Summary
Complexiteit van in-vivo systemen maakt het moeilijk om te onderscheiden tussen de activering en de remming van de inkeping receptor door trans- en GOS-liganden, respectievelijk. Hier presenteren we een protocol op basis van in vitro cel-aggregatie testen voor kwalitatieve en semi-kwantitatieve evaluatie van de binding van Drosophila uitsparing aan trans-liganden vs cis-liganden.
Abstract
Inkeping signalering is een evolutionair geconserveerde cel-cel communicatiesysteem gebruikt in grote lijnen in dierlijke ontwikkeling en volwassen onderhoud. Interactie van de inkeping receptor met liganden van naburige cellen induceert activering van de signalering pathway (trans-activering), terwijl de interactie met liganden van dezelfde cel remt signalering (cis-remming). Evenwicht tussen trans-activering en cis-inhibitie helpt optimale gehalte aan Notch signalering in sommige contexten tijdens dierlijke ontwikkeling. Vanwege de overlappende domeinen van de expressie van Inkeping en de liganden in veel celtypen en het bestaan van mechanismen voor feedback, bestudeert de effecten van een bepaalde posttranslationele wijziging op trans- versus cis-interacties van Inkeping en de liganden in vivo is moeilijk. Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van Drosophila S2 cellen in cel-aggregatie testen om te beoordelen van de effecten van neerhalend een inkeping traject modifier op de binding van uitsparing aan elke ligand in trans en cis. S2 cellen stabiel of Transient transfected met een inkeping-uiten vector worden gemengd met cellen uiten van elke inkeping ligand (S2-Delta of S2-Serrate). Trans-binding tussen de receptor en de liganden resulteert in de vorming van heterotypic cel aggregaten en wordt afgemeten aan het aantal aggregaten per mL samengesteld uit > 6 cellen. Om te onderzoeken het remmende effect van cis-liganden, S2 cellen mede uiting van Inkeping en elke ligand worden vermengd met S2-Delta of S2-Serrate cellen en het aantal aggregaten is gekwantificeerd zoals hierboven beschreven. De relatieve daling in het aantal aggregaten als gevolg van de aanwezigheid van cis-liganden biedt een zekere mate van cis-ligand-gemedieerde remming van de trans-bindend. Deze eenvoudige tests kunnen semi-kwantitatieve gegevens over de gevolgen van genetische of farmacologische manipulaties op de binding van uitsparing aan de liganden, en kunnen helpen bij het ontcijferen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de in vivo effecten van dergelijke manipulaties op Notch signalering.
Introduction
Canonieke Notch signalering is een korte afstand van cel naar cel communicatiemechanisme dat fysiek contact van naburige cellen om het faciliteren van de interactie tussen Inkeping receptoren en hun liganden1vereist. Interactie van Inkeping receptor (aanwezig op het oppervlak van signaal-ontvangende cellen) met liganden (aanwezig op het oppervlak van het verzenden van het signaal cellen) initieert Notch signalering en staat bekend als trans-activering2. Aan de andere kant, interactie tussen Inkeping en de liganden in dezelfde cel leidt tot de remming van de inkeping traject en staat bekend als de cis-inhibitie3. Het evenwicht tussen trans- en cis-interacties nodig is om de optimale ligand-afhankelijke Notch signalering van4. Drosophila heeft een inkeping receptor en twee liganden (Delta en Serrate) in tegenstelling tot zoogdieren, die vier Notch receptoren en vijf liganden hebben [1 (JAG1), JAG2, onderdrukking van gekartelde delta-achtige 1 (DLL1), DLL3 en DLL4]5. Deze eenvoud biedt, de Drosophila model het gemak om te ontleden/studie de effecten van pad modifiers over Notch-ligand interacties en vervolgens over de inkeping signalering. In bepaalde contexten tijdens dierlijke ontwikkeling (inclusief vleugel ontwikkeling in Drosophila), zowel cis- en trans-interacties zijn betrokken cell lot1,6 te bereiken goede Notch signalering . Het is belangrijk om te onderscheiden van de gevolgen van Inkeping traject modifiers in de volgende contexten voor cis- en trans-interacties van inkeping met haar liganden.
Onze fractie heeft eerder gerapporteerd dat de toevoeging van een residu van de koolhydraten genaamd xylose aan Drosophila Notch negatief Notch signalering in bepaalde contexten regelt, met inbegrip van vleugel ontwikkeling7. Verlies van shams (het enzym dat xylosylates inkeping) leidt tot een "verlies van vleugel ader" fenotype7. Meer recentelijk, gene dosering experimenten en klonen analyse werden gebruikt om te laten zien dat verlies van shams Delta-gemedieerde Notch geviseerd versterkt. Om te onderscheiden of de verbeterde Notch signalering in shams mutanten een gevolg van de verminderde cis is-inhibitie of toegenomen trans-activering, ectopische overexpressie studies van Inkeping liganden in larvale vleugel imaginaire schijven met het stuurprogramma van de dpp-GAL4 werden uitgevoerd. Deze experimenten geleverd bewijs suggereert dat Shams regelt trans-activering van Inkeping door Delta zonder Notch cis-remming door liganden8. Echter, feed-back verordeningen en effecten van endogene liganden zou compliceren de interpretatie van ectopische overexpressie studies1,6,9.
U lost dit probleem, Drosophila S2 cellen10 werden gebruikt, die voorzien in een systeem eenvoudig in vitro Notch-ligand interactie studies11,12. S2 cellen niet express endogene Notch receptor en Delta ligand11 en een laag niveau van Serrate13, dat heeft geen invloed op de inkeping-ligand aggregatie experimenten8express. Daarom kunnen S2 cellen zijn stabiel of Transient transfected door Inkeping en/of individuele liganden (Delta of Serrate) voor het genereren van cellen die uitsluitend uitdrukking geven aan de receptor inkeping of één van haar liganden, of een combinatie daarvan. Mengen van Inkeping-uiten S2 cellen met ligand-uiten S2 cellen resulteert in de vorming van heterotypic aggregaten gemedieerd door receptor-ligand bindende11,12,14. Kwantificering van de totale vorming biedt een zekere mate van trans-bindend tussen Inkeping en de liganden15 (Figuur 1). Evenzo S2 cellen kunnen mede transfected met inkeping en Delta of Serrate liganden (d.w.z. cis-liganden). CIS-liganden in deze cellen Notch-uiten S2 trekt de binding van inkeping met trans-liganden en resultaat in daalde de totale vorming8,12,14. De relatieve afname van de totale vorming veroorzaakt door cis-liganden biedt een zekere mate van de remmende werking van cis-liganden op binding tussen Inkeping en trans-liganden (Figuur 2). Dienovereenkomstig, cel aggregatie assays werden gebruikt om de onderzoeken van het effect van het verlies van xylosylation op trans- en cis-interacties tussen Inkeping en de liganden.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor cel aggregatie tests gericht op het evalueren van de binding van inkeping met trans-liganden en haar remming door cis-liganden cuvetten van Drosophila S2. Als een voorbeeld, bieden wij de gegevens die ons toegestaan om te bepalen van het effect van de inkeping xylosylation op de binding tussen Inkeping en trans-Delta8. Deze eenvoudige tests bieden een semi-kwantitatieve beoordeling van Inkeping-ligand interacties in vitro en helpen bij het bepalen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de in vivo effecten van Inkeping traject modifiers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van dubbele Stranded RNA (dsRNA) Shams Knockdown
- PCR versterking van de producten
- Wild-type geel wit (y w) genomic DNA en pAc5.1-EGFP gebruiken als sjabloon en de volgende primerparen aan het versterken van de DNA-fragmenten gebruikt in dsRNA synthese. Gebruik het volgende PCR thermische profiel: denaturatie (95 ° C, 30 s), onthardende (58 ° C, 30 s) en extensie (72 ° C, 1 min).
Verbeterde groen Fluorescent proteïne (EGFP) dsRNA inleidingen (5' - 3')-
Voorwaartse primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
Omgekeerde primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
Shams dsRNA inleidingen (5' - 3')-
Voorwaartse primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
Omgekeerde primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
Opmerking: EGFP dsRNA wordt gebruikt als negatieve controle.
- Wild-type geel wit (y w) genomic DNA en pAc5.1-EGFP gebruiken als sjabloon en de volgende primerparen aan het versterken van de DNA-fragmenten gebruikt in dsRNA synthese. Gebruik het volgende PCR thermische profiel: denaturatie (95 ° C, 30 s), onthardende (58 ° C, 30 s) en extensie (72 ° C, 1 min).
- Gel-zuiveren de polymerase-kettingreactie (PCR)-producten met behulp van een commerciële gel zuivering kit volgens protocol van de fabrikant.
- In vitro transcriptie met behulp van een commercieel product staat voor het transcriberen van de promotor van een T7 volgens protocol van de fabrikant uit te voeren.
- Zuiveren van de dsRNA met behulp van een RNA zuivering kit volgens protocol van de fabrikant en opslaan bij-80 ° C.
- Het beoordelen van de efficiëntie van shams knockdown met behulp van de volgende stappen (1.5.1-1.5.5).
- Graaf de cellen handmatig met behulp van een hemocytometer en plaat 5 x 105 S2 cellen in elk putje van een 6 goed plaat in 1 mL/goed van Schneiders medium aangevuld met 10% foetale boviene Serum (FBS) en 100 U/mL penicilline-streptomycine.
- 7.5 µg EGFP- of shams dsRNA toevoegen aan elk putje en Incubeer bij 25 ° C gedurende 24 uur.
- Oogst de controle (EGFP dsRNA-behandeld) en shams dsRNA-behandelde S2 cellen door zachte pipetteren gevolgd door pillering neer door centrifugeren op 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 25 ° C en proces voor RNA isolatie met behulp van een RNA extractie kit volgens protocol van de fabrikant.
- Het gebruik van een spectrofotometer en proces 100 RNA te kwantificeren ng van RNA voor 1-stap qRT-PCR met commerciële qPCR reagentia en primer/sondes en het volgende PCR thermische profiel: denaturatie (95 ° C, 15 s) en Annealing/uitbreiding (60 ° C, 1 min).
Opmerking: Raadpleeg de Tabel van materialen voor informatie over de primer/sonde sets en het instrument voor shams en controle qRT-PCR experimenten in deze studies. - Bereken de relatieve shams mRNA niveaus met behulp van de 2-ΔΔCT methode16.
2. beoordeling van de Binding tussen de inkeping Receptor en Trans-liganden
- Signaal-ontvangende cellen (S2 cellen uiten de inkeping-receptor) voor te bereiden.
- Handmatig met behulp van een hemocytometer cellen tellen en plaat 5 x 105 S2 en stabiele S2-Notch cellen in elk putje van de plaat van een 6-well in 1 mL/goed van Schneiders medium aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL penicilline-streptomycine.
Opmerking: Voor S2-Notch cellen, die zijn beschikbaar van Drosophila Genomics Resource Center (DGRC), voeg 200 nM methotrexaat in de media. Ter voorbereiding van een stamoplossing van 0.5 mM methotrexaat, eerst voorbereiden een 20 mM methotrexaat oplossing in 250 µL van 1 M NaOH. Daarna Verdun deze oplossing tot 0,5 mM in 1 M fosfaat buffer zoutoplossing en winkel bij-20 ° C. In S2-Notch cellen is uitdrukking van de inkeping proteïne onder de controle van de Drosophila metallothionein promotor in de Bet -vector. - 7.5 µg dsRNA toevoegen aan elk putje en Incubeer bij 25 ° C gedurende 24 uur.
- Toevoegen van 0.7 mM CuSO4 te induceren van de expressie van Inkeping en Incubeer bij 25 ° C gedurende 3 dagen.
Opmerking: CuSO4 wordt gebruikt voor het opwekken van expressie van eiwitten gecontroleerd door de promotor van de metallothionein.
- Handmatig met behulp van een hemocytometer cellen tellen en plaat 5 x 105 S2 en stabiele S2-Notch cellen in elk putje van de plaat van een 6-well in 1 mL/goed van Schneiders medium aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL penicilline-streptomycine.
- Signaal-verzenden cellen (S2 cel Delta of Serrate liganden uitdrukken) voor te bereiden.
- Graaf de cellen handmatig met behulp van een hemocytometer en plaat ~ 5 x 106 stabiele S2-Delta of S2-SerrateTom cellen in elk putje van de plaat van een 6-well in 1 mL/putje van Schneiders medium aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL penicilline-streptomycine.
Opmerking: Voeg 200 nM methotrexaat voor S2-Delta cellen en 100 µg/mL hygromycin voor S2-SerrateTom cellen in de media. Uitdrukking van Delta en SerrateTom— een tomaat-tagged, functionele versie van Serrate12— is onder Drosophila metallothionein promotor in de Bet -vector. - Toevoegen van 0.7 mM CuSO4 te induceren van de expressie van liganden en Incubeer bij 25 ° C gedurende 3 uur.
- Graaf de cellen handmatig met behulp van een hemocytometer en plaat ~ 5 x 106 stabiele S2-Delta of S2-SerrateTom cellen in elk putje van de plaat van een 6-well in 1 mL/putje van Schneiders medium aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL penicilline-streptomycine.
- Samenvoeging tussen de cellen van het verzenden van het signaal en signaal-ontvangst uit te voeren.
- Oogst van de S2 dsRNA-behandeld (control) en S2-Notch cellen door zachte pipetteren en plaat 2.5 x 10,5 cellen/well in een 24-well plaat na handmatige tellen door hemocytometer.
- 5 x 105 stabiele S2-Delta of S2-SerrateTom cellen toevoegen in een totaal volume van 200 µL van Schneiders medium (aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL penicilline-streptomycine).
Opmerking: Alle S2 cellen behandeling (met inbegrip van de behandeling van de beplating, inductie en dsRNA) onder een kast bioveiligheid moest worden verricht. - Plaats de plaat op een roteerschudapparaat bij 150 t/min (942.48 rad/min).
- Na 1 minuut, meng de inhoud van elk putje en neem 20 µL uit voor het tellen van het aantal aggregaten.
- Tegelijkertijd nemen een representatieve afbeelding onder omgekeerde samengestelde microscoop met 10 x vergroting (PLL 10/0.25 doelstelling).
- Handmatig tellen de aggregaten (> 6 cellen) met behulp van een hemocytometer.
- Plaats de plaat op een shaker.
- Herhaal de Beeldacquisitie en tellen na 5 min en 15 min van aggregatie.
- Uitvoeren van kwantificering van trans-bindend.
- Bereken het aantal aggregaten per mL tussen cellen van de S2 en S2-Delta of S2-SerrateTom cellen als een achtergrond controle.
- Bereken het aantal aggregaten per mL tussen S2-Inkeping en S2-Delta of S2-SerrateTom cellen (omvang van trans-bindende).
3.Evaluatie van de remming van de Binding tussen Inkeping en Trans-liganden door Cis-liganden
- Signaal-ontvangende cellen te bereiden.
- Plaat 5 x 105 S2 cellen in elk putje van de plaat van een 6-well in 1 mL/goed van Schneiders medium aangevuld met 10% FBS en 100 U/mL penicilline-streptomycine.
- 7.5 µg dsRNA toevoegen aan elk putje en Incubeer bij 25 ° C gedurende 24 uur.
- Mede de cellen dsRNA-behandeld met pBluescript en Bet-Notch11 (DGRC) alleen of met Bet-inkeping en Bet-Delta11 transfect (DGRC) of pMT-Serrate17 in totaal De concentratie van het DNA van 2 µg per putje met behulp van een commerciële transfectiereagens volgens protocol van de fabrikant.
Opmerking: pBluescript wordt gebruikt als een besturingselement. Mede-transfected cellen zal worden genoemd S2-inkeping & Deltavoorbijgaande of S2-inkeping & Serratevoorbijgaande cellen hierna. - Incubeer de S2 Transient-transfected cellen bij 25 ° C gedurende 24 uur.
- Toevoegen van 0.7 mM CuSO4 te induceren van de uitdrukking van de Inkeping en de liganden en Incubeer bij 25 ° C gedurende 3 dagen.
- Signaal-verzenden cellen bereiden zoals beschreven in punt 2.2.
- Voert aggregatie tussen signaal-verzenden en signaal-ontvangen cellen zoals beschreven in punt 2.3.
- Kwantificeren van de remming van de trans-bindend door cis-liganden.
- Bereken het aantal aggregaten per mL tussen cellen van de S2 en S2-Delta of S2-Serrate cellen als een achtergrond controle.
- Kwantificeren van de omvang van de remming door cis-liganden als volgt.
- Define A als aantal aggregaten tussen S2-Notchvoorbijgaande en S2-Delta cellen.
- B definiëren zoals het aantal aggregaten tussen S2 cellen transfected Transient samen met inkeping en Delta (S2-inkeping & Deltavoorbijgaande) en S2-Delta cellen.
- Berekenen van relatieve aggregatie C = (B x 100) /A
- Berekenen grootte van remming door cis- ligand (Delta of Serrate) als 100- C.
Opmerking: als voorbeeld, als relatieve aggregatie 45%, dan cis-liganden worden beschouwd voor de remming van de trans-bindend met 55%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze observaties in vivo gesuggereerd dat verlies van de xylosyltransferase gen shams resultaten in de winst van de inkeping signalering wijten aan Delta-gemedieerde trans toegenomen-activering van Inkeping zonder het cis-remming van Inkeping door liganden8. Om te testen dit begrip, werden in vitro cel aggregatie tests uitgevoerd. Eerst, shams expressie in S2 cellen werd neergehaald met behulp van shams dsRNA. EGFP dsRNA werd gebruikt als controle. Efficiëntie van knockdown (KD) werd onderzocht door PCR in real time en werd aangetoond dat meer dan 80%8worden gebruikt. Vervolgens, de binding van Inkeping receptor met trans-Delta bij shams KD werd onderzocht met behulp van aggregatie testen. De samenvoeging tussen S2-Inkeping en S2-Delta cellen werd onderzocht op verschillende tijdstippen na het mengen van hen. Aggregatie tussen gewone cellen van de S2 en S2-Delta cellen werd opgevat als achtergrond controle. Figuur 3 toont de grafiek die aangeeft hoeveel aggregaten gevormd op verschillende tijd punten (1, 5, 15 en 30 min) na het mengen. Een scherpe toename werd waargenomen in het aantal aggregaten tussen 1 en 5 min. daarna het aantal aggregaten blijven stijgen tot 30 minuten in een trager tempo. Daarom statistische formatie was beeld op 1, 5 en 15 min en het aantal aggregaten werd gekwantificeerd na 5 min van het mengen.
Figuur 4A toont representatieve beelden van cel aggregatie testen tussen stabiele S2-Inkeping en S2-Delta cellen te beoordelen van de effecten van shams KD op de binding tussen Inkeping receptor en trans-Delta. Afbeeldingen tonen de samenvoeging op drie keer punten (1, 5 en 15 min). Voor achtergrond controle, waren de gewone S2 cellen (behandeld met shams dsRNA) gemengd met S2-Delta cellen. EGFP dsRNA-behandelde S2-Notch cellen gevormd aggregaten met S2-Delta cellen, die in aantal met tijd te verhogen. In tegenstelling, shams dsRNA-behandelde S2-Notch cellen gevormd aggregaten sneller, en de aggregaten waren groter en groter in aantal dan het besturingselement degenen (figuur 4B). Dit aangegeven dat minderen Shams niveaus de trans verbetert-binden van inkeping met Delta8.
Om te onderzoeken of Shams regelt de remmende werking van cis-liganden op binding tussen Inkeping en trans-Delta, we eerst vastgesteld dat mede uiting van Inkeping en Delta in de signaal-ontvangende cel kan verminderen de aggregatie van de cel bemiddeld door Inkeping en trans-Delta. Figuur 5A toont de grafiek die aangeeft hoeveel aggregaten gevormd tussen S2-Delta en S2-inkeping & Deltavoorbijgaande cellen met verschillende hoeveelheden cis-Delta. Transfecting van gelijke hoeveelheden van de Inkeping - en Delta-expressie constructies in S2 cellen drastisch vermindert het aantal aggregaten gevormd tussen deze cellen en S2-Delta cellen. Bovendien, het verminderen van de hoeveelheid cis-Delta leidt tot een toename in het aantal aggregaten, waaruit blijkt dat in de range van Inkeping /cis-Delta ratio's gebruikt in deze tests, cis-Delta kan remmen de binding tussen Inkeping en trans-Delta op een dosis-afhankelijke manier. Sinds de S2-inkeping & Deltavoorbijgaande cellen express zowel Inkeping en Delta, vormen ze misschien homotypic aggregaten onafhankelijk van de S2-Delta-cellen. Na te gaan of de vorming van homotypic onder S2-inkeping aggregaten & Deltavoorbijgaande cellen kunnen een storende factor in het GOS-inhibitie tests weergegeven in figuur 5A, we deze cellen met S2 cellen gemengd en gekwantificeerd de aggregaten. Figuur 5B toont het aantal aggregaten gevormd na het mengen van S2 cellen met S2-inkeping & Deltavoorbijgaande cellen uiten diverse inkeping /cis-Delta ratio's. Een vrij klein aantal homotypic aggregaten in vergelijking met heterotypic aggregaten, zoals weergegeven in figuur 5A werd waargenomen. We concluderen dat deze gehaltebepalingen aggregatie getrouw meten van het effect van cis-Delta op de binding tussen Inkeping en trans-Delta.
Vervolgens onderzochten we het effect van shams KD op de remmende capaciteit van cis-Delta. Dit einde, aggregatie tussen S2-Delta en S2-inkeping & Deltavoorbijgaande cellen werd onderzocht. Figuur 6A toont representatieve beelden van aggregatie tussen S2-Delta cellen en S2-Notchvoorbijgaande (control) of S2-inkeping & Deltavoorbijgaande cellen. S2-Delta en EGFP dsRNA-behandelde S2-Notchvoorbijgaande cellen gevormd aggregaten, die in aantal met tijd, vergelijkbaar met de samenvoeging tussen S2-Delta en stabiele S2-Notch cellen (Figuur 4 toenemen). Met name, het mengen van S2-Delta en S2-inkeping & Deltavoorbijgaande cellen samen met gelijke hoeveelheden van Inkeping - en Delta-expressie plasmiden, transfected gevormd minder aggregaten op zowel EGFP KD en shams KD, suggereren dat minderen het niveau van Shams heeft geen invloed op het vermogen van het cis-Delta te blokkeren Notch /trans-Delta bindend. Om beter het beoordelen van de effecten van shams KD op de activiteit van cis-Delta, de omvang van de remming door cis-Delta werd gemeten door berekening van het percentage van de relatieve aggregatie over een bereik van Inkeping /cis-Delta ratio's zoals uiteengezet in punt 3.4.2. Kwantificering van relatieve aggregatie toonde een vergelijkbare remming van aggregatie op EGFP en shams dsRNA behandeling (figuur 6B). Samen, deze opmerkingen raden dat verlies van xylosylation trans bevordert-bindende zonder DIS-inhibitie8, en een moleculaire mechanisme voor de vleugel ader verlies fenotype waargenomen in shams mutanten.
Figuur 1: Schematische weergave van cel aggregatie Assay voor Trans-bindend. Diagram met inductie van receptor (S2-inkeping) en ligand (S2-Delta of S2-Serrate) waarin S2 cellen door 0.7 mM CuSO4. Inductie van beide S2 cellen wordt gevolgd door het mengen, die de neiging te maken van aggregaten. Deze aggregaten (> 6 cellen) zijn beeld en gekwantificeerd.Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Schematische weergave van cel aggregatie Assay te beoordelen van Cis-remming. S2 cellen werden Transient transfected met Bet-Notch (S2-Nvoorbijgaande), Bet-inkeping en Bet-Delta (S2-inkeping & Deltavoorbijgaande), of Bet-inkeping en Bet-Serrate (S2-inkeping & Serratevoorbijgaande). Na inductie door 0.7 mM CuSO4 en mengen met S2-Delta cellen, aggregaten (> 6 cellen) worden gekwantificeerd. Remming door cis-liganden wordt gemeten in termen van relatieve aggregatie percentage in de aanwezigheid en de afwezigheid van elke cis-ligand. De effecten van cis-liganden op binding tussen Inkeping en trans-Serrate kan worden bepaald door het mengen van de Transient-transfected cellen met S2-SerrateTom cellen (niet afgebeeld). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: aggregatie tussen S2-Notch S2 en S2-Delta cellen op verschillende tijdstippen. Grafiek toont het aantal aggregaten per mL op verschillende tijdstippen (1, 5, 15 en 30 min) tussen de aangegeven soorten cellen. Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM) van drie wordt gerepliceerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Cel aggregatie gemedieerd door Inkeping en trans-Delta. (A) beelden tonen aggregatie op verschillende tijdstippen (1, 5 en 15 min). Aggregatie tussen shams dsRNA-behandelde gewone S2 cellen en S2-Delta cellen werd opgevat als achtergrond controle. Shams- dsRNA behandeld S2-Notch cellen tonen een toename in het aantal en grootte van aggregaten vergeleken met EGFP dsRNA-behandeld (control) S2-Notch cellen na mengen met S2-Delta cellen. Schaal bar = 100 µm. (B) kwantificering van aantal cel aggregaten groter is dan 6 cellen na 5 min van aggregatie. Foutbalken geven SEM. * P < 0,01 (One-way variantieanalyse (ANOVA)). Drie replicatieonderzoeken met drie onafhankelijke herhalingen werden uitgevoerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Cis-Delta remt de cel statistische vorming gemedieerd door Inkeping en trans-Delta op een dosis-afhankelijke manier. (A) grafiek toont de aggregatie (in termen van het aantal aggregaten/mL) tussen de cellen van de S2-Delta en S2 cellen transfected Transient met verschillende verhoudingen van expressievectoren voor Inkeping en cis-Delta (1:0, 1:1, 1: 0. 5, 1:0.2 en 1: 0. 1). Foutbalken geven SEM. * P < 0,01 (One-way ANOVA). Drie replicatieonderzoeken met drie onafhankelijke herhalingen werden uitgevoerd. Merk op dat het verlagen van het niveau van de GOS-Delta resulteert in een toename van de samenvoeging, waarschijnlijk als gevolg van de verminderde cis-remming. (B) grafiek met homotypic aggregatie (in termen van het aantal aggregaten per mL) in S2 cellen Transient transfected met verschillende verhoudingen van Inkeping en Delta (1:0, 1:1, 1: 0. 5, 1:0.2 en 1: 0. 1) en gemengd met gewone S2 cellen. Foutbalken geven SEM. aggregaten aantal is veel kleiner dan het aantal heterotypic aggregaten gevormd tussen S2-Delta en S2-inkeping & Deltavoorbijgaande cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Knockdown van shams heeft geen invloed op de inhiberende activiteit van cis-Delta. (A) getoond zijn representatieve beelden van het effect van shams KD betreffende DIS-Delta-gemedieerde remming van cel aggregatie gemedieerd door Inkeping /trans-Delta bindend. Beelden tonen aggregatie op verschillende tijdstippen (1, 5 en 15 min). Aggregatie tussen shams dsRNA-behandelde gewone S2 cellen en S2-Delta cellen werd opgevat als achtergrond controle. Vergelijkbaar met stabiel transfected S2-Notch cellen, shams KD steeg het aantal aggregaten tussen S2-Delta en S2-Notchvoorbijgaande cellen ten opzichte van de controle (EGFP dsRNA-behandeld). Co uitdrukking van cis-Delta met inkeping in een 1:1 verhouding resulteerde in een vergelijkbare daling in het aantal aggregaten in control (EGFP dsRNA-behandeld) evenals zoals shams dsRNA behandeld cellen. Schaal bar = 100 µm. (B) grafiek toont relatieve aggregatie tussen S2-Delta cellen en S2 cellen Transient mede-transfected met aangegeven verhoudingen (1:0, 1:1, 1: 0. 5, 1:0.2 en 1: 0. 1) van de Inkeping en cis-Delta. EGFP en shams dsRNA behandeling Toon een vergelijkbare daling in de samenvoeging op elke inkeping /cis-Delta verhouding. Hier gepresenteerde gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Canonieke Notch signalering, hangt af van de interacties tussen de inkeping-receptor en de liganden5. Hoewel de meeste studies over de inkeping pathway overwegen voornamelijk de binding van de Inkeping en liganden in naburige cellen (trans), Inkeping en dezelfde-cel liganden werken, en deze zogenaamde GOS-interacties een remmende rol kunnen spelen in de inkeping signalering van3,4. Om te ontcijferen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de gevolgen van een modifier voor canonieke inkeping signalering, daarom vaak relevant zijn voor het onderzoeken van beide soorten Notch-ligand interacties (trans en cis). Echter in vele contexten tijdens dierlijke ontwikkeling compliceert betrokkenheid van beide van deze interacties en hun feedback verordening de in vivo studies1,6. In het huidige protocol bieden wij een gedetailleerde methodologie voor in vitro cel aggregatie testen met behulp van Drosophila S2 cellen te evalueren van de binding van Inkeping receptor met trans- liganden en haar remming door DIS- liganden. (De xylosyltransferase Shams7,8) receptor-ligand bindende signalering, hebben wij het gebruik van deze methode te beoordelen van het effect van een genetische modifier van Inkeping gepresenteerd.
Eerst, aggregatie testen werden uitgevoerd tussen stabiele S2-Delta en EGFP of shams dsRNA-behandelde stabiele S2-Notch cellen te onderzoeken van het effect van shams KD op trans-bindend. Aggregatie van S2-Delta cellen met shams dsRNA-behandelde gewone S2 cellen werd opgevat als achtergrond controle. Shams KD versterkt de samenvoeging tussen S2-Inkeping en S2-Delta cellen in vergelijking met controle. Het is belangrijk om te voeren achtergrond experimentele controle aggregaties tussen gewone cellen van de S2 en S2-cellen ligand-uitvoering parallel aan de trans-bindende experimenten. Hoewel Drosophila S2 cellen doen niet express endogene Notch receptor en Delta ligand11, wordt uitdrukking van lage niveaus van Serrate in S2 cellen13gemeld. Gezien dit, gewone S2 cellen werden gebruikt in cel aggregatie testen als achtergrond controle; deze cellen vertonen geen een aggregatie (figuur 5B). Aggregaten worden geteld handmatig met behulp van een hemocytometer. Om te zorgen voor samenhang in statistische kwantificering, kan 10-20 µL van gemengde cel bevolking worden pipetted uit uit ten minste drie verschillende gebieden per putje voor het tellen. Deze tests vereisen gezond groeiende S2 cellen. Gezien het semi-aanhangend karakter van S2 cellen, zachte pipetteren terwijl het verzamelen van de cellen en constante die schudden tijdens de aggregatie-assay zijn belangrijk.
Wij en anderen hebben vroeger reeds lang gevestigde, oplosbaar ligand-receptor bindende analyses voor een kwantitatieve beoordeling van de binding van de receptor-ligand in trans17,18,19, 20. Aangezien aggregatie testen semi-kwantitatieve zijn, oplosbare ligand bindende analyses ook werden uitgevoerd om te onderzoeken van het effect van shams KD op Notch-ligand trans-bindend. De waargenomen resultaten waren vergelijkbaar in de trend met die welke verkregen van aggregatie assays8. Dit blijkt de trouwe evaluatie van binding van inkeping met trans-liganden met behulp van cel aggregatie testen. Hoewel de totale vorming een uitlezing van receptor-ligand bindend is, kan het ingewikkeld als de oppervlakte uitdrukking van de inkeping receptor of haar liganden wordt beïnvloed door de bepaalde modifiers. Hieruit blijkt de beperking van de cel aggregatie tests, als het niet worden onderscheiden als de verandering in totale vorming vanwege gewijzigde receptor-ligand bindende is of gewijzigd oppervlakte expressie. Daarom, parallel aan aggregatie testen, de gevolgen van elke modifier voor oppervlakte uitdrukking van Inkeping en liganden moeten worden getest in S2 cellen. In het kader van onze studies, werd oppervlakte van Inkeping en Delta niet beïnvloed in shams dsRNA-behandelde S2 cellen8.
Te onderzoeken van de remming van de trans-bindend door toevoeging van cis-liganden, aggregatie testen werden uitgevoerd tussen S2-Delta cellen en EGFP of shams dsRNA-behandelde S2-inkeping & Deltavoorbijgaande cellen . Het aantal aggregaten gevormd tussen deze cellen werd vergeleken met het aantal aggregaten gevormd tussen S2-Delta cellen en S2-Notchvoorbijgaande cellen. De relatieve daling in het aantal aggregaten was berekend en gebruikt als een indicator voor de omvang van de remming door cis-Delta. De controle-experimenten toonde dat cis-liganden Toon een robuust en dosis-afhankelijke remming van uitsparing /trans-Delta bindende over een nogal breed bereik van Inkeping tot DIS-ligand verhoudingen (1:1 tot 1: 0. 1) (figuur 5A)8 . Een 1:1 verhouding resulteerde in de sterkste mate van cis-inhibitie, en daalt het relatieve niveau van cis-Delta verzwakt cis-remming. Bijgevolg de experimenten van de KD over dit bereik van ratio's werd uitgevoerd. Het bedrag van de inkeping receptor en de totale hoeveelheid transfected DNA, was van de nota, in alle experimenten constant gehouden. Dit zal ervoor zorgen dat statistische vorming wordt voornamelijk beïnvloed door de activiteit van cis-liganden en niet door gewijzigd niveaus van Inkeping expressie door de cellen.
Het bleek eerder dat mede uiting van Inkeping en cis-liganden in S2 cellen kunnen leiden tot de vorming van homotypic aggregaties14. Om te onderzoeken of soortgelijke homotypic aggregaties onder S2-inkeping & Deltavoorbijgaande of S2-inkeping & Serratevoorbijgaande cellen kunnen in gevaar komen onze interpretaties van de statistische ondermeer in cis-ligand studies, een besturingselement aggregatie assay werd uitgevoerd tussen S2-inkeping & Deltavoorbijgaande en gewone S2 cellen. Het aantal S2 cellen die worden gebruikt in deze experimenten was hetzelfde als S2-Delta cellen die worden gebruikt in cis-Delta experimenten. De aggregatie van sommige homotypic werd waargenomen, maar kwantificering toonde aan dat de resulterende aggregaten een lage deel van de totale aggregaten in vergelijking met de heterotypic aggregaten tussen S2-inkeping bijdragen & Deltavoorbijgaande en S2-Delta cellen () Figuur 5B).We concluderen dat de veranderingen geconstateerd in het aantal aggregaten in cis-ligand testen zijn voornamelijk te wijten aan de remmende werking van cis-liganden op binding tussen Inkeping en trans-Delta.
Kortom, de aggregatie-assays gepresenteerd in dit protocol voorzien in een eenvoudig en ongecompliceerd methodologie semi-kwantitatieve beoordeling van de trans- en cis-interacties van de inkeping-receptor en de liganden. Deze tests kunnen worden gebruikt om de gevolgen van genetische of farmacologische Notch traject modifiers voor Inkeping-ligand bindende in vitro onderzoeken en daarom kunnen helpen ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de in vivo gevolgen van deze modifiers Notch signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflict van belang.
Acknowledgments
De auteurs erkennen steun van de NIH/NIGMS (R01GM084135 tot HJN) en Mizutani Stichting voor Glycoscience (grant #110071 naar HJN), en zijn dankbaar aan Tom V. Lee voor discussies en suggesties op het testen, en Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine en de Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) voor plasmiden en cellijnen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
References
- de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
- Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
- del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
- Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
- Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).
- Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).
- Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
- Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
- Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
- Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
- Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
- Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
- Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).
