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Genetics

Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen

doi: 10.3791/56915 Published: December 12, 2017

Summary

Wir beschreiben die Produktionsstrategie der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) als Vehikel für Zellen CRISPR/Cas9 bereitzustellen. Mit der Fähigkeit, schnell und robust Gene in Zellen bearbeiten zu vermitteln IDLVs präsentieren ein sicherer und ebenso wirksame Vektor Plattform für gen-Lieferung im Vergleich zu Integrase-kompetente Vektoren.

Abstract

Lentivirale Vektoren sind eine ideale Wahl für die Bereitstellung von gen-Bearbeiten von Komponenten auf Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit zur stabil transducing einen breiten Bereich von Zellen und hohe Stufen der Genexpression zu vermitteln. Jedoch ihre Fähigkeit zur Integration in das Wirtsgenom Zelle erhöht das Risiko der insertional Mutagenität und damit Sicherheit Bedenken und schränkt ihre Verwendung in klinischen Umgebungen. Weiter, geliefert der anhaltenden Ausdruck der gen-Bearbeiten von Komponenten durch diese Integration zuständigen Lentivirale Vektoren (ICLVs) erhöht die Wahrscheinlichkeit von promiscuous Gene targeting. Als Alternative hat eine neue Generation von Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) entwickelt, die viele dieser Bedenken befasst. Hier Produktionsprotokoll einer neuen und verbesserten IDLV-Plattform für CRISPR-vermittelten gen bearbeiten und Liste der Schritte bei der Reinigung und Konzentration von solchen Vektoren beschrieben und deren Transduktion und gen-Bearbeitung Effizienz mit HEK-293T Zellen zeigte. Dieses Protokoll ist leicht skalierbar und kann verwendet werden, um hohe Titer IDLVs generieren, die in der Lage, transducing Zellen in Vitro und in Vivo. Darüber hinaus kann dieses Protokoll für die Herstellung von ICLVs leicht angepasst werden.

Introduction

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Gen präzise Bearbeitung bildet den Grundstein biomedizinische Fortschritte, die die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung genetischer Krankheiten betreffen. An die Spitze der gen-Bearbeitungs-Technologien ist die Methode unter Berufung auf die Nutzung der clustered rregelmässig -IchNterspaced sHort pAlindromic REpeats (CRISPR) / Cas9-System, das zunächst identifiziert wurde als Bestandteil des bakteriellen Immunität gegen die Invasion der viralen Erbsubstanz (rezensiert in Referenzen1,2). Ein wesentlicher Vorteil des CRISPR/Cas9-Systems gegenüber anderen gen-editing-Tools, wie z. B. Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) und Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs) (rezensiert in Referenz3), ist die relative Einfachheit der Plasmid-Design und Bau von CRISPR-Komponenten – ein Feature, das den Ausbau der gen-Bearbeitung von wenigen Speziallabors für eine viel breitere Forschungsgemeinschaft angetrieben hat. Darüber hinaus haben die Einfachheit der CRISPR/Cas9 Programmierung und seine Kapazität für Multiplex Zielerfassung seine Popularität als eine kostengünstige und einfach zu bedienende Technologie weiter angeheizt. Unter den verschiedenen Methoden zur Verfügung, um Forscher solche gen-Bearbeiten von Komponenten an Zellen zu liefern bleiben virale Vektoren bei weitem die beliebteste und effizientes System.

Lentivirale Vektoren (LVs) entstanden als das Fahrzeug der Wahl für die Komponenten des CRISPR/Cas9 System in Vivo für unterschiedlichste Anwendungen4,5,6,7liefert. Mehrere wichtige Funktionen machen LVs eine beliebte Wahl für diesen Prozess, einschließlich ihrer Fähigkeit, sowohl trennende und nicht teilenden Zellen, niedrige Immunogenität und minimale zelluläre Toxizität (rezensiert in Referenz8) zu infizieren. Infolgedessen wurde LV-vermittelte Gentherapie in der Behandlung von Infektionskrankheiten wie HIV-1, HBV und HSV-1, sowie bei der Korrektur von Mängeln, die zugrunde liegenden menschlichen Erbkrankheiten, wie Mukoviszidose und Neo-Kreislauf Makuladegeneration eingesetzt 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Außerdem, LVs wurden effektiv geändert um Multiplex-gen an unterschiedliche genomic Loci mit einem einzigen Vektor System12Bearbeitung ausführen.

Jedoch kann die inhärente Eigenschaft des LVs in das Wirtsgenom integrieren mutagen und oft behindert ihre Nützlichkeit als Transgen Lieferfahrzeuge, vor allem im klinischen Umfeld. Da zudem stabil integriert LVs ihre transgene auf einem nachhaltig hohen Niveau zum Ausdruck bringen, ist dieses System ungeeignet für die Lieferung von gen-Bearbeiten von Komponenten wie CRISPR/Cas9; Überexpression des Cas9-Guide RNA (gRNA) und ähnliche Proteine wie ZFN, sind verbunden mit erhöhten Konzentrationen von Ziel-Effekte, darunter unerwünschte Mutationen13,14,15,16 , 17 und können potenziell Zytotoxizität18verbessern. Daher unbedingt um präzise zu erreichen gen-Bearbeitung mit minimal Ziel Effekte, Design-Systemen, die für die transiente Expression des Gens, die Bearbeitung von Komponenten ermöglichen.

In den letzten Jahren wurden eine Vielzahl von Plattformen entwickelt, um vorübergehend CRISPR/Cas9 in Zellen16,19,20,21 (rezensiert in Referenz22) zum Ausdruck bringen. Dazu gehören Methoden, die direkt Einführung von gereinigten Cas9 zusammen mit der passenden Guide-RNAs in Zellen, die gezeigt wurde, effektiver auf gezielte gen-Bearbeitung im Vergleich zu Plasmid-vermittelte Transfektion16abhängig. Studien haben gezeigt, dass Ribonucleoprotein (RNP) komplexe, bestehend aus Leitfaden RNA/Cas9 Partikel werden schnell umgedreht nach Vermittlung Spaltung der DNA auf ihre Ziele, was darauf hindeutet, dass kurzfristige Ausdruck dieser Komponenten zu erzielen ist robuste gen16bearbeiten. Denkbar, nicht-Integration von viralen Vektoren Plattformen wie Adeno-assoziierten viralen Vektoren (Flugabwehrpanzer) bieten eine echte Alternative um gen-Bearbeitung Maschinen an Zellen zu liefern. Leider AAV Capsids besitzen deutlich geringere Verpackung Fähigkeit als LVs (< 5kb), die schwer behindert ihre Fähigkeit, das Mehrkomponenten CRISPR-Toolkit innerhalb einer einzigen Vektor (rezensiert in Referenz8) zu verpacken. Es ist erwähnenswert, dass die Zugabe von Verbindungen, die Histon Deacetylases (z.B. Natrium Butyrat23) hemmen oder verhindern den Zellzyklus (z.B. Koffein24) gezeigt worden, um Lentivirale Titer zu erhöhen. Trotz der jüngsten Fortschritte sind die transiente Expression-Systeme so weit entwickelt noch mehrere Mängel auf, z. B. geringere Produktionseffizienz, behindert durch führen zu reduzierten virale Titer und niedrigen Transduktion Effizienz erzeugt durch Viren solche Ansätze25.

Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) stellen einen großen Fortschritt in der Entwicklung von gen-Lieferfahrzeuge, wie sie die Verpackung-Fähigkeit des LVs mit dem zusätzlichen Vorteil der AAV-artigen episomal Wartung in Zellen verbinden. Diese Funktionen helfen IDLVs, die die wichtigsten Probleme im Zusammenhang mit Integration von Vektoren, Vis À Vis kontinuierliche Überexpression von potenziell genotoxische Elementen und Integration-vermittelten Mutagenität weitgehend zu umgehen. Es wurde bereits gezeigt, dass IDLVs erfolgreich zur Verbesserung der episomal gen Ausdruck26,27geändert werden kann. In Bezug auf IDLV-vermittelten CRISPR/Cas9 Lieferung beschränkt niedrige Titer und niedriger Ausdruck von Episome getragen Genomen relativ Integrase-kompetente Lentivirale Systeme ihre Nützlichkeit als Bona Fide -Tools für die Bereitstellung von Genom-Bearbeitung transgene Konstrukte. Wir zeigten kürzlich, dass Transgene Ausdruck und virale Titer IDLV Produktion durch die Einbeziehung von Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor Sp1 in der viralen Ausdruck Kassette28erheblich verbessert werden. Die modifizierte IDLVs unterstützt robust CRISPR-vermittelten gen Bearbeitung sowohl in Vitro (in HEK-293T Zellen) und in Vivo (im Post-mitotische Gehirnneuronen), während minimalste Ziel Mutationen im Vergleich zu den entsprechenden ICLV-vermittelte Induktion Systeme-28. Insgesamt entwickelten wir eine neuartige, kompakte, all-in-One CRISPR-Toolkit auf einer IDLV Plattform durchgeführt und erläutert die verschiedenen Vorteile der Verwendung solch ein Transportvehikel für verbesserte gen zu bearbeiten.

Hier ist das Produktionsprotokoll des IDLV-CRISPR/Cas9-Systems beschrieben, darunter die verschiedenen Schritte in der Montage, Reinigung, Konzentration und Titration von IDLVs sowie Strategien, die gen-Bearbeitung Wirksamkeit dieser Vektoren zu validieren. Dieses Protokoll ist leicht skalierbar, um die Bedürfnisse der verschiedenen Forschern und wurde entwickelt, um erfolgreich LV Vektoren mit Titer im Bereich von 1 x 1010 transducing Einheiten (TU) erzeugen / mL. Die Vektoren generiert durch dieses Protokoll können genutzt werden, um effizient mehrere verschiedene Zelltypen, einschließlich schwer transduzieren embryonale Stammzellen, blutbildenden Zellen (T-Zellen und Makrophagen) und kultiviert und in Vivozu infizieren- eingespritzte Neuronen. Darüber hinaus ist das Protokoll für die Produktion der Integrase-kompetente Lentivirale Vektoren in ähnlichen Mengen gleich gut geeignet.

Figure 1
Abbildung 1: IDLV Verpackung. (a) schematische Darstellung der Wildtyp Integrase Protein (b) das modifizierte Plasmid wurde von psPAX2 abgeleitet (siehe Methoden, Plasmid-Konstruktion für Details). Vertreter Agarose Gelbild geschirmt für mutierte Integrase Klone Klone. DNA-Proben mit den standard Plasmid DNA-Isolierung Mini-Kit zubereitet wurden durch Vergärung mit EcoRV und SphI analysiert. Der richtig verdaut Klon (Nummer 5, gestrichelten roten Feld) wurde weiter durch Sequenzierung der direkten (Sanger) für die D64E Substitution in INTüberprüft. Die Integrase-defizienten Verpackung Kassette wurde pBK43 genannt. (c) schematische Darstellung der transiente Transfektion Protokoll eingesetzt, um generieren IDLV-CRISPR/Cas9 Vektoren zeigen, dass 293T Zellen mit VSV-G, Verpackungen und Transgen Kassetten (Sp1-CRISPR/Cas9 all-in-One Plasmid) transfiziert. Viruspartikel, die heraus von der Zellmembran Knospe enthalten die Full-length RNA des Vektors (ausgedrückt aus der Transgen-Kassette). Die zweite Generation der IDLV-Verpackungssystem diente, worunter die regulatorische Proteine Tat und Rev Rev Ausdruck wird von einer separaten Kassette (RSV-REV-Plasmid) ergänzt. Abbrev: LTR Long Terminal repeat, VSV-G, Stomatitis vesicularis Virus G-Protein, pCMV-Zytomegalievirus Veranstalter; Rous Sarkom-Virus (RSV) Veranstalter; RRE-(Rev-Response-Element). Weitere regulatorische Elemente auf der Expressionskassette gehören Sp1-Bindungsstellen, Rev Response-Element (RRE), Murmeltier Hepatitis Virus posttranskritionelle regulatorische Element (WPRE), Kern-Dehnung Faktor 1α Förderer (EFS-NC), der Vektor-Verpackung Element-ψ (Psi), menschliches Cytomegalovirus (hCMV) Veranstalter und menschlichen U6 Förderer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Protocol

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(1) Kultivierung HEK-293T Zellen und Aussaat zur Transfektion

Hinweis: Menschliche embryonale Nieren 293T (HEK-293T) Zellen wachsen in DMEM, hohe Glukose Medien mit 10 % bovine Kälberserum ergänzt mit Eisen und Wachstum Promotoren und 1 x Antibiotikum antimykotische Lösung ergänzt (100 X Lösung enthält 10.000 Einheiten Penicillin 10 mg Streptomycin und 25 µg Amphotericin B pro mL). Die Medien ist auch mit 1 X Natrium Pyruvat, 1 X nicht-essentielle Aminosäure-Mix und 2 mM L-Glutamin ergänzt (Lager 200 mM L-Alanyl-L-Glutamin Dipeptid in 0,85 % NaCl). Zellen sind in 100 mm Gewebekultur Platten kultiviert (ungefähre Wachstum Fläche beträgt 55 cm ²). Ein Sub-Anbau-Verhältnis von 01:10 dient mit Sub-Kultivierung alle 2-3 Tage. Trypsin-EDTA 0,05 % dient zur Dissoziation von Zellen zwischen Passagen. Um Konsistenz zwischen Experimente zu gewährleisten, wir empfehlen Tests Kalb Sera, beim Wechsel zu einer anderen Menge/Charge und alle Änderungen im Zellwachstum, Transfektion Effizienz überwachen und Vektor-Produktion.

  1. Starten Sie eine neue Kultur mit niedrigen Durchgang Zellen (es empfiehlt sich, nach Passage 15 oder wenn Wachstum sich verlangsamt Zellen nicht mehr verwenden) durch Aussaat in einer Gewebekultur 10-cm-Platte. Verwenden Sie DMEM mit 10 % Serum für das Zellwachstum ergänzt. Wachsen Sie bei 37 ° C mit 5 % CO2 in einem Inkubator standard Gewebekultur Zellen. Verwenden Sie ein standard Hemocytometer Zellen für alle weiteren Schritte zu zählen.
  2. Sobald die Zellen konfluierende Wachstum von 90-95 %, Reseed in 15 cm Gewebekultur Platten (siehe unten, Schritte 1,3 - 1,5) erreichen.
  3. Um reseed, aspirieren Sie Medien aus der konfluierende Platte und sanft spülen mit sterilen 1 X PBS. Inkubieren Sie Zellen mit 2 mL Reagenz (z.B.Trypsin-EDTA) Dissoziation bei 37 ° C für ca. 3-5 min. hinzufügen 8 mL Medium, das Serum zu inaktivieren die Dissoziation-Reagenz, genannte 10 - 15 Mal mit einer serologischen 10 mL-Pipette, erstellen Sie eine einzelne Zelle enthält Aufhängung. Aufschwemmen Sie Zellen in der Kultur, Medien, eine Zelldichte von ca. 4 x 106 Zellen/mL zu erhalten.
  4. Zur Verbesserung der Einhaltung der auf das Substrat vor Mantel 15 cm Platten mit 0,2 % Gelatine, Hinzufügen von 8 mL Gelatine pro Platte. Gleichmäßig über die Oberfläche der Platte, bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren und die Flüssigkeit abschöpfen.
  5. Bringen Sie das Gesamtvolumen der jede Platte auf 25 mL mit Warm (37 ° C) HEK-293 T Medien (siehe Hinweis unter Schritt 1) und Samen der Platten durch Zugabe von 2,5 mL Zellen (insgesamt ~ 1 x 107 Zellen/Platte). Inkubieren Sie Platten bei 37 ° C mit 5 % CO2 , über Nacht oder bis 70-80 % Konfluenz erreicht ist.
    Hinweis: Bis zu sechs 15 cm Platten kann für die Produktion verwendet werden. Einstellen Sie Lautstärke der Medien pro Platte bis ~ 20-22 mL, wenn Sie mehr als vier Platten verwenden (siehe Schritt 5 des Protokolls zur Begründung).

2. transfecting HEK-293T Zellen mit einem Calcium-Phosphat-basiertes Protokoll

  1. Transfektion Reagenzien
    1. 2 x BES-gepufferte Lösung BBS (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4) vorzubereiten, kombinieren Sie 16,36 g NaCl, 10,65 g BES (N, N-Bis (2-Hydroxyethyl) -2-amino-Ethanesulfonic Säure), und 0,21 g Na2HPO4. Fügen Sie bidestilliertem H2O (Dd-H2O) bis zu 900 mL. Auflösen, bis pH 6,95 mit 1 M NaOH titrieren und Volumen 1 L. Filter über 0,22 µM-Filter-Einheit zu bringen. Shop bei-20 ° C.
    2. 1M CaCl2vorbereiten. Filtern Sie Lösung über einen 0,22 µM-Filter. Shop bei 4 ° C.
  2. Beobachten Sie die Platten, die einen Tag zuvor ausgesät wurden. Zellen sind bereit zur Transfektion, sobald sie 70-80 % Konfluenz erreicht.
  3. Aspirieren Sie alte Medien von den Platten und fügen Sie frisch zubereiteten Medien ohne Serum sanft hinzu.
    Hinweis: Weitere Informationen über den gewählten Plasmiden und deren Vorbereitung Ergänzende Datei 1-Plasmide .
  4. Bereiten Sie den Plasmid-Mix durch Aliquotierung der vier Plasmide in eine 15 mL konische Röhrchen. Für eine 15 cm Einzelgericht Zubereitung verwenden 37,5 µg der CRISPR/Cas9-Übertragung Vektor-(pBK198 oder pBK189), 25 µg des pBK43 (psPAX2-D64E), 12,5 µg pMD2.G und 6,25 µg pREV (Abbildung 1 c).
  5. 312,5 µL 1M CaCl2 der Plasmid-Mischung hinzufügen. Dazu fügen Sie bis zu 1,25 mL sterile Dd-H20.
  6. Langsam (tropfenweise) 1,25 mL 2 X BBS-Lösung beim Aufschütteln der Mischung hinzugeben. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  7. Fügen Sie die Transfektion Mischung tropfenweise auf jede 15-cm-Platte (2,5 mL pro Teller). Die Platten sanft wirbeln und Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 2-3 h. Danach fügen Sie 2,5 mL (10 %) Serum pro Platte und weiter Inkubation über Nacht (12-18 h).
    Hinweis: Einige Labors verwenden 3 % CO2 Inkubatoren Medien pH-Wert stabilisieren. Wir beobachten jedoch keiner Unterschied in Transfektion Effizienz zwischen 3 % und 5 % CO2. Auch ist die Größe des CaPO4 Ausscheidungen entscheidend für Transfektion Effizienz; die Transfektion Mischung muss klar vor seinen Zusatz auf die Zellen sein. Wenn die Mischung während der Inkubation trübe wird, bereiten frische 2 X BBS (pH = 6,95).

Figure 2
Abbildung 2: Konzentration der viralen Partikel mit Doppel-Saccharose gradient Protokoll. Viruspartikel aus der Überstand (SN) gesammelt werden auf Farbverlauf Saccharose Farbverlauf geladen. 70 %, 60 %, 30 % und 20 % Saccharose-Lösungen werden verwendet, um den Farbverlauf zu erzeugen. Nach Zentrifugation werden die Partikel von 30-60 % Saccharose Fraktionen gesammelt weiter auf 20 % Saccharose Kissen verladen und ausgefällt. Die endgültige Pellet mit gereinigtem Viruspartikel ist Nukleinsäuretablette mit 1 X PBS-Puffer für die weitere Verwendung (siehe Text für weitere Details). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

3. Tag nach Transfektion

  1. Beobachten Sie die Zellen um sicherzustellen, dass sie 100 % Konfluenz zu diesem Zeitpunkt mit wenig bis kein Zelltod nähern. Ersetzen Sie Medien durch Zugabe von 25 mL frische DMEM + 10 % Serum auf jede Platte. Weiter Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2 für weitere 48 h.
    Hinweis: Lautstärke der Medien im Schritt 3.1, wenn mehr als sechs 15 cm Platten verwenden (siehe Schritt 5.2, beachten).

4. Ernte Virus

  1. Sorgfältig sammeln des Überstands von den Gewebekultur Platten der transfizierten Zellen mit einem sterilen 10 mL Gewebekultur Pipette und Pool in 50 mL Zentrifuge Röhren.
  2. Deaktivieren Sie die Suspension durch Zentrifugation bei 400-450 X g für 10 min. mit einer Tischplatte Zentrifuge. Filtern des Überstands durch eine 0,45 µm-Vakuum-Filter-Einheit.
    Hinweis: Der gefilterten überstand kann bei 4 ° C für bis zu 4 Tage vor dem fortfahren mit Konzentration, gespeichert oder regelmÄÑig und bei-80 ° c gelagert werden Die erwarteten Titer IDLV-Sp1-CRISPR/Cas9 (konzentriert) virale Präparate sollte ~ 2 x 107 TU/mL (siehe Schritt 6 für Titer-Bestimmung). Vermeiden Sie jedoch die virale Vorbereitungen für mehrere Gefrier-Tau-Zyklen als jeder Runde von Einfrieren und Auftauen führt eine 10-20 % Verlust in funktionale Titer zu unterwerfen.

5. Konzentration der Viruspartikel durch Ultrazentrifugation

Hinweis: Wir nutzen eine Doppel-Saccharose-Methode der Reinigung, die zwei Schritte beinhaltet: eine Saccharose Farbverlauf und ein Saccharose Kissen Schritt (Abbildung 2).

  1. Laden Sie die konische Ultrazentrifugation Röhren in der folgenden Reihenfolge zum Erstellen eines Farbverlaufs Saccharose: 0,5 mL 70 % Saccharose (1 X PBS aufgelöst), 0,5 mL 60 % Saccharose (aufgelöst in DMEM), 1 mL 30 % Saccharose (aufgelöst in DMEM) und 2 mL 20 % Saccharose (aufgelöst in 1 X PBS).
  2. Fügen Sie den Virus enthaltende überstand sorgfältig auf den Farbverlauf. Da das Gesamtvolumen der Überstand von vier 15 cm Platten 100 mL ist, verwenden Sie sechs Ultrazentrifugation Rohre pro Spin Verarbeitung des vollen Umfangs des Virus überstand.
    1. Jedes Ultrazentrifugation Rohr verwendet für diesen Schritt hat ein Fassungsvermögen von bis zu 30 mL (einschließlich des Volumes von Saccharose), virale überstand gleichmäßig auf Rohre, so dass mindestens 10 % verteilen Headspace um auslaufen zu verhindern.
    2. Die Lautstärke Kultur bis ~ 20-22 mL pro Platte bei der Verwendung von mehr als vier 15 cm Platten für jedes Experiment, so dass der letzte Band der gepoolten virale überstand innerhalb sechs Ultrazentrifugation Rohre problemlos untergebracht werden kann.
    3. Füllung Ultrazentrifugation Rohre bis mindestens drei Viertel ihrer Eigenschaft Gesamtvolumen, sonst Bruch der Rohre bei der Zentrifugation, mögliche Verlust von Probe und/oder Ausrüstung Schäden auftreten kann.
  3. Gleichgewicht der Rohre mit 1 x PBS und Zentrifuge Proben bei 70.000 x g 2 h bei 17 ° C (siehe Tabelle der Materialien für Rotor Details).
    Hinweis: Zur Vermeidung von Störungen der Saccharose Schicht während der Beschleunigung einstellen der Ultrazentrifuge langsam den Rotor auf 200 u/min während der ersten 3 min von der Spin zu beschleunigen. Ebenso festgelegt Ultrazentrifugen langsam den Rotor von 200 u/min, 0 u/min über 3 min am Ende der Drehung gebremst.
  4. Sammeln Sie 30-60 % Saccharose Fraktionen sorgfältig in saubere Rohre (Abbildung 2). Fügen Sie Kälte 1 x PBS der gepoolten Fraktionen und bringen Sie die Lautstärke auf 100 mL; Mischen Sie, indem Sie nach oben und unten mehrmals pipettieren.
  5. Fahren Sie mit der Saccharose Kissen Schritt durch sorgfältig Schichtung der viralen Vorbereitung auf einem Kissen von Saccharose. Hierzu fügen Sie 4 mL 20 % Saccharose (mit 1 X PBS-Puffer) am Rohr, gefolgt von ~ 20-25 mL der viralen Lösung pro Röhre. Wenn Rohre weniger als drei Viertel sind voll, steril 1 X PBS nachfüllen.
  6. Vorsichtig balancieren Sie und Zentrifugieren Sie die Proben bei 70.000 x g 2 h bei 17 ° C, wie zuvor. Der Überstand abgießen und lassen die restlichen Flüssigkeit durch invertieren Röhren auf Küchenpapier abtropfen lassen.
  7. Aspirieren Sie verbleibende Tropfen um alle Flüssigkeit aus den Pellets zu entfernen. Bei diesem Schritt sollten die Virus-haltigen Pellets als kleine durchscheinende Flecken kaum sichtbar.
  8. Aufschwemmen Sie Pellets, indem Sie die erste Röhre und gründlich Pipettieren der Aufhängungs, anschließend die Aussetzung auf den nächsten Schlauch übertragen und mischen wie fortfahren, bis alle Pellets Nukleinsäuretablette sind 70 µL 1 X PBS hinzufügen.
  9. Spülen Sie die Rohre mit einer zusätzlichen 50 µL Kälte 1 x PBS und Mischung wie zuvor. Sicherzustellen Sie, dass das Gesamtvolumen der endgültigen Aufhebung ~ 120 µL, und leicht milchig erscheint; klar, dass es durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 30 s auf eine Tischplatte Microcentrifuge.
  10. Übertragen Sie den Überstand auf ein frisches Microfuge Rohr, 10 µL-Aliquots, und speichern Sie diese bei-80 ° C.
    Hinweis: Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Wechseln auf die Lentivirale Proben durchführen. Außer wenn Zentrifugierung erforderlich ist sollten Bemühungen unternommen, um die verbleibenden Schritte in Gewebekultur Hauben durchzuführen oder bezeichnet Gewebekultur Räume mit geeigneten biologischen Maßnahmen (siehe Diskussion).

6. Abschätzung der viralen Titer

  1. p24 -Enzym-Immunosorbentprobe Assay (ELISA) Methode verknüpft
    Hinweis: Der Test erfolgt mit hoher Bindung 96-Well-Platten, wie gemäß den Anweisungen des Programms NIH AIDS-Impfstoff für HIV-1 p24 Antigen-Capture-Assay Kit (siehe Tabelle der Materialien), mit Änderungen29.
    1. Am nächsten Tag waschen die Brunnen dreimal mit 200 µL 0,05 % Tween 20 in kaltem PBS (PBS-T-Lösung). Bestreichen Sie die Platte mit 100 µL monoklonalen Anti-p24 Antikörper bei einer Verdünnung von 1:1500 mit 1 X PBS-Puffer und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
    2. Unspezifische Bindung zu beseitigen, blockieren Sie die Platte mit 200 µL 1 % BSA mit PBS-Puffer; waschen dreimal mit 200 µL 0,05 % Tween 20 in kaltem PBS (PBS-T-Lösung) für mindestens 1 h bei Raumtemperatur.
    3. Proben vorbereiten: 1 µL der Probe verdünnen für konzentrierte Vektor Vorbereitungen, 100fach durch Zugabe von 89 µL von Dd-H20 und 10 µL des Triton x-100 (Endkonzentration von 10 %). -Konzentrierte Zubereitungen bereiten Sie um das Zehnfache verdünnten Proben (80 µL von Dd-H20 und 10 µL des Triton x-100 (Endkonzentration von 10 %) zu 10 µL der Probe hinzufügen vor).
      Hinweis: Proben können bei-20 ° C bei diesem Schritt für einen längeren Zeitraum zur späteren Verwendung gespeichert werden.
    4. Bereiten Sie HIV-1-Standards durch die Anwendung einer 2-fold serielle Verdünnung (mit einem Start Konzentration 5 ng/mL).
    5. Verdünnen von konzentrierten Proben (von 1: 100 vorverdünnt Bestände) RPMI 1640 ergänzt mit 0,2 % Tween 20 und 1 % BSA herstellen 01:10, 000, 01:50, 000 und 1:250,000 Verdünnungen. -Konzentrierte Proben zu verdünnen (von 01:10 Aktien Pre verdünnt) RPMI 1640 ergänzt mit 0,2 % Tween 20 und 1 % BSA, Verdünnungen von 1: 500, 1:2500 und 1:12,500 zu etablieren.
    6. Proben auf der Platte im Triplicates auftragen und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
    7. Am nächsten Tag waschen die Brunnen sechsmal und Inkubation bei 37 ° C für 4 h mit 100 µL polyklonale Kaninchen Anti-p24 Antikörper, verdünnt 1: 1000 in RPMI 1640, 10 % FBS, 0,25 % BSA und 2 % normale Maus Serum (NMS).
    8. Sechs Mal wie oben beschrieben waschen und Inkubation bei 37 ° C für 1 h mit Ziege-Anti-Kaninchen-Meerrettich-Peroxidase IgG verdünnt 1: 10.000 RPMI 1640 ergänzt mit normalem Ziegenserum 5 %, 2 % NMS, 0,25 % BSA und 0,01 % Tween 20.
    9. Waschen Sie die Platte, wie oben beschrieben, und mit TMB-Substrat Peroxidase bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
    10. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 µL 1 N HCL. Messen der Probe Extinktion bei 450 nm unter Verwendung der Extinktion Platte Leser.
  2. Messung der Intensität der Fluoreszenz-reporter
    1. FACS-Methode
      Hinweis: Das Ausmaß der GFP Signal Erschöpfung in den Zellen genau abgeschätzt werden durch die Messung der mittleren Fluoreszenzintensität der transduced Zellen über Durchflusszytometrie. Entnehmen Sie bitte der aktuellen Papier 28 für FACS Analyse, Darstellung und Interpretation. Das Protokoll wird im folgenden beschrieben.
      1. Machen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung von der Herstellung (von 10-1 bis 10-5) der viralen Zubereitung mit 1 X PBS-Puffer.
      2. Samen Sie ca. 5 x 105 293T Zellen in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte in einem Endvolumen von 2 mL pro Bohrloch. Die Zellen 10 µL der einzelnen viralen Verdünnung hinzu und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C für 48 h.
      3. Ernten von Zellen für FACS Analyse wie folgt: 200 µL 0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C für 5 min. Add 2 mL einer kompletten DMEM-Medien und sammeln Sie Proben in 15 mL konische Röhrchen.
      4. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 400 X g bei 4 ° C, und das Pellet in 500 µL PBS kalt 1 X Aufschwemmen.
      5. Zur Fixierung dieser Suspension ein gleiches Volumen von 4 % Formaldehyd-Lösung hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
      6. Pellet-feste Zellen und in 1 mL 1 X PBS aufzuwirbeln. GFP-Ausdruck mit einem FACS-Instrument zu analysieren, wie in Ortinski Et Al. beschrieben 28 kurz, mithilfe der folgenden Formel funktionale Virustiter ermitteln:
        Equation 1
        Hinweis: Hier Tg = Anzahl der GFP-positiven Zellen gezählt; TN = Gesamtzahl der Zellen gezählt; N = Gesamtzahl der Zellen ausgestrahlt; V = Volumen (in µL) für die Transduktion verwendet. Zum Beispiel: Wenn 1 x 106 Zellen mit 10 µL des Virus ausgestrahlt wurden, waren 2 x 104 Zellen gezählt und 5 x 103 waren GFP-positiven, basierend auf der obigen Gleichung die funktionale Titer wäre:
        Equation 2
    2. GFP-positiven Zellen zählen
      1. Berechnen Sie die Multiplizität der Infektion (MOI) für die Transduktion verwendet. Testen Sie eine breite Palette von MOIs (1-10), mit zunehmender MOIs, was zu einer höheren Effizienz der Transduktion.
      2. Samen Sie vor Transfektion eine 6-Well-Platte mit ca. 3-4 x 105 Zellen pro Bohrloch. Sobald die Zellen erreichen > 90 % Konfluenz (in der Regel innerhalb von 24 h), transduzieren mit dem gereinigten Virus an vorher festgelegten MOIs.
      3. 1-7 Tage für Veränderungen der GFP Signal inkubieren Sie Platte bei 37 ° C mit 5 % CO2 in einer standard Gewebekultur und Monitor Zellen in regelmäßigen Abständen.
      4. Die Anzahl der GFP-positiven Zellen mit einem Fluoreszenz-Mikroskop (PLAN 4 X Objektiv, 0,1 N.A 40 X Vergrößerung) mit einer GLP-Filter-Set (Erregung Wellenlänge 470 nm, Emission Wellenlänge-525 nm), ausgestattet mit naiv (UN-transduced) Zellen, die Bevölkerung der GFP-Negative und positive Zellen.
      5. Schätzen Sie die endgültige Titer durch Anpassen der Verdünnungsfaktor und die Lautstärke, mit der folgenden Formel:
        Equation 3
        Hinweis: Hier, N = Anzahl der GFP-positiven Zellen, D = Verdünnungsfaktor, M = Vergrößerungsfaktor (in der Regel 20 X), V = Volumen des Virus für die Transduktion verwendet. Zum Beispiel für 20 GFP-positiven Zellen (N) gezählt bei einer Verdünnung von 10-4 (01:10, 000) in einer 10 µL Probe (V) bei 20 X Vergrößerung (M) (D) ergäbe sich eine funktionale Titer (20 x 10-4) x (20) (10) x (100 *) = 4 x 108 TU/mL.
        (* zur Anpassung an pro mL)

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Validierung der Ko-Effizienz der IDLV-CRISPR/Cas9 Vektoren
Die Effizienz von CRISPR/Cas9-vermittelte gen Knockout Validierung verwendet wir GFP exprimierenden 293T Zellen als Modell. GLP +-Zellen wurden durch Transduktion von HEK-293T Zellen mit pLenti-GLP (vBK201a) bei einer MOI von 0,5 (Abb. 3 b, "keine-Virus" Panel) erzeugt. Die SgRNA-GLP/Cas9 all-in-One-Vektor-Kassette wurde in IDLV oder ICLV Partikel verpackt und die Effizienz der Produktion wurde durch p24 ELISA (siehe oben; und Abbildung 3a) beurteilt. Die Titer der Vektoren mit Sp1-Bindungsstellen (folgende Konzentration) fanden sich im Bereich von 10 zu10 TU/mL. Dann bewerten wir die Effizienz des GFP-Knockout mit Fluoreszenz-Mikroskopie (Abb. 3 b). Zu diesem Zweck 5 x 105 GLP exprimierenden 293T Zellen wurden in einer 6-Well-Platte ausgesät und ausgestrahlt wir ihnen 24 h später mit IDLV - oder ICLV-CRISPR/Cas9 bei MOIs 1 und 5 (Abb. 3 b). Die Zellen wurden für 24 Stunden, nach denen das Kulturmedium wurde ersetzt und Zellen für weitere 48 h, inkubiert wurden, bevor die Platten für spätere Tage des Experiments Seeding inkubiert.

In einer aktuellen Studie haben wir die mittlere Fluoreszenzintensität der GFP + Zellen ausgestrahlt mit ICLV/CRISPR oder IDLV/CRISPR-Komponenten über Flow Cytometry28gemessen. Wir sahen vergleichbare GFP-Erschöpfung in beiden Proben 14 Tage Post-Transduktion (pt) (ca. 2-4 % Signal Abbau) und nahezu identische GFP Erschöpfung 21 Tage pt (> 99 % Signal Erschöpfung)28. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen, wir beobachteten eine ~ fünffache Verringerung der Zahl der GFP-positiven Zellen so früh wie 7 Tage pt (Abbildung 3), mit einer nahezu vollständige Signal Verarmung von 14 Tagen pt (Daten nicht gezeigt) nach Transduktion mit beobachtet Beide ICLV und IDLV-CRISPR/Cas9-Systeme. Der Signalverlust war als das Verhältnis der Zellen ausgewertet, die GFP-positiven nach Behandlung und die Gesamtzahl der naiven GFP-positiven Zellen blieb. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass CRISPR/Cas9 Konstrukte von IDLVs gelieferte vergleichbar mit denen in ihrer Fähigkeit zur schnellen, robusten und nachhaltigen gen Bearbeitung in teilenden Zellen zu vermitteln durch ihre integrierende Gegenstücke geliefert.

Figure 3
Abbildung 3: Bewertung der viralen Titer. (a) von p24-ELISA-Test. Titer für die konzentrierte Sp1-IDLV-CRISPR/Cas9 (schwarze Balken) und Sp1-ICLV-CRISPR/Cas9 (weißer Balken) wurden ausgewertet. Die Ergebnisse werden festgehalten in Kopie zahlen pro mL, wobei 1 ng p24-gag = 1 x 104 Viruspartikel. Balkendiagramm Daten stellt Mittelwert ± SD von dreifacher Experimente. (b) Bewertung der CRISPR-vermittelten GFP-Ko-Effizienz. Erschöpfung der GFP Signal wurde zwischen ICLV-CRISPR/Cas9 - und IDLV-CRISPR/Cas9-ausgestrahlt 293T GFP + Zellen an MOIs 1 und 5 verglichen. UN-transduced ("kein Virus" Panel in Abbildung) GFP-positiven Zellen dienten als Kontrollen. Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 40 X Vergrößerung bei 7 Tage Post Transduktion erworben. Abbrev: RRE: Rev Response-Element, EFS-NC: Kern-Dehnung Faktor 1α-Promotor, ψ (Psi): Verpackung Vektorelement, hU6: menschliche U6-Promotor, Puro: Puromycin-Widerstand Kassette, WPRE: Murmeltier Hepatitis Virus posttranskritionelle regulatorische Element, LTR: Long Terminal Repeat. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Datei 1: Plasmide Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

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IDLVs haben damit begonnen, als das Fahrzeug der Wahl für die in-Vivo -gen-Bearbeitung, vor allem im Zusammenhang mit genetischen Erkrankungen, weitgehend aufgrund des geringen Risikos Mutagenese diese Vektoren im Vergleich zu integrieren Lieferung Plattformen22 zugeordnet entstehen , 28. im aktuellen Manuskript, wollten wir ausführlich das Protokoll verbunden mit der Produktion von der verbesserten all-in-One IDLV-CRISPR/Cas9 System, das vor kurzem in unserem Labor28entwickelt wurde.

Änderungen an bestehenden Plattformen
Mit dieser Methode konnten wir IDLV-CRISPR/Cas9 und ICLV-CRISPR/Cas9 Vektoren bei Titer im Bereich von 1 x 1010 TU/mL (Abbildung 3a) zu generieren. Diese Verbesserung der Produktionseffizienz kann die Zugabe von Sp1-Bindungsstelle in all-in-One CRISPR/Cas9 Vektor Kassette zugeschrieben werden. In der Tat, wir vor kurzem berichtet, dass Integration von Sp1 führt zu einer Erhöhung der ~2.5-fold der Verpackung Effizienz der IDLV und ICLV-CRISPR/Cas9 Vektoren und ein ~ 7-Fold Zunahme der gesamten funktionellen Titer. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten aus verschiedenen Fraktionen Hervorhebung Sp1 als Schlüsselregulator der Wildtyp HIV-130,31,32,33,34,35 .

Wichtige Schritte und Fehlerbehebung
Wie oben, Sp1-IDLVs tragen dargelegt wurden CRISPR/Cas9 transgene Titer in der Nähe von 1 x 1010 TU/mL pro ~ 5 x 107 Produzent Zellen erzeugen. Titer niedriger als diese Anzeichen für Fehler im Produktionsprozess, wäre in diesem Fall die folgenden wichtigen Punkte berücksichtigt werden für Titer Verbesserung: 1) es wird empfohlen, dass die Hersteller Zellen vorzugsweise niedrige Passagenanzahl mit Ersatz sein nach ≥15 Passagen und/oder als langsameres Wachstum beobachtet wird. (2) die Wahl der Medien Zellbestandteile ist wichtig im Hinblick auf die Effizienz der Produktion. Zum Beispiel anstelle der häufig verwendeten fötalen Rinderserum finden wir, dass die Nutzung des kosmischen Kälberserum konsequent Zellwachstum und virale Produktion, wobei kostengünstige gleichzeitig verbessert. (3) die Produktion Fitness der verschiedenen HEK Linien sollten sorgfältig geprüft werden. Zum Beispiel fanden wir eine ~ dreifache Differenz in virale Produktionsertrag 293T Zellen und 293-FT (siehe Tabelle der Materialien) Zellen (Daten nicht gezeigt). (4) es wird empfohlen, dass Zellen transfiziert werden, wenn sie etwa 70-80 % Zusammenfluss mit geringeren Zelldichten aufgrund vorzeitigen Zelltod durch virale Toxizität und höheren dichten, woraus sich eine deutliche Rückgang in Produktions-Leistungsfähigkeit sind. Als Faustregel gilt empfehlen wir die Bilanzierung einer Zelldichte, die Zellen zu unterziehen, eine weitere Runde der Zellteilung nach Transfektion ermöglicht. (5) Schließlich ist die Effizienz der Transfektion stark abhängig von der pH-Wert von 2 X BBS, die bei genau 6,95 zur idealen Transfektion beibehalten werden soll. Es empfiehlt daher, dass jede neue Charge von 2 X BBS auf einer Skala von Pilot-Transfektion überprüft werden.

Vektor-Handling und Sicherheit
Es gibt mehrere wichtige Sicherheitshinweise bei der Herstellung von IDLV und ICLV Vektoren mit diesem Protokoll. Erstens erfordert eine Zusammenarbeit mit Lentiviren Bio Safety Level II Containment. Trotz der Sicherheits-Features durch die SIN-Vektoren wurde transkriptionelle Restaktivität von SIN-Vektoren berichteten36. Des weiteren Vorarbeiten hat gezeigt, dass IDLV und ICLV Genome können produktiv von HIV-127gerettet werden. Daher, es wird dringend empfohlen, dass Replikation Kompetenz Assays (RCA) durchgeführt werden, vor allem, wenn konzentrierte Lentiviren werden gebrauchte37. Für Sicherheitsvorkehrungen in Bezug auf Handhabung der Lentivirale Vektor Vorbereitungen, siehe Biosicherheit in Mikrobiologie und biomedizinischen Labors, 4. Auflage, herausgegeben von den Zentren für Disease Control (CDC), die Online-38zu finden. Auf die gleiche Note Dritter Generation Verpackung Systeme39 mit verstärkten biologische Funktionen lässt sich Paket IDLVs und ICLVs, wenn auch mit geringeren Wirkungsgrad als die der zweiten Generation System.

Bedeutung und zukünftige Richtungen
Alles in allem, das Produktionsprotokoll für IDLVs für CRISPR/Cas9 - vermittelte gen bearbeiten beschrieben hier die erste Bewertung der Effizienz dieses Systems in sich schnell teilenden Zellen darstellt. Verwendung von GFP-positiven HEK-293T Zellen, haben wir bewiesen, dass Sp1-CRISPR/Cas9 von IDLVs gelieferte GFP in diesen Zellen mit ähnlichen Kinetik als ICLVs schnell und effizient bearbeiten kann. Diese Beobachtungen sind weitgehend im Einklang mit den Ergebnissen aus früheren Arbeiten mit Ribonucleoprotein-komplexe (Cas9 RNPs) für gen über nicht-viralen Transfektion Methoden bearbeiten. Diese neue Plattform weiter bereichert die immer größer werdenden Toolbox für die Lieferung von gen-Bearbeiten von Komponenten und anderen molekularen Ladungen auf Zellen.

Wie schon zuvor, trotz der jüngsten Fortschritte bei der Entwicklung von Lentivirale-basierte gen-Delivery-Systeme, besprochen gibt es wenige bis keine Optionen für Plattformen, mit denen die nachhaltige Produktion von viralen Vektoren hohe Titer für schnelle, transiente und gezielte gen Manipulation. Durch den Einbau von verbindlichen Motive für einen höchst ausgedrückt Transkriptionsfaktor in der Transgen-Expressionskassette konnten wir gleichzeitig mehrere dieser Probleme anzugehen. Diese einfache, aber wichtige Manipulation eröffnet eine Reihe von Möglichkeiten für die Entwicklung von ähnlichen Plattformen. Es wäre besonders nützlich, um zu testen, ob Transgene Ausdruck durch entweder die Zugabe von zahlreichen Exemplaren des gleichen Motivs Bindung oder durch das Sp1-Motiv mit Bindungsstellen für andere Transkriptionsfaktoren multiplexing erhöht werden kann. Mit solchen Werkzeugen zur Verfügung könnte es ist verlockend zu spekulieren, dass die Expression von relativ schwachen gewebespezifische Promotoren, wie Sie für menschliche Synapsin I (hSyn) und Maus Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII), deutlich verbessert in Vitro und in Vivo.

Während die aktuelle Studie zu testen die gen Knockdown Fähigkeit des IDLV geliefert CRISPR/Cas9, im Prinzip beschränkte, wäre die Vielseitigkeit unseres Systems zu unterschiedlichen gen-Bearbeitung Anwendungen, wie diejenigen unter Berufung auf die katalytisch inaktiv dCas940. Zu guter Letzt kombiniert mit kleineren Endonucleases, z. B. SaCas941 und Cpf142, die Plattform in dieser Studie beschriebenen angenommen werden kann in Richtung Aufbau hocheffizienter AAV-basierte gen-Delivery-Systeme in einer relativ kurzen Zeitspanne, die böte den Vorteil geringer Immunogenität im Vergleich zu Lentivirale Vektoren. Unnötig zu sagen, wäre solche Ansätze ein positiver Schritt in Richtung der Entwicklung von neuartigen, effizienten, und klinisch sichere virale Vektoren.

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Disclosures

Patent-USC-499-P (1175) wurde von der University of South Carolina in Bezug auf die in diesem Manuskript beschriebenen Arbeiten eingereicht.

Acknowledgments

Wir möchten die Abteilung für Neurobiologie, Duke University School of Medicine und Dekanat für Grundlagenforschung, Duke University bedanken. Wir danken auch Mitglieder des Duke viraler Vektor Kerns für Kommentare auf das Manuskript. Plasmid pLenti CRISPRv2 war Geschenk von Feng Zhang (Broad Institute). Die LV-Verpackungssystem einschließlich der Plasmide psPAX2, war VSV-G, pMD2.G und pRSV-Rev eine Art Geschenk von Didier Trono (EPFL, Schweiz). Gewähren Sie finanzieller Unterstützung für diese Arbeit von der University Of South Carolina School Of Medicine, zur Verfügung gestellt wurde, RDF18080-E202 (B.K).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
xMark Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
BD FACS Becton Dickinson 338960
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor Beckman Coulter 369650
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
High-binding 96-well plates Corning 3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Tissue culture pipettes, 5 mL Corning 4487
Tissue culture pipettes, 10 mL Corning 4488
Tissue culture pipettes, 25 mL Corning 4489
Hemacytometer with cover slips Cole-Parmer UX-79001-00
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
DMEM, high glucose media Gibco 11965
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) Sigma Aldrich B9879 - BES
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
pRSV-Rev Addgene 12253
lentiCRISPR v2 Addgene 52961
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsrGI New England Biolabs R0575S
BsmBI New England Biolabs R0580S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

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References

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Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen
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Cite this Article

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).More

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).

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