Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Протокол для производства интеграза недостаточным лентивирусные векторы для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной нокаут генов в делящихся клетках

doi: 10.3791/56915 Published: December 12, 2017

Summary

Мы описываем Производственная стратегия интеграза недостаточным лентивирусные векторы (IDLVs) как транспортные средства для доставки ТРИФОСФАТЫ/Cas9 клеток. С возможностью выступить посредником, быстрый и надежный гена редактирования в ячейках IDLVs представляют более безопасным и столь же эффективным вектор платформы для доставки генов по сравнению с интеграза компетентных векторов.

Abstract

Лентивирусные векторы являются идеальным выбором для доставки генов редактирования компонентов клетки из-за их способности для стабильно преобразователя широкий диапазон ячеек и посредническая высокий уровень экспрессии генов. Однако их способность интегрироваться в геном клетки принимающей повышает риск инсерционному мутагенность и таким образом поднимает проблемы безопасности и ограничивает их использование в клинических условиях. Кроме того постоянное выражение гена редактирования компонентов выступил эти интеграции компетентным лентивирусные векторы (ICLVs) увеличивает вероятность прослушивающем гена ориентации. В качестве альтернативы новое поколение интеграза недостаточным лентивирусные векторы (IDLVs) был разработан, рассматриваются многие из этих проблем. Здесь протокол производства новых и усовершенствованных IDLV платформы для редактирования ТРИФОСФАТЫ опосредованной гена и список шаги занимающихся очищения и концентрации таких векторов описан и их электромеханической эффективности ген редактирования с помощью ГЭС 293T был продемонстрирован клетки. Этот протокол легко масштабируема и может использоваться для создания высокого титра IDLVs, которые способны преобразователя клетки в пробирке и в естественных условиях. Кроме того этот протокол может быть легко приспособлено для производства ICLVs.

Introduction

Точное гена редактирования является краеугольным камнем основные биомедицинских достижений, которые предполагают разработку новых стратегий для решения генетических заболеваний. На переднем крае технологий ген редактирования является метод, опираясь на использование cЕврошифер regularly -яnterspaced short palindromic repeats (ТРИФОСФАТЫ) / Cas9 система, которая была первоначально определена как компонент бактериальной иммунитет против вторжения вирусного генетического материала (Обзор ссылки1,2). Основным преимуществом системы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 над другими инструменты для редактирования гена, таких как Цинк пальцевый nucleases (ZFNs) и транскрипции эффекторных активатор как nucleases (Таленс) (обзор в ссылку3), является относительная простота плазмида дизайн и Строительство ТРИФОСФАТЫ компонентов — это функция, которая питание расширения гена редактирования из нескольких специализированных лабораторий для гораздо более широкого исследовательского сообщества. Кроме того Простота программирования ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и его потенциала для распознавания цели мультиплексном далее подпитывают его популярность в качестве экономически эффективной и простой в использовании технологии. Среди различных методов, доступных для исследователей, чтобы доставить такой ген редактирования компонентов клетки вирусных векторов на сегодняшний день остаются наиболее популярной и эффективной системы.

Лентивирусные векторы (ПЗ) появились как транспортное средство выбора для доставки компонентов ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы в естественных условиях для различных приложений4,5,6,7. Несколько ключевых функций делают LVs популярным выбором для этого процесса, включая их способность инфицировать деления и не деления клетки, низкой иммуногенностью и минимальным сотовой токсичности (обзор в ссылка8). В результате был нанят LV-опосредованной генная терапия в лечении инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ-1, ГВ и ВПГ-1, а также в коррекции дефектов, лежащих в основе человеческого наследственных заболеваний, таких, как кистозный фиброз и нео сосудистая дегенерация желтого пятна 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Кроме того, LVs эффективно изменен для выполнения мультиплекс гена редактирования на собственный геномной локусов, используя один вектор системы12.

Однако присущие собственности LVs интегрировать в хост геномов может быть мутагенных и часто препятствует их полезность как средства доставки трансген, особенно в клинических условиях. Кроме того поскольку стабильно интегрированных LVs выразить их трансгенов на устойчиво высоком уровне, эта система плохо подходит для доставки генов редактирования компонентов, таких как ТРИФОСФАТЫ/Cas9; Сверхэкспрессия Cas9-руководство РНК (gRNA) и похожие белки, такие как ZFNs, связаны с повышенным уровнем пробить эффектов, которые включают в себя нежелательные мутации13,14,,1516 , 17 и потенциально может повысить цитотоксичность18. Таким образом для достижения точного редактирования гена с минимальными пробить эффекты, важно для разработки систем, которые позволяют для переходных экспрессии гена редактирования компонентов.

В последние годы был разработан целый ряд платформ доставки выразить временно ТРИФОСФАТЫ/Cas9 в клетки16,-19,20,21 (обзор в ссылку22). К ним относятся методы, которые полагаются на непосредственно представляя очищенный Cas9 вместе с соответствующим руководством РНК в клетки, который был показан более эффективными на целевых генов редактирования по сравнению с плазмида опосредованной трансфекции16. Исследования показали, что рибонуклеопротеида (RNP) комплексов, состоящих из руководство РНК/Cas9 частиц быстро перевернулся после посреднических расщепления ДНК на их цели, предполагая, что краткосрочные выражение этих компонентов является достаточной для достижения надежные ген редактирования16. Предположительно,-интеграция вирусный вектор платформ, таких как аденоассоциированный вирусных векторов (AAVs) может обеспечить жизнеспособную альтернативу доставить ген редактирования техники в клетки. К сожалению, Аав capsids обладают значительно ниже возможности упаковки чем LVs (< 5kb), которая серьезно ограничивает их способность упаковки многокомпонентных ТРИФОСФАТЫ инструментарий в пределах одного вектора (обзор в ссылка8). Стоит отметить, что для увеличения лентивирусные титры было показано добавление соединений, которые подавляют гистона комплексы (например, натрия бутират23) или препятствуют клеточного цикла (например, кофеин24). Несмотря на недавний прогресс переходных выражение систем, разработанных до настоящего времени по-прежнему препятствует ряд недостатков, например ниже эффективности производства, которые ведут к снижение вирусной титры и низкой электромеханической эффективности вирусов, порожденных через такие подходы к25.

Интеграза недостаточным лентивирусные векторы (IDLVs) представляют собой основные улучшения в развитии средств доставки генов, как они сочетают в себе возможность упаковки LVs с дополнительным преимуществом AAV-как episomal содержание в клетках. Эти функции помогают IDLVs значительной степени обойти основные вопросы, связанные с интеграции векторы, vis-à-vis непрерывной гиперэкспрессия потенциально генотоксичных элементов и интеграции опосредованной мутагенность. Ранее было показано, что IDLVs может быть успешно изменен для повышения episomal ген выражение26,27. Что касается IDLV-опосредованной ТРИФОСФАТЫ/Cas9 доставки низкие производственные титры и Нижняя выражение episome нести геномов относительно интеграза владеют лентивирусные систем ограничивает их полезность как средства bona fide для доставки изменения генома Трансгенные конструкции. Мы недавно продемонстрировали, что трансген выражение и вирусных титры, связанные с производством IDLV значительно усиливается включение привязки сайтов для транскрипционного фактора Sp1 в течение вирусных выражение кассеты28. Изменение IDLVs энергично поддерживает ТРИФОСФАТЫ опосредованной гена, редактирования в пробирке (в клетках ГЭС 293T) и в естественных условиях (в постсоветском митотическая мозга, нейроны), а заставить минимальный пробить мутации, по сравнению с соответствующим ICLV-опосредованной 28систем. В целом мы разработали роман, компактный, все-в-одном инструментарий ТРИФОСФАТЫ осуществляется на платформе IDLV и изложил различные преимущества использования такого доставки транспортного средства для расширения гена редактирования.

Здесь протокол производства системы IDLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 описано, включая различные этапы в Ассамблее, очистки, концентрации и титрование IDLVs, а также стратегии для проверки редактирования гена эффективность этих векторов. Этот протокол легко масштабируется для удовлетворения потребностей различных следователей и предназначен для успешного создания LV векторов с титры в диапазоне от 1 x 1010 преобразователя единиц (ту) / мл. Векторы, порожденных через этот протокол может использоваться эффективно заразить несколько различных типов клеток, включая сложные передают эмбриональных стволовых клеток, гемопоэтические клетки (Т-лимфоцитов и макрофагов) и культивировали и в vivo- вводят нейронов. Кроме того протокол одинаково хорошо подходит для производства интеграза компетентных лентивирусные векторы в аналогичных количествах.

Figure 1
Рисунок 1: Упаковка IDLV. () схема дикого типа интеграза белка (b) изменение плазмида была взята из psPAX2 (см. методы, плазмида строительство для подробной информации). Представитель агарозы гель изображение клонов, экранированный мутировавших интеграза клонов. Пищеварение с EcoRV и SphI были проанализированы образцы ДНК, подготовлен с использованием стандартных плазмида ДНК изоляции Мини-кит. Правильно переварить клон (число 5, пунктирной красной рамкой) был проверен последовательности прямых (Сэнгер) для замены D64E в INT. Кассета интеграза недостаточным упаковки был назван pBK43. (c) схема протокола переходных трансфекции работу для создания IDLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 векторов, показываю что transfected клеток 293T с VSV-G, упаковки и трансген кассеты (Sp1-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 все-в-одном плазмида). Вирусные частицы, которые бутон из клеточной мембраны содержат полнометражного РНК вектора (выразил от трансген кассеты). Второе поколение IDLV-упаковочные системы была использована, которая включает в себя регуляторных белков ТАТ и преподобный Rev выражение дополнить с отдельной кассеты (RSV-REV-плазмиды). Abbrev: вирус повтор, VSV-G, везикулярного стоматита LTR-Лонг терминал G-белок, промоутер pCMV цитомегаловирус; Промоутер саркомы Рауса вирус (RSV); RRE-(Rev ответ элемент). Другие нормативные элементы на кассету выражения включают Sp1-привязки сайтов, Rev ответ элемента (RRE), сурок гепатитом вирус посттранскрипционного регулирования элемент (WPRE), удлинение основной фактор 1α промоутер (EFS-NC), упаковка вектор элемент ψ (psi), человека промоутер цитомегаловирус (hCMV) и человека U6 промоутер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. выращивание ГЭС 293T и заполнения ячейки для Transfection

Примечание: Человеческих эмбриональных почки 293T клетки (ГЭС 293T), выращенных в среде DMEM, высокие глюкоза СМИ с 10% бычьего теленка сыворотки, дополненная железа и роста промоутеров и 1 x антибиотик противогрибковое решение (100 x решение содержит 10 000 единиц пенициллин 10 мг стрептомицина и 25 амфотерицин B мкг / мл). Средства массовой информации также дополняется с 1 x пируват натрия, 1 x non-essential аминокислота микс и 2 мм L-глютамин (дипептид запасов 200 мм L-аланил L-глютамина в 0,85% NaCl). Клетки культивировали в 100 мм культуры ткани пластины (приблизительный рост поверхности площадью 55 см²). Под выращивание соотношение 1:10 используется с югу культивирования каждые 2-3 дня. Трипсин-ЭДТА 0,05% используется для диссоциации клеток между проходы. Для обеспечения согласованности между эксперименты, мы рекомендуем тестирования телячьей сыворотки при переключении на другой много/партии и контролировать любые изменения в рост клеток, эффективность трансфекции и векторные производства.

  1. Начните новую культуру с помощью низкий проход клетки (рекомендуется не использовать клетки после прохода 15 или если рост замедляется), посев культуры ткани 10 см пластины. Использование DMEM дополнена 10% сыворотки для роста клеток. Рост клеток при 37 ° C с 5% CO2 в инкубаторе стандартной культуры ткани. Используйте стандартный Горяева для подсчета клеток для всех последующих шагов.
  2. После клетки достигает 90-95% вырожденная роста, повторное заполнение в 15 см пластины культуры тканей (ниже шаги 1.3 - 1.5).
  3. Повторное заполнение, аспирационная СМИ от вырожденная пластины и осторожно промыть стерильной ПБС. Инкубировать клетки с 2 мл реагента диссоциации (например, трипсин-ЭДТА) при 37 ° C на 3-5 мин добавить 8 мл средства массовой информации, содержащих сыворотки инактивировать диссоциации реагента и нарезанных 10 - 15 раз с 10 мл Серологические Пипетки для создания отдельной ячейки подвеска. Ресуспензируйте клеток в культуре СМИ для получения плотность клеток 4 х 106 клеток/мл.
  4. Содействовать присоединению к субстрату, предварительно покройте 15 см пластины с 0,2% желатина, добавление 8 мл желатина на пластину. Равномерно по всей поверхности пластины, инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин и отбором жидкости.
  5. Довести общий объем каждой пластины до 25 мл с теплой (37 ° C) ГЭС-293 T СМИ (см. Примечание в шаг 1) и семян пластины, добавив 2,5 мл клеток (всего ~ 1 x 107 клеток/плита). Инкубируйте пластины при 37 ° C с 5% CO2 на ночь, или до 70-80% confluency.
    Примечание: До шести 15 см пластины может использоваться для производства. Отрегулируйте громкость СМИ на пластину на ~ 20-22 мл при использовании более четырех пластин (см. шаг 5 для обоснование протокола).

2. transfecting ГЭС 293T клеток, используя протокол на основе фосфата кальция

  1. Трансфекция реагентов
    1. Готовить 2 x BES-амортизированное решение BBS (50 мм BES, 280 мм NaCl, 1,5 мм Na2HPO4), объединить 16.36 г NaCl, 10.65 г ПВЛ (N, N-бис (2-гидроксиэтилкрахмала) -2-амино-ethanesulfonic кислота) и 0,21 g Na2HPO4. Добавьте дистиллированную двойной H2O (dd-H2O) до 900 мл. Распустить, титровать до pH 6.95 с 1 M NaOH и довести объем до 1 л фильтр через 0,22 мкм фильтр. Хранить при температуре от-20 ° C.
    2. Подготовьте CaCl 1 М2. Фильтр решение через фильтр 0,22 мкм. Хранить при 4 ° C.
  2. Наблюдать за пластины, которые были посеяны в предыдущий день. Клетки будут готовы к трансфекции, как только они достигают 70-80% confluency.
  3. Аспирационная старых СМИ из пластин и аккуратно добавить свежеприготовленные СМИ без сыворотки.
    Примечание: Смотрите Дополнительный файл 1-плазмиды для подробной информации о выбранной плазмидов и их подготовки.
  4. Подготовьте плазмида микс aliquoting четыре плазмид в 15 мл Конические трубки. Для приготовления одного 15-см блюдо, используйте 37,5 мкг ТРИФОСФАТЫ/Cas9-передача вектор (pBK198 или pBK189), 25 мкг pBK43 (psPAX2-D64E), 12,5 мкг pMD2.G и 6,25 мкг pREV (рис. 1С).
  5. Добавьте 312.5 мкл 1M CaCl2 плазмида микс. Для этого добавьте до 1,25 мл стерильного dd-H20.
  6. Медленно (каплям) добавить 1,25 мл раствора 2 x BBS во время vortexing смеси. Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
  7. Добавьте смесь трансфекции каплям на каждой пластине 15-см (2,5 мл на пластине). Вихревой мягко пластины и инкубировать при 37 ° C с 5% CO2 на 2-3 ч. После этого добавить 2,5 мл (10%) сыворотки на пластину и продолжить инкубации на ночь (12-18 ч).
    Примечание: Некоторые лаборатории используют 3% CO2 инкубаторы для стабилизации рН средства массовой информации. Однако мы не наблюдаем никакой разницы в эффективности трансфекции между 3% и 5% CO2. Кроме того размер4 осаждает Капо имеет решающее значение для эффективности трансфекции; Трансфекция смеси должно быть ясно до его добавления на клетки. Если смесь становится мутным во время инкубации, подготовьте свежие 2 x BBS (рН = 6.95).

Figure 2
Рисунок 2: концентрация вирусных частиц, с использованием градиента протокола двойной сахароза. Вирусных частиц, собранных из супернатант (SN) загружаются на градиент градиент сахарозы. 70%, 60%, 30% и 20% сахарозы решения используются для создания градиента. После центрифугирования частиц, собранных от 30-60% сахарозы фракций далее загружаются на подушке 20% сахарозы и химически осажденный. Окончательный гранулы, содержащие очищенных вирусных частиц высокомобильна в однократном ПБС для дальнейшего использования (см. текст для получения более подробной информации). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. день после Transfection

  1. Наблюдать за клетки, чтобы обеспечить, что они приближаются к 100% confluency на данный момент практически нет смерти клетки. Замените СМИ, добавив 25 мл свежего DMEM + 10% сыворотки для каждой пластины. Далее, инкубации при 37 ° C с 5% CO2 для дополнительных 48 ч.
    Примечание: Регулировка громкости СМИ в шаг 3.1 при использовании более чем шести пластин 15 см (см. шаг 5.2, обратите внимание).

4. заготовка вирус

  1. Тщательно Соберите супернатант от всех плит культуры ткани, содержащие transfected клеток с использованием 10 мл стерильной пипеткой культуры ткани и бассейн в 50 мл пробирок.
  2. Снимите подвеска центрифугированием на 400-450 x g 10 мин с помощью настольной центрифуги. Фильтр супернатант через блок вакуумного фильтра 0.45 мкм.
    Примечание: Отфильтрованных супернатант может быть хранимой на 4 ° C до 4 дней, прежде чем продолжить с концентрацией, или aliquoted и хранятся при температуре-80 ° C. Ожидаемые титры IDLV-Sp1-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 (не сконцентрированные) вирусных препаратов должно быть ~ 2 x 107 ту/мл (см. шаг 6 для определения титра антител). Однако не подвергая вирусных препаратов несколько циклов замораживания оттаивания, как каждый раунд замораживания и оттаивания приводит к потере 10-20% в функциональных титры.

5. концентрация вирусных частиц по Ultracentrifugation

Примечание: Мы используем двойные сахароза метод очистки, которая включает два этапа: сахароза градиента шаг и сахароза подушки шаг (рис. 2).

  1. Загрузить трубы конической ultracentrifugation в следующем порядке для создания градиента сахарозы: 0,5 мл 70%-ая сахароза (растворяют ПБС), 0,5 мл 60% сахарозы (растворяют в среде DMEM), 1 мл 30%-ая сахароза (растворяют в среде DMEM) и 2 мл 20%-ая сахароза (растворяют в однократном ПБС).
  2. Добавьте вирус содержащих супернатант тщательно градиента. Как общий объем супернатант из четырех 15 см пластины 100 мл, используйте шесть ultracentrifugation трубы за спин для обработки полного объема супернатанта вируса.
    1. Каждая трубка ultracentrifugation, для этот шаг имеет объём до 30 мл (включая объем сахарозы), распространение вирусных супернатант поровну между трубы, оставляя по крайней мере 10% headspace для предотвращения утечки.
    2. Отрегулируйте громкость культуры на ~ 20-22 мл на пластине при использовании более четырех 15 см пластины для каждого эксперимента, так что окончательный объем пула вирусных супернатант легко могут быть размещены в шести ultracentrifugation трубы.
    3. Ultracentrifugation заполнения трубки для по меньшей мере три четверти их общий объём, в противном случае поломки трубок может произойти во время центрифугирования, что приводит к потере возможности выборки и/или оборудование повреждения.
  3. Баланс трубки с 1 x PBS и центрифуги образцы на 70000 x g на 2 ч в 17 ° C (см. Таблицу материалы для ротора детали).
    Примечание: Чтобы предотвратить срыв сахарозы слоя при разгоне, установите ультрацентрифуга ускорить медленно ротора до 200 об/мин в течение первых 3 мин спина. Аналогично установите ультрацентрифуга замедляться медленно ротора от 200 об/мин до 0 rpm более 3 мин в конце спина.
  4. Тщательно Соберите 30-60% сахарозы фракций в чистой трубки (рис. 2). Добавьте холодной 1 x PBS в пуле фракций и довести объем до 100 мл; Смешайте закупорить вверх и вниз несколько раз.
  5. Перейти к шагу подушке сахарозы, тщательно расслоение вирусной подготовки на подушке сахарозы. Для этого добавьте 4 мл 20%-ая сахароза (в однократном ПБС) на трубу, следуют ~ 20-25 мл вирусный раствора в трубку. Если трубы не менее чем три четверти полный, пополнить с стерильных ПБС.
  6. Тщательно сбалансировать и Центрифугуйте образцы на 70000 x g на 2 ч в 17 ° C, как раньше. Слить супернатант и разрешить оставшиеся жидкость слить, инвертирование трубы на бумажные полотенца.
  7. Аспирационная оставшиеся капли для того, чтобы удалить все жидкости из гранул. На этом шаге вирус содержащие гранул должно быть едва видна, как небольшие полупрозрачные пятна.
  8. Ресуспензируйте гранулы путем добавления первой трубки и тщательно закупорить подвеска, впоследствии передаче подвеска на следующий трубу и смешивания как и прежде, продолжается до тех пор, пока все гранулы высокомобильна 70 мкл ПБС.
  9. Промойте трубы с дополнительной 50 мкл холодной 1 x PBS и смеси как раньше. Убедитесь, что общий объем окончательное приостановление является ~ 120 мкл и появляется немного Млечный; очистить его центрифугированием на 10000 x g 30 s на настольные microcentrifuge.
  10. Передать трубку свежие отцентрифугировать супернатанта, сделать 10 мкл аликвоты и хранить их при температуре-80 ° C.
    Примечание: Избегайте выполнения циклов повторных замораживания оттаивания на лентивирусные образцов. За исключением тех случаев, когда требуется центрифугирования усилия должны сделать выполнять оставшиеся шаги в капюшоны тканевые культуры, или места для номера культуры ткани, используя соответствующие биобезопасности мер (см. обсуждение).

6. Оценка вирусной титры

  1. p24 -фермент-связанный метод иммуноферментного анализа (ИФА)
    Примечание: Assay осуществляется с использованием высокой привязки 96-луночных пластины как инструкции программы вакцины против СПИДа низ для ВИЧ-1 p24 антигена Assay захвата комплект (см. Таблицу материалы) с изменениями №29.
    1. Следующий день, Промыть лунки три раза с 200 мкл 0,05% 20 анимации в холодных PBS (PBS-T раствор). Слой пластины с 100 мкл антител моноклональных анти p24 при разбавлении 1: 1500 в однократном ПБС и инкубировать на ночь при 4 ° C.
    2. Чтобы исключить неспецифический привязки, блокировать пластину с 200 мкл 1% BSA в PBS; Вымойте три раза с 200 мкл 0,05% 20 анимации в холодных PBS (PBS-T решения) для по крайней мере 1 ч при комнатной температуре.
    3. Подготовить образцы: Для подготовки концентрированных вектор, разбавьте 1 мкл пример 100 раз, добавляя 89 мкл dd-H20 и 10 мкл X-100 Тритон (конечная концентрация 10%). Для не сконцентрированные препаратов Подготовьте десятикратный разреженных образцы (мкл 80 ПД H20 и 10 мкл X-100 Тритон (конечная концентрация 10%) до 10 мкл пример).
      Примечание: Образцы можно хранить при-20 ° C на этом этапе для длительного периода времени для последующего использования.
    4. Подготовка стандартов ВИЧ-1, применяя 2 раза серийный разрежения (с начальной концентрации 5 нг/мл).
    5. Разбавьте концентрированный образцов (от 1: 100 предварительно разбавленного запасов) в RPMI 1640 с 0,2% 20 анимации и 1% BSA установить 1:10 000, 1:50 000 и растительного разведениях. Разбавлять-сконцентрированные образцы (от 1:10 предварительно разбавленный запасов) в RPMI 1640 с 0,2% 20 анимации и 1% BSA установить разведения 1: 500, 1:2500 и 1:12,500.
    6. Применять образцы на плите в triplicates и инкубировать на ночь при 4 ° C.
    7. На следующий день, Промыть лунки шесть раз и инкубировать при 37 ° C для 4 h с 100 мкл кролика polyclonal антитела анти p24 , разбавленных 1: 1000 в RPMI 1640, 10% FBS, BSA 0,25% и 2% нормальной мыши сыворотки (NMS).
    8. Вымойте шесть раз как выше и инкубировать при 37 ° C за 1 час с Коза анти кролик пероксидаза мэм IgG разбавляют в RPMI 1640 с 5% нормальной козьего сыворотки, 2% NMS, 0,25% BSA и 0,01% 20 анимации.
    9. Вымойте тарелку, как указано выше и проинкубируйте с ТМБ пероксидазы субстрата при комнатной температуре в течение 15 мин.
    10. Остановите реакции, добавив 100 мкл 1 N HCL. Измерение оптической плотности образца на 450 Нм, с помощью оптической плотности плиты читателя.
  2. Измерение интенсивности флуоресцентные репортер
    1. СУИМ метод
      Примечание: Степень GFP сигнал истощения в клетках может быть точно оценена путем измерения интенсивности среднее флуоресценции клеток transduced через проточной цитометрии. Пожалуйста, обратитесь в последние бумаги в 28 для анализа данных СУИМ, представления и интерпретации. Протокол описана следующим образом.
      1. Сделайте десятикратный серийный разрежения подготовки (от 10-1 -10-5) вирусной подготовки в однократном ПБС.
      2. Семя приблизительно 5 x 105 293T клеток в каждой скважине 6-ну плиты в окончательном объеме 2 мл на хорошо. 10 мкл каждого вирусный разрежения в клетки и инкубации клеток при 37 ° C в течение 48 часов.
      3. Урожай клетки для анализа СУИМ следующим: 200 мкл 0,05% раствор трипсина-ЭДТА и инкубации клеток при 37 ° C за 5 минут добавить 2 мл полный DMEM СМИ и собирать образцы в 15 мл конические трубы.
      4. Пелле клетки центрифугированием на 400 x g при 4 ° C и Ресуспензируйте гранулы в 500 мкл холодной ПБС.
      5. Для фиксации добавить равным объемом 4% раствора формальдегида в этом подвеска и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
      6. Пелле фиксированные клетки и Ресуспензируйте в 1 мл ПБС. Анализировать экспрессия гена GFP с помощью инструмента СУИМ, как описано в Ортинский и др. 28 кратко, используйте следующую формулу для определения функциональных титр вируса:
        Equation 1
        Примечание: Здесь Tg = количество GFP-положительных клеток учитываются; TN = общее количество клеток учитываются; N = общее число клеток преобразованы; V = объем (в мкл) используется для трансдукции. Например: если 1 x 106 клеток были преобразованы с 10 мкл вируса, 2 x 104 клетки были подсчитанные и 5 x 10-3 были GFP-позитивных, основанный на функциональные титр будет выше уравнения:
        Equation 2
    2. Подсчет GFP-положительных клеток
      1. Вычислите кратность инфекции (МВД) используется для трансдукции. Тестировать широкий диапазон MOIs (1-10), с увеличением MOIs, что приводит к более высокой эффективности трансдукции.
      2. До трансфекции семян 6-ну плита с приблизительно 3-4 x 105 клеток на хорошо. После того, как клетки достичь > 90% confluency (обычно в течение 24 ч), передают с очищенный вирус на заранее MOIs.
      3. Инкубируйте 1-7 дней для изменения сигнала GFP пластины при 37 ° C с 5% CO2 в стандартной культуры ткани и клетки монитор на регулярной основе.
      4. Подсчитать количество GFP-положительных клеток с флуоресцентный микроскоп (план 4 X цель, 0.1 Н.А, 40 кратном) устанавливается с набором фильтров GFP (возбуждения волны-470 Нм, выбросов волны-525 Нм), используя наивный (ООН transduced) клетки для населения GFP-негативных и позитивных клеток.
      5. Оцените окончательный титр, регулируя коэффициент разрежения и тома, с помощью следующей формулы:
        Equation 3
        Примечание: Здесь, N = количество GFP-положительных клеток, D = коэффициент разрежения, M = кратность (обычно 20 X), V = объем вирус используется для трансдукции. Например, для 20 GFP-положительных клеток (N) учитываются при разбавлении 10-4 (1:10, 000) в 10 мкл пример (V) 20 X увеличение (M) (D) приведет к функциональной титр (20 x 104) x (20) x (10) x (100 *) = 4 x 108 ту/мл.
        (* приспособиться к мл)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Проверка эффективности плей IDLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 векторов
Мы использовали GFP-выражая 293T клетки как модель для проверки эффективности ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной Нокаут гена. GFP + клетки были порожденных трансдукции ГЭС 293T клеток с pLenti-GFP (vBK201a) в MOI 0.5 (Рисунок 3b, группа «без вирус»). Кассета sgRNA-GFP/Cas9 все-в-один вектор был упакован в IDLV или ICLV частиц и эффективности производства был оценен p24 ELISA (см. выше; и Рисунок 3А). Титры векторов, содержащие Sp1-привязки сайтов (следующие концентрации) были найдены в диапазоне от 1010 ту/мл. Затем мы провели оценку эффективности GFP нокаут с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 3b). С этой целью 5 x 105 GFP-выражая 293T клетки были посеяны в тарелку 6-Ну и мы преобразованы им 24 h позже с IDLV - или ICLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 в MOIs 1 и 5 (рис. 3b). Клетки инкубировали за 24 ч, после чего был заменен питательной среды и клетки инкубировали для дополнительных 48 часов, прежде чем пересев пластины для последующих дней эксперимента.

В недавнем исследовании мы измерили интенсивности среднее флуоресценции GFP + клеток преобразованы с ICLV/ТРИФОСФАТЫ или IDLV/ТРИФОСФАТЫ компонентов через поток цитометрии28. Мы видели сопоставимых GFP-истощения как образцы 14 дней после трансдукции (pt) (2-4% сигнал истощения), так и почти идентичные GFP истощение 21 дней pt (> 99% сигнал истощения)28. В соответствии с предыдущими замечаниями, мы наблюдали ~ пятикратное сокращение числа GFP-положительных клеток как 7 дней pt (рис. 3), с почти полной сигнал истощения, 14 дней pt (данные не показаны) под наблюдением после трансдукция с Обе системы ICLV - и IDLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9. Потеря сигнала был оценен как соотношение клеток, которые остались после лечения и общее количество наивно GFP-положительных клеток GFP-положительных. Эти результаты ясно показывают, что ТРИФОСФАТЫ/Cas9 конструкции выступил IDLVs, сопоставимые с теми, кто выступил их интеграции коллегами в их способность быть посредником, быстрый, надежный и устойчивый гена редактирования в делящихся клетках.

Figure 3
Рисунок 3: оценка вирусной титры. (a) p24-анализа ELISA. Титры для концентрированных Sp1-IDLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 (черная полоса) и Sp1-ICLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 (белая полоса) были оценены. Результаты записываются в количестве копирования мл, где 1 нг p24-кляп = 1 х 104 вирусных частиц. Гистограммы данных представляет среднее ± SD от трех экземплярах экспериментов. (b) эффективность Оценка ТРИФОСФАТЫ-опосредованной GFP-нокаут. Истощение GFP сигнала сравнивали между ICLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 - и IDLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9-преобразованы 293T GFP + клеток в MOIs 1 и 5. Снимите transduced (Группа «не вирус» на рисунке) GFP-положительных клеток были использованы в качестве контроля. Изображения были приобретены с помощью микроскопа флуоресценции в 40 кратном увеличении на 7 дней поста трансдукции. Abbrev: RRE: Rev ответ элемент, EFS-NC: ядро удлинение фактор 1α промоутер, ψ (psi): Упаковка элемент вектора синхронизации, hU6: человека U6 промоутер, Puro: Кассета Puromycin сопротивление, WPRE: сурок гепатитом вирус посттранскрипционного регулирования Элемент, LTR: Лонг терминал повторить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: плазмид Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

IDLVs начали появляться как средство выбора в vivo гена редактирования, особенно в контексте генетических заболеваний, главным образом ввиду низкого риска мутагенеза, связанные с эти векторы, по сравнению с интеграции платформ доставки22 , 28. в текущем рукописи, мы стремились к деталям протокола, связанного с производством усовершенствованной системы IDLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 все-в-одном, который был недавно разработан в нашу лабораторию28.

Изменения в существующих платформ
С помощью этого метода мы были способны генерировать IDLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и ICLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 векторов на титры в диапазоне от 1 x 1010 ту/мл (рис. 3a). Это повышение эффективности производства может объясняться добавлением Sp1-привязки сайта в все-в-одном ТРИФОСФАТЫ/Cas9 вектор кассеты. Действительно, мы недавно сообщили что включение результатов Sp1 к ~2.5-fold увеличению эффективности упаковки IDLV - и ICLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 векторов и ~ 7-кратным увеличением общей функциональной титры. Эти результаты согласуются с предыдущей работы из различных групп, подчеркивая Sp1 как ключевым регулятором одичал типа ВИЧ-130,,3132,33,34,35 .

Важнейшие шаги и устранение неполадок
Как указывалось выше, перевозящих Sp1-IDLVs трансгенов ТРИФОСФАТЫ/Cas9 были способны генерировать титры в непосредственной близости от 1 x 1010 ту/мл за ~ 5 x 107 продюсер клетки. Титры ниже, чем они бы свидетельствует об ошибках в процессе производства, в этом случае следующих важнейших пунктов следует рассматривать для улучшения титр: 1) рекомендуется, что продюсер клетки предпочтительно быть низкий проход числа, с заменой После ≥15 проходы и/или когда наблюдается замедление темпов роста. 2) выбор компонентов клеток средств массовой информации имеет важное значение с точки зрения эффективности производства. Например вместо широко используется плода бычьим сывороточным, мы находим, последовательно улучшить использование космических телячьей сыворотки роста клеток и вирусных производства, будучи экономически эффективным в то же время. 3 Фитнес производства различных линий ГЭС должны тщательно оцениваться. Например, мы нашли ~ тройным разница между 293T клеток и 293-FT (см. Таблицу материалы) вирусный производства урожаев клетки (данные не показаны). 4) рекомендуется, что transfected клеток, когда они являются примерно 70-80% притока, с нижней плотности клеток, что приводит к преждевременной клеточной гибели из-за вирусной токсичности и более высокой плотности, что привело к заметному падению эффективности производства. Как правило мы предлагаем бухгалтерского учета для плотности клетки, что позволяет дополнительные раунд деление клеток после transfection клетки пройти один. 5) наконец эффективность трансфекции сильно зависит от pH 2 x BBS, который должен поддерживаться на точно 6,95 для идеальной transfection. Поэтому настоятельно рекомендуется, что каждый новый пакет 2 x BBS проверяться в масштабе пилот transfection.

Вектор управляемость и безопасность
Существует несколько важных мер безопасности во время производства IDLV и ICLV векторов с настоящим Протоколом. Во-первых работа с lentiviruses требует сдерживания био-безопасности уровня II. Несмотря на функции безопасности, обеспечиваемой ГРЕХ векторов остаточной транскрипционный анализ активности от греха векторов был сообщил36. Кроме того, Предыдущая работа продемонстрировала, что IDLV - и ICLV-геномов может быть продуктивно спасен ВИЧ-127. Поэтому настоятельно рекомендуется выполнение репликации компетенции анализов (RCA), особенно при концентрации lentiviruses в настоящее время используется37. Для процедур обеспечения безопасности в отношении обработки лентивирусные вектор препаратов, увидеть биобезопасности в микробиологические и биомедицинских лабораториях, 4-е издание, опубликованные в центры по контролю заболеваемости (CDC), которые можно найти онлайн38. На той же ноте третьего поколения, Упаковка систем39 с расширенной биобезопасности функции может использоваться для упаковки IDLVs и ICLVs, хотя и с более низкой эффективности, чем в системе второго поколения.

Значение и будущие направления деятельности
В целом, производство протокол для IDLVs для ТРИФОСФАТЫ/Cas9 - опосредованной гена редактирования, описанные здесь представляет собой первую оценку эффективности этой системы в быстро делящихся клетках. С помощью GFP-положительных ГЭС 293T клеток, мы продемонстрировали, что Sp1-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 по IDLVs можно быстро и эффективно изменить GFP в этих клетках, с аналогичными кинетика как ICLVs. Эти наблюдения широко согласуются с результаты предыдущей работы, с помощью рибонуклеопротеида комплексы (Cas9 RNPs) гена редактирования-вирусных трансфекции методами. Этот роман платформы далее обогащает постоянно расширяет инструментарий для доставки генов редактирования компонентов и другие молекулярные грузов для клеток.

Как говорилось ранее, несмотря на недавний прогресс в развитии систем лентивирусные на основе гена доставки, есть несколько без вариантов для платформ, которые позволяют устойчивого производства высокой титр вирусных векторов для быстрого, переходных и целевых генов манипуляция. Путем включения обязательных мотивов для сильно выражена транскрипционный фактор в кассету выражение трансген мы смогли одновременно решать некоторые из этих вопросов. Этот простой, но критическое манипуляции открывает целый ряд возможностей для разработки аналогичных платформах доставки. Было бы особенно полезно, чтобы проверить если трансген выражение можно повысить посредством либо добавлением многочисленных копий тот же мотив привязки, или путем мультиплексирования Sp1 мотив с обязательными сайты для других факторов транскрипции. С такими инструментами, в нашем распоряжении это соблазн предположить, что выражение с относительно слабым ткани конкретных промоутеров, например для человека Synapsin I (hSyn) и мышь кальция/Кальмодулин зависимая протеинкиназа II (CaMKII), может быть значительно улучшение в пробирке и в естественных условиях.

Хотя настоящее исследование было ограничено тестирование генов нокдаун возможности IDLV-доставлены ТРИФОСФАТЫ/Cas9, в принципе, универсальность нашей системы будет подходят для различных приложений, ген редактирования, например те полагаясь на каталитически неактивные dCas940. Наконец, в сочетании с меньше эндонуклеазами, например SaCas941 и42Cpf1, платформа, описанные в этом исследовании может быть принят к созданию высокоэффективных AAV-основе гена-доставки за относительно короткий промежуток времени, который обеспечит дополнительные преимущества низкой иммуногенностью, по сравнению с лентивирусные векторы. Разумеется такие подходы бы позитивным шагом в направлении развития романа, эффективной и клинически безопасное вирусных векторов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Патентная ОСК-499-P (1175) была подана университета Южной Каролины в связи с работой, описанной в этой рукописи.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Департамент нейробиологии, школа медицины при университете Дьюка и деканат по фундаментальной науки, Университет Дьюка. Мы также благодарим членов герцог вирусный вектор ядра для комментариев на рукопись. Плазмида pLenti CRISPRv2 был подарок от Чжан Фэн (широкой институт). LV-упаковочная система, включая psPAX2 плазмид, VSV-G, pMD2.G и pRSV-Rev был вид подарок от наконец Дидье (EPFL, Швейцария). Финансовая поддержка для проведения этой работы была оказана университета Южной Каролины школы медицины, Грант RDF18080-Е202 (B.K).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
xMark Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
BD FACS Becton Dickinson 338960
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor Beckman Coulter 369650
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
High-binding 96-well plates Corning 3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Tissue culture pipettes, 5 mL Corning 4487
Tissue culture pipettes, 10 mL Corning 4488
Tissue culture pipettes, 25 mL Corning 4489
Hemacytometer with cover slips Cole-Parmer UX-79001-00
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
DMEM, high glucose media Gibco 11965
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) Sigma Aldrich B9879 - BES
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
pRSV-Rev Addgene 12253
lentiCRISPR v2 Addgene 52961
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsrGI New England Biolabs R0575S
BsmBI New England Biolabs R0580S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327, (5962), 167-170 (2010).
  2. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11, (3), 181-190 (2010).
  3. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15, (5), 321-334 (2014).
  4. Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15, (5), 447-459 (2015).
  5. Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
  6. Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146 (2016).
  7. Wang, W., et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9, (12), e115987 (2014).
  8. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv Genet. 87, 125-197 (2014).
  9. Lebbink, R. J., et al. A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape. Sci Rep. 7, 41968 (2017).
  10. Xu, L., et al. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. (2017).
  11. Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (13), 5490-5497 (2016).
  12. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42, (19), e147 (2014).
  13. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32, (3), 279-284 (2014).
  14. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31, (9), 827-832 (2013).
  15. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, (6), 1012-1019 (2014).
  16. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31, (9), 839-843 (2013).
  17. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, (6166), 84-87 (2014).
  18. Schaefer, K. A., et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods. 14, (6), 547-548 (2017).
  19. Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 23, (7), 627-633 (2016).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, (2), 440-455 (2014).
  21. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 43, (13), 6450-6458 (2015).
  22. Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).
  23. Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors. Virol J. 3, 27 (2006).
  24. Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22, (1), 93-100 (2011).
  25. Hoban, M. D., et al. Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).
  26. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 16, (12), 1968-1976 (2008).
  27. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (44), 18786-18791 (2009).
  28. Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).
  29. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 19, (3), 547-556 (2011).
  30. Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 73, (2), 1138-1145 (1999).
  31. Gomez-Gonzalo, M., et al. The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter. J Biol Chem. 276, (38), 35435-35443 (2001).
  32. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. J Biol Chem. 280, (22), 21545-21552 (2005).
  33. Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength. J Neurophysiol. 92, (3), 1718-1727 (2004).
  34. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol. 71, (8), 6113-6127 (1997).
  35. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 68, (4), 2632-2648 (1994).
  36. Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors. Mol Ther. 20, (1), 84-90 (2012).
  37. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations. Available from: https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf (2017).
  38. CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2017).
  39. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72, (11), 8463-8471 (1998).
  40. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167, (1), 233-247 (2016).
  41. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520, (7546), 186-191 (2015).
  42. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, (3), 759-771 (2015).
Протокол для производства интеграза недостаточным лентивирусные векторы для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной нокаут генов в делящихся клетках
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).More

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter