Summary
تعقد النظم في فيفو يجعل من الصعب التمييز بين التنشيط وتثبيط مستقبلات الشق ترانس-و رابطة الدول المستقلة-يغاندس، على التوالي. نقدم هنا، بروتوكول يستند في المختبر فحوصات الخلية-تجميع للتقييم النوعي والكمي شبه ملزمة للشق المورفولوجية عبر-يغاندس مقابل رابطة الدول المستقلة-يغاندس.
Abstract
مما يشير إلى درجة نظام اتصالات تقحم مصانة خلية-خلية تستخدم على نطاق واسع في التنمية الحيوانية وصيانة الكبار. التفاعل بين مستقبلات الشق يغاندس من الخلايا المجاورة الحث على تفعيل المسار إشارات (ترانس-التنشيط)، في حين أن التفاعل مع يغاندس من نفس الخلية يحول دون إشارة (رابطة الدول المستقلة-تثبيط). التوازن السليم بين ترانس-التنشيط و رابطة الدول المستقلة-تثبيط يساعد على تحديد المستويات المثلى للشق إشارات في بعض السياقات أثناء التنمية الحيوانية. بسبب تداخل مجالات التعبير الشق ويغاندس به في العديد من أنواع الخلايا، ووجود آليات التغذية المرتدة، دراسة آثار التعديل بوستترانسلاشونال معين في ترانس-مقابل رابطة الدول المستقلة-التفاعلات من الدرجة الأولى و أن يغاندس في فيفو أمر صعب. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لاستخدام المورفولوجية S2 الخلايا في خلية-تجميع فحوصات لتقييم آثار إسقاط معدل مسار الشق على الربط من الدرجة الأولى لكل من يجند في ترانس وفي رابطة الدول المستقلة. خلايا S2 transfected ثابت أو عابر مع ناقل التعبير عن الشق مختلطة مع خلايا معربا عن كل من يجند الشق (S2-دلتا أو S2 سيراتي). ترانس-الربط بين مستقبلات ويغاندس النتائج في تشكيل خلية الغيروية المجاميع ويقاس من حيث عدد المجاميع كل مل تتألف من > 6 خلايا. لدراسة تأثير المثبطة رابطة الدول المستقلة-يغاندس، خلايا S2 المشترك معربا عن الشق ويجند كل مختلطة مع خلايا دلتا S2 أو S2 سيراتي وعدد المجاميع هي كمياً كما هو موضح أعلاه. الانخفاض النسبي في عدد المجاميع بسبب وجود رابطة الدول المستقلة-يغاندس يوفر مقياسا رابطة الدول المستقلة-يجند-بوساطة تثبيط ترانس-ملزمة. يمكن أن توفر بيانات شبه كمي عن آثار التلاعبات الجينية أو الدوائي على الربط من الدرجة لما يغاندس هذه الاختبارات مباشرة، ويمكن أن تساعد في فك رموز الآليات الجزيئية الكامنة في فيفو آثار مثل هذا التلاعب في الشق الإشارات.
Introduction
يشير الشق الكنسي هو إليه قصيرة المدى لخلية اتصال تتطلب الاتصال الجسدي من الخلايا لتيسير التفاعل بين مستقبلات الشق و يغاندس1المجاورة. التفاعل بين مستقبلات الشق (موجودة على سطح الخلايا المستقبلة للإشارات) يغاندس (موجودة على سطح إرسال إشارة الخلايا) يبدأ الشق الإشارات ويعرف باسم ترانس-التنشيط2. من ناحية أخرى، يؤدي إلى تثبيط مسار درجة التفاعل بين الشق وبه يغاندس في نفس الخلية ويعرف باسم رابطة الدول المستقلة-تثبيط3. التوازن بين ترانس-و رابطة الدول المستقلة-التفاعلات مطلوب لضمان المثلى تعتمد على يجند الشق مما يشير إلى4. المورفولوجية له مستقبلات حز واحد واثنين من يغاندس (دلتا وسيراتي) بدلاً من الثدييات، التي لها أربعة مستقبلات الشق ويغاندس خمسة [خشنة 1 (JAG1)، JAG2، مثل دلتا 1 (DLL1)، DLL3 و DLL4]5. يوفر الطراز المورفولوجية السهولة تشريح ودراسة آثار معدلات المسار في الدرجة-يجند التفاعلات وبعد ذلك في الدرجة الأولى مما يشير إلى أن وجود هذه البساطة،. في سياقات معينة أثناء التنمية الحيوانية (بما في ذلك تطوير الجناح في المورفولوجية)، رابطة الدول المستقلة-و عبر-تشارك التفاعلات لتحقيق إشارات الدرجة المناسبة وخلية مصير1،6 . من المهم التمييز بين آثار الشق مسار المعدلات في هذه السياقات على- رابطة الدول المستقلةمقابل ترانس-التفاعلات من الدرجة الأولى مع ما يغاندس.
وذكرت مجموعتنا سابقا أن ينظم إضافة بقايا الكربوهيدرات تسمى إكسيلوسي إلى درجة المورفولوجية سلبا على الشق إشارات في سياقات معينة، بما في ذلك تطوير الجناح7. فقدان شمس (الإنزيم إكسيلوسيلاتيس هذا الشق) يؤدي إلى النمط الظاهري "خسارة الوريد الجناح"7. في الآونة الأخيرة، استخدمت الجينات الجرعة التجارب وتحليل الاستنساخ لإظهار أن يعزز فقدان شمس الشق دلتا بوساطة أفراد. للتمييز بين ما إذا كان يشير الشق المعززة في طفرات شمس نتيجة ل انخفاض رابطة الدول المستقلة-تثبيط أو زيادة ترانس-التنشيط، ودراسات overexpression حمل خارج الرحم من يغاندس الشق في الجناح اليرقات إيماجينال أقراص وأجريت باستخدام برنامج التشغيل GAL4 الحزب الديمقراطي التقدمي . هذه التجارب قدم أدلة تشير إلى أن شمس ينظم ترانس-تفعيل الشق بدلتا دون التأثير على الدرجة رابطة الدول المستقلة-تثبيط يغاندس8. إلا أن التغذية المرتدة اللوائح وآثار يغاندس الذاتية قد يؤدي إلى تعقيد تفسير overexpression حمل خارج الرحم الدراسات1،،من69.
لحل هذه المشكلة، خلايا S2 المورفولوجية واستخدمت10 ، التي توفر نظام بسيط في المختبر ليجند درجة التفاعل الدراسات11،12. خلايا S2 لا التعبير عن مستقبلات درجة الذاتية ودلتا يجند11 والتعبير عن مستوى منخفض من سيراتي13، التي لا تؤثر على الشق-يجند تجميع التجارب8. ولذلك، الخلايا S2 يمكن أن يكون ثابت أو عابر transfected الشق و/أو يغاندس الفردية (دلتا أو سيراتي) لتوليد الخلايا التي تعبر حصرا عن مستقبلات الشق أو واحد من يغاندس على، أو مزيج منها. خلط الخلايا معربا عن الدرجة S2 مع الإعراب عن يجند S2 خلايا النتائج في تشكيل المجاميع الغيروية توسط يجند مستقبلات ملزم11،،من1214. التحديد الكمي لتشكيل الكلية توفر قدرا من ترانس-الربط بين الدرجة و يغاندس15 (الشكل 1). وبالمثل، يمكن أن تكون الخلايا S2 transfected اشتركت مع يغاندس الشق ودلتا أو سرت (أي رابطة الدول المستقلة-يغاندس). رابطة الدول المستقلة-يغاندس في هذه الخلايا معربا عن الدرجة S2 إلغاء الربط من الدرجة الأولى مع ترانس-يغاندس وتؤدي إلى تناقص تشكيل إجمالي8،،من1214. الانخفاض النسبي في تشكيل الإجمالية الناجمة عن رابطة الدول المستقلة-يغاندس يوفر مقياسا لتأثير المثبطة رابطة الدول المستقلة-يغاندس على الربط بين الدرجة و عبر-يغاندس (الشكل 2). تبعاً لذلك، استخدمت خلية التجميع فحوصات فحص أثر فقدان إكسيلوسيليشن في ترانس-و رابطة الدول المستقلة-التفاعلات بين الشق وبه يغاندس.
هنا، فإننا نقدم بروتوكول مفصل لفحوصات تجميع الخلية بهدف تقييم الربط من الدرجة الأولى مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة-يغاندس استخدام الخلايا S2 المورفولوجية . على سبيل مثال، نحن نقدم البيانات التي سمحت لنا بتحديد أثر الشق إكسيلوسيليشن على الربط بين الدرجة و عبر-دلتا8. هذه الاختبارات مباشرة توفر تقييما شبه كمي للدرجة-يجند التفاعلات في المختبر ، وتساعد في تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء الآثار في فيفو الشق مسار المعدلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد "مزدوجة تقطعت الحمض النووي الريبي" (dsRNA) لضربة قاضية شمس
- [بكر] تضخيم للمنتجات
- استخدام الحمض النووي البرية من نوع الأبيض الأصفر (y w) و pAc5.1-اجفب كقالب، وفيما يلي أزواج التمهيدي لتضخيم الحمض النووي الأجزاء المستخدمة في تجميع دسرنا. استخدام التشكيل الجانبي PCR الحرارية التالية: تمسخ (95 درجة مئوية، 30 s)، انلينغ (58 درجة مئوية، 30 ثانية) وملحق (72 درجة مئوية، 1 دقيقة).
تعزيز البروتينات الفلورية الخضراء (اجفب) دسرنا الإشعال (5 '-3')-
التمهيدي إلى الأمام--جااتاتاكجاكتكاكتاتاججججتجاجكاججكجاجاج
عكس التمهيدي-جااتاتاكجاكتكاكتاتاججججتكتتجكتكاججكج
شمس دسرنا الإشعال (5 '-3')-
التمهيدي إلى الأمام--تاتاكجاكتكاكتاتاجججاجاتجكتجتاتجتجاكاكجات
عكس التمهيدي-تاتاكجاكتكاكتاتاجججاجاتككجتجاتاككتاكجا
ملاحظة: يتم استخدام دسرنا اجفب كمراقبة سلبية.
- استخدام الحمض النووي البرية من نوع الأبيض الأصفر (y w) و pAc5.1-اجفب كقالب، وفيما يلي أزواج التمهيدي لتضخيم الحمض النووي الأجزاء المستخدمة في تجميع دسرنا. استخدام التشكيل الجانبي PCR الحرارية التالية: تمسخ (95 درجة مئوية، 30 s)، انلينغ (58 درجة مئوية، 30 ثانية) وملحق (72 درجة مئوية، 1 دقيقة).
- هلام-تنقية المنتجات بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR) باستخدام مجموعة أدوات تنقية جل تجاري وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- إجراء النسخ في المختبر باستخدام منتج تجاري قادر على تدوين من مروج T7 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- تنقية دسرنا استخدام مجموعة مواد تنقية الجيش النيبالي الملكي وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة وتخزينها في-80 درجة مئوية.
- تقييم الكفاءة لضربة قاضية شمس باستخدام الخطوات التالية (1.5.1-1.5.5).
- عد الخلايا يدوياً باستخدام خلايا 5 × 105 S2 هيموسيتوميتير ولوحة في كل بئر 6 أيضا لوحة في 1 مل/جيدا من المتوسطة شنايدر تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين يو/مليلتر 100-ستربتوميسين.
- إضافة 7.5 ميكروغرام من اجفب-أو دسرنا شمس لكل بئر واحتضان عند 25 درجة مئوية ح 24.
- شمس تعامل دسرنا خلايا S2 بلطيف بيبيتينج تليها التكوير إلى أسفل باستخدام الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية وعملية لعزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي وفقا والحصاد عنصر التحكم (اجفب معاملة دسرنا) البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي وعملية 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي للخطوة 1 قرت-PCR باستخدام الكواشف قبكر التجارية والتمهيدي/تحقيقات وبكر التشكيل الجانبي الحرارية التالية: تمسخ (95 درجة مئوية، 15 s) وأننيالينج/Extension (60 درجة مئوية، 1 دقيقة).
ملاحظة: يرجى الاطلاع الجدول للمواد للحصول على معلومات على مجموعات التحقيق التمهيدي/والأداة المستخدمة لتجارب بكر qRT شمس والتحكم في هذه الدراسات. - حساب مستويات مرناً النسبي شمس باستخدام 2–ΔΔCT الأسلوب16.
2-تقييم للربط بين مستقبلات الشق و عبر-يغاندس
- إعداد الخلايا المستقبلة للإشارات (الخلايا S2 التعبير عن مستقبلات الدرجة).
- عد الخلايا يدوياً باستخدام هيموسيتوميتير واستكمال لوحة 5 × 105 S2 وخلايا S2-الدرجة مستقرة في كل بئر لوحة 6-جيدا في 1 مل/جيدا من المتوسطة شنايدر مع 10% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100-ستربتوميسين.
ملاحظة: للخلايا S2-الدرجة التي تتوفر من مركز الموارد المورفولوجية الجينوم (دجرك)، إضافة 200 نانومتر الميثوتريكسيت في وسائل الإعلام. لإعداد حل أسهم ميثوتريكسات 0.5 مم، أولاً بإعداد حل ميثوتريكسات 20 ملم في 250 ميليلتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم. وبعد ذلك، يضعف هذا الحل إلى 0.5 مم في المالحة العازلة فوسفات 1 متر ومخزن في-20 درجة مئوية. في الخلايا من الدرجة S2، التعبير عن البروتين الشق تحت سيطرة المروج metallothionein المورفولوجية في ناقلات pMT . - إضافة 7.5 ميكروغرام من دسرنا لكل بئر واحتضان عند 25 درجة مئوية ح 24.
- إضافة 0.7 مم CuSO4 للحث على التعبير عن الشق واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
ملاحظة: يتم استخدام CuSO4 للحث على التعبير عن البروتينات التي تسيطر عليها المروج ميتالوثيونين.
- عد الخلايا يدوياً باستخدام هيموسيتوميتير واستكمال لوحة 5 × 105 S2 وخلايا S2-الدرجة مستقرة في كل بئر لوحة 6-جيدا في 1 مل/جيدا من المتوسطة شنايدر مع 10% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100-ستربتوميسين.
- إعداد إشارة إرسال الخلايا (خلية S2 معربا عن يغاندس دلتا أو سرت).
- عد الخلايا يدوياً باستخدام هيموسيتوميتير ولوحة ~ 5 × 106 مستقرة دلتا S2 S2 سيراتيتوم الخلايا أو في كل بئر من لوحة 6-جيدا في 1 مل/جيدا من المتوسطة شنايدر وتستكمل مع 10% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100-ستربتوميسين.
ملاحظة: إضافة 200 نانومتر الميثوتريكسات لخلايا دلتا S2 و 100 ميكروغرام/مل هيجروميسين للخلايا S2 سيراتيتوم في وسائل الإعلام. التعبير عن دلتا وسيراتيتوم– نسخة وظيفية معلم الطماطم سيراتي12– تحت المورفولوجية metallothionein المروج في ناقلات pMT . - إضافة 0.7 مم CuSO4 للحث على التعبير عن يغاندس واحتضان عند 25 درجة مئوية ح 3.
- عد الخلايا يدوياً باستخدام هيموسيتوميتير ولوحة ~ 5 × 106 مستقرة دلتا S2 S2 سيراتيتوم الخلايا أو في كل بئر من لوحة 6-جيدا في 1 مل/جيدا من المتوسطة شنايدر وتستكمل مع 10% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100-ستربتوميسين.
- القيام بتجميع بين الخلايا الإشارات المرسلة والمستقبلة للإشارات.
- حصاد S2 دسرنا معاملة (تحكم) والخلايا الدرجة S2 بيبيتينج لطيف و لوحة 2.5 × 105 خلايا/بئر في صفيحة 24-جيدا بعد العد اليدوي من هيموسيتوميتير.
- إضافة 5 × 105 مستقرة S2-دلتا أو S2 سيراتيتوم خلايا في إجمالي حجم 200 ميليلتر من المتوسطة شنايدر (تستكمل مع 10% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100-ستربتوميسين).
ملاحظة: تم كافة الخلايا S2 المناولة (بما في ذلك العلاج والطلاء والتعريفي ودسرنا) إطار السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. - وضع اللوحة على شاكر مداري 150 لفة في الدقيقة (راد 942.48/دقيقة).
- وبعد 1 دقيقة، تخلط محتويات كل بئر وإخراج 20 ميليلتر لإحصاء عدد المجاميع.
- في نفس الوقت تأخذ صورة تمثيلية تحت المجهر المركب المقلوب باستخدام 10 x التكبير (الهدف 10/0.25 PLL).
- عد يدوياً في المجاميع (> 6 خلايا) استخدام هيموسيتوميتير.
- وضع اللوحة على شاكر.
- تكرار الحصول على الصورة والعد بعد 5 دقائق و 15 دقيقة للتجميع.
- إجراء التحديد الكمي ترانس-ملزمة.
- حساب عدد المجاميع كل مل بين S2 الخلايا والخلايا S2-دلتا أو S2 سيراتيتوم كعنصر تحكم خلفية.
- حساب عدد المجاميع كل مل بين خلايا دلتا S2 أو S2 سيراتيتوم والدرجة S2 (حجم ترانس-ملزمة).
3.تقييم لتثبيط للربط بين الدرجة و عبر-يغاندس رابطة الدول المستقلة-يغاندس
- إعداد الخلايا المستقبلة للإشارات.
- استكمال لوحة 5 × 105 S2 خلايا في كل بئر لوحة 6-جيدا في 1 مل/جيدا من المتوسطة شنايدر مع 10% FBS والبنسلين يو/مليلتر 100-ستربتوميسين.
- إضافة 7.5 ميكروغرام من دسرنا لكل بئر واحتضان عند 25 درجة مئوية ح 24.
- شارك ترانسفيكت الخلايا دسرنا تعامل مع ببلويسكريبت و الشق pMT11 (دجرك) وحدها أو مع pMT-الدرجة و دلتا pMT11 (دجرك) أو pMT سيراتي17 لإجمالي تركيز الحمض النووي 2 ميكروغرام/كذلك استخدام كاشف تعداء تجارية وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
ملاحظة: يتم استخدام ببلويسكريبت كعنصر تحكم. شارك transfected الخلايا سيتم استدعاء الدرجة S2 & دلتاعابرة أو الدرجة S2 & سيراتي الخلاياعابرة الآخرة. - احتضان خلايا S2 transfected عابر عند 25 درجة مئوية ح 24.
- إضافة 0.7 مم CuSO4 للحث على التعبير عن درجة ويغاندس واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
- إعداد إشارة إرسال الخلايا كما هو موضح في 2.2.
- تنفيذ التجميع بين الخلايا الإشارات المرسلة والمستقبلة للإشارات كما هو موضح في الفرع 2-3.
- التحديد الكمي لتثبيط ترانس-ملزمة رابطة الدول المستقلة-يغاندس.
- حساب عدد المجاميع كل مل بين S2 الخلايا والخلايا S2-دلتا أو S2 سيراتي كعنصر تحكم خلفية.
- تحديد حجم تثبيط رابطة الدول المستقلة-يغاندس على النحو التالي.
- تعريف A كعدد من المجاميع بين الدرجة S2عابرة وخلايا دلتا S2.
- تعريف ب عدد من المجاميع بين الخلايا S2 عابر شارك transfected مع الشق ودلتا (الدرجة S2 & دلتاعابرة) وخلايا دلتا S2.
- حساب التجميع النسبي ج = (ب x 100)/A
- حساب حجم تثبيط من رابطة الدول المستقلة-يجند (دلتا أو سيراتي) 100 – ج.
ملاحظة: على سبيل مثال، إذا كان التجميع النسبي هو 45%، ثم رابطة الدول المستقلة-تعتبر يغاندس تحول دون ترانس-ملزمة بنسبة 55 في المائة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ملاحظاتنا في فيفو اقترح زيادة فقدان نتائج شمس الجين إكسيلوسيلترانسفيراسي في الحصول على إشارات الدرجة المستحقة لوساطة دلتا ترانس-التنشيط من الدرجة الأولى دون أن يؤثر ذلك في رابطة الدول المستقلة-تثبيط الدرجة من يغاندس8. لاختبار هذه الفكرة، أجريت في المختبر فحوصات تجميع الخلية. أولاً، طرقت التعبير شمس في الخلايا S2 إلى أسفل باستخدام دسرنا شمس . دسرنا اجفب كعنصر التحكم. فحص PCR الوقت الحقيقي الكفاءة من ضربة قاضية (دينار كويتي) وتبين أن أكثر من 80%8. ثم ربط مستقبلات الشق مع ترانس-دلتا عند شمس دينار كويتي تم بحث استخدام فحوصات التجميع. التجميع بين الخلايا الدرجة S2 و S2-دلتا بحثت في نقاط زمنية مختلفة بعد الاختلاط بهم. تجميع بين عادي S2 الخلايا والخلايا S2-دلتا اتخذ كخلفية عنصر التحكم. الوقت يظهر الشكل 3 الرسم البياني يشير إلى عدد المجاميع تشكلت في مختلف النقاط (1، 5 و 15 و 30 دقيقة) بعد خلط. ولوحظ زيادة حادة في عدد المجاميع بين 1 و 5 دقيقة وبعد ذلك عدد المجاميع استمر في الزيادة حتى 30 دقيقة بمعدل أبطأ. ولذلك، تشكيل الكلية تم تصويرها في 1 و 5 و 15 دقيقة وكان كمياً عدد المجاميع بعد 5 دقائق من الاختلاط.
يظهر الشكل 4A الصور التمثيلية للخلية فحوصات التجميع بين الخلايا الدرجة S2 و S2-دلتا مستقرة لتقييم آثار شمس دينار كويتي على الربط بين مستقبلات الشق و عبر-دلتا. إظهار الصور التجميع نقاط ثلاث مرات (1 و 5 و 15 دقيقة). للتحكم في الخلفية، كانت مختلطة عادي الخلايا S2 (تعامل مع دسرنا شمس ) مع الخلايا S2-دلتا. اجفب دسرنا تعامل الخلايا الدرجة S2 شكلت المجاميع مع خلايا S2-دلتا، التي تتزايد مع مرور الوقت. وفي المقابل، شمس دسرنا تعامل الخلايا S2-الشق تشكيل المجاميع أسرع، والمجاميع كانت أكبر وأكبر في عدد من عنصر التحكم منها (الشكل 4 باء). هذا يشير إلى أن انخفاض مستويات شمس يعزز ترانس-ملزمة من الدرجة الأولى مع دلتا8.
لفحص ما إذا كان شمس ينظم تأثير المثبطة رابطة الدول المستقلة-يغاندس على الربط بين الدرجة و عبر-دلتا، أنشأنا هذا التعبير المشارك من الدرجة الأولى ودلتا أولاً في الإشارة-تلقي خلية يمكن إنقاص تجميع الخلايا بالدرجة الأولى، و عبروساطة-دلتا. الشكل 5A يظهر الرسم البياني يشير إلى عدد المجاميع التي تشكلت بين S2-دلتا والدرجة S2 & خلايا دلتاعابر مع كميات مختلفة من رابطة الدول المستقلة-دلتا. ترانسفيكتينج كميات متساوية من الدرجة ودلتا التعبير بنيات داخل الخلايا S2 كبير يقلل عدد المجاميع التي تشكلت بين هذه الخلايا والخلايا S2-دلتا. وعلاوة على ذلك، إنقاص مقدار من رابطة الدول المستقلة-دلتا يؤدي إلى زيادة في عدد المجاميع، مما يدل على أن في نطاق الدرجة/رابطة الدول المستقلة-دلتا النسب المستخدمة في هذه الاختبارات، رابطة الدول المستقلة-دلتا يمكن أن تحول دون الربط بين الدرجة و ترانس-دلتا بطريقة تعتمد على الجرعة. منذ S2-الشق & خلايا دلتاعابر التعبير عن الشق والدلتا، فإنها قد تشكل مجاميع هوموتيبيك مستقلة عن الخلايا S2-دلتا. لفحص إذا كان تشكيل هوموتيبيك تجمع بين الدرجة S2 & خلايا دلتاعابر يمكن أن يكون أحد عوامل المؤثرة الأخرى في رابطة الدول المستقلة-تثبيط فحوصات هو موضح في الشكل 5A، نحن المختلطة هذه الخلايا مع خلايا S2 وكمياً المجاميع. 5B الرقم يظهر عدد المجاميع التي تشكلت بعد خلط الخلايا S2 مع الشق S2 & خلايا دلتاعابر معربا عن الشق مختلف/رابطة الدول المستقلة-نسب دلتا. ولوحظ عدد صغير بدلاً من المجاميع هوموتيبيك مقارنة بالمجاميع الغيروية كما هو موضح في الشكل 5 ألف . نخلص إلى أن هذه الاختبارات التجميع إخلاص قياس الأثر رابطة الدول المستقلة-دلتا في الربط بين الدرجة و عبر-دلتا.
درسنا القادم أثر شمس دينار كويتي على قدرة المثبطة رابطة الدول المستقلة-دلتا. لهذا الغرض، وتجميع بين دلتا S2 و S2-الدرجة & تم فحص خلايا دلتاعابرة . ويبين الشكل 6A الصور التمثيلية للتجميع بين الخلايا S2-دلتا والدرجة S2عابرة (تحكم) أو الدرجة S2 & خلايا دلتاعابرة . S2-دلتا اجفب دسرنا معاملة الدرجة S2عابر الخلايا وتشكيل المجاميع، التي تتزايد مع الوقت، مماثلة للتجميع بين S2-دلتا ومستقرة الدرجة S2 الخلايا (الشكل 4). جدير بالذكر أن خلط S2-دلتا والدرجة S2 & الخلاياعابرة دلتا transfected اشتركت مع كميات متساوية من الشق ودلتا التعبير والبلازميدات شكلت أقل المجاميع إلى اجفب دينار كويتي و شمس دينار كويتي، مما يوحي بأن تناقص مستوى شمس لا يؤثر على قدرة رابطة الدول المستقلة-دلتا لمنع الشق/ترانس-دلتا ملزمة. إلى تقييم أفضل لآثار شمس دينار كويتي عن النشاط رابطة الدول المستقلة-دلتا، ضخامة تثبيط رابطة الدول المستقلة-دلتا تم قياسه بواسطة حساب النسبة المئوية التجميع النسبي عبر نطاق من الشق/رابطة الدول المستقلة-دلتا نسب كما هو موضح في المقطع 3.4.2. أظهر التقدير الكمي للتجميع النسبي تثبيط قابلة لمقارنة للتجميع عند معاملة دسرنا اجفب و شمس (الشكل 6B). معا، هذه الملاحظات تشير بقوة إلى أن فقدان إكسيلوسيليشن يعزز ترانس-ملزمة دون التأثير على رابطة الدول المستقلة-تثبيط8، وتوفر إليه جزيئية للجناح الوريد النمط الظاهري الخسارة في شمس طفرات.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للخلية تجميع المقايسة عبر-ملزمة. رسم تخطيطي يوضح تحريض مستقبلات (S2-الدرجة) ويجند (S2-دلتا أو S2 سيراتي) وإذ تعرب عن الخلايا S2 من 0.7 مم CuSO4. ويعقب التعريفي لكلا الخليتين S2 الاختلاط، الذي يميل إلى جعل المجاميع. هذه المجاميع (> 6 خلايا) يتم تصويرها وتقديرها كمياً.الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التمثيل التخطيطي للخلية تجميع المقايسة لتقييم رابطة الدول المستقلة-تثبيط. تم transfected الخلايا S2 عابر مع pMT-الدرجة الأولى (S2-Nعابرة) و الشق pMT pMT-دلتا (S2-الدرجة & دلتاعابر)، أو pMT-الدرجة و pMT-سيراتي (الدرجة S2 & سيراتيعابرة). بعد التعريفي 0.7 مم CuSO4 والاختلاط مع خلايا S2-دلتا، المجاميع (> 6 خلايا) تحدد كمياً. تثبيط رابطة الدول المستقلة-يغاندس يقاس من حيث النسبة المئوية التجميع النسبي في حضور وغياب كل رابطة الدول المستقلة-يجند. آثار رابطة الدول المستقلة-يغاندس على الربط بين الدرجة و عبر-سيراتي يمكن تحديده من خلال خلط الخلايا transfected عابر مع خلايا S2 سيراتيتوم (غير معروضة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تجميع بين الدرجة S2 و S2 أو خلايا دلتا S2 في نقاط زمنية مختلفة- ويبين الرسم البياني عدد المجاميع كل مل في نقاط زمنية مختلفة (1، 5 و 15 و 30 دقيقة) بين أنواع الخلايا المشار إليها. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ القياسي للمتوسط (SEM) replicates الثلاثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: خلية التجميع "وساطة من" الدرجة و عبر-دلتا. الصور (أ) إظهار التجميع في نقاط زمنية مختلفة (1 و 5 و 15 دقيقة). تجميع بين شمس دسرنا تعامل عادي S2 الخلايا والخلايا S2-دلتا اتخذ كخلفية عنصر التحكم. شمس-دسرنا معاملة الدرجة S2 الخلايا تظهر زيادة في العدد وحجم المجاميع مقارنة بمعاملة دسرنا اجفب (مراقبة) خلايا S2-الدرجة بعد الاختلاط مع خلايا دلتا S2. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) التحديد الكمي لعدد من الخلايا الركام أكبر من 6 خلايا بعد 5 دقائق من التجميع. أشرطة الخطأ تشير إلى sem. * ف < 0.01 (One-way تحليل التباين (ANOVA)). وأجريت replicates الثلاثة مع ثلاثة يكرر مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: رابطة الدول المستقلة-يمنع دلتا في خلية الإجمالي تشكيل "وساطة" الشق و عبر-دلتا بطريقة تعتمد على جرعة. (A) يظهر الرسم البياني بتجميع (من حيث عدد المجاميع مليلتر) بين S2-دلتا الخلايا والخلايا S2 transfected عابر مع نسب مختلفة من ناقلات التعبير للشق و رابطة الدول المستقلة-دلتا (1:0. 1:1, 1:0، 5، 1:0.2 و 1:0. 1). أشرطة الخطأ تشير إلى sem. * ف < 0.01 (One-way ANOVA). وأجريت replicates الثلاثة مع ثلاثة يكرر مستقلة. نلاحظ أن تناقص مستوى رابطة الدول المستقلة-دلتا يؤدي إلى زيادة في التجميع، يرجح أن سبب انخفاض رابطة الدول المستقلة-تثبيط. (ب) الرسم البياني عرض التجميع هوموتيبيك (من حيث عدد المجاميع كل مل) في الخلايا S2 عابر transfected مع نسب مختلفة من الدرجة الأولى ودلتا (1:0. 1:1, 1:0، 5، 1:0.2 و 1:0. 1) ومختلطة مع خلايا S2 عادي. أشرطة الخطأ تشير إلى عدد المجاميع sem. أصغر بكثير من عدد المجاميع الغيروية شكلت بين S2-دلتا والدرجة S2 & خلايا دلتاعابرة . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: ضربة قاضية شمس لا يؤثر على "النشاط المثبطة" رابطة الدول المستقلة-دلتا. الموضح (A) صور الممثل أثر شمس دينار كويتي في رابطة الدول المستقلة-دلتا-وساطة تثبيط تراكم الخلية بوساطة من الدرجة/ترانس-دلتا ملزمة. وتظهر الصور التجميع في نقاط زمنية مختلفة (1 و 5 و 15 دقيقة). تجميع بين شمس دسرنا تعامل عادي S2 الخلايا والخلايا S2-دلتا اتخذ كخلفية عنصر التحكم. مماثلة ستابلي transfected الخلايا S2-الشق، شمس دينار كويتي زيادة عدد المجاميع بين S2-دلتا وخلاياعابر S2-الدرجة بالمقارنة مع التحكم (اجفب معاملة دسرنا). التعبير المشترك رابطة الدول المستقلة-دلتا بالدرجة الأولى بنسبة 1:1 نتج عنه انخفاض مماثلة في عدد المجاميع في عنصر التحكم (اجفب معاملة دسرنا) كذلك كما هو الحال في الخلايا دسرنا تعامل شمس . شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يبين الشكل (ب) التجميع النسبي بين S2-دلتا الخلايا والخلايا S2 عابر شارك transfected مع النسب المشار إليها (1:0. 1:1, 1:0، 5، 1:0.2 و 1:0. 1) الشق و رابطة الدول المستقلة-دلتا. العلاج دسرنا اجفب و شمس تظهر انخفاض مماثل في التجميع في كل درجة/رابطة الدول المستقلة-نسبة دلتا. البيانات المقدمة هنا هي الممثل لثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يشير الشق الكنسي يعتمد على التفاعلات بين مستقبلات الشق و يغاندس5. على الرغم من أن معظم الدراسات في المسار الشق النظر أساسا الربط من الدرجة الأولى ويغاندس في الخلايا المجاورة (ترانس)، تتفاعل الشق ويغاندس نفس الخلية، وهذه ما يسمى رابطة الدول المستقلة-التفاعلات يمكن أن تلعب دوراً مثبطة في الشق مما يشير إلى3،4. وبناء على ذلك، فك الآليات الكامنة وراء آثار التعديل على إشارات الشق الكنسي، أنها غالباً ما ذات الصلة لدراسة كلا النوعين من التفاعلات الشق-يجند (ترانس و رابطة الدول المستقلة). بيد في العديد من السياقات أثناء التنمية الحيوانية، يعقد مشاركة كل من هذه التفاعلات وتنظيمها بالتغذية المرتدة في فيفو الدراسات1،6. في هذا البروتوكول، نقدم منهجية مفصلة للخلية في المختبر فحوصات التجميع باستخدام خلايا S2 المورفولوجية لتقييم ربط مستقبلات الشق مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة- يغاندس. وقد قدمنا الاستفادة من هذه المنهجية لتقييم تأثير التعديل الوراثي للشق الإشارات (إكسيلوسيلترانسفيراسي شمس7،8) على ربط مستقبلات-يجند.
أولاً، تم إجراء فحوصات التجميع بين دلتا S2 مستقرة و اجفب أو شمس تعامل دسرنا مستقرة S2-الشق الخلايا لدراسة تأثير شمس دينار كويتي على ترانس-ملزمة. تجميع الخلايا S2-دلتا مع شمس دسرنا تعامل الخلايا S2 عادي اتخذ كخلفية عنصر التحكم. شمس دينار كويتي تعزيز التجميع بين S2-الدرجة وخلايا دلتا S2 مقارنة بعنصر التحكم. من المهم أن أداء المجموعات التجريبية التحكم الخلفية بين عادي S2 الخلايا والخلايا الحاملة ليجند S2 بالتوازي مع ترانس-ملزم التجارب. على الرغم من أن لا تعبر عن المورفولوجية S2 الخلايا مستقبلات درجة الذاتية ودلتا يجند11، يرد التعبير عن مستويات منخفضة من سرت في S2 الخلايا13. ونظرا لهذا، استخدمت عادي S2 الخلايا في الخلية تجميع فحوصات كخلفية عنصر التحكم؛ ولم تظهر هذه الخلايا أي التجميع (الشكل 5 (ب)). يتم حساب المجاميع يدوياً باستخدام هيموسيتوميتير. لضمان الاتساق في التقدير الكمي التجميعية، يمكن بيبيتيد 10-20 ميليلتر من الخلايا المختلطة السكان خارجاً من على الأقل ثلاثة مجالات مختلفة كل بئر للعد. تتطلب هذه فحوصات صحية الخلايا S2 المتنامية. وبالنظر إلى طبيعة شبه ملتصقة S2 الخلايا، لطيف بيبيتينج حين جمع الخلايا وثابت تهتز أثناء الفحص التجميع مهمة.
سابقا، ونحن وآخرون قد استخدمت فحوصات ملزمة مستقبلات يجند الراسخة، والقابلة للذوبان لتقييم كمي ليجند مستقبلات ملزم في ترانس17،،من1819، 20-نظراً لفحوصات التجميع شبه كمي، فحوصات ملزم يجند القابلة للذوبان أجريت أيضا دراسة تأثير شمس دينار كويتي على الشق-يجند ترانس-ملزمة. وكانت نتائج الملاحظة مماثلة في الاتجاه مع تلك التي تم الحصول عليها من تجميع الاختبارات8. وهذا يشهد على تقييم المؤمنين ملزمة من الدرجة الأولى مع ترانس-يغاندس استخدام فحوصات تجميع الخلية. على الرغم من تشكيل مجموع قراءات من مستقبلات-يجند ملزمة، يمكن أن تكون معقدة إذا كان التعبير السطحي من مستقبلات الشق أو يغاندس به يتأثر بمعدلات معينة. ويبرز هذا الحد فحوصات تجميع الخلايا، كما أنه لا يمكن تمييزها إذا كان التغيير في تشكيل التجميعية بسبب ملزم يجند مستقبلات غيرت أو تغيير التعبير السطحي. ولذلك، موازية لفحوصات التجميع، آثار كل معدل على التعبير السطحي من الدرجة الأولى ويغاندس يحتاج إلى اختبار في الخلايا S2. في سياق الدراسات لدينا، لم تتأثر مستويات سطح الدرجة ودلتا في شمس تعامل دسرنا S2 الخلايا8.
دراسة تثبيط ترانس-ملزمة بالإضافة إلى رابطة الدول المستقلة-يغاندس، تجميع فحوصات أجريت بين S2-دلتا الخلايا و اجفب أو شمس تعامل دسرنا S2-الدرجة & خلايا دلتاعابر . تمت مقارنة عدد المجاميع التي تشكلت بين هذه الخلايا مع عدد المجاميع التي تشكلت بين S2-دلتا الخلايا والخلاياعابرة S2-الدرجة. حساب الانخفاض النسبي في عدد المجاميع ويستخدم كمؤشر لحجم تثبيط رابطة الدول المستقلة-دلتا. مراقبة التجارب أظهرت أن رابطة الدول المستقلة-يغاندس إظهار تثبيط قوية وتعتمد على الجرعة من الدرجة/ترانس-دلتا الربط عبر طائفة واسعة بدلاً من الشق رابطة الدول المستقلة-يجند نسب (1:1 إلى 1:0. 1) (الشكل 5A)8 . أدت إلى نسبة 1:1 بدرجة أقوى من رابطة الدول المستقلة-تثبيط وتقليل المستوى النسبي رابطة الدول المستقلة-دلتا تضعف رابطة الدول المستقلة-تثبيط. وبناء على ذلك، أجريت التجارب دينار كويتي على هذا النطاق من نسب. من المذكرة، أبقى مقدار مستقبلات الشق والمبلغ الإجمالي للحمض النووي transfected ثابت في جميع التجارب. وهذا يضمن أن تشكيل الكلي يتأثر أساسا بنشاط رابطة الدول المستقلة-يغاندس ولا بتغيير مستويات التعبير الشق من الخلايا.
سابقا وتبين أن التعبير المشارك من الدرجة الأولى، و رابطة الدول المستقلة-يغاندس في الخلايا S2 يمكن أن يسفر تشكيل تجمعات هوموتيبيك14. لفحص ما إذا كانت مماثلة تجميعات هوموتيبيك بين الدرجة S2 & دلتاعابرة أو الدرجة S2 &عابرة سيراتي الخلايا يمكن أن تمس لدينا تفسيرات كوانتيفيكيشنز التجميعية في رابطة الدول المستقلة-يجند الدراسات، أنجز مقايسة تجميع تحكم بين الدرجة S2 & دلتاعابر وعادي S2 الخلايا. وكان عدد S2 الخلايا المستخدمة في هذه التجارب نفس S2-دلتا الخلايا المستخدمة في رابطة الدول المستقلة-تجارب دلتا. ولوحظ بعض التجميع هوموتيبيك، ولكن التقدير الكمي وأظهرت أن المجاميع الناتجة في جزء منخفضة من المجاميع الإجمالية بالمقارنة مع المجاميع الغيروية بين الدرجة S2 & دلتاعابرة ودلتا S2 الخلايا ( الشكل 5 (ب)).نخلص إلى أن التغييرات التي لوحظت في عدد المجاميع في رابطة الدول المستقلة-يجند فحوصات أساسا بسبب تأثير المثبطة رابطة الدول المستقلة-يغاندس على الربط بين الدرجة و عبر-دلتا.
وباختصار، توفير فحوصات التجميع الواردة في هذا البروتوكول بمنهجية سهلة ومباشرة لتقييم شبه كمي ترانس-و رابطة الدول المستقلة-التفاعلات مستقبلات الشق وبه يغاندس. هذه الاختبارات يمكن استخدامها لدراسة آثار معدلات المسار الشق الوراثية أو الدوائي على الشق-يجند ملزمة في المختبر ولذلك يمكن أن تساعد في توضيح الآليات الكامنة في فيفو آثار هذه المعدلات على الشق الإشارات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد المؤلفون لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب الاعتراف بدعم من المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس (R01GM084135 هجن) ومؤسسة ميزوتاني جليكوسسينسي (منحة #110071 هجن)، وهي ممتنة للي ف توم للمناقشات والاقتراحات المتعلقة الاختبارات، وسبيروس أرتافانيس-تساكوناس، "هوغو بيلين"، روبرت فليمينغ، إيرفين كين ومركز الموارد الجينومية المورفولوجية (دجرك) البلازميدات وخطوط الخلية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
References
- de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
- Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
- del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
- Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
- Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).
- Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).
- Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
- Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
- Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
- Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
- Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
- Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
- Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).
