Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En protokoll for produksjon av Integrase dårlig Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-mediert Gene Knockout i dele celler

Published: December 12, 2017 doi: 10.3791/56915
Automatic Translation
1, 1
1Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine

Summary

Vi beskriver produksjon strategi integrase dårlig lentiviral vektorer (IDLVs) som kjøretøy for å levere CRISPR/Cas9 til cellene. Med en evne å megle rask og robust genet redigering i celler, IDLVs presenterer en tryggere og like effektivt vektor plattform for gen levering sammenlignet integrase-kompetent vektorer.

Abstract

Lentiviral vektorer er et ideelt valg for å levere gen-redigering komponenter til på grunn av deres evne til stabilt transducing et bredt spekter av celler og formidling av høye nivåer av genuttrykk. Men deres evne til å integrere i verten celle genomet øker risikoen for insertional genetisk virkning og dermed øker sikkerheten bekymringer og begrenser deres bruk i klinisk innstillinger. Videre levert vedvarende uttrykket av gen-redigering komponenter av disse integrasjon-kompetent lentiviral vektorer (ICLVs) øker sannsynligheten for promiskuøse genet målrette. Som et alternativ, har en ny generasjon integrase dårlig lentiviral vektorer (IDLVs) blitt utviklet som løser mange av disse bekymringene. Her produksjon protokollen av en ny og forbedret IDLV plattform for CRISPR-mediert genet redigering og listen trinnene involvert i rensing og konsentrasjonen av slike vektorer er beskrevet og signaltransduksjon og gen-redigering effektivitet ved hjelp HEK-293T cellene ble demonstrert. Denne protokollen er lett skalerbare og kan brukes til å generere høy titer IDLVs som kan transducing celler i vitro og i vivo. Dessuten, denne protokollen kan lett tilpasses for produksjon av ICLVs.

Introduction

Presis genet redigering utgjør hjørnesteinen i store biomedisinsk fremskritt som involverer utviklingen av romanen strategier for å takle genetiske sykdommer. I forkant av gen-redigering teknologiene er metoden stole på bruk av den clustered regularly -jegnterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / Cas9 system som ble identifisert som en del av bakteriell immunitet mot invasjonen av viral genetiske materiale (omtalt i referanser1,2). En stor fordel av CRISPR/Cas9 over andre gen-redigeringsverktøy, som sink-finger nucleases (ZFNs) og transkripsjon aktivator som effektor nucleases (TALENs) (omtalt i referanse3), er den relative enkelheten av plasmider design og bygging av CRISPR komponenter, en funksjon som har drevet utvidelse av gen-redigering av noen få spesialiserte laboratories til en mye bredere forskningsmiljø. I tillegg har enkelheten til CRISPR/Cas9 programmering og dens kapasitet for multiplex målet anerkjennelse ytterligere fueled sin popularitet som en kostnadseffektiv og lett-å-bruke teknologi. Blant de ulike metodene tilgjengelig for forskere å levere slike gen-redigering komponenter til celler, fortsatt viral vektorer langt den mest populære og effektive systemet.

Lentiviral vektorer (LVs) har dukket opp som den ønsker å levere komponentene i CRISPR/Cas9 systemet i vivo for diverse programmer4,5,6,7. Flere viktige funksjoner gjør LVs et populært valg for denne prosessen inkluderer deres evne til å infisere både dele og ikke dele celler, lav immunogenisitet og minimal mobilnettet toksisitet (omtalt i referanse8). Som et resultat, har LV-mediert genterapi vært ansatt i behandling av infeksjonssykdommer, som HIV-1 og HBV HSV-1, og i korrigering av feil underliggende menneskelige arvelige sykdommer, som cystisk fibrose og neo-vaskulær macular degenerasjon 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. videre, LVs har endret effektivt for å utføre multiplex genet redigering på tydelige genomisk loci bruker en enkelt vektor systemet12.

Men den iboende egenskapen av LVs å integrere i vert genomet kan mutagene og ofte handicap deres nytte som transgene levering biler, spesielt i klinisk innstillinger. Videre siden stabilt integrert LVs uttrykke deres effekter av transgener på bærekraftig høye nivåer, er dette systemet dårlig tilpasset for levering av gen-redigering komponenter som CRISPR/Cas9; overuttrykte Cas9-guide RNA (gRNA) og lignende proteiner som ZFNs, er forbundet med forhøyede nivåer av off-målet effekter, blant annet uønsket mutasjoner13,14,15,16 , 17 og kan potensielt øke cytotoksisitet18. Derfor, for å oppnå presis gen-redigering med minimal off-målet effekter, er det viktig å design systemer som tillater for forbigående uttrykket av genet redigeringskomponenter.

De siste årene, en rekke levering plattformer er utviklet for å uttrykke transiently CRISPR/Cas9 i cellene16,19,20,21 (omtalt i referanse22). Disse omfatter metoder som bruker direkte innføre renset Cas9 sammen med riktig veiledning RNAs i celler, som viste seg å være mer effektiv på målrettet gen-redigering i forhold til plasmider-mediert transfection16. Studier har vist at ribonucleoprotein (RNP) komplekser bestående av guide RNA/Cas9 partikler er raskt snudd etter formidling DNA cleavage på sine mål, antyder at kortsiktige uttrykket av disse komponentene er tilstrekkelig for å oppnå robust genet redigering16. Tenkes, ikke integrert viral vektor plattformer som adeno-assosiert virus vektorer (AAVs) kan gi et levedyktig alternativ å levere gen-redigering maskiner til cellene. Dessverre AAV capsids har betydelig lavere emballasje kapasiteter enn LVs (< 5kb), som sterkt hindrer deres evne til å pakke multi-komponent CRISPR verktøysettet innenfor en enkelt vektor (omtalt i referanse8). Det er verdt å merke seg at tillegg av forbindelser som hemme histone deacetylases (f.eks, natrium butyrate23) eller hindre cellen syklus (f.eks, koffein24) har vist seg å øke lentiviral titers. Til tross for framskritt, er forbigående uttrykk systemer utviklet så langt fortsatt hindret av flere mangler, for eksempel lavere effektivitet, som fører til redusert viral titers, og lav signaltransduksjon effektiviteten av virus generert gjennom slike tilnærminger25.

Integrase dårlig lentiviral vektorer (IDLVs) representerer et stort fremskritt i utviklingen av genet levering biler, som de kombinerer emballasje evnen til LVs med fordelen av AAV-lignende episomal vedlikehold i celler. Disse funksjonene hjelper IDLVs i stor grad omgå de store problemene forbundet med å integrere vektorer, vis-à-vis kontinuerlig overuttrykte potensielt gentoksisk elementer og integrasjon-mediert genetisk virkning. Det ble tidligere vist at IDLVs kan endres med hell for å forbedre episomal gene expression26,27. Med hensyn til IDLV-mediert CRISPR/Cas9 levering begrenser lav produksjon titers og lavere uttrykk for episome-borne genomer i forhold til integrase-dyktige lentiviral systemer deres nytte som bona fide verktøy for å levere genomet-redigering transgene konstruksjoner. Vi har nylig vist at både transgene uttrykk og viral titers knyttet IDLV produksjon er betydelig forbedret ved inkludering av bindende områder for transkripsjon factor Sp1 i viral uttrykk kassett28. De endrede IDLVs støttet robust CRISPR-mediert genet redigering både i vitro (i HEK-293T celler) og i vivo (på etter mitotisk hjernen nevroner), mens inducing minimal off-målet mutasjoner sammenlignet med tilsvarende ICLV-mediert systemer28. Samlet, vi utviklet en roman, kompakt, alle-inne-ettall CRISPR toolkit gjennomført på en IDLV plattform og skissert ulike fordelene med å bruke slike en levering kjøretøy for forbedret genet redigering.

Her er produksjon protokollen av IDLV-CRISPR/Cas9 beskrevet, inkludert de ulike trinnene involvert i samlingen, renselse, konsentrasjon og titrering av IDLVs, samt strategier for å validere gen-redigering effekten av disse vektorer. Denne protokollen er lett skalerbare for å møte behovene til ulike etterforskere og er utformet for å kunne generere LV vektorer med titers i området fra 1 x 1010 transducing enheter (TU) / mL. Vektorer generert gjennom denne protokollen kan brukes til å effektivt infisere flere ulike celletyper, inkludert vanskelig å transduce embryonic stilk celler, blodkreft cellene (T-celler og makrofager) og kultivert og i vivo- injisert neurons. Videre er protokollen like godt egnet for produksjon av integrase-kompetent lentiviral vektorer i lignende mengder.

Figure 1
Figur 1: IDLV emballering. (a) skjematisk av wild type integrase protein (b) den endrede plasmider ble avledet fra psPAX2 (se metoder, plasmider konstruksjon for detaljer). Representant agarose gel bilde av kloner vist for muterte integrase kloner. DNA-prøver tilberedt med en standard plasmider DNA isolasjon mini kit ble analysert av fordøyelsen med EcoRV og SphI. Riktig fordøyd klone (nummer 5, stiplet rød boks) ble ytterligere bekreftet ved direkte (Sanger) sekvenser for D64E substitusjon i INT. Integrase-mangelfull emballasje kassetten ble kalt pBK43. (c) skjematisk av forbigående transfection protokollen ansatt til å generere IDLV-CRISPR/Cas9 vektorer, viser transfekterte 293T celler med VSV-G, emballasje og transgene kassetter (Sp1-CRISPR/Cas9 alt-i-ett plasmider). Virus partikler som bud ut fra cellemembranen inneholder den fulle RNA av vektoren (uttrykt fra transgene kassetten). Den andre generasjonen av IDLV-emballasje systemet ble brukt, som inkluderer regulatoriske proteiner Tat og rev Rev uttrykk er ytterligere supplert fra en egen kassett (RSV-REV-plasmider). ABBREV: LTR-lang-terminal gjenta, VSV-G, vesicular stomatitt virus G-protein, pCMV-cytomegalovirus promoter; Rous sarkomspesialitet virus (RSV) selskapet; RRE-(Rev svar Element). Andre regulerende elementer på uttrykk kassetten inkluderer Sp1 bindende områder, Rev Response element (RRE), hakkespett hepatitt Virus Posttranscriptional regulatorisk Element (WPRE), en kjerne-forlengelse faktor 1α promoter (EFS-NC), vektor emballasjen elementet ψ (psi), menneskelige Cytomegalovirus (hCMV) arrangøren og menneskelige U6 promoter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. dyrking HEK-293T cellene og Seeding for hva

Merk: Menneskelige embryonale nyre 293T (HEK-293T) celler er dyrket i DMEM, høy glukose media med 10% bovin kalv serum supplert med jern og vekst arrangører og 1 x antibiotika-antimycotic løsning (100 x løsningen inneholder 10.000 enheter penicillin 10 mg streptomycin og 25 µg amfotericin B per mL). Media er også supplert med 1 x natrium pyruvate, 1 x ikke-essensielle aminosyren mix og 2 mM L-glutamin (lager 200 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptide i 0,85% NaCl). Celler er kultivert i 100 mm vev kultur plater (omtrentlig vekst areal er 55 cm ²). Sub dyrking forholdet 1:10 brukes med sub dyrking hver 2-3 dager. Trypsin-EDTA 0,05% brukes til av cellene mellom avsnitt. Hvis du vil beholde konsekvensen mellom eksperimenter, vi anbefaler testing kalv sera når du bytter til en annen mye/bakst og overvåke endringer i cellevekst, hva effektivitet, og vektor produksjon.

  1. Starte en ny kultur med lav passasje celler (det anbefales å ikke bruke celler etter passering 15 eller hvis veksten bremser) av frø i en 10 cm vev kultur plate. Bruk DMEM med 10% serum for cellevekst. Vokse cellene på 37 ° C med 5% CO2 i en standard vev-kultur inkubator. Bruk en standard hemocytometer å telle celler for alle etterfølgende trinnene.
  2. Når cellene nå 90-95% confluent vekst, reseed i 15 cm vev kultur plater (under trinn 1.3 - 1.5).
  3. For å reseed, Sug opp media fra confluent plate og forsiktig skyll med sterilt 1 x PBS. Inkuber celler med 2 mL en dissosiasjon reagens (f.eksTrypsin-EDTA) ved 37 ° C i 3-5 min. legge 8 mL av mediet som inneholder serum for å deaktivere dissosiasjon reagensen og triturate 10 - 15 ganger med en 10 mL serologisk pipette opprette en enkelt celle suspensjon. Resuspend celler i kultur media vil ha en celle tetthet av ca 4 x 106 celler/mL.
  4. For å forsterke tilslutning til underlaget, pre coat 15 cm plater med 0,2% gelatin, legge 8 mL av per plate. Jevnt over overflaten på platen, ruge ved romtemperatur for 10 min og siphon av væsken.
  5. Bringe det totale volumet av hver plate til 25 mL med varm (37 ° C) HEK-293 T media (se merknad under trinn 1) og frø platene ved å legge til 2,5 mL av celler (totalt ~ 1 x 107 celler/plate). Inkuber plater på 37 ° C med 5% CO2 over natten eller inntil 70-80% confluency er nådd.
    Merk: Opptil seks 15 cm plater kan brukes til produksjon. Juster volumet av media per plate til ~ 20-22 mL når du bruker mer enn fire plater (se trinn 5 av protokollen for begrunnelse).

2. transfecting HEK-293T celler med en kalsium fosfat-basert protokoll

  1. Hva reagenser
    1. For å forberede 2 x BES-bufret løsning BBS (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4), kombinere 16.36 g NaCl, 10.65 g av BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-amino-ethanesulfonic acid), og 0.21 g Na2HPO4. Legge til dobbel-destillert H2O (dd-H2O) opptil 900 mL. Oppløse, sjarmere til pH 6.95 med 1 M NaOH og få volum 1 L. filter via 0.22 µM filter enhet. Butikken på 20 ° C.
    2. Forberede 1M CaCl2. Filtrere løsning via filtere 0.22 µM. Butikken på 4 ° C.
  2. Observere platene som ble sådd en dag før. Cellene er klar for transfection når de når 70-80% confluency.
  3. Sug opp gamle medier fra platene og forsiktig legge nylagde media uten serum.
    Merk: Se Utfyllende fil 1-plasmider for detaljer om de valgte plasmider og forberedelsen.
  4. Klargjør plasmider blandingen av aliquoting fire plasmider inn i et 15-mL konisk rør. For en enkelt 15 cm parabolen forberedelse, bruke 37,5 µg av den CRISPR/Cas9-overføring vektor (pBK198 eller pBK189), 25 µg av pBK43 (psPAX2-D64E), 12.5 µg pMD2.G og 6,25 µg av forrige (figur 1 c).
  5. Legge til 312,5 µL 1M CaCl2 plasmider mix. Til dette, kan du legge til 1,25 mL steril dd-H20.
  6. Sakte (drop-wise) Legg 1,25 mL av 2 x BBS-løsningen mens vortexing mix. Inkuber i 30 min ved romtemperatur.
  7. Legg transfection blanding dropwise hver 15 cm plate (2.5 mL per plate). Swirl platene forsiktig og ruge på 37 ° C med 5% CO2 for 2-3 h. Deretter legge 2,5 mL (10%) serum per plate og fortsette rugende overnatting (12-18 h).
    Merk: Noen labs bruke 3% CO2 inkubatorer for å stabilisere media pH. Men følger vi ikke alle aldersforskjell hva effektivitet mellom 3% og 5% CO2. Også er CaPO4 precipitates avgjørende for hva effektivitet; Hva mix må være klare før sin tillegg til cellene. Hvis blandingen blir skyet under inkubasjonen, forberede frisk 2 x BBS (pH = 6.95).

Figure 2
Figur 2: konsentrasjonen av viral partikler med dobbel-sukrose gradient protokollen. Virus partikler fra nedbryting (SN) er lastet inn gradient sukrose gradering. 70%, 60%, 30% og 20% sukrose løsninger brukes til å opprette gradient. Etter sentrifugering, partikler fra 30-60% sukrose fraksjoner ytterligere lastet opp på en 20% sukrose pute og igangsatte. Den endelige pellet inneholder renset virus partikler er resuspended i 1 x PBS for ytterligere behandling (se tekst for detaljer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. dag etter Transfection

  1. Observere cellene slik at de nærmer 100% confluency på dette punktet med liten eller ingen celledød. Erstatte media ved å legge til 25 mL av fersk DMEM + 10% serum hver plate. Fortsette rugende på 37 ° C med 5% CO2 for en ekstra 48 h.
    Merk: Justere volumet av media i trinn 3.1 Hvis bruker mer enn seks 15 cm plater (se trinn 5.2, Merk).

4. høsting Virus

  1. Nøye samle nedbryting fra alle vev kultur platene som inneholder de transfekterte cellene med et sterilt 10 mL vev kultur pipette og svømmebasseng i 50 mL sentrifuge rør.
  2. Fjern suspensjon av sentrifugering 400-450 x g i 10 min ved hjelp av en tabletop sentrifuge. Filtrere nedbryting gjennom en 0,45 µm vakuum filter enhet.
    Merk: Filtrerte nedbryting kan være lagret på 4 ° C i opptil 4 dager før du fortsetter med konsentrasjon, eller aliquoted og lagret på-80 ° C. De forventede titers IDLV-Sp1-CRISPR/Cas9 (ikke konsentrert) viral forberedelser skal ~ 2 x 107 TU/mL (se trinn 6 for titer vilje). Men unngå å utsette viral forberedelsene til flere fryse-Tin sykluser, som hver runde av fryses resultater i en 10-20% tap i funksjonelle titers.

5. konsentrasjon av virus partikler av Ultracentrifugation

Merk: Vi benytter en dobbel-sukrose metoden for renselse som omfatter to trinn: en sukrose gradient trinn og en sukrose pute (figur 2).

  1. Laste koniske ultracentrifugation rør i følgende rekkefølge for å lage en sukrose gradering: 0,5 mL 70% sukrose (oppløst 1 x PBS), 0,5 mL 60% sukrose (oppløst i DMEM), 1 mL 30% sukrose (oppløst i DMEM) og 2 mL 20% sukrose (oppløst i 1 x PBS).
  2. Legge til virus inneholder nedbryting nøye på graderingen. Det totale volumet av nedbryting fra fire 15 cm plater er 100 mL, bruk seks ultracentrifugation rør per spinn behandle hele volumet av viruset supernatant.
    1. Hver ultracentrifugation og elueringsrøret for dette trinnet har en volumkapasitet på opp til 30 mL (inkludert volumet av sukrose), distribuere viral nedbryting likt mellom rør, forlater minst 10% headspace å hindre søl.
    2. Juster volumet kultur ~ 20-22 mL per plate når du bruker mer enn fire 15 cm plater for hvert eksperiment, slik at det siste bindet gruppert viral nedbryting av kan lett innpasses i seks ultracentrifugation rør.
    3. Fyll ultracentrifugation rør til minst tre fjerdedeler totalvolum kapasiteten, ellers brudd på rør kan oppstå under sentrifugering, som resulterer i tapt utvalg og/eller utstyr skade.
  3. Balansere rør med 1 x PBS og sentrifuger prøver 70.000 x g for 2t ved 17 ° C (se Tabell for materiale for rotoren detaljer).
    Merk: For å unngå avbrudd av sukrose laget under akselerasjon, satt ultracentrifuge til å akselerere sakte rotoren til 200 rpm under den første 3 min spinn. Tilsvarende sett ultracentrifuge til å sakte avta rotoren fra 200 rpm til 0 rpm over 3 min på slutten av spinn.
  4. Nøye samle 30-60% sukrose brøker i ren rør (figur 2). Legge til kalde 1 x PBS til grupperte fraksjoner og ta opp til 100 mL; Bland ved pipettering opp og ned flere ganger.
  5. Videre til sukrose pute trinn ved nøye lagdeling viral forberedelse på en sukrose pute. For dette, legger du til 4 mL av 20% sukrose (i 1 x PBS) til røret, etterfulgt av ~ 20-25 mL av viral løsningen per rør. Hvis rør er mindre enn tre fjerdedeler full, fylle opp med sterilt 1 x PBS.
  6. Nøye balanse og sentrifuge prøvene 70.000 x g for 2t ved 17 ° C, som før. Hell av nedbryting og la de resterende væsken renne ved å snu rør på papirhåndklær.
  7. Sug opp gjenværende dråper for å fjerne all væsken fra pellet. På dette trinnet bør virus inneholder pellets være knapt synlig som små gjennomskinnelig flekker.
  8. Resuspend pellets ved å legge til 70 µL av 1 x PBS til første rør og grundig pipettering suspensjon, deretter overføre suspensjon til neste røret og blande som før, fortsetter til alle pellets er resuspended.
  9. Skyll rør med en ekstra 50 µL av kaldt 1 x PBS og bland som før. Kombinert volumet av siste suspensjon er ~ 120 µL og vises litt melkeaktig; klart det med sentrifugering 10.000 x g for 30 s på en tabletop microcentrifuge.
  10. Overføre nedbryting til en frisk microfuge tube gjøre 10 µL dele og lagre dem på-80 ° C.
    Merk: Unngå utfører gjentatte fryse-Tin sykluser på lentiviral prøvene. Unntatt når sentrifugering er nødvendig, bør arbeidet gjøres å utføre resten av trinnene i vev kultur hetter, eller utpekt vev-kultur rom ved hjelp av riktig biosikkerhet tiltak (se diskusjon).

6. estimering av Viral Titers

  1. p24 -enzym-koblet immunosorbent analysen (ELISA) metode
    Merk: Analysen utføres ved hjelp av høy-bindende 96-brønns plater som pr. instruksjonene av programmet NIH AIDS vaksine HIV-1 p24 Antigen fange analysen Kit (se Tabell for materiale) med modifikasjoner29.
    1. Neste dag, vaske brønnene tre ganger med 200 µL 0,05% mellom 20 i kalde PBS (PBS-T løsning). Coat platen med 100 µL monoklonale anti-p24 antistoff på en fortynning av 1:1500 i 1 x PBS og ruge over natten på 4 ° C.
    2. For å eliminere ikke-spesifikk bindende, blokkere platen med 200 µL 1% BSA i PBS; vask tre ganger med 200 µL 0,05% mellom 20 i kalde PBS (PBS-T løsning) minst 1t ved romtemperatur.
    3. Forberede eksempler: For konsentrert vektor preparater, fortynne 1 µL av utvalget 100-fold ved å legge 89 µL av dd-H20 og 10 µL av Triton X-100 (siste konsentrasjon på 10%). For ikke-konsentrert preparater, forberede tidoble fortynnede prøver (legge 80 µL av dd-H20 og 10 µL av Triton X-100 (siste konsentrasjon på 10%) til 10 µL av utvalget).
      Merk: Utvalg kan lagres på 20 ° C på dette trinnet i lengre tid for senere bruk.
    4. Forberede HIV-1 standarder ved å bruke en 2-fold føljetong fortynning (med en start konsentrasjon 5 ng/mL).
    5. Fortynne konsentrert prøver (fra 1: 100 pre utvannet aksjer) i RPMI 1640 supplert med 0,2% mellom 20 og 1% BSA å etablere 1:10, 000, 1:50, 000, og 1:250,000 fortynninger. Fortynne ikke konsentrert prøver (fra 1:10 pre utvannet aksjer) i RPMI 1640 supplert med 0,2% mellom 20 og 1% BSA å etablere 1:500, 1:2500 og 1:12,500 fortynninger.
    6. Bruke eksempler på platen i triplicates og ruge over natten på 4 ° C.
    7. Neste dag, vask brønnene seks ganger og ruge på 37 ° C 4 h med 100 µL polyklonale kanin anti-p24 antistoff, utvannet 1:1000 i RPMI 1640, 10% FBS, 0,25% BSA og 2% normal mus serum (NMS).
    8. Vask seks ganger som ovenfor og ruge ved 37 ° C i 1 time med geit anti-kanin pepperrotperoksidase IgG fortynnet 1:10,000 i RPMI 1640 supplert med 5% normal geit serum, 2% NMS, 0,25% BSA og 0,01% mellom 20.
    9. Vaske platen, som ovenfor, og ruge med TMB peroxidase substrat ved romtemperatur i 15 min.
    10. Stoppe reaksjonen ved å legge til 100 µL av 1 N HCL. Måle eksempel absorbans ved 450 nm bruker absorbansen plate leseren.
  2. Måling av fluorescerende reporter intensitet
    1. FACS metode
      Merk: Omfanget av GFP signal uttømming i celler kan nøyaktig anslås ved å måle mener fluorescens intensiteten av transduced celler via flowcytometri. Se de siste papir 28 for FACS dataanalyse, presentasjon og tolkning. Protokollen er beskrevet som følger.
      1. Gjør en ti-fold føljetong fortynning av utarbeidelse (fra 10-1 til 10-5) av viral forberedelse i 1 x PBS.
      2. Frø ca 5 x 105 293T celler i hver brønn av en 6-vel plate i et siste volum 2 ml per brønn. Legg til 10 µL av hver viral fortynning til cellene og ruge celler ved 37 ° C i 48 timer.
      3. Høste celler for FACS analyse som følger: legge til 200 µL 0,05% Trypsin-EDTA løsning og ruge celler ved 37 ° C i 5 min. Legg 2 mL av en komplett DMEM media og oppsamling i 15 mL konisk rør.
      4. Pellets celler med sentrifugering 400 x g på 4 ° C, og resuspend pellet i 500 µL av kaldt 1 x PBS.
      5. For fiksering, legge til en lik mengde 4% formaldehyd løsning til denne suspensjon og ruge i 10 min ved romtemperatur.
      6. Pellets fast celler og resuspend i 1 mL 1 x PBS. Analysere GFP uttrykk med en FACS instrument, som beskrevet i Ortinski et al. 28 kort, bruk følgende formel til å bestemme virusets funksjonelle titer:
        Equation 1
        Merk: Her vs = antall GFP-positive celler telt. TN = totalt antall celler telt. N = antall celler transduced; V = volum (i µL) brukes for signaltransduksjon. For eksempel: Hvis 1 x 106 celler var transduced med 10 µL av virus, 2 x 104 celler var telt og 5 x 103 var GFP-positive, basert på ovenstående ligningen funksjonelle titer ville være:
        Equation 2
    2. Telle GFP-positive celler
      1. Beregne mangfoldet av infeksjon (MOI) brukes for signaltransduksjon. Teste et bredt utvalg av MOIs (1-10), med økende MOIs resulterer i en høyere signaltransduksjon effektivitet.
      2. Før transfection, frø en 6-vel plate med ca 3-4 x 105 celler per brønn. Når cellene når > 90% confluency (vanligvis innen 24 timer), transduce med renset virus på forhåndsbestemte MOIs.
      3. Inkuber plate på 37 ° C med 5% CO2 i en standard vev kultur, og skjermen celler med jevne mellomrom for 1-7 dager for endringer i GFP signal.
      4. Antall GFP-positive celler med fluorescerende mikroskop (PLAN 4 X mål, 0,1 N.A, 40 X forstørrelse) med et GFP filteret sett (eksitasjon bølgelengde-470 nm, utslipp bølgelengde-525 nm) benytter naiv (un transduced) celler sette befolkningen GFP-negative og positive celler.
      5. Beregne den endelige titer ved å justere fortynningsfaktoren og volumet ved hjelp av følgende formel:
        Equation 3
        Merk: Her, N = antall GFP-positive celler, D = fortynningsfaktoren, M = Forstørrelsesfaktoren (vanligvis 20 X), V = volum av viruset brukes for signaltransduksjon. For eksempel for 20 GFP-positive celler (N) telles på en fortynning av 10-4 (1:10, 000) i en 10 µL prøve (V) på 20 X forstørrelse (M) (D) vil resultere i en funksjonell titer (20 x 104) x (20) (10) x (100 *) = 4 x 108 TU/mL.
        (* justere til per mL)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering av knockout-effektiviteten av IDLV-CRISPR/Cas9 vektorer
Vi brukte GFP-uttrykke 293T celler som en modell for å validere effektiviteten av CRISPR/Cas9-mediert genet knockout. GFP + celler ble generert av signaltransduksjon av HEK-293T-celler med pLenti-GFP (vBK201a) på en MOI på 0,5 (figur 3b, "no-virus" panel). SgRNA-til-GFP/Cas9 alt-i-ett vektor kassetten ble pakket inn i IDLV eller ICLV partikler og produksjonen effektiviteten ble vurdert av p24 ELISA (se ovenfor, og figur 3a). Titers av vektorer som inneholder Sp1 bindende områder (følgende konsentrasjon) ble funnet for å være 1010 TU/mL. Vi deretter vurdert effektiviteten av GFP knockout med fluorescerende mikroskopi (figur 3b). Dette 5 x 105 GFP-uttrykke 293T celler var frø i en 6-vel plate og vi transduced dem 24 timer senere med IDLV - eller ICLV-CRISPR/Cas9 på MOIs 1 og 5 (figur 3b). Cellene ble inkubert for 24 timer, hvoretter kultur mediet ble erstattet og cellene var ruget for en ekstra 48t, før reseeding plater for påfølgende dager av eksperimentet.

I en fersk studie målte vi mener fluorescens intensiteten av GFP + celler transduced med ICLV/CRISPR eller IDLV/CRISPR komponenter via flyt cytometri28. Vi så sammenlignbare GFP-uttømming i både prøver 14 dager etter signaltransduksjon (pt) (2-4% signal uttømming), og nesten-identiske GFP uttømming 21 dager pt (> 99% signal uttømming)28. I samsvar med tidligere observasjoner, observerte vi en ~ fem ganger reduksjon i antall GFP-positive celler så tidlig som i 7 dager pt (Figur 3), med en nesten komplett signal uttømming observert av 14 dager pt (data ikke vist) etter signaltransduksjon med både ICLV - og IDLV-CRISPR/Cas9 systemer. Signaltap ble vurdert som forholdet mellom cellene som forble GFP-positive etter behandling og antall naive GFP-positive celler. Disse resultatene viser tydelig at CRISPR/Cas9 konstruksjoner av IDLVs er sammenlignbare med levert av sine integrere kolleger i å megle rask, robust og varig genet redigering i dele celler.

Figure 3
Figur 3: evaluering av viral titers. (a) av p24-ELISA-analysen. Titers for konsentrert Sp1-IDLV-CRISPR/Cas9 (svart bar) og Sp1-ICLV-CRISPR/Cas9 (hvite linjen) ble evaluert. Resultatene registreres i kopi tall per mL, der 1 ng p24-kneble = 1 x 104 virus partikler. Søylediagram dataene representerer gjennomsnittlig ± SD fra tre eksemplarer eksperimenter. (b) evaluering av CRISPR-mediert GFP-knockout effektivitet. Nedbryting av GFP signalet var forhold mellom ICLV-CRISPR/Cas9 - og IDLV-CRISPR/Cas9-transduced 293T GFP + celler på MOIs 1 og 5. Un transduced ("ingen virus" panel i figur) GFP-positive celler ble brukt som kontroller. Bildene ble anskaffet bruker fluorescens mikroskop på 40 X forstørrelse på 7 dager innlegget signaltransduksjon. ABBREV: RRE: Rev Response Element, EFS-NC: core-forlengelse faktor 1α promoter, ψ (psi): emballasje vektorelementene, hU6: menneskelig U6 promoter, Puro: Puromycin-motstand kassett, WPRE: hakkespett hepatitt Virus Posttranscriptional forskrifter Element, LTR: Lang-terminal gjenta. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende filen 1: plasmider Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

IDLVs har begynt å dukke opp som bilen av valget for i vivo gen-redigering, spesielt i sammenheng med genetiske sykdommer, på grunn hovedsak til lav risiko for mutagenese forbundet med disse vektorer sammenlignet integrere levering plattformer22 , 28. i gjeldende manuskriptet, vi søkte på detaljer protokollen tilknyttet produksjonen av forbedret alt-i-ett IDLV-CRISPR/Cas9 systemet som ble nylig utviklet i vårt laboratorium28.

Endringer i eksisterende plattformer
Med denne metoden var vi i stand til å generere IDLV-CRISPR/Cas9 og ICLV-CRISPR/Cas9 vektorer på titers i området fra 1 x 1010 TU/mL (figur 3a). Denne forbedringen i produksjonseffektivitet kan tilskrives tillegg av Sp1-binding området i alt-i-ett CRISPR/Cas9 vektor kassett. Vi nylig rapportert at inkludering av Sp1 resulterer i en ~2.5-fold økning i emballasje effektivitet av IDLV - og ICLV-CRISPR/Cas9 vektorer og ~ 7-fold økning i de totale funksjonelle titers. Disse resultatene er enige med tidligere arbeid fra ulike grupper utheving Sp1 som en viktig regulator av vill-type HIV-130,31,32,33,34,35 .

Avgjørende skritt og feilsøking
Som påpekt ovenfor, Sp1-IDLVs med var CRISPR/Cas9 effekter av transgener generere titers i 1 x 1010 TU/mL per ~ 5 x 107 produsent celler. Titers lavere enn dette kan være indikasjon på feil i produksjonsprosessen, da følgende viktige punkter bør vurderes for titer forbedring: 1) anbefales at produsent cellene fortrinnsvis være av lav passasje, erstatning etter ≥15 passasjer og/eller når lavere vekst er observert. 2) valg av cellen media komponentene er viktig når det gjelder effektivitet. For eksempel, i stedet for vanlige fosterets bovin serum finner vi at bruken av kosmisk kalv Serum konsekvent bedre cellevekst og viral produksjon, samtidig kostnadseffektiv samtidig. 3) produksjon egnethet av de ulike HEK linjene bør vurderes nøye. For eksempel vi fant en ~ tredelt forskjellen i viral produksjonsytelse 293T celler og 293-FT (se Tabell for materiale) celler (data ikke vist). 4) det anbefales at cellene være transfekterte når de er omtrent 70-80% confluent, med lavere celle tettheter resulterer i tidlig celledød på grunn av viral toksisitet, og høyere tettheter resulterer i en markant nedgang i produksjonen effektiviteten. Som en tommelfingerregel foreslår vi sto for en celle tetthet der celler gjennomgå en ekstra runde av celledeling etter hva. 5) endelig er effektiviteten av hva svært avhengig av pH i 2 x BBS, som holdes i nøyaktig 6.95 for ideelle transfection. Det er derfor sterkt anbefalt at hver ny gruppe med 2 x BBS kontrolleres i pilot-hva skala.

Vector håndtering og sikkerhet
Det er flere viktige sikkerhetshensyn i produksjonen av IDLV og ICLV vektorer med denne protokollen. Først krever arbeider med lentiviruses Bio-sikkerhet nivå II forvaring. Til tross for sikkerhetsfunksjoner by av synd vektorer, er gjenværende transcriptional aktivitet fra synd vektorer rapportert36. Videre tidligere arbeid har vist at IDLV - og ICLV-genomer kan være produktivt reddet av HIV-127. Derfor er det sterkt anbefalt at utføres replikering kompetanse analyser (RCA), spesielt når konsentrert lentiviruses blir brukt37. For sikkerhetsprosedyrer angående håndtering lentiviral vektor forberedelser, se biosikkerhet mikrobiologisk og biomedisinsk laboratorier, 4th edition, utgitt av Centers for Disease Control (CDC), hvilke kan grunnlegge online38. På samme notatet, kan tredje generasjon emballasje systemer39 med forbedret biosikkerhet funksjoner brukes til å IDLVs og ICLVs, men med lavere effektivitet enn andre generasjon systemet.

Betydning og fremtidige retninger
Overall, produksjon protokollen for IDLVs for CRISPR/Cas9 - mediert genet redigering beskrevet her representerer den første vurderingen av effektiviteten av dette systemet i hurtig-dele celler. Bruker GFP-positive HEK-293T celler, viste vi at Sp1-CRISPR/Cas9 levert av IDLVs kan effektivt og raskt redigere GFP i disse cellene, med lignende kinetics som ICLVs. Disse observasjonene er bredt samsvar med resultatene fra tidligere arbeid med ribonucleoprotein komplekser (Cas9 RNPs) for genet redigering gjennom ikke-viral transfection metoder. Denne romanen perrongen fremme beriker voksende verktøykassen for levering av gen-redigering komponenter og andre molekylære cargos celler.

Som omtalt tidligere, til tross for framskritt i utviklingen av lentiviral-baserte gen levering systemer, er det få til ingen alternativer for plattform som tillater bærekraftig produksjon av høy-titer viral vektorer for rask forbigående og målrettet genet manipulasjon. Gjennom inkorporering av bindende motiver for en svært uttrykt transkripsjon faktor i transgene uttrykk kassetten, kunne vi samtidig løse flere av problemene. Dette enkle, men avgjørende manipulasjon åpner opp en rekke muligheter for å utvikle lignende levering plattformer. Det ville være spesielt nyttig å teste om transgene uttrykk kan styrkes gjennom enten tillegg mange eksemplarer av samme binding motivet eller ved multipleksing Sp1 motivet med bindende nettsteder for andre transkripsjonsfaktorer. Med slike verktøy til disposisjon, er det fristende å spekulere uttrykket fra relativt svake vev-spesifikke arrangører, slik som for menneskelig Synapsin jeg (hSyn) og mus kalsium/calmodulin-avhengige protein kinase II (CaMKII), kan være betydelig forbedret både i vitro og i vivo.

Mens denne studien var begrenset til testing genet knockdown evnen til IDLV-levert CRISPR/Cas9, i prinsippet, ville allsidighet av vårt system være mottakelig for mangfoldig gen-redigering programmer, f.eks stole på det katalytisk inaktiv dCas940. Til slutt, kombinert med mindre endonucleases, for eksempel SaCas941 og Cpf142, plattformen beskrevet i denne studien kan vedtas mot etablering høyeffektiv AAV basert gen-levering systemer i en relativt kort tidsperiode, som vil gi den ekstra fordelen av lave immunogenisitet sammenlignet lentiviral vektorer. Unødvendig å si, vil disse være et positivt skritt mot utviklingen av romanen, effektiv, og klinisk trygt viral vektorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Patent USC-499-P (1175) ble anlagt av University of South Carolina i forhold til arbeidet som er beskrevet i dette manuskriptet.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke avdeling av Surgery, Duke University School of Medicine og Dekanus kontor for grunnleggende vitenskap, Duke University. Vi takker også medlemmer av Duke Viral vektor kjernen for kommentarer på manuskriptet. Plasmider pLenti CRISPRv2 var gave fra Feng Zhang (bred Institute). LV-pakkesystemet inkludert plasmider psPAX2, var VSV-G, pMD2.G og pRSV-Rev en slags gave fra Didier Trono (EPFL, Sveits). Økonomisk støtte til dette arbeidet ble levert av universitetet av South Carolina School Of Medicine, gi RDF18080-E202 (B.K).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
xMark Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
BD FACS Becton Dickinson 338960
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor Beckman Coulter 369650
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
High-binding 96-well plates Corning 3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Tissue culture pipettes, 5 mL Corning 4487
Tissue culture pipettes, 10 mL Corning 4488
Tissue culture pipettes, 25 mL Corning 4489
Hemacytometer with cover slips Cole-Parmer UX-79001-00
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
DMEM, high glucose media Gibco 11965
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) Sigma Aldrich B9879 - BES
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
pRSV-Rev Addgene 12253
lentiCRISPR v2 Addgene 52961
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsrGI New England Biolabs R0575S
BsmBI New England Biolabs R0580S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  2. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).
  3. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  4. Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).
  5. Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
  6. Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146 (2016).
  7. Wang, W., et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9 (12), e115987 (2014).
  8. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv Genet. 87, 125-197 (2014).
  9. Lebbink, R. J., et al. A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape. Sci Rep. 7, 41968 (2017).
  10. Xu, L., et al. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. , (2017).
  11. Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).
  12. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), e147 (2014).
  13. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).
  14. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  15. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  16. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
  17. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  18. Schaefer, K. A., et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).
  19. Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  21. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  22. Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).
  23. Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors. Virol J. 3, 27 (2006).
  24. Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
  25. Hoban, M. D., et al. Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).
  26. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  27. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  28. Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).
  29. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).
  30. Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).
  31. Gomez-Gonzalo, M., et al. The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter. J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).
  32. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  33. Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength. J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).
  34. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  35. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  36. Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors. Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).
  37. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations. , Available from: https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf (2017).
  38. CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2017).
  39. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  40. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  41. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  42. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).

Tags

Genetikk problemet 130 Viral-mediert genoverføring HEK-293T celler integrase dårlig lentiviral vektorer CRISPR/Cas9 gene redigering system p24 ELISA sukrose-gradert ultracentrifugation FACS
En protokoll for produksjon av Integrase dårlig Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-mediert Gene Knockout i dele celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A… More

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter