci-dessous, étapes 1,3 - 1,5).
  3. Pour réamorcer, aspirer les médias de la plaque confluente et rincer doucement avec du PBS stérile 1 x. Incuber les cellules avec 2 mL de réactif dissociation (par exemple, la trypsine-EDTA) à 37 ° C pendant 3-5 min. ajoutez 8 mL de milieux contenant du sérum pour inactiver le réactif de dissociation et triturer les 10 - 15 fois avec une pipette sérologique pour créer une cellule unique de 10 mL suspension. Remettre en suspension des cellules dans les milieux de culture pour obtenir une densité cellulaire d’environ 4 x 106 cellules/mL.
  4. Pour améliorer l’adhérence au substrat, préalablement recouvrir les plaques de 15 cm avec 0,2 % de gélatine, ajoutant 8 mL de gélatine par plaque. Répartis uniformément sur la surface de la plaque et incuber à température ambiante pendant 10 min siphonner le liquide.
  5. Porter le volume total de chaque plaque à 25 mL avec tiède (37 ° C) médias HEK-293 T (voir la Note sous étape 1) et les plaques des graines en ajoutant 2,5 mL de cellules (total ~ 1 x 107 cellules/plaque). Incuber les plaques à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant la nuit ou jusqu'à ce que la confluence de 70 à 80 % est atteint.
    NOTE : Jusqu'à six planches de 15 cm peut être utilisé pour la production. Régler le volume des médias par plaque à ~ 20-22 mL lors de l’utilisation de plus de quatre assiettes (se reporter à l’étape 5 du protocole pour raison d’être).

2. transfectant HEK-293 t des cellules à l’aide d’un protocole à base de Phosphate de Calcium

  1. Réactifs de transfection
    1. Pour préparer 2 x solution tamponnée BES BBS (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4), combiner 16,36 g de NaCl, 10,65 g de BES (N, N-bis (2-hydroxyéthyl) -2-amino-ethanesulfonic acide) et 0,21 g de Na2HPO4. Ajouter bidistillée H2O (dd-H2O) jusqu'à 900 mL. Dissoudre, titrer à pH 6,95 avec 1 NaOH M et porter le volume à 1 L. filtre par filtre de 0,22 µM. Conserver à-20 ° C.
    2. Préparer 1M CaCl2. Filtrer la solution via un filtre de 0,22 µM. Conserver à 4 ° C.
  2. Observer les plaques qui ont été ensemencés un jour avant. Les cellules sont prêtes pour la transfection dès qu’ils atteignent la confluence de 70 à 80 %.
  3. Aspirer les anciens médias des plaques et ajouter doucement les médias fraîchement préparés sans sérum.
    Remarque : Consultez le Fichier complémentaire 1-plasmides pour plus de détails sur les plasmides choisis et leur préparation.
  4. Préparer le mélange de plasmide de plasmides toutes les quatre dans un tube conique de 15 mL. Pour une préparation de plat unique de 15 cm, utilisez 37,5 µg le vecteur CRISPR/Cas9-transfert (pBK198 ou pBK189), du 25 µg de pBK43 (psPAX2-D64E), 12,5 µg pMD2.G et 6,25 µg de pREV (Figure 1C).
  5. Ajouter 312,5 µL 1M CaCl2 pour le mix de plasmide. Pour cela, ajouter jusqu'à 1,25 mL stérile JJ-H20.
  6. Lentement (goutte-à-goutte) ajouter 1,25 mL de solution de x BBS 2 alors que l’agitation du mélange. Incuber 30 min à température ambiante.
  7. Ajouter le mélange de transfection goutte à chaque plaque de 15 cm (2,5 mL par plaque). Doucement tournoyer les plaques et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 2-3 h. Par la suite, ajouter 2,5 mL (10 %) de sérum par plaque et continuer en incubant pendant la nuit (12-18 h).
    Remarque : Certains laboratoires utilisent 3 % CO2 incubateurs pour stabiliser le pH de médias. Cependant, nous n’observons pas une différence dans l’efficacité de transfection entre 3 % et 5 % de CO2. En outre, la taille du CaPO4 précipite est cruciale pour l’efficacité de la transfection ; le mélange de transfection doit être clair avant son ajout dans les cellules. Si le mélange devient trouble durant l’incubation, préparer les frais 2 x BBS (pH = 6,95).

Figure 2
Figure 2 : Concentration des particules virales à l’aide de double-saccharose protocole dégradé. Les particules virales prélevés dans le surnageant (SN) sont chargés sur gradient gradient de saccharose. solutions de saccharose de 70 %, 60 %, 30 % et 20 % sont utilisées pour créer le dégradé. Après centrifugation, les particules prélevés dans les fractions de saccharose de 30 à 60 % sont plus chargés sur un coussin de saccharose de 20 % et précipités. Le granule final contenant des particules virales purifiées est resuspendu dans du PBS 1 x pour l’utilisation de l’autre (voir le texte pour plus de détails). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

3. jour après la Transfection

  1. Observer les cellules pour s’assurer qu’ils sont presque 100 % confluence à ce stade avec peu ou pas de mort cellulaire. Remplacer le support en ajoutant 25 mL de DMEM fraîche + 10 % de sérum de chaque plaque. Continuer en incubation à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 48 h supplémentaires.
    Remarque : Régler le volume des médias à l’étape 3.1 si vous utilisez plus de six planches de 15 cm (voir point 5.2, Note).

4. Virus de récolte

  1. Recueillir soigneusement le surnageant de toutes les plaques de culture de tissu contenant les cellules transfectées à l’aide d’une pipette de vitroplants stérile de 10 mL et de la piscine dans des tubes à centrifuger 50 mL.
  2. Désactivez la suspension par centrifugation à 400-450 x g pendant 10 min à l’aide d’une centrifugeuse de table. Filtrer le surnageant à travers une unité de filtration sous vide de 0,45 µm.
    Remarque : Le surnageant filtré peut être stockées à 4 ° C jusqu'à 4 jours avant de procéder à la concentration, ou aliquotés et stockées à-80 ° C. Les titres attendus de jusque-Sp1-CRISPR/Cas9 (non concentré) les préparations virales doivent être ~ 2 x 107 TU/mL (se reporter à l’étape 6 pour la détermination du titre). Cependant, éviter de soumettre les préparations virales à plusieurs cycles de gel-dégel, comme chaque cycle de gel et de dégel entraîne une perte de 10 à 20 % dans des titres fonctionnels.

5. la concentration de particules virales par Ultracentrifugation

Remarque : Nous utilisons une méthode de double-saccharose de purification qui comporte deux étapes : une étape de dégradé de saccharose et un pas de coussin de saccharose (Figure 2).

