Summary
המורכבות של מערכות ויוו מקשה להבחין בין הפעלת עיכוב של קולטן חריץ על ידי טרנס- ו - cis-ליגנדים, בהתאמה. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מבוסס על במבחנה תא-צבירת מבחני הערכה כמותיים למחצה של הכריכה של חריץ דרוזופילה טרנס-ליגנדים vs cis-ליגנדים.
Abstract
חריץ איתות הינה מערכת תקשורת תא שנשמרת אבולוציונית-תא בשימוש נפוץ חיות פיתוח ותחזוקה למבוגרים. האינטראקציה של הקולטן חריץ עם ליגנדים מגבולות התאים גורם ההפעלה של מסלול איתות (טרנס-הפעלה), תוך אינטראקציה עם ליגנדים מאותו תא מעכב איתות (cis-עיכוב). האיזון הראוי בין הטרנס-הפעלה ו- cis-עיכוב מסייעת בהקמת רמות אופטימלית של חריץ איתות בהקשרים מסוימים במהלך התפתחות בעלי חיים. בגלל על התחומים ביטוי חופפים בין החריץ שלה ליגנדים סוגי תאים רבים על קיום מנגנוני משוב, לומד את ההשפעות של שינוי post-translational נתון על טרנס- לעומת cis-האינטראקציות של דרגה, קשה שלה ליגנדים ויוו . כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור שימוש בתאים דרוזופילה -S2 תא-צבירת מבחני כדי להעריך את ההשפעות של מפילה את צירוף מסלול חריץ על הכריכה של חריץ כדי כל ליגנד טרנס , ב- cis. S2 תאים stably או transiently transfected עם חריץ-להביע וקטור מעורבבים עם תאים לבטא כל ליגנד דרגה (S2-דלתא או מסורית-S2). טרנס-מחייבים בין קולטן ליגנדים גורמת להיווצרות של אגרגטים תא heterotypic, נמדד במונחים של מספר אגרגטים לכל mL המורכב > 6 תאים. כדי לבחון את ההשפעה המעכבת של cis-S2 תאים משותפת להביע חריץ ואת כל ליגנד מעורבבים עם תאים S2-דלתא או S2-מסורית של ליגנדים, המספר של אגרגטים הוא לכמת כמתואר לעיל. הירידה היחסית במספר של אגרגטים בשל נוכחותם של cis-ליגנדים מספק מידה של cis-ליגנד-מתווכת עיכוב של טרנס-איגוד. אלה מבחני פשוטה יכול לספק נתונים כמותיים למחצה על ההשפעות של גנטית או תרופתי מניפולציות על הכריכה של חריץ כדי ליגנדים שלה, יכול לעזור לפענח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס ויוו השפעות כזה מניפולציות על חריץ איתות.
Introduction
איתות חריץ קאנוני הוא מנגנון תקשורת לתא לטווח קצר הדורש מגע פיזי של השכנה תאים כדי להקל על האינטראקציה בין קולטני חריץ שלהם ליגנדים1. האינטראקציה של חריץ קולטן (קיים על פני תאי קליטת אות) עם ליגנדים (בהווה על פני השטח של שליחת אות תאים) יוזם חריץ איתות, המכונה הטרנס-הפעלת2. מצד שני, האינטראקציה בין החריץ שלה ליגנדים באותו התא מוביל אל עיכוב של מסלול חריץ, ידועה בשם cis-עיכוב3. האיזון בין הטרנס- cis-האינטראקציות נדרש כדי להבטיח חריץ תלויות ליגנד-אופטימלי איתות4. דרוזופילה יש קולטן חריץ אחד, שני ליגנדים (דלתא ו Serrate) לעומת יונקים, אשר יש קולטנים דרגה ארבע חמש ליגנדים [משוננים 1 (JAG1), JAG2, כמו דלתא 1 (DLL1), DLL3, DLL4]5. המודל דרוזופילה נתקל הפשטות, מציע את הקלות כדי לנתח/לימוד ההשפעות של מסלול מכפילי על אינטראקציות חריץ-ליגנד ובעקבות כך על חריץ איתות. בהקשרים מסוימים במהלך התפתחות בעלי חיים (כולל אגף פיתוח בדרוזופילה), הן cis- והן הטרנס-האינטראקציות מעורבים איתות חריץ המתאים ושאיפה תא גורל1,6 . חשוב להבחין את ההשפעות של חריץ מכפילי מסלול בהקשרים אלה ב- cis- לעומת הטרנס-האינטראקציות של חריץ עם ליגנדים שלה.
הקבוצה שלנו דיווחו בעבר כי תוספת של משקע פחמימות שנקרא xylose כדי חריץ דרוזופילה שלילית מווסת את חריץ איתות בהקשרים מסוימים, כולל אגף פיתוח7. אובדן שמס (האנזים הזה xylosylates דרגה) שמוביל פנוטיפ "אובדן וריד כנף"7. לאחרונה, ג'ין המינון ניסויים וניתוח המשובטים שימשו כדי להראות כי אובדן שמס מגבירה את חריץ בתיווך דלתא להתמקד. כדי להבחין בין אם באיתות חריץ משופרת במוטציות שמס הוא תוצאה של ירידה cis-עיכוב או מוגבר טרנס-הפעלה, ביטוי חוץ רחמי מחקרים של ליגנדים דרגה ב דיסקים דמותי כנף זחל בוצעו באמצעות מנהל התקן dpp-GAL4 . ניסויים אלה סיפק ראיות שמרמזות על כך שמס מווסת את טרנס-הפעלה של חריץ על ידי דלתא מבלי להשפיע על הרמה cis-עיכוב על ידי ליגנדים8. עם זאת, הזנה-בחזרה תקנות, ההשפעות של ליגנדים אנדוגני עלול לסבך את הפרשנות של ביטוי חוץ רחמי מחקרים1,6,9.
כדי לפתור בעיה זו, תאים S2 דרוזופילה 10 שימשו, אשר מספקים מערכת פשוטה במבחנה חריץ-ליגנד אינטראקציה מחקרים11,12. תאים S2 לא אקספרס אנדוגני חריץ קולטן ו- ליגנד דלתא11 ולבטא רמה נמוכה של מסורית13, אשר אינה משפיעה על הרמה-ליגנד צבירה ניסויים8. לכן, S2 תאים יכולים להיות stably או transiently transfected על ידי חריץ ו/או ליגנדים בודדים (דלתא או Serrate) כדי ליצור תאים המבטאים באופן בלעדי את הקולטן חריץ או באחד ליגנדים שלה, או שילוב של אותם. ערבוב של תאים לבטא חריץ S2 עם הבעת-ליגנד S2 תאים תוצאות להיווצרות של אגרגטים heterotypic מתווכת על-ידי ליגנד קולטן איגוד11,12,14. כימות של היווצרות צבירה מספק מידה של טרנס-מחייב בין החריץ שלה ליגנדים15 (איור 1). באופן דומה, תאים S2 יכול להיות שותף transfected עם ליגנדים חריץ, דלתא או Serrate (דהיינו cis-ליגנדים). Cis-ליגנדים בתאים אלה S2 לבטא חריץ מחסלים. את הכריכה של חריץ עם טרנס-תוצאה של ליגנדים ירד היווצרות הצבירה8,12,14. הירידה היחסית במבנה הצבירה הנגרמת על ידי חבר העמים-ליגנדים מספק מדד ההשפעה המעכבת של cis-ליגנדים על איגוד בין הרמה הטרנס-ליגנדים (איור 2). בהתאם לכך, מבחני צבירת תא נוצלו לבחון את ההשפעה של אובדן xylosylation על טרנס- ו - cis-האינטראקציות בין דרגה ליגנדים שלה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור תא צבירת מבחני שנועדה להעריך את הכריכה של חריץ עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים באמצעות תאים S2 דרוזופילה . לדוגמה, אנו מספקים את הנתונים אפשרה לנו לקבוע את ההשפעה של חריץ xylosylation על איגוד בין הרמה הטרנס-דלתא8. אלה מבחני ישירה לספק הערכה כמותית למחצה של חריץ-ליגנד אינטראקציות במבחנה , לעזור לקבוע את המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההשפעות ויוו ממגבילי מסלול חריץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה של RNA תקועים כפול (dsRNA) נוקאאוט שמס
- PCR הגברה של המוצרים
- להשתמש DNA גנומי פראי-סוג לבן צהוב (y w) ו pAc5.1-EGFP כמו תבנית זוגות פריימר הבאים כדי להגביר את שברי DNA המשמשים סינתזה dsRNA. להשתמש בפרופיל תרמי PCR הבאים: דנטורציה (95 ° C, 30 s), מחזק (58 ° C, 30 s) והסיומת (72 ° C, 1 דקות).
משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) dsRNA תחל (5' - 3')-
פריימר לפנים-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
הפוך פריימר-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
שמס dsRNA תחל (5' - 3')-
פריימר לפנים-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
הפוך פריימר-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
הערה: EGFP dsRNA משמש בקרה שלילית.
- להשתמש DNA גנומי פראי-סוג לבן צהוב (y w) ו pAc5.1-EGFP כמו תבנית זוגות פריימר הבאים כדי להגביר את שברי DNA המשמשים סינתזה dsRNA. להשתמש בפרופיל תרמי PCR הבאים: דנטורציה (95 ° C, 30 s), מחזק (58 ° C, 30 s) והסיומת (72 ° C, 1 דקות).
- ג'ל-לטהר המוצרים תגובת שרשרת (PCR) פולימראז באמצעות ערכת טיהור ג'ל מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן.
- לבצע במבחנה תמלול באמצעות מוצר מסחרי מסוגל תעתיק של מקדם T7 לפי הפרוטוקול של היצרן.
- לטהר את dsRNA באמצעות ערכת טיהור RNA לפי הפרוטוקול של היצרן ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
- להעריך את היעילות של נוקאאוט שמס באמצעות השלבים הבאים (1.5.1-1.5.5).
- ספירת התאים באופן ידני באמצעות hemocytometer ותאי 5 x 105 S2 צלחת כל טוב של 6 טוב צלחת 1 מ"ל/טוב של המדיום של שניידר בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין....
- להוסיף 7.5 µg של EGFP- או שמס dsRNA מכל קידוח, דגירה 25 ° c במשך 24 שעות ביממה.
- קציר הפקד (EGFP שטופלו dsRNA) ותאים שמס שטופלו dsRNA S2 מאת pipetting עדין ואחריו pelleting למטה על ידי צנטריפוגה-1000 g x עבור 5 דקות 25 ° c ותהליך לבידוד RNA באמצעות ערכת חילוץ RNA לפי הפרוטוקול של היצרן.
- לכמת את הרנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים תהליך 100 ננוגרם של RNA עבור לרביעיית 1-צעד-שימוש qPCR מסחרי ריאגנטים, פריימר/רגשים והפרופיל הבאים PCR תרמי PCR: דנטורציה (95 ° C, 15 s) והסיומת Annealing / (60 ° C, 1 דקות).
הערה: נא עיין טבלה של חומרים למידע על ערכות פריימר/בדיקה, כלי המשמש עבור ניסויים לרביעיית-PCR שמס , בקרת במחקרים אלה. - לחשב את רמות ה-mRNA היחסי שמס באמצעות 2–ΔΔCT שיטת16.
2. הערכה של האיגוד בין דרגה קולטן הטרנס-ליגנדים
- להכין את קליטת אות תאים (S2 תאים המבטאים את הקולטן חריץ).
- לספור את התאים באופן ידני באמצעות hemocytometer, צלחת 5 x 105 S2 ו- S2-דרגה יציבה, בתאים מכל קידוח של צלחת. ובכן 6 ב 1 מ"ל/טוב של המדיום של שניידר בתוספת 10% FBS ו פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין....
הערה: עבור חריץ S2 תאים, אשר הינם זמינים מן מרכז משאבים גנומיקה דרוזופילה (DGRC), הוסף 200 ננומטר מטוטרקסט בתקשורת. כדי להכין פתרון מניות של מטוטרקסט 0.5 מ מ, יש להכין תחילה פתרון מטוטרקסט 20 מ מ ב- 250 µL של 1 M NaOH. בשלב הבא, לדלל שפתרון זה 0.5 מ מ 1 מ' מאגר פוספט תמיסת מלח וחנות ב-20 ° C. בתאים חריץ S2, ביטוי של החלבון חריץ הוא תחת השליטה של האמרגן metallothionein דרוזופילה ב- pMT וקטור. - להוסיף 7.5 µg של dsRNA מכל קידוח, דגירה 25 ° c במשך 24 שעות ביממה.
- הוסף 0.7 מ מ CuSO4 זירוז הביטוי של חריץ, דגירה 25 ° c למשך 3 ימים.
הערה: CuSO4 משמש כדי לעודד ביטוי של חלבונים נשלט על ידי האמרגן metallothionein.
- לספור את התאים באופן ידני באמצעות hemocytometer, צלחת 5 x 105 S2 ו- S2-דרגה יציבה, בתאים מכל קידוח של צלחת. ובכן 6 ב 1 מ"ל/טוב של המדיום של שניידר בתוספת 10% FBS ו פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין....
- להכין את התאים. שולח אות (S2 תא לבטא ליגנדים דלתא או Serrate).
- לספור את התאים באופן ידני באמצעות hemocytometer וצלחת ~ 5 x 106 יציב S2-דלתא או S2-מסוריתטום תאים כל טוב של צלחת. ובכן 6 ב 1 מ"ל/טוב של המדיום של שניידר בתוספת 10% FBS ו פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין....
הערה: להוסיף 200 ננומטר מטוטרקסט עבור תאי דלתא S2 ו 100 hygromycin µg/mL עבור תאים S2-מסוריתטום בתקשורת. ביטוי של דלתא, מסוריתטום— גרסה מתויג עגבניות, פונקציונלי של מסורית12— תחת דרוזופילה יזם metallothionein ב- pMT וקטור. - הוסף 0.7 מ מ CuSO4 זירוז הביטוי של ליגנדים, דגירה 25 ° c במשך 3 שעות.
- לספור את התאים באופן ידני באמצעות hemocytometer וצלחת ~ 5 x 106 יציב S2-דלתא או S2-מסוריתטום תאים כל טוב של צלחת. ובכן 6 ב 1 מ"ל/טוב של המדיום של שניידר בתוספת 10% FBS ו פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין....
- לבצע צבירה בין האות-לשליחה וקבלה אות תאים.
- הקציר S2 שטופלו dsRNA (בקרה) ותאים S2 חריץ pipetting עדין, צלחת 2.5 10x5 תאים/היטב לתוך צלחת 24-ובכן לאחר ספירה ידנית על-ידי hemocytometer.
- מוסיפים 5 x 105 יציב S2-דלתא S2-מסוריתטום תאים או הנפח הכולל של 200 µL בינוני של שניידר (בתוספת 10% FBS ו פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין...).
הערה: כל התאים S2 טיפול (כולל טיפול יופיצ, אינדוקציה, dsRNA) נעשתה תחת אבטחה ארון. - מניחים את הצלחת על תפקודי לב / נשימה-150 סל ד (ראד 942.48/דקה).
- לאחר 1 דקות, מערבבים את התוכן של כל טוב, להוציא 20 µL לספירת מספר אגרגטים.
- במקביל לקחת תמונה ייצוגית תחת הפוך מיקרוסקופים המתחם באמצעות הגדלה x 10 (PLL 10/0.25 המטרה).
- באופן ידני לספור מצרפי (> 6 תאים) באמצעות של hemocytometer.
- מניחים את הצלחת על מטרף.
- חזור על רכישת התמונה וסופר לאחר 5 דקות, 15 דקות של מצבור.
- לבצע כימות של טרנס-איגוד.
- לחשב את המספר של אגרגטים לכל mL בין S2 תאים ותאים S2-דלתא או S2-מסוריתטום כפקד רקע.
- לחשב את מספר אגרגטים לכל מ ל S2 חריץ בין תאים S2-דלתא או S2-מסוריתטום (סדר הגודל של טרנס-מחייב).
3.הערכה של עיכוב של האיגוד בין הרמה הטרנס-ליגנדים מאת Cis-ליגנדים
- להכין את קליטת אותות התאים.
- צלחת 5 x 10 תאים5 S2 היטב בכל צלחת. ובכן 6 ב 1 מ"ל/טוב של המדיום של שניידר בתוספת 10% FBS ו פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין....
- להוסיף 7.5 µg של dsRNA מכל קידוח, דגירה 25 ° c במשך 24 שעות ביממה.
- שיתוף transfect התאים שטופלו dsRNA עם pBluescript ו- pMT-דרגה11 (DGRC) לבד או עם חריץ pMT , pMT-דלתא11 (DGRC) או מסורית-pMT17 עבור סכום ריכוז ה-DNA של 2 µg/היטב באמצעות ריאגנט תקנים מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן.
הערה: pBluescript משמש פקד. התאים משותפת transfected ייקרא S2 חריץ & דלתאארעי או חריץ S2 & מסורית תאיםארעי להלן. - דגירה התאים S2 transiently transfected ב 25 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
- הוסף 0.7 מ מ CuSO4 זירוז הביטוי של הרמה, על ליגנדים, דגירה 25 ° c למשך 3 ימים.
- להכין את התאים. שולח אות כמתואר ב- 2.2.
- לבצע צבירה בין תאים. שולח אות וקליטת אות כמתואר בסעיף 2.3.
- לכמת עיכוב של טרנס-מחייבות לפי חבר העמים-ליגנדים.
- לחשב את המספר של אגרגטים לכל mL בין S2 תאים ותאים S2-דלתא או S2-מסורית כפקד רקע.
- לכמת את סדר הגודל של עיכוב על ידי חבר העמים-ליגנדים כדלקמן.
- להגדיר A כמו מספר של אגרגטים בין חריץ S2ארעי ותאים S2-דלתא.
- הגדר B כמו מספר של אגרגטים בין תאים S2 transiently משותפת transfected עם חריץ ודלתא (S2-חריץ & דלתאארעי) ותאים S2-דלתא.
- חישוב צבירה היחסי C = (B x 100) /A
- לחשב את סדר הגודל של עיכוב על ידי חבר העמים- ליגנד (דלתא או Serrate) כמו 100 – C.
הערה: בתור דוגמה, אם צבירת היחסי הוא 45%, אז חבר העמים-ליגנדים נחשבים כדי לעכב את טרנס-מחייב ב- 55%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התצפיות ויוו הציע כי אובדן של ג'ין xylosyltransferase שמס התוצאות ברווח של חריץ איתות בשל מוגבר בתיווך דלתא הטרנס-הפעלה של חריץ מבלי להשפיע על cis-עיכוב של חריץ על ידי ליגנדים8. כדי לבדוק את הרעיון הזה, במבחנה תא צבירת מבחני בוצעו. ראשית, הביטוי שמס בתאים S2 היו על הרצפה באמצעות dsRNA שמס EGFP dsRNA שימש שליטה. היעילות של נוקאאוט (KD) נבדק על ידי ה-PCR בזמן אמת, הוצגה להיות גדול מ- 80%8. לאחר מכן, הכריכה של קולטן חריץ עם טרנס-דלתא על שמס KD נבדקה באמצעות מבחני צבירה. הצבירה בין תאים חריץ S2 ו- S2-דלתא נבחנה בנקודות זמן שונות לאחר ערבוב אותם. צבירת בין תאים S2 רגיל ותאים S2-דלתא נלקח רקע הפקד. איור 3 מראה גרף המציין את מספר אגרגטים שהוקמה ב שונים נקודות (1, 5, 15, 30 דקות) זמן, לאחר ערבוב. עלייה חדה נצפתה במספר של אגרגטים בין 1 ו- 5 דקות לאחר מכן, המספר של אגרגטים המשיך לגדול עד 30 דקות בקצב איטי יותר. לכן, צבירה היווצרות הגלקסיה צולמה ב- 1, 5 ו-15 דקות, המספר של אגרגטים הייתה לכמת אחרי 5 דקות של ערבוב.
איור 4A מציגה להחליפן בתמונות של תא צבירת מבחני בין תאים חריץ S2 ו- S2-דלתא יציב כדי להעריך את ההשפעות של שמס KD באיגוד בין דרגה קולטן הטרנס-דלתא. תמונות להראות את המצבור בנקודות שלוש פעמים (1, 5 ו-15 דקות). על רקע שליטה, תאים S2 רגיל (שטופלו שמס dsRNA) היו מעורבים עם תאים S2-דלתא. EGFP שטופלו dsRNA S2 חריץ תאים הקימו אגרגטים עם תאים S2-דלתא, אשר להגדיל את מספר עם הזמן. לעומת זאת, שמס שטופלו dsRNA S2 חריץ תאים נוצר אגרגטים מהר יותר, ואת מצרפי נעשו יותר גדול מאשר מספר הפקד אלה (איור 4B). זה צוין כי הפחתת רמות שמס משפר את טרנס-עקדת. חריץ עם דלתא8.
כדי לבחון אם שמס מסדיר את ההשפעה המעכבת של cis-ליגנדים על איגוד בין הרמה הטרנס-דלתא, תחילה הקמנו את הביטוי שיתוף של חריץ ודלתא ב האות-קבלת התא יכול להקטין את המצבור תא מתווך על ידי חריץ ושומן טראנס-דלתא. איור 5A מראה גרף המציין את מספר אגרגטים הנוצרת בין S2-דלתא S2 חריץ & תאיםארעי דלתא עם כמויות שונות של cis-דלתא. Transfecting כמויות שוות של חריץ-דלתא-הבעה בונה לתאים S2 באופן דרמטי מקטינה את מספר אגרגטים בין אלה תאים ותאים S2-דלתא. יתר על כן, להקטין את כמות cis-דלתא גורמת לעלייה, אגרגטים, בהתאם למספר המציין טווח בחריץ /חבר העמים-דלתא ויחסי בשימוש מבחני הללו, חבר העמים-דלתא יכול לעכב את האיגוד בין דרגה, טרנס-דלתא באופן תלוי מינון. מאז החריץ S2 & תאיםארעי דלתא אקספרס חריץ והן דלתא, הם שעלולים להיווצר homotypic אגרגטים בנפרד התאים S2-דלתא. כדי לבחון אם היווצרות של homotypic אגרגטים בין S2 חריץ & תאיםארעי דלתא יכול להיות גורם מבלבלים ב- cis-מבחני עיכוב שמוצג באיור 5A, אנחנו מעורבים תאים אלה עם תאים S2 ואת לכמת אגרגטים. איור 5B מציג את המספר של אגרגטים נוצר אחרי ערבוב S2 תאים עם חריץ S2 & דלתאארעי תאים המבטאים השונים דרגה /חבר העמים-דלתא יחסי. נצפתה מספר קטן למדי של אגרגטים homotypic בהשוואה אגרגטים heterotypic, כפי שמוצג באיור 5A . אנו מסיקים כי אלה מבחני צבירת בנאמנות למדוד את ההשפעה של cis-דלתא-מחייב בין הרמה הטרנס-דלתא.
אנו הבא בחן את השפעת שמס KD ביכולת המעכבת של cis-דלתא. זה סיום, צבירה בין S2-דלתא S2 חריץ & תאיםארעי דלתא נבדקה. איור 6A מציג תמונות נציג של מצבור בין תאים S2-דלתא ל S2 חריץארעי (בקרה) או חריץ S2 & תאיםארעי דלתא. S2-דלתא EGFP שטופלו dsRNA S2 חריץארעי ותאי הקימו אגרגטים, אשר מגבירים במספר עם הזמן, דומה צבירה בין S2-דלתא S2-דרגה יציבה תאים (איור 4). ראוי לציין, ערבוב S2-דלתא ו- S2 חריץ & דלתא תאיארעי transfected במשותף עם כמויות שוות של פלסמידים חריץ-דלתא-הביטוי נוצר פחות אגרגטים על EGFP KD והן KD שמס , רומז כי הפחתת הרמה של שמס אינו משפיע על היכולת של cis-דלתא לחסום את הרמה /טרנס-דלתא מחייב. כדי להעריך את ההשפעות של שמס KD על הפעילות של cis-דלתא, ההשלכות של עיכוב על ידי חבר העמים-דלתא נמדדה על ידי חישוב אחוז צבירה היחסי על פני טווח של חריץ /חבר העמים-דלתא יחסי גודל כפי שהוסבר בסעיף 3.4.2. כימות של צבירת יחסית הראה על עיכוב מקביל של צבירה בעת טיפול dsRNA EGFP ו שמס (איור 6B). יחד, תצפיות אלה ממליצים כי אובדן xylosylation מקדמת את טרנס-איגוד מבלי להשפיע על cis-עיכוב8, מספקים מנגנון מולקולרי פנוטיפ אובדן וריד כנף שנצפתה שמס מוטציות.
איור 1: ייצוג סכמטי של התא Assay צבירה עבור טרנס-איגוד. דיאגרמה המציגה את אינדוקציה של קולטן (S2-חריץ) וליגנד (S2-דלתא או מסורית-S2) תאים S2 לביטוי על ידי 0.7 מ מ CuSO4. אינדוקציה של שני התאים S2 מלווה על ידי ערבוב, אשר נוטה ליצור צבירות. אלה אגרגטים (> 6 תאים) עם תמונה, לכמת.אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ייצוג סכמטי של התא צבירת הנועד להעריך Cis-עיכוב. S2 התאים היו transiently transfected עם חריץ pMT (S2-Nארעי), חריץ pMT , pMT-דלתא (S2-חריץ & דלתאארעי), או חריץ pMT , pMT-מסורית (S2-חריץ & מסוריתארעי). לאחר אינדוקציה על ידי 0.7 מ מ CuSO4 ולערבב עם תאים S2-דלתא, אגרגטים (> 6 תאים) הם לכמת. עיכוב על ידי חבר העמים-ליגנדים נמדד במונחים של צבירת היחסי באחוזים הנוכחות ואת היעדר כל חבר העמים-ליגנד. ההשפעות של cis-ליגנדים על איגוד בין הרמה הטרנס-מסורית יכול להיקבע על ידי ערבוב התאים transiently transfected עם תאים S2-מסוריתטום (לא מוצג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: צבירת בין חריץ S2 ל S2 או תאים S2-דלתא בנקודות זמן שונות. הגרף מציג את המספר של אגרגטים לכל mL בנקודות זמן שונות (1, 5, 15, 30 דקות) בין סוגי תאים שצוין. קווי שגיאה מציינים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM) של שלושה משכפל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תא צבירת מתווך על ידי חריץ ושומן טראנס-דלתא. (א) תמונות להראות צבירת בנקודות זמן שונות (1, 5 ו-15 דקות). צבירת בין שמס שטופלו dsRNA רגיל S2 תאים ותאים S2-דלתא נלקח רקע הפקד. שמס- dsRNA מטופלים S2 חריץ תאים להראות עלייה במספר, גודל האגרגטים בהשוואה dsRNA שטופלו EGFP (בקרה) חריץ S2 תאים לאחר ערבוב עם תאים S2-דלתא. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) כימות של מספר תאים אגרגטים גדול מ- 6 תאים לאחר 5 דקות של מצבור. קווי שגיאה מציינים ב- SEM * P < 0.01 (One-way השונות (ANOVA)). משכפל שלושה עם שלושה חזרה עצמאית בוצעו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: Cis-דלתא מעכבת את התא צבירה היווצרות מתווך על ידי חריץ ושומן טראנס-דלתא באופן תלוי מינון. (א) גרף הצבירה (מבחינת מספר אגרגטים/mL) בין S2-דלתא תאים ותאים S2 transiently transfected עם יחס שונה של הביטוי וקטורים עבור חריץ ו- cis-דלתא (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2, 1:0. 1). קווי שגיאה מציינים ב- SEM * P < 0.01 (One-way ANOVA). משכפל שלושה עם שלושה חזרה עצמאית בוצעו. שימו לב כי הפחתת רמת cis-דלתא תוצאות בהגברת צבירה, ככל הנראה עקב צמצום cis-עיכוב. (B) גרף המציג צבירה homotypic (מבחינת מספר אגרגטים לכל מ"ל) ב- S2 תאים transiently transfected עם יחס שונה של חריץ, דלתא (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2, 1:0. 1), מעורבב עם תאים S2 רגיל. קווי שגיאה מציינים מספר ב- SEM של אגרגטים הוא הרבה יותר קטן מאשר המספר של אגרגטים heterotypic הנוצרת בין S2-דלתא S2 חריץ & תאיםארעי דלתא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: נוקאאוט של שמס אינו משפיע על פעילות המעכבת של cis-דלתא. (א) מוצג הן תמונות נציג השפעת שמס KD- cis-דלתא-מתווכת עיכוב של צבירת התא מתווכת על-ידי הרמה /טרנס-דלתא מחייב. תמונות להראות צבירת בנקודות זמן שונות (1, 5 ו-15 דקות). צבירת בין שמס שטופלו dsRNA רגיל S2 תאים ותאים S2-דלתא נלקח רקע הפקד. דומה stably transfected S2 חריץ תאים, שמס KD גדל המספר של אגרגטים S2-דלתא בין תאיםארעי חריץ S2 לעומת שליטה (EGFP שטופלו dsRNA). ביטוי משותף של cis-דלתא עם חריץ על יחס 1:1, גרמו ירידה דומה במספר של אגרגטים בשליטה (EGFP שטופלו dsRNA) כמו גם כמו תאים dsRNA מטופלים שמס . סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) גרף צבירת היחסי בין S2-דלתא תאים ותאים S2 transiently משותפת transfected עם יחס המצוין (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2, 1:0. 1) של חריץ ו- cis-דלתא. EGFP וטיפול dsRNA שמס להציג ירידה דומה צבירת כל דרגה /חבר העמים-דלתא יחס. הנתונים המובאים כאן הם נציג של 3 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
איתות חריץ הקנוני תלוי האינטראקציות בין הקולטן החריץ שלה ליגנדים5. אמנם רוב המחקרים על השביל חריץ לשקול בעיקר הכריכה של חריץ, ליגנדים בתאים הסמוכים (טרנס), דרגה, לאותו תא ליגנדים אינטראקציה, ואת אלה כביכול cis-האינטראקציות יכולים לשחק תפקיד מעכבות בחריץ איתות3,4. בהתאם לכך, כדי לפענח את המנגנונים את ההשפעות של צירוף על חריץ הקנוני איתות, לעתים קרובות הרלוונטי לבחון שני סוגי האינטראקציות חריץ-ליגנד (טרנס ו- cis). עם זאת, בהקשרים רבים במהלך התפתחות בעלי חיים, מעורבות של שני אלה אינטראקציות ורגולציה הזנה חוזרת שלהם מסבך ויוו מחקרים1,6. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מספקים מתודולוגיה מפורט עבור במבחנה תא צבירת מבחני באמצעות תאים S2 דרוזופילה כדי להעריך את הכריכה של קולטן חריץ עם טרנס- ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים- ליגנדים. הוצגו הניצול של מתודולוגיה זו כדי להעריך את ההשפעה של צירוף גנטי של חריץ איתות (את xylosyltransferase שמס7,8) על איגוד קולטן-ליגנד.
ראשית, צבירת מבחני בוצעו בין S2 יציב-דלתא EGFP שמס שטופלו dsRNA יציב S2 חריץ תאים או לבחון את השפעת שמס KD- טרנס-איגוד. צבירה של S2-דלתא תאים עם שמס שטופלו dsRNA רגיל S2 תאים נלקח רקע הפקד. שמס KD משופרת הצבירה בין חריץ S2 ותאים S2-דלתא לעומת שליטה. חשוב לבצע רקע מצבורים בקרה ניסויית בין תאים S2 רגיל ותאים S2 נושא ליגנד במקביל הטרנס-איגוד ניסויים. למרות דרוזופילה S2 תאים שאינם מבטאים אנדוגני חריץ קולטן ו- ליגנד דלתא11, ביטוי של רמות נמוכות של Serrate מדווח S2 תאים13. בהתחשב בכך, תאים S2 רגיל שימשו ב תא צבירת מבחני שליטה רקע; תאים אלה לא הראה כל צבירה (איור 5B). אגרגטים נספרים באופן ידני באמצעות של hemocytometer. כדי להבטיח עקביות כימות צבירה, יכול pipetted µL 10-20 מאוכלוסיית לתא מעורב לצאת מאזורים שונים לפחות שלושה לכל טוב עבור ספירה. מבחני אלה דורשים תאים בריאים S2 הולך וגדל. בהתחשב הטבע למחצה חסיד של S2 תאים, עדין pipetting תוך איסוף התאים, קבוע רועד במהלך וזמינותו צבירת חשובים.
בעבר, אנחנו ואחרים השתמשו ומבוססת, מסיסים ליגנד קולטן איגוד מבחני עבור הערכה כמותית של איגוד קולטן-ליגנד טרנס17,18,19, 20. מאז מבחני צבירה כמותית למחצה, מבחני הכריכה ליגנד מסיסים בוצעו גם לבחון את השפעת שמס KD על חריץ-ליגנד הטרנס-איגוד. התוצאות שנמדדו היו דומים במגמה עם אלה המתקבל צבירת מבחני8. זה העיד הערכת נאמן קשירה של חריץ עם טרנס-ליגנדים באמצעות מבחני צבירת התא. למרות היווצרות צבירה readout איגוד קולטן-ליגנד, זה יכול להיות מורכב אם הביטוי משטח של הקולטן חריץ או ליגנדים שלה מושפע הביטויים המגבילים נתון. זה מדגיש את המגבלה של מבחני מצבור התא, כמו זה לא ניתן להבחין בין אם השינוי במבנה הצבירה בגלל איגוד קולטן שינו-ליגנד או שינו את פני השטח הביטוי. לכן, במקביל צבירת מבחני, ההשפעות של כל צירוף על ביטוי משטח הרמה ליגנדים צריך להיבדק בתאים S2. בהקשר של המחקרים שלנו, לא הושפעו שמס שטופלו dsRNA S2 תאים8רמות משטח של חריץ ודלתא.
לבחון עיכוב של טרנס-איגוד על ידי תוספת של cis-ליגנדים, צבירת מבחני בוצעו בין תאי דלתא S2 ל EGFP או שמס שטופלו dsRNA S2 חריץ & תאיםארעי דלתא . המספר של אגרגטים בין תאים אלה הושווה עם המספר של אגרגטים בין S2-דלתא תאים ותאיםארעי חריץ S2. ההתמעטות היחסית במספר של אגרגטים היה מחושב ונועד לשמש כמחוון ההשלכות של עיכוב על ידי חבר העמים-דלתא. בקרת ניסויים הראו כי cis-ליגנדים להראות על עיכוב ועמיד תלוית מינון של חריץ /טרנס-דלתא מחייב על טווח רחב למדי של חריץ כדי cis-ליגנד יחסי (1:1 עד 1:0. 1) (איור 5A)8 . יחס של 1:1, גרמו מידת החזק cis-עיכוב ולאחר הפחתת הרמה היחסית של cis-דלתא נחלש cis-עיכוב. בהתאם לכך, הניסויים KD מעל זה מגוון של יחסי בוצעה. ראוי לציין, את כמות הקולטן חריץ ואת הסכום הכולל של transfected DNA נשמר קבוע בניסויים כל. פעולה זו תבטיח כי היווצרות צבירה מושפע בעיקר הפעילות של חבר העמים-ליגנדים לא שונה על ידי רמות ביטוי חריץ על ידי התאים.
זה הוצג בעבר את הביטוי שיתוף של חריץ ו- cis-ליגנדים בתאים S2 יכול לגרום להיווצרות של הסיכומים homotypic14. כדי לבחון אם דומה homotypic הסיכומים בין חריץ S2 & דלתאארעי או חריץ S2 & תאים מסוריתארעי יכול לסכן שלנו פרשנויות quantifications צבירה ב- cis-ליגנד מחקרים, assay מצבור שליטה בוצע בין S2 חריץ & דלתאארעי ותאים רגילים S2. מספר התאים S2 שימוש בניסויים אלה היה זהה S2-דלתא תאים המשמשים cis-דלתא ניסויים. צבירת כמה homotypic נצפתה אבל כימות הראו כי מצרפי הנובעת לתרום שבריר מצרפי הכולל לעומת מצרפי heterotypic בין S2-דרגה נמוכה & דלתאארעי ודלתא S2 תאים ( איור 5B).אנו מסיקים כי השינויים שנצפו במספר של אגרגטים ב- cis-ליגנד מבחני הן בעיקר בשל ההשפעה המעכבת של cis-ליגנדים על איגוד בין הרמה הטרנס-דלתא.
לסיכום, מבחני צבירת הוצג פרוטוקול זה לספק מתודולוגיה קל ופשוט עבור הערכה כמותית למחצה של טרנס- ו - cis-האינטראקציות של הקולטן חריץ, ליגנדים שלה. מבחני אלה ניתן להשתמש כדי לבחון את ההשפעה ממגבילי מסלול חריץ גנטית או תרופתי על חריץ-ליגנד איגוד במבחנה , ולכן יכול לסייע להבהיר את המנגנונים ויוו ההשפעות של אלה מגבילים על חריץ איתות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים לאשר תמיכה NIH/NIGMS (R01GM084135 כדי HJN), מיזוטני Glycoscience (מענק #110071 HJN), שיטות מודה טום (פ') לי על דיונים והצעות מבחני, והיסוד ספירו Artavanis-Tsakonas, הוגו Bellen, רוברט פלמינג, קן אירווין, את דרוזופילה גנומיקה משאב מרכז (DGRC) פלסמידים וקווים התא.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
References
- de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
- Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
- del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
- Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
- Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).
- Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).
- Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
- Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
- Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
- Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
- Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
- Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
- Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).
