Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Ett protokoll för produktionen av integras-brist Lentiviral vektorer för CRISPR/Cas9-medierad gen Knockout i delande celler

doi: 10.3791/56915 Published: December 12, 2017

Summary

Vi beskriver strategin produktion av integras-brist lentiviral vektorer (IDLVs) som fordon för att leverera CRISPR/Cas9 till celler. Med en förmåga att förmedla snabb och robust gen redigering i celler, IDLVs presentera en säkrare och lika effektiv vektor plattform för gen leverans jämfört med integras-behöriga vektorer.

Abstract

Lentiviral vektorer är ett idealiskt val för att leverera genredigering komponenter till celler på grund av sin kapacitet för stabilt transducing ett brett spektrum av celler och medla höga nivåer av genuttryck. Men deras förmåga att integrera i den mottagande cell arvsmassan ökar risken för insertional mutagenicitet och därmed väcker oro för säkerheten och begränsar deras användning i kliniska inställningar. Ytterligare, långlivade uttryck för genredigering komponenter levereras av dessa integration-behöriga lentiviral vektorer (ICLVs) ökar sannolikheten för promiskuösa gen inriktning. Som ett alternativ, har det utvecklats en ny generation av integras-brist lentiviral vektorer (IDLVs) som tar upp många av dessa farhågor. Här protokollet produktion av en ny och förbättrad IDLV plattform för CRISPR-medierad gen redigering och lista stegen involverade i rening och koncentration av sådana vektorer beskrivs och deras transduktion genredigering effektivitet använder HEK-293T celler visades. Detta protokoll är enkelt skalbar och kan användas för att generera hög titer IDLVs som klarar av transducing celler in vitro och in vivo. Dessutom kan detta protokoll lätt anpassas för produktion av ICLVs.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Exakt gen redigering utgör hörnstenen i stora biomedicinsk framsteg som innebär utvecklingen av nya strategier för att hantera genetiska sjukdomar. I spetsen för genredigering teknik är metoden att förlita sig på användningen av det clustered regularly -jagnterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / Cas9-system som identifierades inledningsvis som en del av bakteriell immunitet mot invasionen av viral arvsmassa (ses i referenser1,2). En stor fördel av CRISPR/Cas9 systemet över andra genredigering verktyg, såsom zink finger nukleotider (motvilligt) och transkription aktivator-liknande effektor nukleaser (TALENs) (ses i referens3), är den relativa enkelheten i plasmiden design och byggandet av CRISPR komponenter — en funktion som har driv utbyggnaden av genredigering från några specialiserade laboratorier till en mycket bredare forskarsamhället. Enkelheten av CRISPR/Cas9 programmering och dess kapacitet för multiplexering prismalås har dessutom ytterligare underblåst dess popularitet som en kostnadseffektiv och lätt att använda teknik. Bland de olika metoderna tillgängliga för forskare att leverera sådana genredigering komponenter till celler, fortfarande virala vektorer överlägset mest populära och effektiva systemet.

Lentiviral vektorer (LVs) har dykt upp som fordonet val leverera komponenterna i CRISPR/Cas9-system i vivo för applikationsmöjligheter4,5,6,7. Flera viktiga funktioner gör LVs ett populärt val för denna process inklusive deras förmåga att infektera både dela och icke-dividera celler, låg immunogenicitet och minimal cellulär toxicitet (ses i referens8). Som ett resultat, har LV-medierad genterapi varit anställd i behandlingar av smittsamma sjukdomar, som HIV-1, HBV och HSV-1, samt korrigering av defekter underliggande mänskliga ärftliga sjukdomar som cystisk fibros och neo-vaskulär makuladegeneration 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Dessutom LVs effektivt har ändrats för att utföra multiplex gen redigering på distinkt genomisk lokus använder en enda vector systemet12.

Men den inneboende egenskapen hos LVs att integrera i värd genomet kan vara mutagena och ofta svårigheter deras nytta som transgenens leveransfordon, särskilt i kliniska inställningar. Dessutom eftersom stabilt-integrerade LVs express deras transgener på hållbart höga nivåer, är detta system dåligt lämpade för leverans av genredigering komponenter såsom CRISPR/Cas9; överuttryck av Cas9-guide RNA (gärna), och liknande proteiner som motvilligt, är associerade med förhöjda nivåer av off-effekter, som inkluderar oönskade mutationer13,14,15,16 , 17 och kan potentiellt öka cytotoxiciteten18. För att uppnå exakt genredigering med minimal off-target effekter, det är därför absolut nödvändigt att konstruera system som möjliggör övergående uttrycket av genen redigering komponenter.

Under de senaste åren har en mängd olika leveransplattformar utvecklats för att övergående express CRISPR/Cas9 i celler16,19,20,21 (ses i referens22). Dessa inkluderar metoder som förlitar sig på direkt införa renat Cas9 tillsammans med lämplig guide RNASEN i celler, vilket visade sig vara mer effektiva på riktade genredigering jämfört med plasmidmedierad transfection16. Studier har visat att ribonukleoprotein (RNP) komplex bestående av guide RNA/Cas9 partiklar vänds snabbt efter medla DNA klyvning på sina mål, vilket tyder på att kortsiktiga uttryck av dessa komponenter är tillräckligt för att uppnå robust genen redigering16. Möjligen, icke-integrering virala vektorn plattformar såsom adeno-associerade virala vektorer (AAVs) kan ge ett lönsamt alternativ för att leverera genredigering maskiner till celler. Tyvärr AAV förhoppningsvis ha betydligt lägre förpackning kapacitet än LVs (< 5kb), som allvarligt hämmar deras förmåga att paketera flera komponenter CRISPR toolkit inom en enda vektor (ses i referens8). Det är värt att notera att tillägg av föreningar som hämmar Histon deacetylases (e.g., natrium butyrate23) eller hindra cellcykeln (t.ex., koffein24) har visat sig öka lentiviral titrar. Trots de senaste framsteg hindras de övergående uttryck system utvecklat hittills fortfarande av flera brister, såsom lägre produktionseffektivitet, vilket leder till minskad viral titrar och låg transduktion effektiviteten av de virus som genereras genom sådana strategier25.

Integras-brist lentiviral vektorer (IDLVs) utgör ett stort framsteg i utvecklingen av gen-leverans fordon, eftersom de kombinerar LVs förpackning förmåga med fördelen av AAV-liknande episomal underhåll i celler. Dessa funktioner hjälpa IDLVs till stor del kringgå de viktiga frågor i samband med att integrera vektorer, vis-à-vis kontinuerlig överuttryck av potentiellt genotoxiska element och integration-medierad mutagenicitet. Det visades tidigare att IDLVs framgångsrikt kan ändras för att förbättra episomal gen uttryck26,27. När det gäller IDLV-medierad CRISPR/Cas9 leverans begränsar låg produktion titrar och lägre uttryck för episome-burna genomen i förhållande till integras-kunnig lentiviral system deras användbarhet som bona fide verktyg för att leverera editering transgena konstruktioner. Vi har nyligen visat att både transgenens uttryck och viral titrarna är associerade med IDLV produktionen har förbättrats avsevärt genom införandet av bindande platser för Transkriptionfaktorn Sp1 i viral uttryck kassett28. De modifierade IDLVs stöds kraftfullt CRISPR-medierad gen redigering både in vitro- (i HEK-293T celler) och i vivo (i efter mitotiska hjärnans nervceller), medan inducerande minimal off-target mutationer jämfört med motsvarande ICLV-medierad system28. Sammantaget utvecklade vi en roman, kompakt, allt-i-ett CRISPR toolkit transporteras på en IDLV plattform och beskrivs de olika fördelarna med att använda sådant leveransfordon för förbättrade genen redigering.

Här är protokollet produktion av IDLV-CRISPR/Cas9 systemet beskrivs, inklusive de olika steg som ingår i församlingen, rening, koncentration, och titrering av IDLVs, samt strategier för att validera genredigering effekten av dessa vektorer. Detta protokoll är enkelt skalbart för att möta behoven hos olika undersökare och är utformad att framgångsrikt generera LV vektorer med titrar i spänna av 1 x 1010 transducing enheter (TU) / mL. De vektorer som genereras genom detta protokoll kan utnyttjas för att effektivt angripa flera olika celltyper, däribland svårt-att-transduce embryonala stamceller, hematopoetiska celler (T-celler och makrofager) och odlade och in vivo- injicerade nervceller. Protokollet är dessutom lika väl lämpad för produktion av integras-behöriga lentiviral vektorer i liknande kvantiteter.

Figure 1
Figur 1: IDLV förpackningar. (a) Schematisk bild av vildtyp integras protein (b) modifierad plasmiden härleddes från psPAX2 (se metoder, plasmid konstruktion för detaljer). Representant agaros gel bild av kloner screenas för muterade integras kloner. DNA-prover som tillagas med ett mini-kit med standard plasmid-DNA med isolering analyserades av matsmältningen med EcoRV och SphI. Korrekt rötas klonen (nummer 5, streckad röd ruta) bekräftades ytterligare genom direkt (Sanger) sekvensering för D64E substitution i INT. Integras-bristfällig förpackning kassetten hette pBK43. (c) Schematisk av protokollet övergående transfection anställd för att generera IDLV-CRISPR/Cas9 vektorer, visar 293T celler transfekterade med VSV-G, förpackningar och transgenens kassetter (Sp1-CRISPR/Cas9 allt-i-ett plasmid). Viruspartiklar som bud ut från cellmembranet innehåller fullängds RNA av vektor (uttryckt från transgenens kassett). Den andra generationen av systemets IDLV-förpackning användes, vilket inkluderar de reglerande proteinerna Tat och Rev. Rev uttryck kompletteras vidare från en separat kassett (RSV-REV-plasmid). ABBREV: LTR-lång-terminal upprepa, VSV-G, vesikulär stomatit virus G-protein, pCMV-cytomegalovirus arrangören; Rous sarkom virus (RSV) arrangören; RRE-(Rev svar Element). Andra reglerande element på uttrycket kassetten omfattar Sp1-bindande platser, Rev Response element (RRE), murmeldjur hepatit Virus från föreskrivande Element (WPRE), en core-töjning faktor 1α promotor (EFS-NC), vektor förpackningen elementet ψ (psi), human Cytomegalovirus (hCMV) arrangören och mänskliga U6 arrangören. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. odla HEK-293T och sådd celler för Transfection

Obs: Mänskliga embryonala njure 293T (HEK-293T) celler odlas i DMEM, hög glukos media kompletteras med 10% bovint kalvserum kompletteras med järn och tillväxt initiativtagare och 1 x antibiotikum-antimycotic lösning (innehåller 100 x lösning 10 000 enheter penicillin 10 mg streptomycin och 25 µg amfotericin B per mL). Media är också kompletterad med 1 x natrium pyruvat, 1 x icke-essentiell aminosyra mix och 2 mM L-glutamin (lager 200 mM L-alanyl-L-glutamin dipeptid i 0,85% NaCl). Celler odlas i 100 mm vävnadsodling plattor (ungefärliga tillväxt yta är 55 cm²). En sub odling förhållandet 1:10 används med sub odling varje 2-3 dagar. Trypsin-EDTA 0,05% används för dissociationen av celler mellan passager. För att behålla överensstämmelsen mellan experiment, vi rekommenderar testning kalv sera när du byter till en annan hel/sats och övervaka ändringar i celltillväxt, transfection effektivitet, och vektor produktion.

  1. Starta en ny kultur genom låg passage celler (det rekommenderas att inte använda celler efter passage 15 eller om tillväxt saktar ner) med seedning till en 10-cm vävnadsodling platta. Använd DMEM kompletteras med 10% serum för celltillväxt. Odla cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 i en standard vävnad-kultur inkubator. Använda en standard hemocytometer att räkna celler för alla efterföljande steg.
  2. När cellerna når 90-95% konfluenta tillväxt, reseed i 15 cm vävnadsodling plattor (nedan, steg 1.3 - 1.5).
  3. För att Reseeda, sug ut media från konfluenta plattan och försiktigt spola med steril 1 x PBS. Inkubera cellerna med 2 mL av en dissociation-reagens (t.ex., Trypsin-EDTA) vid 37 ° C för 3-5 min. Tillsätt 8 mL av media som innehåller serum för att inaktivera dissociation reagens och pulverisera 10 - 15 gånger med 10 mL serologiska pipett att skapa en enda cell suspension. Att resuspendera cellerna i kultur media att erhålla en cell densiteten av cirka 4 x 106 celler/mL.
  4. För att förbättra vidhäftning till underlaget, pre coat 15 cm plattorna med 0,2% gelatin, att tillsätta 8 mL gelatin per platta. Jämnt fördelade över ytan av plattan, odla i rumstemperatur i 10 min och suga upp vätskan.
  5. Ta den totala volymen av varje platta till 25 mL med varm (37 ° C) HEK-293 T media (se not under steg 1) och utsäde plattorna genom att lägga till 2,5 mL av celler (totalt ~ 1 x 107 celler/platta). Inkubera plattorna vid 37 ° C med 5% CO2 över natten eller tills 70-80% konfluens nås.
    Obs: Upp till sex 15 cm plattor kan användas för produktion. Justera volymen av media per platta ~ 20-22 ml när du använder fler än fyra plåtar (se steg 5 i protokollet för motivering).

2. transfecting HEK-293T celler med ett kalciumfosfat-baserade protokoll

  1. Transfection reagenser
    1. För att förbereda 2 x BES-buffrad lösning BBS (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4), kombinera 16,36 g NaCl, 10.65 g BES (N, N-bis (2-hydroxietyl) -2-amino-ethanesulfonic syra), och 0.21 g av Na2HPO4. Lägg till dubbeldestillerat H2O (dd-H2O) upp till 900 mL. Upplösa, titrera till pH 6,95 med 1 M NaOH och ge volym till 1 L. Filter via 0,22 µM filterenhet. Förvaras vid-20 ° C.
    2. Laga 1M CaCl2. Filtrera lösningen genom ett 0,22 µM filter. Förvaras vid 4 ° C.
  2. Iaktta de plattor som var seedad en dag tidigare. Celler är redo för transfection när de uppnår 70-80% konfluens.
  3. Aspirera gamla medier från plattorna och försiktigt lägga nylagade media utan serum.
    Obs: Se Kompletterande fil 1-plasmider för mer information om de valda plasmidsna och deras förberedelser.
  4. Förbereda plasmid mixen av alikvotering fyra plasmider in i en 15 mL koniska rör. För en enda 15-cm skål förberedelse, använda 37,5 µg av den CRISPR/Cas9-överföring vektor (pBK198 eller pBK189), 25 µg av pBK43 (psPAX2-D64E), 12,5 µg pMD2.G och 6,25 µg av föregående (figur 1 c).
  5. Lägg till 312,5 µL 1M CaCl2 till plasmid mixen. Till detta, Lägg upp till 1,25 mL steril dd-H20.
  6. Långsamt (drop-wise) tillsätt 1,25 mL 2 x BBS lösning medan vortexa mixen. Inkubera i 30 min i rumstemperatur.
  7. Tillsätt transfection blandning droppvis varje 15-cm platta (2.5 mL per platta). Snurra plattorna försiktigt och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 för 2-3 h. Därefter Tillsätt 2,5 mL (10%) serum per platta och fortsätt ruvning övernattning (12-18 h).
    Obs: Vissa labs använda 3% CO2 inkubatorer för att stabilisera media pH. Dock vi inte konstatera någon skillnad i transfection effektivitet mellan 3% och 5% CO2. Storleken på CaPO4 påskyndar är också avgörande för transfection effektivitet. transfection mixen måste vara klart innan dess tillägg på cellerna. Om blandningen blir grumligt under inkuberingen, förbereda färska 2 x BBS (pH = 6,95).

Figure 2
Figur 2: koncentrationen av viral partiklar med hjälp av dubbel-sackaros gradient protokollet. Viruspartiklar som samlas in från supernatanten (SN) lastas på gradient sackaros lutning. 70%, 60%, 30% och 20% sackaros lösningar används för att skapa övertoningen. Efter centrifugering, är de partiklar som samlas in från 30-60% sackaros fraktioner ytterligare lastas en 20% sackaros kudde och fälls ut. Den slutliga pellets som innehåller renade viruspartiklar är resuspended i 1 x PBS för ytterligare användning (se text för ytterligare detaljer). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. dagen efter Transfection

  1. Iaktta cellerna för att säkerställa att de närmar sig 100% konfluens på denna punkt med liten eller ingen celldöd. Ersätta media genom att lägga till 25 mL färsk DMEM + 10% serum varje platta. Fortsätt inkubation vid 37 ° C med 5% CO2 för en ytterligare 48 h.
    Obs: Justera volymen för media i steg 3,1 om du använder mer än sex 15 cm plattor (se steg 5.2, Observera).

4. skörda Virus

  1. Omsorgsfullt samla supernatanten från alla vävnadsodling plattorna som innehåller transfekterade celler med hjälp av en steril 10 mL vävnadsodling pipett och pool i 50 mL centrifugrör.
  2. Rensa suspensionen genom centrifugering vid 400-450 x g i 10 min med en bordsskiva centrifug. Filtrera supernatanten genom ett 0,45 µm vakuum filterenheten.
    Obs: Filtrerade supernatanten kan vara lagrad vid 4 ° C i upp till 4 dagar innan du fortsätter med koncentration, eller aliquoted och lagras vid-80 ° C. De beräknade titrarna av IDLV-Sp1-CRISPR/Cas9 (icke-koncentrerat) viral preparat bör vara ~ 2 x 107 TU/mL (se steg 6 för titerbestämning). Dock undvika att utsätta viral förberedelserna att flera frysning-tining cykler, som varje omgång av frysning och upptining resulterar i en 10-20% förlust i funktionella titrar.

5. koncentrationen av viruspartiklar av ultracentrifugering

Obs: Vi använder en dubbel-sackaros metod för rening som görs i två steg: en sackaros gradient steg och en sackaros kudde (figur 2).

  1. Ladda koniska ultracentrifugering rören i följande ordning för att skapa en sackaros övertoning: 0,5 mL 70% sackaros (upplöst 1 x PBS), 0,5 mL 60% sackaros (upplöst i DMEM), 1 mL 30% sackaros (upplöst i DMEM) och 2 mL 20% sackaros (upplöst i 1 x PBS).
  2. Lägg till virusinnehållande supernatanten noggrant i övertoningen. Den totala volymen av supernatant från fyra 15 cm plattor är 100 mL, använda sex ultracentrifugering tuber per spin för att bearbeta hela volymen av viruset supernatant.
    1. Varje ultracentrifugering rör används för det här steget har en volymkapacitet upp till 30 ml (inklusive volymen av sackaros), distribuera viral supernatanten lika mellan rör, lämnar minst 10% headspace att förhindra spill.
    2. Volymen kultur till ~ 20-22 mL per platta när du använder fler än fyra 15 cm plattor för varje experiment, så att den slutliga volymen av poolade viral supernatanten kan enkelt rymmas inom sex ultracentrifugering rör.
    3. Fyll ultracentrifugering rör till minst tre fjärdedelar deras totala kapacitet, annars brott på tuber kan inträffa under centrifugeringen, vilket resulterar i eventuell förlust av prov och/eller utrustning skador.
  3. Balansera rören med 1 x PBS och centrifugera proverna vid 70 000 x g för 2 h vid 17 ° C (se Tabell av material för rotor Detaljer).
    Obs: För att förhindra störningar av lagrets sackaros under acceleration, in den ultracentrifugen långsamt accelerera rotorn till 200 rpm under de första 3 min av snurrandet. På samma sätt ange den ultracentrifugen att långsamt avta rotorn från 200 rpm till 0 rpm över 3 min i slutet av spinn.
  4. Omsorgsfullt samla 30-60% sackaros fraktioner i rena rör (figur 2). Tillsätt kall 1 x PBS till de poolade fraktionerna och få upp volymen till 100 mL; Blanda genom pipettering upp och ner flera gånger.
  5. Fortsätt till sackaros kudde steg genom att försiktigt skikta viral preparatet på en sackaros kudde. För detta, lägga till 4 mL 20% sackaros (i 1 x PBS) till röret, följt av ~ 20-25 mL av den virala lösningen per rör. Om rören är mindre än tre fjärdedelar full, toppa upp med sterila 1 x PBS.
  6. Noggrant balans och centrifugera proverna vid 70 000 x g för 2 h vid 17 ° C, som tidigare. Häll av supernatanten och låta de återstående vätskan rinna genom att vända rören på hushållspapper.
  7. Aspirera återstående droppar för att ta bort all vätska från pelleten. I detta steg bör virusinnehållande pellets knappt syns som små genomskinliga fläckar.
  8. Återsuspendera pellets genom att lägga till 70 µL av 1 x PBS första röret och grundligt pipettering suspensionen, därefter överföra suspensionen till nästa röret och blandning som tidigare, fortsätter tills alla pellets är resuspended.
  9. Skölj rören med en ytterligare 50 µL kallt 1 x PBS och mix som tidigare. Säkerställa att den kombinera mängden slutgiltiga suspensionen är ~ 120 µL, och verkar något mjölkaktig; Avmarkera det genom centrifugering vid 10 000 x g i 30 s på en bordsskiva mikrocentrifug.
  10. Överför supernatanten till ett färskt mikrofugrör, gör 10 µL portioner och lagra dem vid-80 ° C.
    Obs: Undvik utför upprepad frysning-tining cykler på lentiviral prover. Utom när det krävs centrifugering, bör ansträngningar att genomföra de återstående stegen i vävnadsodling huvor, eller utsett vävnadsodling rum med hjälp av lämpliga biosäkerhet åtgärder (se diskussion).

6. uppskattning av Viral titrar

  1. p24 -enzym-länkade immunosorbent assay (ELISA) metod
    Obs: Analysen utförs med hög-bindande 96 brunnar som per instruktioner programmet NIH AIDS-vaccin för HIV-1 p24 Antigen Capture Assay Kit (se Tabell för material) med ändringar29.
    1. Nästa dag, Tvätta brunnarna tre gånger med 200 µL 0,05% Tween-20 i kalla PBS (PBS-T lösning). Täck tallriken med 100 µL monoklonal anti-p24 antikroppar vid en spädningsgrad av 1: 1500 i 1 x PBS och inkubera över natten vid 4 ° C.
    2. För att eliminera icke-specifik bindning, blockera plattan med 200 µL 1% BSA i PBS; Tvätta tre gånger med 200 µL 0,05% Tween-20 i kalla PBS (PBS-T lösning) för minst 1 tim i rumstemperatur.
    3. Förbereda prover: För koncentrerad vektor preparat, späd 1 µL av provet 100-fold genom att lägga till 89 µL av dd-H20 och 10 µL av Triton x-100 (slutliga koncentration av 10%). För icke-koncentrerat preparat, förbereda tiofaldig utspädda prover (Lägg 80 µL av dd-H20 och 10 µL av Triton x-100 (slutliga koncentration av 10%) till 10 µL av provet).
      Obs: Prover kan förvaras vid-20 ° C vid detta steg under en längre tid för senare användning.
    4. Förbereda HIV-1 standarder genom att tillämpa en 2-faldig seriell utspädning (med start koncentration 5 ng/mL).
    5. Späd koncentrerad prover (från 1: 100 före utspädda aktier) i RPMI 1640 kompletteras med 0,2% Tween-20 och 1% BSA att upprätta 1:10 000, 1:50, 000 och 1:250,000 utspädningar. Späd prover som är icke-koncentrerat (1:10 pre utspädda aktier) i RPMI 1640 kompletteras med 0,2% Tween-20 och 1% BSA att upprätta 1: 500, 1: 2500 och 1:12,500 utspädningar.
    6. Applicera prover på plattan i exemplar och inkubera över natten vid 4 ° C.
    7. Nästa dag, Tvätta brunnarna sex gånger och inkubera vid 37 ° C i 4 h med 100 µL polyklonala kanin-anti-p24 -antikropp, utspädd 1: 1000 i RPMI 1640, 10% FBS, 0,25% BSA och 2% normal mus serum (NMS).
    8. Tvätta sex gånger som ovan och inkubera vid 37 ° C för 1 h med get-anti-kanin pepparrotsperoxidas IgG utspädd 1:10,000 RPMI 1640 kompletteras med 5% normala get serum, 2% NMS, 0,25% BSA och 0,01% Tween-20.
    9. Tvätta plattan, som ovan, och inkubera med TMB peroxidas substrat i rumstemperatur i 15 min.
    10. Stoppa reaktionen genom att lägga till 100 µL av 1 N HCL. Mäta prov absorbans vid 450 nm med absorbansen tallrik läsare.
  2. Mätning av fluorescerande reporter intensitet
    1. FACS metod
      Obs: Omfattningen av GFP signal utarmning i celler kan beräknas korrekt genom att mäta genomsnittlig fluorescensintensiteten hos de transduced cellerna via flödescytometri. Se de senaste papper 28 för FACS dataanalys, presentation och tolkning. Protokollet beskrivs enligt följande.
      1. Gör en tiofaldig seriell utspädning av preparatet (från 10-1 till 10-5) av viral förberedelserna i 1 x PBS.
      2. Utsäde cirka 5 x 105 293T celler i varje brunn 6-well platta i en slutlig volym av 2 mL per brunn. Tillsätt 10 µL av varje viral utspädning till cellerna och inkubera cellerna vid 37 ° C för 48 h.
      3. Skörda celler för FACS analys enligt följande: Tillsätt 200 µL av Trypsin-EDTA-lösningen, 0,05% och inkubera cellerna vid 37 ° C i 5 min. Lägg till 2 mL av en komplett DMEM-media och samla in prover till 15 mL koniska rör.
      4. Pellet celler genom centrifugering vid 400 x g vid 4 ° C och återsuspendera pelleten i 500 µL kallt 1 x PBS.
      5. För fixering, tillsätt en motsvarande volym 4% formaldehydlösning till denna suspension och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
      6. Pellet fast celler och resuspendera i 1 mL 1 x PBS. Analysera GFP-uttryck med en FACS instrument, som beskrivs i Ortinski et al. 28 använda kortfattat följande formel för att bestämma viruset funktionella titer:
        Equation 1
        Obs: Här Tg = antal GFP-positiva celler räknas; TN = totala antalet celler som räknas; N = totalt antal celler sensorik; V = volym (µL) används för transduktion. Till exempel: om 1 x 106 celler var sensorik med 10 µL av virus, 2 x 104 celler var räknade och 5 x 103 GFP-positiv, baserat på ovanstående ekvation funktionella titern skulle vara:
        Equation 2
    2. Räkna GFP-positiva celler
      1. Beräkna multiplicityen av infektion (MOI) används för transduktion. Testa ett brett utbud av MOIs (1-10), med ökande MOIs vilket resulterar i en högre transduktion effektivitet.
      2. Innan transfection, frö en 6-well platta med cirka 3-4 x 105 celler per brunn. När cellerna når > 90% konfluens (vanligtvis inom 24 h), transduce med renat virus på förutbestämda MOIs.
      3. Inkubera plattan vid 37 ° C med 5% CO2 i en standard vävnadsodling och övervaka celler med jämna mellanrum i 1-7 dagar för förändringar i GFP signalen.
      4. Räkna antalet GFP-positiva celler med ett fluorescerande Mikroskop (PLAN 4 X-objektiv, 0.1 Norlin, 40 X förstoring) försedd med en god Jordbrukarsed filter set (excitation våglängd-470 nm, emission våglängd-525 nm) med naiva (UN-transduced) celler för att sätta befolkningens GFP-negativa och positiva celler.
      5. Uppskatta den slutliga titern genom att justera för utspädningsfaktorn och den volym med följande formel:
        Equation 3
        Obs: Här, N = antal GFP-positiva celler, D = utspädningsfaktorn, M = förstoringsfaktor (vanligtvis 20 X), V = volymen av virus används för transduktion. Till exempel för 20 GFP-positiva celler (N) räknas vid en spädning på 10-4 (1:10 000) i en 10 µL prov (V) 20 X förstoring (M) (D) skulle resultera i en funktionell titer (20 x 104) x (20) x (10) x (100 *) = 4 x 108 TU/mL.
        (* att anpassa sig till per mL)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Validering av knockout-effektiviteten av IDLV-CRISPR/Cas9 vektorer
Vi för GFP-uttryckande 293T celler som en modell för att verifiera effektiviteten av CRISPR/Cas9-medierad gen knockout. GFP + celler genererades av transduktion HEK-293T celler med pLenti-GFP (vBK201a) på en MOI 0,5 (figur 3b, ”no-virus” panel). SgRNA-till-GFP/Cas9 allt-i-ett vektor kassetten levererades till IDLV eller ICLV partiklar och produktionseffektiviteten bedömdes genom p24 ELISA (se ovan; och figur 3a). Titrarna av vektorer som innehåller Sp1-bindningsställen (följande koncentration) befanns vara i intervallet 1010 TU/mL. Sedan bedömde vi effektiviteten i GFP knockout använder fluorescerande mikroskopi (figur 3b). I detta syfte 5 x 105 GFP-uttryckande 293T celler var seedad till en 6-well platta och vi sensorik dem 24 h senare med IDLV - eller ICLV-CRISPR/Cas9 på MOIs 1 och 5 (figur 3b). Cellerna inkuberades för 24 timmar, varefter odlingssubstratet ersattes och celler inkuberades för en ytterligare 48 h, innan omläggning plattorna för efterföljande dagar av experimentet.

I en färsk studie mätte vi genomsnittlig fluorescensintensiteten hos GFP + celler sensorik med ICLV/CRISPR eller IDLV/CRISPR komponenter via flöde flödescytometri28. Vi såg jämförbara GFP-utarmning i både prover 14 dagar efter transduction (pt) (2-4% signal utarmning) och nästan identiska GFP utarmning 21 dagar pt (> 99% signal utarmning)28. I överensstämmelse med tidigare iakttagelser, vi observerade en ~ femfaldigt minskning av antalet GFP-positiva celler så tidigt som 7 dagar pt (figur 3), med en nästan komplett signal utarmning observerats av 14 dagar pt (inga data anges) efter transduktion med både ICLV - och IDLV-CRISPR/Cas9-system. Signalförlust utvärderades som förhållandet mellan cellerna som återstod GFP-positiv efter behandling och det totala antalet naiva GFP-positiva celler. Dessa resultat visar tydligt att CRISPR/Cas9 konstruktioner levereras av IDLVs är jämförbara med de avgivit sina integrerande motsvarigheter i sin förmåga att förmedla snabb, robust och ihållande gen redigering i delande celler.

Figure 3
Figur 3: utvärdering av viral titrar. (a) av p24-ELISA-testet. Titrarna för koncentrerad Sp1-IDLV-CRISPR/Cas9 (svart fält) och Sp1-ICLV-CRISPR/Cas9 (vit stapel) utvärderades. Resultaten redovisas i kopia nummer per mL där 1 ng p24-gag = 1 x 104 viruspartiklar. Stapeldiagram data representerar medelvärdet ± SD från tre exemplar experiment. (b) utvärdering av CRISPR-medierad GFP-knockout effektivitet. Utarmning av GFP signal jämfördes mellan ICLV-CRISPR/Cas9 - och IDLV-CRISPR/Cas9-sensorik 293T GFP + celler på MOIs 1 och 5. Un-transduced (”inga virus” panel i figur) GFP-positiva celler användes som kontroller. Bilder förvärvades med fluorescens Mikroskop med 40 X förstoring på 7 dagar post transduktion. ABBREV: RRE: Rev Response Element, EFS-NC: core-töjning faktor 1α promotorn, ψ (psi): förpackning vektorelement, hU6: mänskliga U6 promotorn, Puro: Puromycin-motstånd kassett, WPRE: murmeldjur hepatit Virus från föreskrivande Element, LTR: Long-terminal upprepa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1: plasmider Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

IDLVs har börjat dyka upp som fordonet val för i vivo genredigering, särskilt inom ramen för genetiska sjukdomar, till stor del på den låga risken för mutagenicitet associerade med dessa vektorer jämfört med att integrera leverans plattformar22 , 28. i den nuvarande manuskriptet, vi försökte detalj i protokollet som är associerade med produktionen av det förbättra allt-i-ett IDLV-CRISPR/Cas9-system som har nyligen utvecklats i vårt laboratorium28.

Ändringar av befintliga plattformar
Med den här metoden har vi kunnat generera IDLV-CRISPR/Cas9 och ICLV-CRISPR/Cas9 vektorer på titrar i spänna av 1 x 1010 TU/mL (figur 3a). Den här förbättringen produktionseffektivitet kan hänföras till tillägg av Sp1-bindande webbplats in i allt-i-ett CRISPR/Cas9 vektor kassett. Faktiskt, vi nyligen rapporterade att inkludering av Sp1 resultat i en ~2.5-fold ökning av förpackningar effektiviteten i IDLV - och ICLV-CRISPR/Cas9 vektorer och en ~ 7-fold ökning av de totala funktionella titrarna. Dessa resultat är i samförstånd med tidigare arbete från olika grupper som belyser Sp1 som en nyckelroll i regulering av vildtyp HIV-130,31,32,33,34,35 .

Kritiska moment och felsökning
Som påpekats ovan, Sp1-IDLVs bär var CRISPR/Cas9 transgener kan generera titrar i närheten av 1 x 1010 TU/mL per ~ 5 x 107 producent celler. Titrar lägre än dessa skulle vara ett tecken på fel i produktionsprocessen, i vilket fall följande avgörande punkter bör övervägas för titer förbättring: 1) Det rekommenderas att producenten cellerna helst vara av låg passage nummer, med ersättning efter ≥15 passager eller när långsammare tillväxt observeras. 2) valet av cell mediekomponenter är viktigt när det gäller produktionseffektivitet. Till exempel, i stället för den vanliga fetalt bovint serumen finner vi att användningen av Cosmic kalvserum konsekvent förbättrats celltillväxt och viral produktion, samtidigt som den är kostnadseffektiv samtidigt. (3) de olika raderna i HEK produktion lämplighet bör utvärderas noggrant. Till exempel, Vi hittade en ~ trefaldig skillnad mellan 293T celler och 293-FT (se Tabell för material) viral produktion ränta celler (inga data anges). (4) det är rekommenderat att celler vara transfekterade när de är ungefär 70-80% konfluenta, med lägre cell tätheter som leder till för tidig celldöd på grund av viral toxicitet och högre tätheter vilket resulterade i en markant nedgång i produktionseffektivitet. Som en tumregel föreslår vi redovisning för en cell densiteten som gör att celler skall genomgå en ytterligare runda av celldelningen efter transfection. (5) Slutligen är transfection effektivitet starkt beroende av pH-värdet i 2 x BBS, som ska hållas vid exakt 6.95 för perfekt transfection. Det rekommenderas därför starkt att varje ny omgång 2 x BBS kontrolleras på en pilot-transfection skala.

Vektor hantering och säkerhet
Det finns flera viktiga säkerhetsöverväganden under produktionen av IDLV och ICLV vektorer med detta protokoll. Först kräver arbeta med lentiviruses biosäkerhet nivå II inneslutning. Trots de säkerhetsdetaljer som ges genom SIN vektorer, varit kvarvarande transkriptionell verksamhet från SIN vektorer rapporterade36. Dessutom tidigare arbete har visat att IDLV - och ICLV-genom produktivt kan räddas av HIV-1-27. Det rekommenderas därför starkt att replikering kompetens analyser (RCA) utföras, särskilt när koncentrerade lentiviruses att använda37. För säkerhetsrutiner avseende hantering av lentiviral vector preparat, se biosäkerhet i Microbiological och biomedicinska laboratorier, 4: e upplagan, utgiven av Centers for Disease Control (CDC), som kan hittas online38. På samma anteckning, kan tredje generationen förpackning system39 med förbättrad biosäkerhet funktioner användas till IDLVs och ICLVs, dock med lägre effektivitet än för det andra generationens systemet.

Betydelse och framtida inriktningar
Sammantaget produktion protokollet för IDLVs för CRISPR/Cas9 - medierad gen redigering beskrivs här representerar den första utvärderingen av effektiviteten av detta system i snabbt delande celler. Med GFP-positiv HEK-293T celler, visat vi att Sp1-CRISPR/Cas9 levereras av IDLVs kan snabbt och effektivt redigera GFP i dessa celler, med liknande kinetik som ICLVs. Dessa iakttagelser är i stort sett överensstämmer med resultaten från tidigare arbete med ribonukleoprotein komplex (Cas9 RNPs) för gen redigering genom icke-virala transfection metoder. Denna roman plattform ytterligare berikar den ständigt växande verktygslådan för leverans av genredigering komponenter och andra molekylär laster till celler.

Som diskuterats tidigare, trots de senaste framsteg i utvecklingen av lentiviral-baserade gen-leverans system, finns det några att inga alternativ för plattformar som tillåter en hållbar produktion av hög-titer virala vektorer för snabb, övergående och riktade gene manipulation. Genom införlivandet av bindande motiv för en starkt uttryckta transkriptionsfaktor i transgenens uttryck kassett, kunde vi samtidigt ta itu med flera av dessa frågor. Denna enkla men kritiska manipulation öppnar upp ett antal vägar för att utveckla liknande leveransplattformar. Det skulle vara särskilt användbart för att testa om transgenens uttryck kan förbättras genom antingen tillägg av många kopior av samma bindande motiv, eller genom multiplexing Sp1 motivet med bindande platser för andra transkriptionsfaktorer. Med sådana verktyg till vårt förfogande, det är frestande att spekulera detta uttryck från relativt svag vävnadsspecifika initiativtagare, till exempel för människors Synapsin jag (hSyn) och mus kalcium/calmodulin-beroende proteinkinas II (Chytridiomycota), kan vara betydligt förbättrades både in vitro- och in vivo.

Medan den aktuella studien var begränsad till testning gen knockdown förmåga IDLV-levererade CRISPR/Cas9, i princip, skulle mångsidigheten i vårt system vara mottagliga för genredigering applikationsmöjligheter, såsom de förlitar sig på de katalytiskt-inaktiv dCas940. Slutligen, i kombination med mindre endonucleases, såsom SaCas941 och Cpf142, den plattform som beskrivs i denna studie kan antas mot upprättandet högeffektiv AAV-baserade gen-leverans system i en relativt kort tidsperiod, som skulle ge fördelen av låg immunogenicitet jämfört med lentiviral vektorer. Sådana tillvägagångssätt skulle naturligtvis vara ett positivt steg mot utveckling av nya, effektiva, och kliniskt säker virala vektorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Patent USC-499-P (1175) lämnades in av University of South Carolina i förhållande till det arbete som beskrivs i detta manuskript.

Acknowledgments

Vi vill tacka Institutionen för neurobiologi, Duke University School of Medicine och fakultetskansli för grundläggande vetenskap, Duke University. Vi tackar också medlemmar av hertig Viral vektor kärnan för synpunkter på manuskriptet. Plasmiden pLenti CRISPRv2 var gåva från Feng Zhang (Broad Institute). LV-förpackning systemet inklusive den plasmider psPAX2, var VSV-G, pMD2.G och pRSV-Rev en slags gåva från Didier Trono (EPFL, Schweiz). Ekonomiskt stöd för detta arbete ges av den University i South Carolina School Of Medicine, bevilja RDF18080-E202 (Bloom).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
xMark Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
BD FACS Becton Dickinson 338960
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor Beckman Coulter 369650
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
High-binding 96-well plates Corning 3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Tissue culture pipettes, 5 mL Corning 4487
Tissue culture pipettes, 10 mL Corning 4488
Tissue culture pipettes, 25 mL Corning 4489
Hemacytometer with cover slips Cole-Parmer UX-79001-00
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
DMEM, high glucose media Gibco 11965
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) Sigma Aldrich B9879 - BES
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
pRSV-Rev Addgene 12253
lentiCRISPR v2 Addgene 52961
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsrGI New England Biolabs R0575S
BsmBI New England Biolabs R0580S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327, (5962), 167-170 (2010).
  2. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11, (3), 181-190 (2010).
  3. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15, (5), 321-334 (2014).
  4. Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15, (5), 447-459 (2015).
  5. Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
  6. Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146 (2016).
  7. Wang, W., et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9, (12), e115987 (2014).
  8. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv Genet. 87, 125-197 (2014).
  9. Lebbink, R. J., et al. A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape. Sci Rep. 7, 41968 (2017).
  10. Xu, L., et al. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. (2017).
  11. Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (13), 5490-5497 (2016).
  12. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42, (19), e147 (2014).
  13. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32, (3), 279-284 (2014).
  14. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31, (9), 827-832 (2013).
  15. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, (6), 1012-1019 (2014).
  16. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31, (9), 839-843 (2013).
  17. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, (6166), 84-87 (2014).
  18. Schaefer, K. A., et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods. 14, (6), 547-548 (2017).
  19. Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 23, (7), 627-633 (2016).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, (2), 440-455 (2014).
  21. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 43, (13), 6450-6458 (2015).
  22. Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).
  23. Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors. Virol J. 3, 27 (2006).
  24. Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22, (1), 93-100 (2011).
  25. Hoban, M. D., et al. Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).
  26. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 16, (12), 1968-1976 (2008).
  27. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (44), 18786-18791 (2009).
  28. Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).
  29. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 19, (3), 547-556 (2011).
  30. Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 73, (2), 1138-1145 (1999).
  31. Gomez-Gonzalo, M., et al. The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter. J Biol Chem. 276, (38), 35435-35443 (2001).
  32. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. J Biol Chem. 280, (22), 21545-21552 (2005).
  33. Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength. J Neurophysiol. 92, (3), 1718-1727 (2004).
  34. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol. 71, (8), 6113-6127 (1997).
  35. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 68, (4), 2632-2648 (1994).
  36. Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors. Mol Ther. 20, (1), 84-90 (2012).
  37. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations. Available from: https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf (2017).
  38. CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2017).
  39. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72, (11), 8463-8471 (1998).
  40. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167, (1), 233-247 (2016).
  41. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520, (7546), 186-191 (2015).
  42. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, (3), 759-771 (2015).
Ett protokoll för produktionen av integras-brist Lentiviral vektorer för CRISPR/Cas9-medierad gen Knockout i delande celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).More

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter