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Genetics

細胞分裂に CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル

doi: 10.3791/56915 Published: December 12, 2017

Summary

セルに CRISPR/Cas9 を提供するための車としてインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター (IDLVs) の生産戦略について述べる。迅速かつ堅牢な遺伝子がセル内編集を仲介する能力、IDLVs 現在安全と同様に効果的なベクトル遺伝子送達用に比べてベクトル インテグラーゼ主務。

Abstract

レンチウイルスベクターは、安定して高いレベルの遺伝子発現を仲介する細胞の広い範囲を伝達の能力による細胞に遺伝子編集コンポーネントを提供するための理想的な選択肢です。しかし、宿主細胞のゲノムに統合する能力を挿入変異原性のリスクを高めるため安全上の懸念を発生させます、臨床現場での使用を制限します。さらに、これら統合主務レンチウイルスベクター (ICLVs) 増加によって無差別遺伝子ターゲティングの確率を配信遺伝子編集コンポーネントの永続的な表現。代わりは、これらの問題の多くが解決、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター (IDLVs) の新世代が開発されています。ここ CRISPR 媒介性遺伝子編集およびリストのための新しく、改良された IDLV プラットフォームの生産のプロトコル、精製の手順し、このようなベクトルの濃度が記載されて伝達と HEK 293 t を使用して遺伝子編集効率細胞を示した。このプロトコルは、拡張が容易細胞in vitroin vivoのことができる高価 IDLVs を生成に使用することができます。さらに、このプロトコルは、ICLVs の生産のために容易に適応することができます。

Introduction

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正確な遺伝子編集遺伝的疾患に取り組むために新しい戦略の開発を含む生物医学的進歩の基礎を形成します。遺伝子編集技術の最前線は、 c光沢regularly -nterspaced s「hort」 palindromic repeats (CRISPR) の使用に依存するメソッド/最初に識別された Cas9 システム(参照1,2レビュー) ウイルスの遺伝物質の侵入に対する細菌免疫のコンポーネント。亜鉛指核酸 (ZFNs) と転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs) を (参照3の見直し) などの他の遺伝子編集ツール以上 CRISPR/Cas9 システムの主な利点はプラスミド設計の相対的なシンプルさとCRISPR コンポーネントの構築-の電源が大いにより広い研究コミュニティにいくつかの専門の研究所から遺伝子-編集の拡張機能。また、CRISPR/Cas9 プログラミングの簡潔さと多重ターゲット認識能力さらにコスト効果の高い、簡単に使用できる技術としてその人気を煽っています。ウイルスのベクトル、細胞にこのような遺伝子編集コンポーネントを提供する研究者に利用できるさまざまな方法の中で最も人気のある、効率的なシステムのまま抜いて。

レンチウイルスベクター (LVs) は、CRISPR/Cas9 システム生体内で多様なアプリケーション4,5,67のためのコンポーネントを提供する最適な手段として浮上しています。いくつかの主要な機能は、LVs 分割と非分裂細胞、低免疫原性と最小の細胞毒性 (文献8の見直し) の両方に感染する能力を含むこのプロセスの人気のある選択肢を作る。結果として、LV 媒介性遺伝子治療は人間の遺伝性疾患、嚢胞性線維症やネオ血管の加齢黄斑変性などの基礎となる欠陥の補正だけでなく、HIV 1、HBV、HSV-1 などの感染症の治療に採用されています。4,5,7,9,10,11します。 また、LVs を効果的に多重遺伝子の単一のベクトル システム12を使用して異なるゲノム遺伝子編集を実行に変更されています。

しかし、Lv がホストのゲノムに統合するための固有の特性は変異することができます、しばしばハンディキャップとして transgene の配送車、特に臨床の現場での実用。さらに、Lv が安定的に統合された持続可能な高いレベルで自分の遺伝子を表現、以来このシステムは適して CRISPR/Cas9; など遺伝子編集コンポーネントの配信のためCas9 ガイド RNA (gRNA)、および ZFNs など同じような蛋白質の過剰発現は望ましくない突然変異13,14,15,16を含むオフターゲット効果の高いレベルに関連付けられています。,17 18細胞毒性を高めることができる可能性があります。したがって、正確な達成するために最小限のオフターゲット効果と遺伝子編集だ編集コンポーネント遺伝子の一過性発現を可能にするシステムを設計することが不可欠。

近年、一過性細胞16,19,20,21 (参照22レビュー) に CRISPR/Cas9 を表現するさまざまな配信プラットフォームが開発されています。直接ご紹介と共に適切なガイド Rna 精製 Cas9 細胞にトランスフェクションのプラスミド性16と比較する対象となる遺伝子編集でより効果的に示されていたに依存するメソッドが含まれます。そのリボ核タンパク質 (RNP) の調査は示した錯体から成るガイド RNA/Cas9 粒子はそれらの目標は、これらのコンポーネントの短期的な表現が達成するために十分であることを示唆で DNA 切断を仲介後急速にめくって堅牢な遺伝子16を編集します。多分、非統合アデノ随伴ウイルスベクター (通気) などウイルスのベクトルのプラットフォームは細胞に遺伝子編集機械を提供する実行可能な代案を提供できます。残念ながら、AAV カプシドは Lv よりも大幅に低い包装機能を所有している (< 5 kb)、これは深刻な (文献8の見直し) 単一ベクター内多成分 CRISPR ツールキットをパッケージ化する能力を妨げます。それは、レンチ ウイルスの力価を増加する (例えばナトリウム酪酸23) にヒストン脱アセチル化酵素を阻害する、または (例えば、カフェイン24) 細胞周期阻害化合物添加が示されていることは注目に値するです。最近の進歩にもかかわらず、これまで開発した一過性発現システムはまだ生産効率が悪くなどに、減らされたウイルス抗体とウイルスを介して生成された低伝達効率につながる欠点によって妨げ25をのようなアプローチします。

インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター (IDLVs) は、LVs の包装機能を組み合わせて細胞における AAV のような episomal 整備の利点として遺伝子デリバリー車両の開発に大きな進歩を表しています。これらの機能は、主ベクトル、潜在的遺伝毒性要素の統合による変異原性に対して-à-に対して継続的な過剰発現の統合に関連する主要な問題を回避 IDLVs を助けます。以前 episomal 遺伝子式26,27を強化する IDLVs、正常に変更できることが示された.IDLV を介した CRISPR/Cas9 配信に関して低生産価とインテグラーゼ熟練したレンチウイルスベクター システムと比較して episome 由来のゲノムの低い表現制限ゲノム編集を提供するための善意のツールとしての実用遺伝子組換えを構築します。我々 は最近、遺伝子発現および IDLV の生産に関連付けられているウイルスの抗体は、ウイルス発現カセット28内転写因子 Sp1 のためのサイトのバインドを含めることによって大幅に強化を示した。変更された IDLVs は確実 CRISPR 媒介性遺伝子 ICLV を介した対応と比較して最小限のオフのターゲット変異を誘導しながら両方体外(HEK 293 t 細胞)体内(分裂後の脳ニューロン) での編集をサポートシステム28。全体的に、小説を開発した、コンパクト、CRISPR ツールキット IDLV プラットフォームで実施し、強化された遺伝子編集のような配信手段を使用しての様々 な利点を説明しました。

ここでは、IDLV-CRISPR/Cas9 システムの生産プロトコルは述べたように、アセンブリ、浄化、集中、および IDLVs、だけでなく、戦略は、これらのベクトルの遺伝子編集の有効性を検証するための滴定に関連するさまざまな手順を含みます。このプロトコルは別の捜査官のニーズを満たすために拡張が容易と 1 x 10 の10単位 (TU) の伝達の範囲の値と LV ベクトルを正常に生成するように設計/mL。このプロトコルを介して生成されたベクトルを活用すると、効率的にいくつかの異なる種類の細胞、培養および変換困難な胚性幹細胞、造血細胞 (T 細胞やマクロファージ) を含むとin vivo- に感染すること注入されたニューロン。さらに、プロトコルは似たような量のインテグラーゼ有能なレンチウイルスベクターの生産のため均等に適しています。

Figure 1
図 1: IDLV 包装します。変更されたプラスミドは、psPAX2 から派生した野生型インテグラーゼ蛋白質(b)(a)の回路図 (詳細についてはプラスミド構築メソッドを参照してください)。クローン変異インテグラーゼ クローンのスクリーニングの代表 agarose ゲル画像。標準プラスミド DNA 分離ミニ キットを使用して作製した DNA サンプルは、EcoRV と SphI 消化によって分析されました。正しく消化クローン (番号 5、赤い点線) は直通 (サンガー) intD64E 置換シーケンスによってさらに検証されました。インテグラーゼ欠損包装カセット pBK43 に選ばれました。(c)トランスフェクション プロトコルの概略図は VSV G、パッケージング、および遺伝子カセット (Sp1-CRISPR/Cas9 オール イン ワン プラスミッド) をトランスフェクトした 293 t 細胞を示す IDLV-CRISPR/Cas9 ベクトルを生成する採用。細胞膜から芽をウイルス粒子には (遺伝子カセットから表される) ベクトルのフルレングスの RNA が含まれます。Tat の規制のタンパク質が含まれています、IDLV 包装システムの第二世代が使用され、牧師回転式はさらに別のカセット (RSV REV プラスミド) から補われます。略語: LTR 長いターミナル繰り返し、VSV-g の水疱性口内炎ウイルス pCMV サイトメガロ ウイルス プロモーター; G タンパク質ラウス肉腫ウイルス (RSV) プロモーター。RRE - (回転応答要素)。式カセットの他の規制要素があります Sp1 結合部位、Rev 応答要素 (RRE)、ウッド チャック肝炎ウイルス転写規制要素 (WPRE)、コア伸長因子 1 α プロモーター (EFS ノースカロライナ州)、ベクトル包装要素 ψ (psi)、人間のサイトメガロ ウイルス (hCMV) プロモーターおよび人間の U6 プロモーター。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Protocol

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1. HEK 293 t 細胞を培養とトランスフェクションの細胞を播種

注: 人間の萌芽期の腎臓 293 t (HEK 293 t) セルは高グルコース培地 10% 牛子牛血清鉄と成長プロモーターと抗生物質抗真菌薬ソリューション x 1 添加 DMEM で育つ (100 x ソリューションが含まれています 10,000 単位のペニシリンには、10 mg ストレプトマイシンと 1 mL あたり 25 μ g アムホテリシン B)。メディアもピルビン酸ナトリウム x 1、1 x 非必須アミノ酸ミックス 2 mM L グルタミンと補われる (0.85% でストック 200 mM L-アラニル-L-グルタミン ジペプチド NaCl)。セル (おおよそ成長表面面積は 55 cm の ²) 100 mm 組織培養皿で培養されます。1:10 のサブの栽培比率がサブで 2-3 日毎の培養による使用されます。トリプシン-EDTA の通路間のセルの解離の 0.05% を使用します。実験の間の一貫性を維持するために我々 は、細胞の成長、トランスフェクション効率の変更を監視してベクトル生産異なる多く/バッチへの切り替え時に子牛血清のテストをお勧めします。

  1. 10 cm 組織培養プレートに播種低通過細胞 (通路 15 以降成長が減速したかどうかセルを使用しないように推奨) を使用して新しい文化を開始します。細胞の成長のための 10% 血清と DMEM を使用します。標準的な組織文化のインキュベーターで 5% CO2と 37 ° C で細胞を成長します。標準検定を使用して、すべての後続のステップのセルをカウントします。
  2. セルは (以下、手順 1.3 - 1.5) 組織培養プレート 90-95% コンフルエント成長、15 cm にシードを達する。
  3. シード、合流のプレートからメディアを吸引し、優しく滅菌 1x PBS で洗いします。追加 8 mL の解離試薬を不活性化し、単一のセルを作成する 10 mL の血清ピペットで 10 〜 15 回をカップ刻んだ血清を含む培地 3 ~ 5 分の 37 ° C で 2 ml の解離試薬 (例えばトリプシン-EDTA) の細胞を孵化させなさい懸濁液。約 4 x 106細胞/ml の細胞密度を得るため培地で細胞を再懸濁します。
  4. 基板への付着を高めるためには、事前の 0.2% のゼラチン、ゼラチン板あたりの 8 mL を追加で 15 cm プレートをコートします。プレートの表面に均等に広がる、10 分間室温でインキュベート、液体を吸い上げます。
  5. 各プレートの総容積をもたらす 25 mL のぬるま湯 (37 ° C) HEK 293 T メディア (手順 1 でメモを参照してください) でセル (合計 〜 1 107セル/プレート x) の 2.5 mL を追加することでプレートをシードします。一晩または 70-80% の confluency に達するまで 5% CO2と 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
    注: 生産の 6 の 15 cm プレートまでを使用できます。以上 4 つのプレート (理論的根拠のためのプロトコルの手順 5 を参照) を使用する場合は、20 〜 22 mL にプレートごとメディアの音量を調整します。

2 株の HEK 293 t 細胞カルシウム リン酸ベースのプロトコルを使用して

  1. トランスフェクション試薬
    1. BES 緩衝液掲示板 (50 mM、BES 280 mM の NaCl、1.5 mM Na2HPO4) x 2 を準備するには、BES の 10.65 g, 塩化ナトリウム 16.36 g を組み合わせる (N, N-ビス (2-ヒドロキシエチル)-2-アミノ-ethanesulfonic 酸)、および Na2HPO40.21 g。ダブル蒸留 H2O (dd H2O) 追加 900 mL。溶かし、ph 6.95 1 M NaOH で滴定しなさい、0.22 μ M フィルター ユニットを介して 1 の l. フィルターにボリュームをもたらします。-20 ° C にてストア
    2. 1 M CaCl2を準備します。0.22 μ M のフィルターを経由してソリューションをフィルター処理します。4 ° C でのストア
  2. 日前日を播種板を観察します。セルは、70-80% の confluency に達すれば transfection のため準備ができています。
  3. プレートから古いメディアを吸引し、優しく血清なし出来立てのメディアを追加します。
    注: 選択したプラスミドと彼らの準備の詳細については補足ファイル 1 プラスミドを参照してください。
  4. 15 mL の円錐管に早かった 4 つのプラスミド プラスミド ミックスを準備します。単一の 15 cm 皿の準備のため、CRISPR/Cas9-転送ベクトル (pBK198 または pBK189)、25 μ g pBK43 の 37.5 μ g を使用 (psPAX2 D64E)、12.5 μ g pMD2.G と前のページ (図 1 c) の 6.25 μ g。
  5. 312.5 μ L 1 M CaCl2をプラスミッドのミックスに追加します。これに、滅菌 dd H20 の最大 1.25 mL を追加します。
  6. ゆっくりと (drop-wise) ボルテックス ミックス中 2 の x BBS ソリューションの 1.25 mL を追加。室温で 30 分間インキュベートします。
  7. 各 15 cm プレート (プレートあたり 2.5 mL) に滴下トランスフェクション混合物を追加します。プレートを軽く旋回し、5% CO2 2-3 h の 37 ° C で孵化させなさい。その後、プレートあたり 2.5 mL (10%) の血清を追加し、培養を続ける一晩 (12-18 h)。
    注: いくつかのラボは、メディアの pH を安定させるために 3% CO2インキュベーターを使用します。しかし、我々 は 3% と 5% CO2のトランスフェクション効率の違いを観察しません。また、カポ4の沈殿物のサイズはトランスフェクション効率のために重要トランスフェクション ミックスは、細胞に添加する前に明確にすること。ミックスは、インキュベーション中に曇りになると、新鮮な 2 x BBS を準備 (pH = 6.95)。

Figure 2
図 2: ダブル ショ糖勾配のプロトコルを使用してウイルスの粒子の濃度が。上清 (SN) から収集したウイルス粒子は、グラデーション ショ糖密度勾配上に読み込まれます。70%、60%、30%、20% のショ糖液を使用して、グラデーションを作成します。遠心分離後 30 〜 60% ショ糖分数から収集された粒子は 20% ショ糖クッション上に読み込まれ、沈殿さらに。精製ウイルス粒子を含む最終的なペレットはそれ以上の使用のための 1x PBS で再停止される (詳細は本文を参照してください)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

3 トランスフェクション後日

  1. 細胞は細胞死には少しこの時点で 100% の confluency を近づいていることを確認するを確認します。25 ミリリットル新鮮な DMEM + 10% 血清を各プレートに追加することによってメディアを交換してください。さらに 48 時間 5% CO2と 37 ° C で培養を続けます。
    注: は、六つ以上 15 cm プレート (注: ステップ 5.2 を参照) を使用している場合、3.1 の手順でメディアの音量を調整します。

4. ウイルスの収穫

  1. 慎重に上清を収集し、10 mL の滅菌培養ピペット 50 mL 遠沈管にプールして transfected セルを含むすべての組織培養プレートから。
  2. 卓上型遠心分離機を使用して 10 分の 400-450 × g で遠心分離によって懸濁液をクリアします。0.45 μ m の真空フィルター ユニットを介して上清をフィルター処理します。
    注: フィルター処理された上澄みはまたは検体および-80 ° C で保存されますの 4 日前に濃度、4 ° C で保存をすることができます。IDLV-Sp1-CRISPR/Cas9 (非濃縮) ウイルス製剤の期待される抗体は、〜 10 x 2 をする必要があります7 TU/mL (力価を決定するための手順 6 を参照)。ただし、各ラウンドの凍結及び融解機能価の 10-20% の損失の結果として、複数の凍結融解サイクルにウイルス製剤を服従させることを避けます。

5. 超遠心法によるウイルス粒子の濃度

注: 駆使し浄化の 2 つの手順のダブル ショ糖法: ショ糖勾配ステップとショ糖クッション ステップ (図 2)。

  1. ショ糖密度勾配を作成するのには、次の順序で円錐形遠心チューブをロード: 0.5 mL 70% ショ糖 (1 x PBS を解散) (DMEM で解散) 0.5 mL 60% ショ糖, 1 mL 30% ショ糖 (DMEM で解散)、および 2 mL 20% スクロース (1 × PBS で解散)。
  2. グラデーションにウイルスを含む上清を慎重に追加します。4 つの 15 cm プレート上澄みの総量は 100 mL、ウイルスの培養上清中のフル ・ ボリュームを処理するのにスピンあたりの六つの遠心管を使用します。
    1. このステップで使用される各遠心チューブ (ショ糖の量を含む) に 30 mL の容積容量は少なくとも 10% を残して、チューブの間で均等にウイルス上清を配布流出を防ぐためヘッド スペース。
    2. 音量を調整する文化板あたり 20 ~ 22 ml 各実験のためよりも 4 つの 15 cm プレートを用いたときのでプールのウイルス上清の最終巻は 6 遠心チューブ内で簡単に対応できます。
    3. 塗りつぶし遠心チューブ、少なくとも 4 分の 3 の合計ボリューム容量、遠心分離、サンプルおよび/または機器の損傷の消失の結果中にチューブの破損が発生するそれ以外の場合。
  3. 17 ° C で 2 時間 70,000 x g で PBS および遠心分離機のサンプル × 1 と管のバランス (詳細についてはローター材料の表を参照)。
    注: 加速中にショ糖層の破壊を防ぐためには、ゆっくりとスピンの最初の 3 分間を 200 rpm ローターを加速する超遠心機を設定します。同様に、0 rpm の回転の終わりに 3 分間以上 200 rpm からローターをゆっくりと減速する超遠心機を設定します。
  4. 慎重にきれいな管 (図 2) に 30 〜 60% ショ糖分数を収集します。冷 1 の追加プールの分数に PBS x そして 100 mL にボリュームを持ってくる上下に数回ピペッティングで混ぜます。
  5. ショ糖クッションにウイルスの準備を慎重にレイヤリングによってスクロースのクッション ステップに進みます。このため、チューブ、チューブごとウイルス ソリューションの 20 ~ 25 mL に続いてに 4 mL (1 × PBS) で 20% ショ糖を追加します。チューブは 4 分の 3 未満である場合、完全な滅菌 1x PBS でトップ。
  6. 慎重にバランスし、遠心分離機の 17 ° C で 2 時間 70,000 x g でサンプルとして前に。上清を離れて注ぎ、残りを許可するペーパー タオルの管の反転によって流出させる液体。
  7. ペレットからすべての液体を除去するために残りの水滴を吸引します。この手順では、ウイルスを含んでいるペレットは、半透明の小さな白い斑点としてかろうじて見えるはず。
  8. 初の管徹底的に懸濁液を分注、その後次の管に懸濁液を転送すると、続行する前に、すべての餌を再停止されるまで混合 1 × PBS の 70 μ L を追加することでペレットを再懸濁します。
  9. 前に冷たい 1 × PBS とミックスの追加の 50 μ L でチューブをすすいでください。最終的な懸濁液の合計量 ~ 120 μ L し若干乳白色; が表示されます確実に30 10,000 × g で遠心分離によってクリア s 卓上遠心機です。
  10. 新鮮なおよび microfuge の管に上清を転送、10 μ 因数を作る、-80 ° C で保存
    注: は、レンチ ウイルス サンプルの凍結融解の繰り返しを実行しないでください。遠心分離が必要な場合を除く努力するティッシュ文化フードの残りの手順を行ってか適切なバイオ セーフティ対策 (ディスカッションを参照) を使用して組織培養室を指定します。

6. ウイルス抗体価の推定

  1. p24 -酵素-結合抗体法 (ELISA) 法をリンク
    注: アッセイを用いて高バインド 96 ウェル プレートとして HIV 1 p24 NIH エイズ ワクチン プログラムの指示に従って抗原捕獲の試金 (材料の表を参照) とキットの変更29
    1. 次の日は 200 μ 0.05% で 3 回洗浄冷 PBS (PBS T ソリューション) でトゥイーン 20。コートの 1:1500 1x PBS で希釈抗体モノクローナル抗 p24の 100 μ L をプレートと 4 ° C で一晩インキュベート
    2. 非特異的結合を避けるためには、PBS; で 200 μ L 1 %bsa を用いたプレートをブロックします。0.05% を 200 μ L で 3 回洗い冷 PBS (PBS T ソリューション) 室温で少なくとも 1 時間でトゥイーン 20。
    3. サンプルの準備:集中のベクトル準備のため 1 μ L のサンプルを 100 倍希釈トリトン X-100 (最終濃度 10%) の dd H20 と 10 μ l 89 μ L を追加することによって。非濃縮製剤 (トリトン X-100 (最終濃度 10%) の dd H20、10 μ L の 80 μ L を 10 μ L のサンプルに追加) 10 倍希釈試料を準備します。
      注: サンプルはこの手順で-20 ° C での後で使用のための時間の長時間保存できます。
    4. (開始濃度 5 ng/mL) と 2 倍連続希釈を適用することによって HIV-1 標準を準備します。
    5. 1:10, 000 を確立する 0.2% Tween 20 と 1 %bsa 添加 RPMI 1640 年 (1: 100 希釈株式) から集中してサンプルを希釈 1:50, 000、および 1:250,000 希薄。非濃縮試料を希釈 (1:10 から株式を希釈済み) 1: 500、デジタルラ スター、および 1:12,500 の希釈を確立する 0.2% Tween 20 と 1 %bsa 添加 RPMI 1640 年に。
    6. トリプリケートでプレートのサンプルを適用し、4 ° C で一晩インキュベート
    7. 次の日は 6 回洗浄し、100 μ L ポリクローナルウサギ抗 p24 、RPMI 1640、10 %fbs、0.25 %bsa、2% に正常マウス血清 (NMS) の希釈 1: 1000 で 4 h の 37 ° C で孵化させなさい。
    8. 6 回として上記洗浄し、, ヤギ抗うさぎペルオキシダーゼを 1 h の 37 ° C で 5% ヤギ血清、2 %nms、0.25 %bsa、0.01% 添加 RPMI 1640 年に igg 抗体希釈 1: 10,000 トゥイーン 20。
    9. 上記のように、プレートを洗浄し、TMB ペルオキシダーゼ基板 15 分間室温でインキュベートします。
    10. 1 N の HCL の 100 μ L の追加によって反作用を停止します。450 でサンプルの吸光度を測定 nm の吸光度を使用してプレート リーダー。
  2. 蛍光レポーター強度の測定
    1. FACS 法
      注: の細胞における GFP 信号減少の程度は、フローサイトメトリーを介して導入された細胞の平均蛍光強度を測定することによって正確に推定できます。FACS データ分析、プレゼンテーション、および解釈の最近のペーパー 28を参照してください。プロトコルは次のとおりです。
      1. 1x PBS で (10-1 10-5) からウイルスの準備の準備の 10 倍連続希釈を行います。
      2. ウェルあたり 2 mL の最終巻で 6 ウェル プレートの各ウェルに約 5 × 105 293 t 細胞を播きます。セルに各ウイルスの希釈の 10 μ L を追加し、48 h の 37 ° C でセルを孵化させなさい。
      3. FACS 解析のためのセルを次のように収穫: 0.05% トリプシン-EDTA 溶液 200 μ L を追加し、5 分追加 2 mL 完全な DMEM メディアの 37 ° C でセルを孵化させなさいし、15 mL の円錐管にサンプルを収集します。
      4. 4 ° c、400 × g で遠心分離によって細胞をペレットし、500 μ L の冷 1x PBS でペレットを再懸濁します。
      5. 固定、この懸濁液 4% ホルムアルデヒド溶液の等量を追加し、室温で 10 分間インキュベートします。
      6. 固定セルをペレットし、1 mL の 1x PBS に再懸濁します。Ortinskiで説明されているように FACS 装置を用いて GFP 発現を分析します。28は簡単に言えば、ウイルスの機能価を決定する次の数式を使用します。
        Equation 1
        注: ここで Tg = カウント; GFP 陽性細胞数Tn = カウントされますセルの合計数。N = 導入; セルの合計数V = ボリューム (μ L) の伝達に使用されます。たとえば: 1 x 10 の6セルは、ウイルスの 10 μ L で導入された、2 x 10 の4セルならカウントと 5 x 10 の3機能価になる上記の方程式に基づく、GFP 陽性であった。
        Equation 2
    2. GFP 陽性細胞を数える
      1. 感染症 (MOI) 伝達の使用の多様性を計算します。モアでより高い伝達効率を増やすことで、広い範囲のモア (1-10) をテストします。
      2. トランスフェクション効率を促進する前に約 3 - 4 ウェルあたり 10 の5セル × 6 ウェル プレートをシードします。セルに達すれば > 90% の confluency (24 時間) 以内に通常前もって決定されたモアで純化ウイルスを変換します。
      3. GFP 信号の変化、1-7 日の標準的な組織培養における 5% CO2と 37 ° C でプレートと定期的にモニター細胞を孵化させなさい。
      4. 蛍光顕微鏡を用いた GFP 陽性細胞数をカウント (計画 4 × 対物、0.1 N.A 40 倍) GFP フィルター セット (励起波長 470 nm、発光波長 525 nm)、装備ナイーブ (非導入された) 細胞を使用して人口を設定するにはGFP 否定と肯定的な細胞。
      5. 希釈倍率と次の数式を使用して、ボリュームの調整、最終価を推定します。
        Equation 3
        注: ここでは、N = D GFP 陽性細胞数希釈係数、M = = 倍率 (通常 20 X) V = ウイルス伝達の使用のボリューム。たとえば、20 GFP 陽性細胞 (N) 10-4 (1:10, 000)、20 X の 10 μ L のサンプル (V) の希釈でカウントの倍率 (M) (D) になる (10) x (20) x (20 x 10 の4) の機能価 (100 *) = 4 × 108 TU/mL。
        (* 1 mL あたりを調整する)

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Representative Results

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IDLV-CRISPR/Cas9 ベクトルのノックアウト効率の検証
CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトの効率を検証するのにモデルとして gfp 発現する 293 t 細胞を使用します。GFP 陽性細胞は、pLenti GFP (vBK201a) を 0.5 (図 3 b、「いいえウイルス」パネル) の MOI で HEK 293 t 細胞の伝達によって生成されました。SgRNA-GFP/Cas9 オール イン ワン ベクトル カセットは IDLV や ICLV の粒子にパッケージ化され、生産効率は p24 (上記を参照してくださいおよび図 3 a) elisa 法によって評価されました。Sp1 結合部位 (以下濃度) を含むベクトルの抗体価が 10 の範囲内に判明した10 TU/mL。我々 は、蛍光顕微鏡 (図 3 b) を用いた GFP ノックアウトの効率性を評価しました。このためには、5 × 105 gfp 発現する 293 t 細胞は 6 ウェル プレートに播種したし、我々 は 24 h 後で IDLV- または ICLV-CRISPR/Cas9 1 と 5 (図 3 b) のモアにそれらを導入します。細胞培養実験の後の日のプレートを再シードする前に、さらに 48 時間 24 h、その後培養培地交換したし、細胞培養用。

最近の研究では、ICLV/CRISPR または流れの cytometry の28IDLV/CRISPR コンポーネントで導入した GFP 陽性細胞の平均蛍光強度を測定した.21 日 pt サンプル 14 日後伝達 (pt) (2-4% 信号枯渇) とほぼ同一の GFP の枯渇に匹敵する GFP 枯渇を見ました (> 99% 信号枯渇)28。前の所見と一致が見られました、~ GFP 陽性数の 5 倍減少細胞と伝達に続いて 14 日 pt (データは示されていない) で観測されたほぼ完全な信号枯渇、早ければ 7 日 pt (図 3)、両方の ICLV と IDLV CRISPR/Cas9 システム。信号の損失は、治療と素朴な GFP 陽性細胞の総数後 GFP 陽性に残った細胞の比率として評価されました。これらの結果は、IDLVs によって提供される CRISPR/Cas9 構造が急速な堅牢で、持続的な遺伝子は、細胞分裂で編集を仲介する彼らの能力で対応する統合によって提供されるそれらと対等を明確に示します。

Figure 3
図 3: ウイルス抗体の評価。(a) p24-ELISA の試金。抗体は集中して Sp1-IDLV-CRISPR/Cas9 (黒いバー) と Sp1-ICLV-CRISPR/Cas9 (白いバー) を評価しました。結果は、1 mL あたりのコピー数に記録されます ng p24-ギャグ = 1 × 104ウイルス粒子。バー グラフのデータは、帳票の実験から平均 ± SD を表します。(b)評価の CRISPR を介した GFP ノックアウト効率。GFP シグナルの枯渇を 1 のモアで 293 t GFP 陽性細胞を ICLV-CRISPR/Cas9- と IDLV-CRISPR/Cas9-導入と 5 の比較しました。非導入された (図の「ウイルス」パネル) GFP 陽性細胞はコントロールとして使用されました。7 日間ポスト伝達で 40 倍の倍率で蛍光顕微鏡を使用して画像を取得しました。略語: RRE: Rev 応答要素、EFS NC: コア伸長因子 1 α プロモーター、ψ (psi): ベクトル包装要素、hU6: 人間 U6 プロモーター、Puro: ピューロマイシン耐性カセット、WPRE: ウッド チャック肝炎ウイルス転写後調節要素、LTR: 長いターミナル操作を繰り返します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

1 の補足ファイル: プラスミドこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください

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Discussion

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IDLVs は生体内遺伝子編集、配信プラットフォーム22の統合と比較してこれらのベクトルに関連する突然変異誘発のリスクの低いが主因となって、遺伝性疾患のコンテキストで特にのための最適な手段として浮上し始めています。,28.28私たちの研究室で開発された最近改良されたオール ・ イン ・ ワン IDLV-CRISPR/Cas9 システムの生産に関連付けられているプロトコルの詳細を現在原稿を目指しました。

既存のプラットフォームへの変更
この方法では、1 x 1010 TU/mL (図 3 a) の範囲で IDLV-CRISPR/Cas9 と ICLV-CRISPR/Cas9 価でベクトルを生成することができました。生産効率のこの拡張は、オール イン ワン CRISPR/Cas9 ベクトル カセットに Sp1 結合部位のさらに帰することができます。確かに、我々 は最近 IDLV と ICLV CRISPR/Cas9 ベクトルの包装効率の ~2.5-fold 増加で Sp1 の結果の含めることを報告と 〜 全体的な機能的な抗体価の 7 倍増。これらの結果は、野生型 HIV 130,31,32,33,34,35 の重要な調節因子として Sp1 を強調するさまざまなグループからの初期の作品と一致しています。.

重要なステップとトラブルシューティング
Sp1 IDLVs を運ぶ上で指摘 CRISPR/Cas9 transgenes でした 1 × 1010 TU/mL 〜 107プロデューサー セル × 5 あたりの近くの抗体を生成することができます。これらよりも低い抗体は生産プロセスでのエラーを示すだろう重要な次のポイントを考慮すべき価改善: 1) プロデューサー細胞ができれば低通過数の交換をお勧め後 ≥15 の通路および/またはより遅い成長が観察されます。2) 携帯メディア コンポーネントの選択は、生産効率の面で重要です。例えば、一般的に使用される牛胎児血清の代わりに我々 は宇宙の子牛血清の使用量は、細胞の成長と同時に低コストでありながら、ウイルスの生産に一貫して改善を見つけます。3) 異なる HEK ラインの生産フィットネスは慎重に評価する必要があります。たとえば、私たちが見つかりました、~ 293 t 細胞と 293 フィート (材料の表を参照してください) のウイルスの生産収量の 3 倍差はセル (データは示されていない)。4) 細胞がウイルスの毒性による早期の細胞死の細胞密度が低いとその結果マークを削除、生産効率より高い密度の 70-80% の合流がほぼトランスフェクションすることをお勧めします。親指のルールとして、私達は 1 つを受ける細胞が細胞分裂後トランスフェクションのラウンド追加できる細胞密度のための会計を提案します。5) 最後に、トランスフェクションの効率は理想的な transfection のため 6.95 正確に維持することである 2 x BBS の pH に大きく依存。したがって強くお勧め 2 x BBS の各の新しいバッチがパイロット トランスフェクション規模でチェックすること。

ベクトル処理と安全性
このプロトコルで IDLV と ICLV のベクトルの生産の間にいくつかの安全上重要な考慮事項があります。まず、レンチで作業は、バイオ セーフティ レベル II の封じ込めを必要です。罪のベクトルによって与えられる安全機能、にもかかわらず罪ベクトルから残留の転写活性が報告された36をされています。さらに、前の仕事ことを実証した IDLV および ICLV のゲノムは生産的 HIV-1 の27によって救出されることができます。したがって、レプリケーション能力試金 (RCA) が実行する、集中のレンチは使用される37をされている場合は特にそれを強くお勧めします。安全手順についてレンチウイルスベクター準備の処理、微生物学的および生物医学研究所、第 4 版、制御 (CDC) 疾病、オンライン38を見つけることができるセンター刊でバイオを参照してください。同じノートでは、第二世代のシステムのそれよりも低い効率を伴い、IDLVs と ICLVs、パッケージに包装システム39バイオ セーフティの強化された機能を持つ第三世代を使用できます。

意義と今後の方向性
全体的にみて、CRISPR/Cas9 の IDLVs の生産のプロトコル - 仲介された急速に分割の細胞のこのシステムの効率性の最初の評価を表す遺伝子は、ここで説明を編集します。GFP 陽性 HEK 293 t 細胞を使用して、こと効率的にこれらの細胞は、ICLVs として同じような速度でのGFP編集を Sp1-CRISPR/Cas9 IDLVs で配信を行った。これらの観察は、広く遺伝子編集非ウイルス性遺伝子導入方法でリボ核蛋白質複合体 (Cas9 結合) を使用する前の仕事からの結果と一致しています。この新しいプラットフォームをさらには、遺伝子編集コンポーネントの配信とセルに他の分子の貨物の拡大ツールボックスを富ませます。

急速な一時的なもので、対象となる遺伝子の高力価ウイルスのベクトルの持続可能な生産ができるプラットフォームのオプションを指定せずにいくつかがあるレンチ ウイルスを用いた遺伝子デリバリー システムの開発の最近の進歩にもかかわらず、前述したよう操作。結合モチーフ遺伝子発現カセットの高発現の転写因子の定款を同時にこれらの問題のいくつかに対処することができました。このシンプルで重要な操作は、同様の配信プラットフォームの開発のための道の数を開きます。それは数多くのコピーまたは他の転写因子の結合と Sp1 のモチーフを多重化して同じ結合モチーフの添加によって遺伝子発現を高めることができる場合をテストするのには特に有用であります。私達の処分でこのようなツールは、それは比較的弱い組織特異的発現プロモーターからその式を推測する魅力的な人間 Synapsin など私 (hSyn) とマウス カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ II (CaMKII) 可能性があります大幅in vitroin vivoの両方を改善します。

現在の研究は、原則として IDLV 配信 CRISPR/Cas9、遺伝子ノックダウン能力をテストに限られていた、我々 のシステムの汎用性に触媒-非アクティブに頼るものなど、多様な遺伝子編集のアプリケーションに従順なります。dCas940。最後に、SaCas941 Cpf142, などの小さい酵素と組み合わせて本プラットフォーム採用できる比較的短い時間のスパンで非常に効率的な AAV を用いた遺伝子デリバリー システムの確立に向けて、レンチウイルスベクターに比べて低免疫原性の利点を提供します。言うまでもなく、このようなアプローチは効率的、小説の発展に向けた前向きな一歩と臨床的に安全なウイルスのベクトルでしょう。

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Disclosures

USC-499-P を特許 (1175) がこの原稿で説明する作業に関連してサウスカロライナ大学によって提出されました。

Acknowledgments

デューク大学医学部、基礎科学, デューク大学の学部長のオフィス、神経生物学部に感謝したいと思います。私たちも原稿のコメントのデューク ウイルス ベクター コアのメンバーに感謝します。プラスミド pLenti CRISPRv2 は、張鋒 (ブロード研究所) からの贈り物だった。プラスミド psPAX2 を含む LV 包装システム、VSV G、pMD2.G、pRSV Rev はだったディディエ ・ Trono (スイス連邦工科大学、スイス連邦共和国) からの優しい贈り物です。この仕事のための財政支援は、大学のサウスカロライナの医学によって提供された RDF18080 E202 (B.K) を付与します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
xMark Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
BD FACS Becton Dickinson 338960
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor Beckman Coulter 369650
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
High-binding 96-well plates Corning 3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Tissue culture pipettes, 5 mL Corning 4487
Tissue culture pipettes, 10 mL Corning 4488
Tissue culture pipettes, 25 mL Corning 4489
Hemacytometer with cover slips Cole-Parmer UX-79001-00
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
DMEM, high glucose media Gibco 11965
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) Sigma Aldrich B9879 - BES
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
pRSV-Rev Addgene 12253
lentiCRISPR v2 Addgene 52961
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsrGI New England Biolabs R0575S
BsmBI New England Biolabs R0580S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

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References

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細胞分裂に CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル
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Cite this Article

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).More

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).

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