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Genetics

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

doi: 10.3791/56915 Published: December 12, 2017

Summary

우리는 셀에 CRISPR/Cas9를 제공 하기 위한 차량으로 integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 생산 전략을 설명 합니다. 셀에서 편집 하는 신속 하 고 강력한 유전자를 중재 하는 능력, IDLVs 안전 제시와 유전자 배달에 대 한 동등 하 게 효과적인 벡터 플랫폼 integrase 유능한 벡터에 비해.

Abstract

Lentiviral 벡터 셀 안정적으로 세포의 광범위 한 범위를 시험 하 고 높은 수준의 유전자 발현의 중재에 대 한 자신의 능력 때문에 유전자 편집 구성 요소를 제공 하기 위한 이상적인 선택입니다. 그러나, 호스트 세포 게놈으로 통합 하는 능력 강화 insertional 변이의 위험 하 고 따라서 안전 우려를 제기 하 고 임상 조정에 있는 그들의 사용을 제한. 또한, 유전자 편집 구성의 영구 식 무차별 유전자 타겟팅의 확률이 통합 관할 lentiviral 벡터 (ICLVs) 증가 의해 전달. 대신, integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 새로운 세대 개발 되었습니다 많은 이러한 문제를 해결 하는. 여기 CRISPR 중재 유전자 편집 및 목록에 대 한 새로운 기능 및 향상 된 IDLV 플랫폼의 생산 프로토콜 단계 정화에 관여 하 고 설명 하는 같은 벡터의 농도 변환 및 HEK 293T를 사용 하 여 유전자 편집 효율성 셀 시연 했다. 이 프로토콜은 쉽게 확장 가능한 고 시험 세포 생체 외에 비보수 있는 높은 titer IDLVs를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 ICLVs의 생산을 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

Introduction

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정확한 유전자 편집 유전 질병을 해결 하기 위해 새로운 전략의 개발을 포함 하는 주요 생물 의학 발전의 초석을 형성 한다. 유전자 편집 기술의 최전선 이다는 c광택 regularly-nterspaced s읽힌 palindromic repeats (CRISPR)의 사용에 의존 하는 방법 / 처음 확인 된 Cas9 시스템 으로 바이러스 유전 물질 (참조1,2검토)의 침공에 대 한 세균의 구성 요소입니다. 아연 손가락 nucleases (ZFNs) 등 전사 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs) (참조3에서 검토 한 결과), 다른 유전자 편집 도구 CRISPR/Cas9 시스템의 주요 이점은 이다 플라스 미드 디자인의 상대적 단순 하 고 CRISPR 구성 요소 건설-기능 유전자 편집, 몇 가지 전문된 실험실에서 훨씬 더 광범위 한 연구 공동체의 확장을 강화 했다. 또한, CRISPR/Cas9 프로그래밍의 단순 하 고 다중화 대상 인식에 대 한 용량 추가 비용 효율적이 고 사용 하기 쉬운 기술로 인기를 연료 있습니다. 셀에 같은 유전자 편집 구성 요소를 제공 하는 연구자를 사용할 수 있는 다양 한 방법 중에서 바이러스 성 벡터 남아 지금까지 가장 인기 있는 하 고 효율적인 시스템.

Lentiviral 벡터 (LVs) CRISPR/Cas9 시스템에 비보에 대 한 다양 한 응용 프로그램4,5,,67의 구성 요소를 제공 하는 선택의 수단으로 떠오르고 있다. 몇 가지 주요 기능 LVs 셀 분할 및 분할 비, 낮은 immunogenicity 및 최소한의 세포 독성 (참조8에서 검토) 감염을 그들의 능력을 포함 하 여이 프로세스에 대 한 인기 있는 선택을 하십시오. 결과적으로, LV-중재 유전자 치료는 고용, HBV, 및 HSV-1, 등 전염 성 질병의 치료 뿐만 아니라 인간의 유전 질병, 낭 성 섬유 증, 신 혈관 황 반 변성 등을 기본 결함의 수정에 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. 게다가, LVs 효과적으로 수정 된 다중 유전자 단일 벡터 시스템12을 사용 하 여 고유한 게놈 loci에서 편집을 수행 하.

그러나, 호스트 게놈으로 통합 하는 LVs의 고유의 속성 기지가 될 수 있으며 종종 오답 임상 설정에서 특히 transgene 배달 차량으로 그들의 유틸리티. 또한, 안정적 통합 LVs 지속적으로 높은 수준에서 그들의 transgenes 표현, 이후이 시스템은 적합 CRISPR/Cas9; 같은 구성 요소를 편집 하는 유전자의 전달 Cas9 가이드 RNA (gRNA), 그리고 ZFNs, 같은 유사한 단백질의 overexpression 오프 대상 효과, 바람직하지 않은 돌연변이13,14,,1516 를 포함 하는 높은 수준의와 관련 된 , 17 그리고 잠재적으로 세포 독성18을 향상 시킬 수 있습니다. 따라서, 정확 하 게 달성 하기 위해 최소한의 대상에서 효과, 유전자 편집 그것은 구성 요소를 편집 하는 유전자의 변이 표현에 대 한 수 있도록 시스템을 설계 하는 것이 필수적.

최근 몇 년 동안, 전송 플랫폼의 다양 한 정도 셀16,19,,2021 (참조22검토) CRISPR/Cas9을 표현 하기 위해 개발 되었습니다. 직접 소개 적절 한 가이드 RNAs 함께 순화 Cas9 셀으로 타겟 유전자를 플라스 미드 중재 transfection16에 비해 편집에 더 효과적일 표시 했다에 의존 하는 방법이 포함 됩니다. 그 ribonucleoprotein (RNP)을 증명 하는 연구 단지의 구성 된 가이드 RNA/Cas9 입자는 이러한 부품의 단기 식 달성 하기에 충분을 제안 하는 그들의 목표에서 DNA 분열 중재 후 급속 하 게 인계 16편집 하는 강력한 유전자. 비 통합 adeno 관련 바이러스 성 벡터 (AAVs) 같은 바이러스 성 벡터 플랫폼 세포에 유전자 편집 기계를 제공 하는 대안을 제공할 수 있습니다. 불행히도, AAV capsids LVs 보다 크게 낮은 포장 기능 보유 (< 5 kb)는 심각 하 게 단일 벡터 (검토 참조8) 내에서 다중 구성 요소 CRISPR 툴킷을 포장 하는 그들의 능력을 방해 한다. 히스톤 deacetylases (예를 들면, 나트륨 낙 산 염23)을 억제 하거나 (예를 들어, 카페인24) 세포 주기를 방해 하는 화합물의 추가 lentiviral titers을 증가 표시 되었습니다 지적 가치가 있다. 몇 가지 단점, 낮은 생산 효율성 등 감소 바이러스 titers을 통해 생성 하는 바이러스의 낮은 변환 효율성 있는 최근 진도도 불구 하 고 지금까지 개발 된 과도 식 시스템 장애가 여전히는 같은25를접근 한다.

LVs의 포장 능력을 결합 하 여 셀에서 AAV 같은 episomal 유지 보수의 추가 혜택으로 Integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs) 유전자 배달 차량 개발에서 큰 발전을 나타냅니다. 이러한 기능을 통합 벡터, 마주-à-마주 연속 overexpression 잠재적으로 차적인 요소 및 통합 중재 변이와 관련 된 주요 문제를 크게 우회 하는 IDLVs 있습니다. 그것은 이전 IDLVs 성공적으로 episomal 유전자 식26,27향상을 수정할 수 있습니다 시연 했다. CRISPR/Cas9 IDLV 중재 배달에 관하여 낮은 생산 titers 및 낮은 표현의 integrase 능숙 lentiviral 시스템 상대적인 episome 부담 게놈 게놈 편집 제공 하기 위한 진실 fide 도구로 그들의 유틸리티 제한 유전자 변형 구문입니다. 우리는 최근 transgene 표현과 IDLV 생산과 관련 된 바이러스 titers 크게 바이러스 성 식 카세트28내 녹음 방송 요인 s p 1에 대 한 사이트 바인딩을 포함 하 여 향상 된 시연. 수정 된 IDLVs 튼튼하게 CRISPR 중재 하는 유전자는 해당 ICLV 중재에 비해 최소한의 대상에서 돌연변이 유도 하는 동안 생체 외에서 (HEK 293T 세포)에서 그리고 vivo에서 (포스트 mitotic 뇌 신경)에 편집 지원 시스템28. 전반적으로, 우리는 소설을 개발, 소형, 모든-에-하나의 CRISPR 툴킷 IDLV 플랫폼에서 실시 하 고 향상 된 유전자 편집에 대 한 배달 차량을 사용 하 여 다양 한 이점을 설명.

여기, IDLV-CRISPR/Cas9 시스템의 생산 프로토콜은 설명, 어셈블리, 정화, 농도, 그리고이 벡터의 유전자 편집 효능을 확인 하기 위해 전략 뿐만 아니라 IDLVs, 적정에 관련 된 다양 한 단계를 포함 하 여. 이 프로토콜은 다른 수 사관 들의 요구를 충족 하도록 쉽게 확장 가능한 고 성공적으로 1 x 1010 단위 (TU) 시험의 범위에서 titers와 LV 벡터를 생성 하도록 설계 되었습니다 / mL. 이 프로토콜을 통해 생성 된 벡터 효율적으로 여러 다른 세포 유형, 어려운 transduce 배아 줄기 세포, 조 혈 모 세포 (T 세포와 대 식 세포)를 포함 하 여 그리고 교양 및 시내 vivo-감염에 이용 될 수 있다 주입된 하는 신경. 또한, 프로토콜은 동등 하 게 잘 비슷한 수량 integrase 유능한 lentiviral 벡터의 생산에 적합 합니다.

Figure 1
그림 1: IDLV 포장. 수정 된 플라스 미드는 psPAX2에서 파생 된 야생 타입 integrase 단백질 (b)(a) 회로도 (방법, 플라스 미드 건설에 대 한 자세한 내용은 참조). 클론 돌연변이 integrase 클론에 대 한 검사의 대표 agarose 젤 이미지. DNA 샘플 표준 플라스 미드 DNA 분리 미니 키트를 사용 하 여 준비 EcoRV와 SphI 소화에 의해 분석 되었다. 제대로 소화 클론 (5 번, 파선된 빨간색 상자) 직접 (생어) 연속 D64E 대체 INT에 대 한 추가 확인 했습니다. Integrase 불충분 한 포장 카세트 pBK43 선정 됐다. (c) 과도 transfection 프로토콜의 회로도 고용 IDLV-CRISPR/Cas9 벡터 생성 하 293T 세포 VSV G, 포장, 및 transgene 카세트 (s p 1-CRISPR/Cas9-에-하나의 플라스 미드)와 페 보여주는. 바이러스 성 입자를 세포 막에서 밖으로 새싹 (transgene 카세트에서 표현) 벡터의 길이 RNA 포함. 그리고 IDLV-포장 시스템의 두 번째 세대 사용, 규제 단백질 문신 포함 목사 식 추가 별도 카세트 (RSV-레 브-플라스 미드)에서 보완. Abbrev: LTR 긴 터미널 반복, VSV G vesicular 구내 염 바이러스 G-단백질, pCMV 세포 발기인; 라우 스 육 종 바이러스 (RSV) 발기인; RRE-(계 응답 요소)입니다. 다른 규제 요소 식 카세트에 포함 Sp1 바인딩 사이트, 레 브 응답 요소 (RRE), 마 형 간염 바이러스 Posttranscriptional 규제 요소 (WPRE), 코어-신장 요인 1α 발기인 (EFS-NC), 벡터 포장 요소 ψ (psi), 인간의 세포 (hCMV) 발기인, 그리고 인간의 U6 발기인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Protocol

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1. HEK 293T 세포 배양과 Transfection에 대 한 셀을 시드

참고: 인간 미 발달 신장 293T DMEM, 10% 소 송아지 혈 청 철 및 성장 발기인 및 항생제 antimycotic 솔루션 x 1 보충으로 보충 하는 높은 포도 당 미디어에서에서 재배 되 고 (HEK 293T) 세포 (100 x 솔루션 포함 10000 단위 페니실린 10 mg 스와 25 µ g 암포 B mL 당). 미디어는 또한 1 x 나트륨 pyruvate, 1 x 비 필수 아미노산 믹스, 그리고 2 mM L-글루타민 보충 (재고 200 mM L-alanyl-L-글루타민 dipeptide 0.85 %NaCl에서). 셀 (대략 성장 표면적은 55 c m ²) 100 m m 조직 문화 접시에 교양. 1시 10분의 하위 재배 비율 하위 모든 2-3 일 배양 사용 됩니다. 트립 신-EDTA 0.05% 통행 사이 세포의 분리에 사용 됩니다. 실험 간에 일관성을 유지, 세포 성장, transfection 효율에에서 어떤 변화를 모니터링 하 고 생산 벡터 다른 많은/일괄 전환 시 테스트 종 아리 세라 추천 우리.

  1. 10cm 조직 문화 접시에 뿌리기에 의해 낮은 통로 셀 (그것 후에 통로 15 또는 성장 감속 경우 셀을 사용 하지 않도록 권장)를 사용 하 여 새로운 문화를 시작 합니다. DMEM 세포 성장에 대 한 10% 혈 청으로 보충을 사용 합니다. 5% CO2 표준 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 성장. 표준 hemocytometer를 사용 하 여 셀에 대 한 모든 후속 단계.
  2. 일단 셀 도달 90-95 %confluent 성장, 15 cm로 다시 조직 문화 접시 (아래 단계 1.3-1.5).
  3. 다시 시드하, aspirate 미디어는 합칠에서 접시와 부드럽게 살 균 1 x PBS와 린스. 3-5 분 추가 8 mL 혈 청 분리 시 비활성화 하 여 단일 셀을 만드는 데 10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 10-15 회를 triturate 포함 된 미디어에 대 한 37 ° C에서 셀 분리 시 약 (예를 들어, 트립 신-EDTA)의 2 개 mL를 품 어 현 탁 액입니다. 약 4 x 106 셀/mL의 셀 밀도를 문화 미디어에 셀 resuspend
  4. 기판에 부착을 강화 하려면 사전에 0.2% 젤라틴, 젤라틴 접시 당 8 mL을 추가와 15 cm 판 코트. 접시의 표면에 걸쳐 균일 하 게 확산, 10 분 동안 실내 온도에 품 어 그리고 액체에서 사이 펀.
  5. 따뜻한 (37 ° C) HEK 293 T 미디어 (1 단계 아래 참고 참조) 25 mL에 각 격판덮개의 전체 볼륨을 가져오고 셀 (총 ~ 1 x 107 셀/플레이트)의 2.5 mL을 추가 하 여 판 씨. 하룻밤 또는 70-80 %confluency이 때까지 접시 5% CO2 와 37 ° c를 품 어.
    참고: 6 15 cm 접시 최대 생산을 위해 사용할 수 있습니다. 4 개 이상 접시 (근거에 대 한 프로토콜의 5 단계를 참조)를 사용 하는 경우 20 ~ 22 ml 접시 당 미디어의 볼륨을 조정 합니다.

2. transfecting HEK 293T 세포 칼슘 인산 염 기반 프로토콜을 사용 하 여

  1. Transfection 시 약
    1. BES 버퍼 솔루션 게시판 (50mm BES, 280 m m NaCl, 1.5 m m 나2HPO4) x 2를 준비 하려면 16.36 g의 NaCl, 10.65 BES의 결합 (N, N-비스 (2-hydroxyethyl)-2-아미노-ethanesulfonic 산), 나2HPO40.21 g. 추가 이중 증 류 H2O (dd-H2O) 최대 900 mL. 해산, 6.95 1 M NaOH로 pH를 적정와 볼륨 0.22 μ M 필터 장치 통해 1 L. 필터. -20 ° c.에 게
    2. 1 M CaCl2를 준비 합니다. 솔루션 0.22 μ M 필터를 통해 필터링. 4 ° c.에 게
  2. 하루 전에 시드 했다 번호판을 관찰 합니다. 그들은 70-80 %confluency 도달 세포 transfection 준비 되어 있다.
  3. 판에서 오래 된 미디어를 발음 하 고 부드럽게 혈 청 하지 않고 갓 미디어를 추가 합니다.
    참고: 선택한 플라스 미드 및 그들의 준비에 대 한 자세한 보충 파일 1-플라스 미드 를 참조.
  4. 15 mL 원뿔 튜브에 aliquoting 4 플라스 미드에 의해 플라스 미드 믹스를 준비 합니다. 한 15 cm 접시 준비에 대 한 사용은 CRISPR/Cas9-전송 벡터 (pBK198 또는 pBK189), 25 µ g의 pBK43의 37.5 µ g (psPAX2-D64E), 12.5 µ g pMD2.G, 및 이전 (그림 1c)의 6.25 µ g.
  5. 플라스 미드에 312.5 µ L 1 M CaCl2 를 추가 합니다. 이 살 균 dd-H20의 최대 1.25 mL를 추가 합니다.
  6. 천천히 (drop-wise) vortexing 믹스 2 x BBS 솔루션의 1.25 mL을 추가. 실 온에서 30 분 동안 품 어.
  7. 각 15 cm 플레이트 (접시 당 2.5 mL)에 dropwise transfection 혼합물을 추가 합니다. 플레이트를 부드럽게 소용돌이 5% CO2 2-3 h 37 ° C에서 품 어. 그 후, 접시 당 혈 청 2.5 mL (10%)를 추가 하 고 잠복기 계속 하룻밤 (12 월 18 일 h).
    참고: 일부 연구소 미디어 pH를 안정 시키기 위해 3% CO2 인큐베이터를 사용 합니다. 그러나, 우리 3%와 5% CO2사이 transfection 효율에 어떤 차이 관찰 하지 않습니다. 또한, 카 포4 침전의 크기가 transfection 효율;에 대 한 중요 한 transfection 혼합 셀에 그것의 추가 하기 전에 명확 하 게 있다. 혼합 되 면 흐린 인큐베이션 기간 동안, 준비 신선한 2 x BBS (pH = 6.95).

Figure 2
그림 2: 더블-자당 그라데이션 프로토콜을 사용 하 여 바이러스 성 입자의 농도. 상쾌한 (SN)에서 수집 된 바이러스 성 입자는 그라데이션 자당 기온 변화도에 로드 됩니다. 70%, 60%, 30%, 및 20% 자당 솔루션은 그라디언트를 만드는 데 사용 됩니다. 원심 분리, 다음 30-60% 자당 분수에서 수집 하는 입자는 추가 20% 자당 쿠션에 로드 하 고 시 켰 던. 순화 된 바이러스 입자를 포함 하는 마지막 펠 릿 추가 사용에 대 한 1 x PBS에 resuspended (대 한 자세한 내용은 텍스트 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3입니다. 다음날 Transfection

  1. 그들은 100 %confluency 시점에서 아무 세포 죽음에 거의 근접 하는 보장 하기 위해 세포를 관찰 합니다. 각 접시에 신선한 DMEM + 10% 혈 청 25 mL를 추가 하 여 미디어를 교체 합니다. 5% CO2 는 추가 48 h에 대 한 37 ° C에서 배양을 계속 한다.
    참고: 이상의 6 15 cm 번호판 (주의 단계 5.2 참조)를 사용 하는 경우 단계 3.1에서에서 미디어의 볼륨을 조정 합니다.

4. 바이러스를 수확

  1. 조심 스럽게 transfected 세포 조직 문화 피펫은 멸 균 10 mL 및 50 mL 원심 분리기 튜브에서 수영장을 사용 하 여 포함 된 모든 조직 배양 접시에서는 상쾌한을 수집 합니다.
  2. 탁상 원심 분리기를 사용 하 여 10 분 동안 400-450 x g에서 원심 분리에 의해 중단을 취소 합니다. 0.45 μ m 진공 필터 장치 통해 상쾌한 필터링.
    참고: 필터링 된 상쾌한 수 농도, 계속 하기 전에 최대 4 일 동안 4 ° C에서 저장 또는 aliquoted-80 ° c.에 저장 IDLV-s p 1-CRISPR/Cas9 (비-농축) 바이러스 준비의 예상된 titers 2 ~ 10 배 해야7 화/mL (titer 결정을 위한 6 단계 참조). 그러나, 쓰는 중지 및 재개 기능 titers에 10-20% 손실에 결과의 각 라운드로 여러 freeze-thaw 주기를 바이러스 준비 하지 마십시오.

5입니다. Ultracentrifugation에 의해 바이러스 성 입자의 농도

참고: 두 단계를 포함 하는 정화의 더블 자당 방법 활용: 자당 그라데이션 단계와 자당 쿠션 단계 (그림 2).

  1. 자당 기온 변화도 만들려면 다음 순서로 원뿔 ultracentrifugation 튜브 로드: 0.5 mL 70% 자당 (1 x PBS 해산) 0.5 mL 60% 자당 (DMEM에 녹아 있는), 1 mL 30% 자당 (DMEM에 녹아 있는), 그리고 2 mL 20% 자당 (1 x PBS에 용 해).
  2. 그라디언트를 신중 하 게 바이러스를 포함 하는 상쾌한을 추가 합니다. 4 15 cm 접시에서 상쾌한의 총 볼륨은 100 mL, 스핀 당 6 ultracentrifugation 튜브 표면에 뜨는 바이러스의 전체 볼륨을 처리 하는 데 사용.
    1. 이 단계에 사용 하는 각 ultracentrifugation 튜브는 최대 30 mL (를 포함 하 여 자당의 볼륨)의 볼륨의 용량, 튜브, 적어도 10%를 떠나 중 동등 하 게 바이러스 상쾌한 배포 headspace 흘림을 방지 하기 위해.
    2. 풀링된 바이러스 상쾌한의 마지막 볼륨 쉽게 6 ultracentrifugation 튜브 내에서 수용 될 수 있도록 각 실험에 대 한 더 이상의 15 cm 번호판을 사용 하는 경우 문화 볼륨 접시 당 20 ~ 22 mL을 조정 합니다.
    3. 채우기 ultracentrifugation 적어도 3-4에 그들의 총 볼륨 용량 튜브, 튜브의 파손 원심 분리, 샘플 및/또는 장비 손상의 가능한 손실을 하는 동안 발생할 수 있습니다.
  3. 70000 x g 17 ° C에서 2 h에서 PBS 및 원심 분리기 샘플 x 1 튜브 균형 (회전자 세부 사항에 대 한 재료의 표 참조).
    참고: 가속 중 자당 계층의 중단을 방지 하기 위해 천천히 가속 화 하기 위해로 터 200 rpm 회전 급강하의 처음 3 분 동안 ultracentrifuge를 설정 합니다. 유사 하 게, 천천히 0 rpm 회전 급강하의 끝에 3 분 이상 200 rpm에서 회전자를 감속에 ultracentrifuge를 설정 합니다.
  4. 신중 하 게 깨끗 한 튜브 (그림 2)에 30-60% 자당 분수를 수집 합니다. 감기 1 추가 풀링된 분수 PBS x 100 ml; 볼륨을가지고 여러 번 왔다 갔다 pipetting으로 혼합.
  5. 신중 하 게 자당 쿠션에 바이러스 준비를 레이어 링 여 자당 쿠션 단계를 진행 합니다. 이 위해, 뒤에 튜브 당 바이러스 솔루션의 20 ~ 25 mL 튜브에 (1 x PBS)에서 20% 자당의 4 mL를 추가 합니다. 튜브는 3-4 분 미만 하는 경우 전체, 살 균 1 x PBS와 충전을.
  6. 신중 하 게 균형 그리고 원심에서 70000 x g 17 ° C에서 2 시간에 대 한 샘플 전에. 부는 상쾌한 어 고 나머지 액체를 종이 타 올에 튜브를 거꾸로 하 여 배출.
  7. 펠 릿에서 모든 액체를 제거 하려면 나머지 방울을 발음. 이 단계에서 바이러스를 포함 하는 펠 릿 겨우 작은 반투명 반점으로 표시 되어야 합니다.
  8. 1 x PBS의 70 µ L 첫 번째 튜브와 철저 하 게 정지를 pipetting, 이후 다음 튜브에 정지를 전송 및 추가 계속 하기 전에, 모든 펠 릿 resuspended 때까지 혼합 하 여 펠 릿을 resuspend.
  9. 이전과 PBS와 믹스 감기 1의 추가 50 µ L 튜브를 헹 구 십시오. 최종 서 스 펜 션의 결합 된 볼륨 ~ 120 µ L 이며, 약간 밀키; 나타납니다 확인 30에 대 한 10000 x g에서 원심 분리 하 여 취소 탁상 microcentrifuge에 s.
  10. 신선한 microfuge 관에는 상쾌한 전송, 10 µ L aliquots, 고-80 ° c.에서 그들을 저장합니다
    참고: lentiviral 샘플에 반복된 freeze-thaw 주기를 수행 하지 마십시오. 원심 분리가 필요한 때를 제외 하 고 노력 해야 조직 문화 후드의 나머지 단계를 수행 하려고 또는 적절 한 biosafety 조치 (내용 참조)를 사용 하 여 조직 문화 객실을 지정.

6입니다. 바이러스 Titers의 추정

  1. p24 -효소-연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 메서드
    참고: 분석 결과 수행으로 에이즈-1 p24 를 위한 NIH 에이즈 백신 프로그램의 지시 당 항 원 캡처 시험 키트 ( 재료의 표참조) 수정29높은 바인딩 96 잘 접시를 사용 하 여.
    1. 다음 날 씻어 200 µ L 0.05%로 세 번 우물 차가운 PBS (PBS-T 솔루션)에 트윈 20. 1:1500 1 x PBS에 희석에 항 체 단일 클로 널 반대로 p24 의 100 µ L 플레이트 코트와 4 ° c.에서 밤새 품 어
    2. 일반적인 바인딩 제거, 차단 PBS;에서 200 µ L 1 %BSA 접시 200 µ L 0.05%로 세 번 세척 실 온에서 1 시간 이상에 대 한 차가운 PBS (PBS-T 솔루션)에 트윈 20.
    3. 샘플을 준비: 집중된 벡터 준비, 대 한 약 1 µ L 샘플의 희석 Triton X-100 (최종 농도 10%)의 dd-H20과 10 µ L의 89 µ L을 추가 하 여. 비 집중 준비에 대 한 ten-fold 희석된 샘플 (샘플의 10 µ L 트라이 톤 X-100 (최종 농도 10%)의 dd-H20과 10 µ L의 80 µ L 추가)을 준비 합니다.
      참고: 샘플을 저장할 수 있습니다이 단계에서-20 ° C에서 나중 사용을 위해 시간의 연장된 기간에 대 한.
    4. 에이즈-1 표준 적용 (시작 농도 5 ng/mL)와 2-fold 직렬 희석 하 여 준비 합니다.
    5. 설정 1:10, 000, 0.2% 트윈 20, 1 %BSA 보충 RPMI 1640 년에 (1: 100 미리 희석된 주식)에서 집중된 샘플을 희석 1:50, 000, 그리고 1:250,000 희석. 비 집중 샘플 희석 (1시 10분에서 미리 희석 주식) 설정 1: 500, 1: 2500, 그리고 1:12,500 희석 하 0.2% 트윈 20, 1 %BSA 보충 RPMI 1640 년에.
    6. Triplicates에서 접시에 샘플을 적용 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
    7. 다음 날, 세척 우물 6 번 하 고 37 ° C 4 h 100 µ L polyclonal 토끼 안티-p24 항 체, RPMI 1640, 10 %FBS, 0.25 %BSA, 및 2% 정상 마우스의 혈 청 (NMS)에 희석된 1:1000에서 품 어.
    8. 6 배 위와 같이 세척 하 고 5% 정상 염소 혈 청, 2 %NMS, 0.25 %BSA 및 0.01% 보충 RPMI 1640에 IgG 희석 1:10,000 염소 안티 토끼 양 고추냉이 과산화 효소와 함께 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어 트윈 20.
    9. 위의 접시를 세척 하 고 15 분 동안 실 온에서 TMB 과산화 효소 기질으로 품 어.
    10. 1 N HCL의 100 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다. 450에 샘플의 흡 광도 측정 nm에서 흡 광도 사용 하 여 플레이트 리더.
  2. 기자는 형광 강도 측정
    1. FACS 메서드
      참고: 셀에 GFP 신호 고갈의 범위 수 있습니다 정확 하 게 추정 하실 cytometry 통해 transduced 셀의 의미 형광 강도 측정 하 여. FACS 데이터 분석, 프레 젠 테이 션, 및 해석에 대 한 최근 종이 28 을 참조 하십시오. 프로토콜은 다음과 같이 설명 되어 있습니다.
      1. 1 x PBS에 바이러스 준비 (10-510-1 )에서 준비의 ten-fold 직렬 희석을 확인 합니다.
      2. 잘 당 2 mL의 최종 볼륨에서 6 잘 플레이트의 각 음에 약 5 x 105 293T 세포 씨앗 셀에 각 바이러스 희석의 10 µ L을 추가 하 고 셀 48 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
      3. FACS 분석에 대 한 셀을 다음과 같이 수확: 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 200 µ L을 추가 하 고 37 ° C 5 분 추가 2 mL의 완전 한 DMEM 미디어에서 세포를 품 어 15 mL 원뿔 튜브 샘플을 수집.
      4. 4 ° C에 400 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 고 차가운 1 x PBS의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend.
      5. 고정,이 서 스 펜이 션에 4% 포름알데히드 솔루션의 동일한 볼륨을 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
      6. 고정된 셀 펠 렛 및 1 x PBS의 1 mL에 resuspend. Ortinski 에 설명 된 대로 GFP 식 FACS 악기를 사용 하 여 분석 28 잠시, 수식을 사용 하 여 다음 바이러스 기능 titer를 결정:
        Equation 1
        참고: 여기 Tg = GFP-긍정적인 세포 계산; Tn = 계산; 세포의 총 수 N = 불리고; 세포의 총 수 V = (µ L)에서 볼륨을 사용 하는 변환에 대 한. 예: 1 x 106 세포 바이러스의 10 µ L로 불리고 있었다, 2 x 104 의 세포 라면 계산 및 5 x 103 GFP-긍정적인, 기능 titer 것 위의 방정식에 따라 했다:
        Equation 2
    2. GFP-긍정적인 세포 계산
      1. 감염 (MOI) 변환에 대 한 사용의 다양성을 계산 합니다. MOIs 높은 변환 효율성이 증가 광범위 한 범위 MOIs (1-10)를 테스트 합니다.
      2. Transfection, 전에 대략 3-4 배 잘 당 105 셀 6 잘 플레이트 씨앗. 일단 셀 도달 > 90 %confluency (24 시간) 이내 transduce pre-determined MOIs에서 순화 된 바이러스.
      3. GFP 신호에 변화에 대 한 1-7 일에 대 한 표준 조직 문화, 5% CO2 와 37 ° C에서 접시와 정기적으로 모니터 세포를 품 어.
      4. GFP-긍정적인 세포의 수를 계산 하는 형광 현미경 (계획 4 X 목표, 0.1 한다 40 배 확대) 장착 GFP 필터 세트 (여기 파장 470 nm, 방출 파장-525 nm), 순진한 (유엔 transduced) 셀을 사용 하 여 인구를 설정 GFP 부정과 긍정적인 세포.
      5. 희석 비율 및 다음 수식을 사용 하 여 볼륨을 조정 하 여 최종 titer를 예상:
        Equation 3
        참고: 여기에서, N = GFP-긍정적인 세포, D의 수 희석 요인, M = 확대 비율 (보통 20 X), V = = 변환에 사용 되는 바이러스의 볼륨. 예를 들어 20 GFP-긍정적인 세포 (N) 10-4 (1:10, 000) 20 X 10 µ L 샘플 (V)의 희석에서 계산에 대 한 배율 (M) (D) 귀 착될 것입니다 (10) x x x (20) (20 x 104)의 기능 titer (100 *) = 4 × 108 화/mL.
        (* mL 당 조정 하기)

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Representative Results

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IDLV-CRISPR/Cas9 벡터의 녹아웃 효율성의 유효성 검사
우리는 유전자 녹아웃 CRISPR/Cas9-중재의 효율성을 확인 하기 위해 모델 GFP 표현 293T 세포를 사용. GFP + 셀 HEK 293T 세포 pLenti-GFP (vBK201a) 0.5 (그림 3b, "no 바이러스" 패널)의 나에의 변환에 의해 생성 되었다. SgRNA-GFP/Cas9 모든-에-하나의 벡터 카세트 IDLV 또는 ICLV 입자에 포장 되었다 그리고 생산 효율 p24 일 라 (위; 참조 고 그림 3a)에 의해 평가 되었다. S p 1-바인딩 사이트 (다음 농도)를 포함 하는 벡터의 titers 10의 범위에 있을 것을 발견 했다10 화/mL. 우리는 다음 형광 현미경 검사 법 (그림 3b)를 사용 하 여 GFP 녹아웃의 효율성 평가. 이 위해, 5 x 105 GFP 표현 293T 세포 6 잘 플레이트에 시드 했다 그리고 우리가 그들에 게 24 h 나중으로 IDLV-또는 ICLV-CRISPR/Cas9 5 (그림 3b)의 1 개월에 불리고. 셀 24 h 이후 문화 매체 교체 및 셀 했다 알을 품는 추가 48 h에 대 한 실험의 연속적인 일에 대 한 번호판을 reseeding 전에 대 한 인 큐베이 팅 했다.

최근 연구에서 GFP + ICLV/CRISPR 또는 IDLV/CRISPR 구성 요소 흐름 cytometry28통해 불리고 셀의 평균 형광 강도 측정 했습니다. 우리는 21 일 pt 샘플 14 일 후 변환 (태평양 표준시) (2-4% 신호 소모), 그리고 거의 동일한 GFP 소모에 비해 GFP 고갈 보았다 (> 99% 신호 고갈)28. 이전 관찰과 일치, 우리는 관찰 한 ~ GFP-긍정적인 수에 5 배 감소 이르면 7 일 pt (그림 3), 거의 완전 한 신호 고갈으로 변환에 따라 14 일 pt (데이터 표시 되지 않음)에 의해 관찰 된 세포 두 ICLV-및 IDLV-CRISPR/Cas9 시스템. 신호 손실 GFP-긍정적인 순진한 GFP-긍정적인 세포의 총 수와 치료 후 남아 있는 셀의 비로 평가 했다. 이러한 결과 명확 하 게 IDLVs에 의해 전달 하는 CRISPR/Cas9 구조는 분할 셀에서 편집, 강력, 신속 하 고 지속적인 유전자를 중재 하는 기능에 그들의 통합 대응에 의해 전달와 비교할 다는 것을 보여줍니다.

Figure 3
그림 3: 바이러스 titers의 평가. (a) p24로-ELISA 분석 결과. Titers 집중 s p 1-IDLV-CRISPR/Cas9 (검은 막대)와 s p 1-ICLV-CRISPR/Cas9 (흰색 막대)에 대 한 평가 했다. 여기서 1 mL 당 복사 숫자에 결과 기록 됩니다 ng p24-개 그 1 x 104 바이러스 성 입자를 =. 막대 그래프 데이터 triplicate 실험에서 평균 ± SD를 나타냅니다. (b) 평가의 CRISPR 중재 GFP 녹아웃 효율성. GFP 신호의 소모는 ICLV-CRISPR/Cas9-및 IDLV-CRISPR/Cas9-불리고 293T GFP + 셀 1 개월에서 5 사이의 비교 되었다. 유엔 transduced (그림에서 "바이러스" 패널) GFP-긍정적인 세포 컨트롤으로 사용 되었다. 이미지 7 일 게시물 변환에서 40 배 확대에 형광 현미경을 사용 하 여 인수 했다. Abbrev: RRE: 레 브 응답 요소, EFS-NC: 코어 신장 요인 1α 발기인, ψ (psi): 벡터 포장 요소, hU6: 인간의 U6 발기인, 순수 하지 않아: Puromycin 저항 카세트, WPRE: 마 간염 바이러스 Posttranscriptional 규제 요소, LTR: 긴-단말기 반복 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 1: 플라스 미드 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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IDLVs는 vivo에서 유전자-편집, mutagenesis 배달 플랫폼22 통합에 비해 이러한 벡터와 관련 된의 낮은 위험 때문에 크게 유전 질병의 맥락에서 특히 선택의 차량으로 등장 하기 시작 했습니다. , 28. 현재 원고, 우리는 우리의 실험실28에 최근 개발한 향상 된 모든-에-하나의 IDLV-CRISPR/Cas9 시스템의 생산과 관련 된 프로토콜에 자세히 설명 하고자.

기존 플랫폼을 수정
이 방법으로 1 x 1010 화/mL (그림 3a)의 범위에서 IDLV-CRISPR/Cas9와 ICLV-CRISPR/Cas9 벡터 titers에서 생성할 수 있었습니다. 생산 효율에서이 향상이 모두 한 CRISPR/Cas9 벡터 카세트에 Sp1 바인딩 사이트의 추가를 지정할 수 있습니다. 사실, 우리 최근 보고 ~2.5-fold 증가의 s p 1 포함 IDLV-및 ICLV-CRISPR/Cas9 벡터의 포장 효율성에와 ~ 전반적인 기능 titers에서 창사 증가. 이러한 결과 야생 형 HIV-130,31,32,33,34,35의 키 레 귤 레이 터로 s p 1을 강조 하는 다양 한 그룹에서 이전 작업 계약 .

중요 한 단계 및 문제 해결
S p 1-IDLVs를 들고 위에서 지적 CRISPR/Cas9 transgenes titers 1 x 1010 화/mL 당 5 ~ 107 프로듀서 셀 배 주변을 생성할 수 있었다. 이들 보다 낮은 titers 생산 과정에서 오류를 나타내는 것이 다음과 같은 중요 한 경우에 포인트 위해 고려 되어야 한다 titer 개선: 1) 프로듀서 셀 교체와 함께 낮은 통로 번호의 선호 될 것이 좋습니다. ≥15 통행 및 느린 성장 관찰 때 후. 2) 셀 미디어 구성 요소 선택 생산 효율성 측면에서 중요 하다. 예를 들어, 일반적으로 사용 되 태아 둔감 한 혈 청, 대신 우리 우주 송아지 혈 청의 사용을 일관 되 고 동시에 비용 효율적인 하면서 바이러스 생산 향상 찾으십시오. 3) 다른 HEK 라인의 생산 적합성을 신중 하 게 평가 되어야 한다. 예를 들어 우리가 발견 한 ~ 삼 배 차이 바이러스 생산 수율에서 293T 세포와 293 피트 ( 재료의 표참조) 세포 (데이터 표시 되지 않음). 4) 그것은 대략 바이러스 독성 때문에 조 세포 죽음의 결과로 더 낮은 세포 밀도와 높은 밀도 생산 효율성에 표시 된 드롭 인 70-80% 합칠 때 셀 페 수 것이 좋습니다. 엄지손가락의 규칙으로 서 세포 분열 후 transfection의 라운드 추가 셀을 하나 수 셀 밀도를 고려를 하는 것이 좋습니다. 5) 마지막으로, transfection 효율 높은 이상적인 transfection에 대 한 정확 하 게 6.95에서 유지 되어야 하는 2 x BBS의 pH에 따라 달라 집니다. 그것은 따라서 좋습니다 조종사 transfection 규모 2 x BBS의 각 새로운 배치를 확인.

벡터 처리 및 안전
생산 동안에 IDLV 및 ICLV 벡터가 프로토콜의 몇 가지 중요 한 안전 고려 사항 있다. 첫째, lentiviruses 작업 바이오 안전 수준 II 포함을 해야합니다. 죄 벡터에 의해 여유 안전 기능에도 불구 하 고 죄 벡터에서 잔여 transcriptional 활동 보고36되었습니다. 또한, 이전 작업을 하는 보여주었다 IDLV 그리고 ICLV 유전자를 생산적으로 에이즈-127에 의해 구출 될 수 있다. 따라서, 특히 때 집중된 하는 lentiviruses는 사용된37복제 능력 분석 (RCA) 수행 되어야 하는 것이 좋습니다. 안전 절차에 대 한 Microbiological 및 생물 의학 실험실, 제 4 판, 센터에 대 한 질병 제어 (CDC), 온라인38찾을 수 있습니다 발행에 Biosafety 참조 lentiviral 벡터 준비의 처리. 같은 메모 시스템39 biosafety 향상 된 기능을 포장 하는 제 3 세대를 2 세대 시스템의 그것 보다 낮은 효율와 IDLVs 및 ICLVs, 패키지를 사용할 수 있습니다.

의미와 향후 방향
전반적으로, CRISPR/Cas9에 대 한 IDLVs에 대 한 생산 프로토콜-중재 급속 하 게 분할 세포에이 시스템의 효율성의 첫 번째 평가 나타냅니다 진 여기에 설명 된 편집. 우리는 s p 1-CRISPR/Cas9 IDLVs에 의해 전달 수 있습니다 효율적이 고 신속 하 게 편집 ICLVs로 비슷한 속도와 이러한 셀에 GFP 시연 GFP-긍정적인 HEK 293T 세포를 사용 하 여. 이 관측은 광범위 하 게 유전자 transfection 비 바이러스 성 방법을 통해 편집 ribonucleoprotein 복합물 (Cas9 RNPs)를 사용 하 여 이전 작업에서 결과와 일치. 이 새로운 플랫폼을 더 풍요롭게 유전자 편집 부품의 납품 및 셀에 다른 분자 화물에 대 한 적-확대 도구 상자.

과도, 신속 하 고 타겟 유전자에 대 한 높은 titer 바이러스 성 벡터의 지속 가능한 생산을 허용 하는 플랫폼에 대 한 옵션을 몇 가지 있다 lentiviral 기반 유전자 전달 시스템 개발에 최근 진행에도 불구 하 고 앞서 설명한 것 처럼 조작입니다. 바인딩 transgene 식 카세트에 매우 표현 녹음 방송 요인에 대 한 모티프의 결합을 통해 동시에 여러 이러한 문제를 해결할 수 있었습니다. 이 간단 하 고 그러나 중요 한 조작 다양 한 유사한 배달 플랫폼 개발을 위한도 연다. 그것은 transgene 식 동일한 바인딩 주제, 또는 다른 녹음 방송 요인에 대 한 사이트 바인딩을 가진 Sp1 모티브를 멀티플렉싱 하 여 수많은 복사본의 추가 통해 향상 될 수 있는지 테스트 하려면 특히 유용할 것 이다. 우리의 처분에 이러한 도구, 그것은 상대적으로 약한 조직 특정 발기인에서 식 추측을 유혹, 인간 Synapsin 등 나 (hSyn) 및 마우스 칼슘 calmodulin 인당 단백질 키 니 아 제 II (CaMKII), 수 크게 향상 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서.

현재 연구 테스트 IDLV 전달 CRISPR/Cas9의 유전자 최저의 기능 원리에서 제한 되었다, 하는 동안 우리의 시스템의 다양 한 유전자 편집 같은 응용 프로그램에는 촉매로-비활성 그 의무가 있을 것 dCas940. 마지막으로, 작은 endonucleases, SaCas941 ,42, Cpf1 등 함께이 연구에 설명 된 플랫폼 채택 될 수 상대적으로 짧은 기간에 매우 효율적인 AAV 기반 유전자 전달 시스템 구축으로 lentiviral 벡터에 비해 낮은 immunogenicity의 추가 이점을 제공 합니다. 말할 필요도 없이, 이러한 접근 될 것 이라고 소설,의 개발을 향한 긍정적인 단계 임상 안전 바이러스 성 벡터.

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Disclosures

USC-499-P 특허 (1175)이이 원고에 설명 된 작업에 관하여 사우스 캐롤라이나 대학에 의해 제기 되었다.

Acknowledgments

우리는 신경 생물학의 학과 듀크 대학의과 대학 및 기초 과학, 듀크 대학에 대 한 학장의 사무실 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 원고에 의견에 대 한 공작 바이러스 성 벡터 코어의 회원을 감사합니다. 플라스 미드 pLenti CRISPRv2 Feng 장 (브로드 연구소)에서 선물 했다. LV-포장 시스템 플라스 미드 psPAX2를 포함 하 여, VSV G, pMD2.G, pRSV 계 Didier Trono (EPFL, 스위스)에서 종류 선물 했다. 이 작품에 대 한 재정 지원에의 사우스 캐롤라이나의과 대학에 의해 제공 된 RDF18080 E202 (B.K) 부여 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
xMark Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
BD FACS Becton Dickinson 338960
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor Beckman Coulter 369650
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
High-binding 96-well plates Corning 3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Tissue culture pipettes, 5 mL Corning 4487
Tissue culture pipettes, 10 mL Corning 4488
Tissue culture pipettes, 25 mL Corning 4489
Hemacytometer with cover slips Cole-Parmer UX-79001-00
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
DMEM, high glucose media Gibco 11965
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) Sigma Aldrich B9879 - BES
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
pRSV-Rev Addgene 12253
lentiCRISPR v2 Addgene 52961
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsrGI New England Biolabs R0575S
BsmBI New England Biolabs R0580S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜
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Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).More

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).

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