  1. Charger les tubes coniques ultracentrifugation dans l’ordre suivant pour créer un gradient de saccharose : 0,5 mL 70 % de sucrose (dissous en solution 1 PBS x), 0,5 mL 60 % de saccharose (dissous en DMEM), 1 mL 30 % de saccharose (dissous en DMEM) et 2 mL 20 % de sucrose (dissous dans du PBS 1 x).
  2. Ajouter délicatement le surnageant contenant le virus au gradient. Comme le volume total de liquide surnageant de quatre plaques de 15 cm est de 100 mL, utiliser six tubes ultracentrifugation par rotation pour traiter le volume complet du virus surnageant.
    1. Chaque tube d’ultracentrifugation utilisé pour cette étape a une capacité de volume allant jusqu'à 30 ml (y compris le volume de saccharose), distribuer le surnageant viral également entre les tubes, en laissant au moins 10 % headspace pour éviter toute fuite.
    2. Réglez le volume de la culture à ~ 20-22 mL par plaque lors de l’utilisation de plus de quatre plaques de 15 cm pour chaque expérience, afin que le volume final du surnageant viral mis en commun peut facilement être logé au sein de six tubes d’ultracentrifugation.
    3. Ultracentrifugation remplissage tubes au moins trois quarts leur capacité de volume total, sans quoi la rupture des tubes peut survenir lors de la centrifugation, ce qui entraîne une perte possible de dommages d’échantillon ou de l’équipement.
  3. Équilibrer les tubes avec 1 x PBS et centrifuger les échantillons à 70 000 x g pendant 2 h à 17 ° C (voir Table des matières pour plus de détails du rotor).
    Remarque : Pour éviter des perturbations de la couche de saccharose pendant l’accélération, définir l’ultracentrifugeuse pour accélérer lentement le rotor à 200 tr/min durant les 3 premières minutes de l’essaimage. De même, définir l’ultra-centrifugeuse à décélérer lentement le rotor de 200 tr/mn à 0 tr/min pendant 3 min à la fin de l’essorage.
  4. Recueillir soigneusement fractions de saccharose de 30 à 60 % dans des tubes propres (Figure 2). Ajouter froid 1 x PBS aux fractions mis en commun et faire apparaître le volume à 100 mL ; la composition de pipetage et descendre plusieurs fois.
  5. Passez à l’étape de coussin de saccharose en superposant soigneusement la préparation virale sur un coussin de saccharose. Pour ce faire, ajouter 4 mL de 20 % de sucrose (dans du PBS 1 x) dans le tube, suivi par environ 20-25 mL de la solution virale par tube. Si les tubes sont moins de trois quarts plein, compléter avec du PBS stérile 1 x.
  6. Soigneusement équilibrer et centrifuger les échantillons à 70 000 x g pendant 2 h à 17 ° C, comme avant. Décanter le liquide surnageant et laisser le reste liquide s’écouler en inversant les tubes sur du papier absorbant.
  7. Aspirer les gouttes restantes afin d’évacuer tout le liquide de la pastille. À cette étape, les granules contenant le virus devraient être à peine visibles sous forme de petites taches translucides.
  8. Remettre en suspension les boulettes en ajoutant 70 µL de PBS 1 x dans le premier tube et soigneusement pipetage la suspension, par la suite transférer la suspension pour le tube suivant et mélange comme avant, jusqu'à ce que toutes les granules sont remises en suspension.
  9. Rincer les tubes avec un supplémentaire 50 µL de froid 1 x PBS et mélange comme avant. Veiller à ce que le volume combiné de la suspension définitive est ~ 120 µL et apparaît légèrement laiteux ; l’effacer par centrifugation à 10 000 x g pendant 30 s sur une micro-centrifugeuse sur table.
  10. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger fraîches, faire 10 µL d’extraits et les stocker à-80 ° C.
    Remarque : Évitez d’effectuer des cycles de gel-dégel répétés sur les échantillons des gènes. Sauf si la centrifugation est nécessaire, des efforts doivent être faits pour effectuer les étapes restantes de vitroplants hottes ou désignés chambres de culture de tissus à l’aide de mesures de biosécurité appropriées (voir Discussion).

6. estimation des titres viraux

  1. p24 -enzyme-liée méthode d’immunosorbent assay (ELISA)
    Remarque : Le dosage est effectué à l’aide de plaques de 96 puits de haute-liaison que selon les instructions du programme NIH sida vaccin pour le VIH-1 p24 analyse de saisie d’antigène nécessaire (voir Table des matières) avec modifications29.
    1. Le lendemain, laver les puits trois fois avec 200 µL 0,05 % Tween 20 dans du PBS froid (solution de PBS-T). Recouvrir la plaque avec 100 µL de l’anticorps monoclonal anti-p24 à une dilution de 1:1500 dans du PBS 1 x et incuber une nuit à 4 ° C.
    2. Afin d’éliminer les liaisons non spécifiques, bloquer la plaque avec 200 µL 1 % BSA dans du PBS ; laver trois fois avec 200 µL 0,05 % Tween 20 dans du PBS froid (solution de PBS-T) pendant au moins 1 h à température ambiante.
    3. Préparer les échantillons : Pour les préparations concentrées vector, diluer 1 µL de l’échantillon 100 fois en ajoutant 89 µL de JJ-H20 et 10 µL de Triton X-100 (concentration finale de 10 %). Pour les préparations non concentré, préparer des échantillons dilués dix fois (ajouter 80 µL de JJ-H20 et 10 µL de Triton X-100 (concentration finale de 10 %) à 10 µL de l’échantillon).
      Remarque : Les échantillons peuvent être conservés à-20 ° C à cette étape pour une longue période de temps pour un usage ultérieur.
    4. Élaborer des normes de VIH-1 par l’application d’une facteur 2 dilutions (avec un départ ng/mL de concentration 5).
    5. Diluer les échantillons concentrés (à partir de stocks préalablement dilué au 1/100) en RPMI 1640 additionné de 0,2 % Tween 20 et 1 % de BSA d’établir à 01:10, 000, 01:50, 000 et des dilutions de 1/250 000. Diluer les échantillons non concentré (de 01:10, préalablement dilué les stocks) en RPMI 1640 additionné de 0,2 % Tween 20 et 1 % de BSA pour établir la dilution 1/500, 1:2500 et 1:12,500.
    6. Demander des échantillons sur la plaque en géométrie et incuber une nuit à 4 ° C.
    7. Le lendemain, laver les puits six fois et incuber à 37 ° C pendant 4 h avec 100 µL anticorps polyclonal de lapin anti-p24 anticorps, dilué 1/1000 dans RPMI 1640, 10 % FBS, 0,25 % de BSA et sérum de souris normales 2 % (NMS).
    8. Laver 6 fois comme indiqué ci-dessus et incuber à 37 ° C pendant 1 h avec la peroxydase de raifort anti-lapin chèvre IgG dilué 1/10 000 en milieu RPMI 1640 additionné de sérum de chèvre normal de 5 %, 2 % NMS, BSA de 0,25 % et 0,01 % Tween 20.
    9. Laver la plaque, comme indiqué ci-dessus et incuber avec substrat peroxydase TMB à température ambiante pendant 15 min.
    10. Arrêter la réaction en ajoutant 100 µL de 1 N HCL. Mesurer l’absorbance d’échantillon à 450 nm en utilisant l’absorbance sur plaque de lecteur.
  2. Mesure de l’intensité de fluorescence journaliste
    1. Méthode de FACS
      NOTE : L’étendue de l’appauvrissement de la couche de signal GFP dans des cellules peut être estimé avec précision en mesurant l’intensité de la fluorescence moyenne des cellules transduits par cytométrie en flux. Veuillez consulter le document récent 28 pour l’analyse de données de FACS, présentation et interprétation. Le protocole est décrit comme suit.
      1. Faire une dilution en série dix fois de la préparation (à partir de 10-1 à 10-5) de la préparation virale dans du PBS 1 x.
      2. Graines d’environ 5 x 105 293 t cellules dans chaque puits d’une plaque de 6 puits dans un volume final de 2 mL par puits. Ajouter 10 µL de chaque dilution virale aux cellules et incuber les cellules à 37 ° C pendant 48 h.
      3. Récolte des cellules pour l’analyse des FACS comme suit : ajouter 200 µL de solution de trypsine-EDTA 0,05 % et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 2 mL d’un média DMEM complet et prélever des échantillons dans des tubes coniques 15 mL.
      4. Cellules de granule par centrifugation à 400 x g à 4 ° C et Resuspendre le culot dans 500 µL de PBS 1 x contre le rhume.
      5. Pour la fixation, ajouter un volume égal de solution de formaldéhyde de 4 % à cette suspension et incuber pendant 10 min à température ambiante.
      6. Les cellules fixes de granule et remettre en suspension dans 1 mL de PBS 1 x. Analyser l’expression de la GFP à l’aide d’un instrument de FACS, comme décrit dans Ortinski et al. 28 a brièvement, utilisez la formule suivante pour déterminer le titre fonctionnel des virus :
        Equation 1
        NOTE : Ici Tg = nombre de cellules positives à GFP comptés ; TN = nombre total de cellules comptées ; N = nombre total de cellules transduites ; V = volume (µL) utilisé pour la transduction. Par exemple : si 1 x 106 cellules étaient transduites avec 10 µL de virus, 2 x 104 cellules ont été comptés et 5 x 103 GFP-positive, basée sur l’équation qui précède le titre fonctionnel serait :
        Equation 2
    2. Comptage des cellules positives GFP
      1. Calculer la multiplicité d’infection (MOI) utilisée pour la transduction. Tester une large gamme de MOIs (1-10), avec une augmentation de MOIs, ce qui entraîne une plus grande efficacité de transduction.
      2. Avant la transfection, amorcer une plaque 6 puits avec environ 3-4 x 105 cellules par puits. Une fois les cellules atteignent > confluence de 90 % (généralement moins de 24 h), transduce avec le virus purifié au MOIs pré-déterminé.
      3. Incuber 1 à 7 jours pour les modifications du signal GFP plaque à 37 ° C, avec 5 % de CO2 dans une culture de tissu standard et moniteur de cellules à intervalles réguliers.
      4. Compter le nombre de cellules GFP-positives avec un microscope à fluorescence (objectif PLAN 4 X, N.A 0.1, un grossissement de 40 X) équipé d’un jeu de filtre GFP (excitation d’onde-470 nm, émission nm de longueur d’onde-525), utilisant des cellules (non transduits) naïf pour définir la population des cellules de GFP-négatifs et positifs.
      5. Estimer le titre final en ajustant pour le facteur de dilution et le volume, à l’aide de la formule suivante :
        Equation 3
        NOTE : Ici, N = nombre de cellules de GFP-positives, D = facteur de dilution, M = facteur de grossissement (habituellement 20 X), V = volume du virus utilisé pour la transduction. Par exemple, pour 20 cellules de GFP-positif (N) dénombrées à une dilution de 10-4 (01:10, 000) dans un échantillon de 10 µL (V) à 20 X grossissement (M) (D) se traduirait par un titre fonctionnel (20 x 10-4) x (20) x (10) x (100 *) = 4 x 108 TU/mL.
        (* pour s’adapter à / mL)

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Representative Results

Validation de l’élimination directe-efficacité des vecteurs jusque-CRISPR/Cas9
Nous avons utilisé les cellules 293 t exprimant GFP comme modèle pour valider l’efficacité de la débouchure de gène CRISPR/Cas9-médiée. GFP + cellules ont été générés par transduction des cellules HEK-293 t avec pLenti-GFP (vBK201a) à un MOI de 0,5 (Figure 3 b, panneau « no-virus »). La cassette de sgRNA-à-GFP/Cas9 tout-en-un vecteur a été emballée en particules jusqu’ou ICLV et l’efficacité de la production a été évaluée par p24 ELISA (voir ci-dessus ; et Figure 3 a). Les titres des vecteurs contenant les sites de liaison du Sp1 (concentration suivante) se sont avérés pour être de l’ordre de 1010 TU/mL. Ensuite, nous avons évalué l’efficacité de la débouchure GFP, microscopie de fluorescence (Figure 3 b). À cette fin, 5 x 105 GFP exprimant des cellules 293 t ont été ensemencées dans une plaque de 6 puits et nous leur transduites 24 h plus tard avec jusque - ou ICLV-CRISPR/Cas9 à MOIs de 1 et 5 (Figure 3 b). Les cellules sont incubées pour 24h, après quoi le milieu de culture a été remplacé et les cellules sont incubées pendant 48 h supplémentaires, avant de réensemencer les plaques pour les jours suivants de l’expérience.

Dans une étude récente, nous avons mesuré l’intensité de fluorescence moyenne de GFP + cellules transduites avec ICLV/CRISPR ou composants jusque/CRISPR via écoulement cytometry28. Nous avons vu GFP-épuisement comparable dans la transduction après 14 jours échantillons (pt) (appauvrissement de la couche du signal 2-4 %) et l’appauvrissement presque identiques de GFP 21 jours pt (> appauvrissement de 99 % de signal)28. En concordance avec les observations précédentes, nous avons observé un ~ quintuple réduction du nombre de séropositifs au GFP cellules dès 7 jours pt (Figure 3), avec une déplétion de signal presque complète après transduction avec observé par 14 jours pt (données non présentées) les deux systèmes ICLV - et jusque-CRISPR/Cas9. La perte de signal a été évaluée comme étant le rapport des cellules qui sont restées GFP-positif après le traitement et le nombre total de cellules positives à GFP naïf. Ces résultats démontrent clairement que les constructions de CRISPR/Cas9 envoyées par IDLVs sont comparables à ceux offerts par leurs homologues intégrés dans leur capacité de médiation gène rapide, robuste et soutenue d’édition dans les cellules en division.

Figure 3
Figure 3 : Evaluation des titres viraux. (a) par p24-analyse d’ELISA. Des titres pour le concentré Sp1-jusque-CRISPR/Cas9 (barre noire) et Sp1-ICLV-CRISPR/Cas9 (barre blanche) ont été évalués. Les résultats sont consignés dans le nombre de copies / mL, où 1 ng p24-gag = 1 x 104 particules virales. Données de graphique à barres représentent la moyenne ± écart type des expériences en triple. (b) l’efficacité induite par l’évaluation de CRISPR GFP-knockout. Appauvrissement de la couche du signal de la GFP a été comparée entre 5 et cellules GFP + 293 t ICLV-CRISPR/Cas9 - et jusque-CRISPR/Cas9-transduites à MOIs de 1. Non-transduite (panneau « aucun virus » dans la figure) des cellules positives GFP ont été utilisés comme témoins. Des images ont été acquises à l’aide d’un microscope à fluorescence à un grossissement de X 40 à 7 jours post transduction. ABBREV: RRE : Rev Response Element, EFS-NC : promoteur de core-élongation facteur 1α, ψ (lb/po2) : élément d’emballage vector, hU6 : humaine promoteur U6, Puro : cassette de résistance à la puromycine, WPRE : Woodchuck Hepatitis Virus post-transcriptionnel réglementaire ELEMENT, LTR : Répétition de Long-terminal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : plasmides S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

IDLVs ont commencé à émerger en tant que véhicule de choix pour l’in vivo gene-édition, en particulier dans le contexte des maladies génétiques, due en grande partie au faible risque de mutagenèse associée à ces vecteurs par rapport à l’intégration de plateformes de livraison22 , 28. dans le manuscrit actuel, nous avons cherché à détailler le protocole lié à la production de l’all-in-one jusque-CRISPR/Cas9 système amélioré qui a été récemment mis au point dans notre laboratoire28.

Modifications aux plateformes existantes
Avec cette méthode, nous avons pu générer jusque-CRISPR/Cas9 et ICLV-CRISPR/Cas9 vecteurs aux concentrations de l’ordre de 1 x 1010 TU/mL (Figure 3 a). Cette amélioration de l’efficacité de production est attribuable à l’ajout du site de liaison Sp1 dans la cassette de vecteur CRISPR/Cas9 all-in-one. En effet, nous avons récemment rapporté que l’inclusion de Sp1 entraîne une augmentation de ~2.5-fold dans l’efficacité de l’emballage de jusque - et ICLV-CRISPR/Cas9 vecteurs et un ~ ordre 7 augmentation dans les titres fonctionnelles globale. Ces résultats sont en accord avec les précédents travaux de divers groupes en soulignant Sp1 comme un régulateur clé de type sauvage du VIH-130,31,32,33,34,35 .

Étapes critiques et dépannage
Comme souligné plus haut, Sp1-IDLVs transportant CRISPR/Cas9 transgènes étaient capables de générer des titres dans le voisinage de 1 x 1010 TU/mL par ~ 5 x 107 cellules de producteur. Plus bas que ces titres serait indicatifs d’erreurs dans le processus de production, auquel cas la crucial qui suit points devraient être considérés pour l’amélioration de titre : 1) il est recommandé que les cellules de producteur de préférence être du nombre de passage bas, avec remplacement après ≥ 15 passages et/ou quand on observe une croissance plus lente. 2) le choix des composants de médias cellulaire est important en termes d’efficacité de production. Par exemple, à la place de l’usage courant sérum de veau fœtal, nous constatons que l’utilisation de sérum de veau cosmique constamment améliorée de la croissance cellulaire et la production virale, tout en étant rentable en même temps. 3) la remise en forme de production des différentes lignes HEK doit être soigneusement évaluée. Par exemple, nous avons trouvé un ~ triple différence de rendement de la production virale entre cellules 293 t et 293-pi (voir la Table des matières) cells (données non présentées). 4) il est recommandé que les cellules transfected lorsqu’ils sont à peu près confluente de 70 à 80 %, avec des densités plus faibles de cellule ayant entraîné la mort prématurée des cellules en raison de la toxicité virale et des densités plus élevées, entraînant une baisse marquée de l’efficacité de production. En règle générale, nous vous suggérons de comptabilité pour une densité cellulaire qui permet aux cellules de subir un supplémentaire autour de la division cellulaire après transfection. 5) Enfin, l’efficacité de la transfection dépend fortement du pH de 2 x BBS, qui doit être maintenue à exactement 6,95 pour la transfection idéale. Il est donc fortement recommandé que chaque nouveau lot de 2 x BBS être vérifié sur une échelle de pilote-transfection.

Sécurité et manutention de vecteur
Il y a plusieurs considérations de sécurité importantes lors de la production de vecteurs jusqu’et ICLV avec ce protocole. Tout d’abord, l’utilisation de lentivirus exige de confinement de biosécurité de niveau II. Malgré les caractéristiques de sécurité offertes par des vecteurs SIN, activité transcriptionnelle résiduelle de vecteurs SIN a été rapporté36. En outre, les travaux précédents a fait valoir que jusque - et ICLV-génomes peuvent être productivement sauvées par le VIH-1,27. Par conséquent, il est fortement recommandé que tests de compétence de réplication (RCA) accomplir, surtout lorsque des lentivirus concentrés sont utilisé37. Pour les procédures de sécurité en ce qui concerne manipulation des préparations de vecteur lentiviral, voir Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4e édition, publié par les Centers for Disease Control (CDC), qui peuvent être trouvés en ligne38. Sur la même note, troisième génération de systèmes39 avec fonctionnalités de biosécurité renforcée d’emballage utilisable pour emballer les IDLVs et ICLVs, mais avec une efficacité moindre que celle du système de deuxième génération.

Signification et orientations futures
Dans l’ensemble, le protocole de production pour IDLVs pour CRISPR/Cas9 - mediated gene montage décrit ici représente la première évaluation de l’efficacité de ce système dans les cellules se divisant rapidement. À l’aide de cellules positives GFP HEK-293 t, nous avons démontré que le Sp1-CRISPR/Cas9 envoyées par IDLVs pouvez éditer rapidement et efficacement GFP dans ces cellules, avec des cinétiques similaires comme ICLVs. Ces observations concordent avec les résultats de travaux antérieurs à l’aide de complexes ribonucléoprotéiques (Cas9 RNP) pour le gène modifier par le biais de méthodes de transfection non-virales. Cette nouvelle plateforme plus enrichit la boîte à outils en constante expansion pour la livraison de gène-montage de composants et autres cargos moléculaires de cellules.

Comme discuté plus tôt, malgré les récents progrès dans le développement de systèmes axés sur des gènes gène-livraison, il y a peu à aucune option pour les plateformes qui permettent la production durable de haut-titre de vecteurs viraux pour gène transitoire, rapide et ciblée manipulation. Grâce à l’incorporation du liant les motifs pour un facteur de transcription fortement exprimés dans la cassette d’expression de transgènes, nous avons pu traiter simultanément plusieurs de ces questions. Cette manipulation simple mais néanmoins essentielle ouvre un certain nombre de pistes pour le développement de plateformes de distribution similaires. Il serait particulièrement utile tester si l’expression de transgènes peut être renforcée par soit l’ajout de nombreuses copies du même motif contraignant ou de multiplexage le motif Sp1 avec accepteurs d’autres facteurs de transcription. Avec de tels outils à notre disposition, il est tentant de spéculer que l’expression de promoteurs relativement faibles de tissu-spécifiques, tels que ceux des humain Synapsin I (hSyn) et souris calcium/calmoduline-dépendante protéine kinase II (CaMKII), pourrions être significativement amélioré les deux in vitro et in vivo.

Bien que la présente étude se limitait à tester la capacité de knockdown de gène de livraison jusque CRISPR/Cas9, en principe, la polyvalence de notre système serait se prête à diverses applications d’édition gène, telles que celles s’appuyant sur le catalytiquement inactif dCas940. Enfin, combiné avec des endonucléases de plus petits, tels que SaCas9,41 et42de Cpf1, la plate-forme décrite dans cette étude peut être adoptée vers l’établissement de systèmes très efficace axée sur les AAV gène-livraison dans un relativement court laps de temps, qui offrirait l’avantage supplémentaire de l’immunogénicité faible par rapport aux vecteurs LENTIVIRAUX. Inutile de préciser que ces approches serait un pas positif vers le développement du roman, efficace et les vecteurs viraux cliniquement sûrs.

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Disclosures

USC-499-P de brevet (1175) a été déposée par la University of South Carolina, en ce qui concerne les travaux décrits dans ce manuscrit.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier le département de neurobiologie, Duke University School of Medicine et Décanat en sciences fondamentales, Université Duke. Nous remercions également les membres du noyau Duke vecteur Viral pour commentaires sur le manuscrit. Plasmide pLenti CRISPRv2 était le cadeau de Feng Zhang (Broad Institute). Le système de LV-emballage, y compris le psPAX2 de plasmides, VSV-G, pMD2.G et pRSV-Rev était un gentil cadeau de Didier Trono (EPFL, Suisse). Soutien financier à ce travail a été fourni par l’Université d’école de médecine en Caroline du Sud, accorder RDF18080-E202 (BA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
xMark Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
BD FACS Becton Dickinson 338960
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor Beckman Coulter 369650
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
High-binding 96-well plates Corning 3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Tissue culture pipettes, 5 mL Corning 4487
Tissue culture pipettes, 10 mL Corning 4488
Tissue culture pipettes, 25 mL Corning 4489
Hemacytometer with cover slips Cole-Parmer UX-79001-00
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
DMEM, high glucose media Gibco 11965
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) Sigma Aldrich B9879 - BES
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
pRSV-Rev Addgene 12253
lentiCRISPR v2 Addgene 52961
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsrGI New England Biolabs R0575S
BsmBI New England Biolabs R0580S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Génétique numéro 130 transfert de gènes d’origine virale cellules HEK-293 t vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficients gène CRISPR/Cas9 montage système p24 ELISA saccharose-gradient ultracentrifugation FACS
Un protocole pour la Production de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient pour CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout dans les cellules en Division
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Vijayraghavan, S., Kantor, B. A… More

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).

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