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Developmental Biology

Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der Drosophila Kerbe mit Transzu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden

doi: 10.3791/56919 Published: January 2, 2018

Summary

Komplexität von in-Vivo -Systemen erschwert die Unterscheidung zwischen Aktivierung und Hemmung des Notch-Rezeptors durch Trans- und Cis-Liganden, beziehungsweise. Hier präsentieren wir ein Protokoll basiert auf in-vitro- Zelle-Aggregation-Assays für die semi-quantitative und qualitative Bewertung der Bindung von Drosophila -Kerbe zu Trans-Liganden Vs GUS-Liganden.

Abstract

Kerbe-Signalisierung ist ein evolutionär konservierte Zell-Zell-Kommunikations-System im großen und ganzen in Tierentwicklung und Erwachsenen Wartung verwendet. Interaktion des Notch-Rezeptors mit Liganden von benachbarten Zellen induziert Aktivierung der Signalweg (Trans-Aktivierung), während der Interaktion mit Liganden aus der gleichen Zelle Signalisierung hemmt (Cis-Hemmung). Richtige Balance zwischen Trans-Aktivierung und Cis-Hemmung hilft optimale Notch signaling in einigen Kontexten während Tierentwicklung festzusetzen. Aufgrund der überlappenden Ausdruck Domänen der Kerbe und seine Liganden in vielen Zelltypen und die Existenz der Feedback-Mechanismen, studieren die Auswirkungen einer bestimmten Post-translationale Modifikation auf Trans- im Vergleich zu Cis-Interaktionen der Kerbe und die Liganden in Vivo ist schwierig. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verwendung von Drosophila S2 Zellen in Zelle Aggregation Tests zur Beurteilung der Auswirkungen der eine Kerbe Weg Modifikator auf die Bindung von Kerbe an jeder Ligand in Trans und in GUSumzuwerfen. S2-Zellen stabil oder vorübergehend mit einer Kerbe exprimierenden Vektor transfiziert werden mit Zellen, die mit dem Ausdruck jeder Notch-Liganden (S2-Delta oder S2 gesägt) gemischt. Trans-Bindung zwischen Rezeptor und Liganden führt zur Bildung der heterotypen Zelle Aggregate und ist gemessen an der Anzahl der Aggregate pro mL bestehend aus > 6 Zellen. Zu prüfen, die hemmende Wirkung von Cis-Liganden, S2-Zellen Co Ausdruck Kerbe und jede Liganden sind gemischt mit S2-Delta oder S2 gesägt Zellen und die Anzahl der Aggregate wird quantifiziert, wie oben beschrieben. Der relative Rückgang in der Anzahl der Aggregate durch die Anwesenheit von Cis-Liganden liefert ein Maß für GUS-Liganden-vermittelte Hemmung der Trans-Bindung. Diese einfache Assays können semi-quantitative Angaben über die Auswirkungen der genetischen oder pharmakologische Manipulationen auf die Bindung der Kerbe an seinen Liganden und können helfen, die molekularen Mechanismen der in Vivo -Effekte der Entschlüsselung solche Manipulationen auf Kerbe zu signalisieren.

Introduction

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Kanonische Kerbe Signalisierung ist ein Nahbereichskommunikation von Zelle zu Zelle-Mechanismus, der Körperkontakt der benachbarten Zellen, um die Interaktion zwischen Notch Rezeptoren und ihre Liganden1erfordert. Interaktion des Notch-Rezeptors (vorhanden auf der Oberfläche der Signal-Empfang Zellen) mit Liganden (auf der Oberfläche des Signal senden Zellen) initiiert, Kerbe Signalisierung und ist bekannt als Trans-Aktivierung2. Auf der anderen Seite Interaktion zwischen Kerbe und seine Liganden in derselben Zelle führt zur Hemmung der Notch-Signalweg und ist bekannt als Cis-Hemmung3. Die Balance zwischen Trans- und Cis-Interaktionen ist erforderlich, um optimale Liganden-abhängige Kerbe4Signalisierung zu gewährleisten. Drosophila ist ein Notch-Rezeptor und zwei Liganden (Delta und Serrate) im Gegensatz zu Säugetieren, die vier Notch Rezeptoren und fünf Liganden haben [gezackt 1 (JAG1), JAG2, Delta-Like 1 (DLL1), DLL3 und DLL4]5. Diese Einfachheit bietet, der Drosophila -Modell die Leichtigkeit zu sezieren/Studie die Auswirkungen der Weg-Modifikatoren auf Notch-Liganden Interaktionen und anschließend auf Kerbe Signalisierung. In bestimmten Kontexten während der tierischen Entwicklung (einschließlich Flügel Entwicklung in Drosophila), Cis- und Trans-Interaktionen zu erreichen, richtige Kerbe Signalisierung und Schicksal1,6 Zelle beteiligt sind . Es ist wichtig zu unterscheiden, die Beeinflussung der Kerbe Weg Modifikatoren in diesen Kontexten Cis- und Trans-Interaktionen der Kerbe mit seinen Liganden.

Unsere Fraktion berichtete zuvor, dass Zusatz von ein Kohlenhydrat-Rückstand genannt Xylose, Drosophila Kerbe negativ Notch signaling in bestimmten Kontexten reguliert, einschließlich Flügel Entwicklung7. Verlust der Shams (das Enzym, dass Xylosylates Kerbe) führt zu einem "Verlust der Flügel Vene" Phänotyp7. In jüngerer Zeit, dienten die gen Dosierung Experimente und klonale Analyse zeigen, dass Verlust der Shams Delta-vermittelten Kerbe Vereinzelung verbessert. Zu unterscheiden, ob die verbesserte Kerbe Signalisierung in Shams Mutanten eine Folge der verminderten Cis ist-Hemmung oder erhöhten Trans-Aktivierung, ektopische Überexpression Studien von Notch-Liganden in Larven Flügel imaginalen Scheiben mit dem Dpp-GAL4 -Treiber wurden durchgeführt. Diese Experimente zur Verfügung gestellt, Anhaltspunkte dafür, dass Shams regelt Trans-Aktivierung des Notch von Delta ohne Kerbe Cis-Hemmung durch Liganden8. Jedoch Feed-Back-Regeln und Auswirkungen der endogenen Liganden möglicherweise erschweren die Interpretation von ektopische Überexpression Studien1,6,9.

Beheben Sie dieses Problem, Drosophila S2 Zellen10 wurden verwendet, die einen einfachen in Vitro -System für Notch-Liganden Interaktion Studien11,12vorsehen. S2-Zellen nicht endogene Notch-Rezeptor und Delta Ligand11 ausdrücken und Ausdrücken ein niedriges Niveau der gesägt13, der Notch-Liganden Aggregation Experimente8nicht beeinflusst. Daher können S2 Zellen stabil oder vorübergehend transfiziert werden durch Kerbe und/oder einzelne Liganden (Delta oder Serrate), um Zellen zu generieren, die ausschließlich den Notch-Rezeptor oder eines ihrer Liganden ausdrücken oder eine Kombination davon. Mischen von S2 Kerbe exprimierenden Zellen mit Liganden exprimierenden S2 Zellen führt zur Bildung von heterotypen Aggregate vermittelt durch Rezeptor-Ligand verbindliche11,12,14. Quantifizierung der Aggregatbildung liefert ein Maß für Trans-Bindung zwischen Kerbe und seine Liganden15 (Abbildung 1). In ähnlicher Weise können S2 Zellen Co transfected mit Notch und Delta oder Serrate Liganden werden (d.h. Cis-Liganden). CIS-Liganden in diese Kerbe exprimierenden S2-Zellen aufheben die Bindung der Kerbe mit Trans-Liganden und führt zu verringerte Aggregatbildung8,12,14. Der relative Rückgang der Aggregatbildung verursacht durch GUS-Liganden liefert ein Maß für die hemmende Wirkung von Cis-Liganden auf die Bindung zwischen Kerbe und Trans-Liganden (Abbildung 2). Dementsprechend Zelle Aggregation Assays wurden genutzt, um untersuchen die Auswirkungen des Verlustes von Xylosylation auf Trans- und Cis-Wechselwirkungen zwischen Kerbe und seine Liganden.

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für Zelle Aggregation Assays zielte darauf ab, die Bindung der Kerbe mit Transbewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden mit Drosophila S2 Zellen. Als Beispiel, wir liefern die Daten, die uns erlaubt, die Wirkung der Kerbe Xylosylation auf Bindung zwischen Kerbe und Transbestimmen-Delta8. Diese einfachen Tests eine semi-quantitative Beurteilung der Notch-Liganden Interaktionen in-vitro- und helfen, die molekularen Mechanismen der in Vivo -Effekte der Notch-Signalweg-Modifikatoren zu bestimmen.

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Protocol

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1. Vorbereitung von Double-Stranded RNA (DsRNA) für Shams Knockdown

  1. PCR-Amplifikation der Produkte
    1. Verwenden Sie genomischer DNA Wildtyp gelb weiß (w y) und pAc5.1-EGFP als Vorlage und die folgende Primer-Paaren, um die DNA-Fragmente in DsRNA Synthese verwendet zu verstärken. Verwenden Sie die folgenden PCR Temperaturprofil: Denaturierung (95 ° C, 30 s), Glühen (58 ° C, 30 s) und Verlängerung (72 ° C, 1 min).
      Grünes fluoreszierendes Protein verbessert (EGFP) DsRNA Primer (5' - 3')-
      Forward Primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Reverse Primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Shams DsRNA Primer (5' - 3')-
      Forward Primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Reverse Primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      Hinweis: EGFP DsRNA dient als Negativkontrolle.
  2. Gel-Reinigen der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Produkte mit einem kommerziellen Gel Reinigung-Kit nach Herstellerangaben Protokoll.
  3. Durchführen Sie in Vitro Transkription mit einem kommerziellen Produkt in der Lage, der Transkription von T7 Promoter laut Protokoll des Herstellers.
  4. Reinigen der DsRNA eine RNA-Reinigung-Kit nach Herstellerangaben Protokoll verwenden und speichern bei-80 ° C.
  5. Beurteilen Sie die Effizienz der Shams Zuschlag mithilfe der folgenden Schritte (1.5.1-1.5.5).
    1. Die Anzahl der Zellen manuell mit Hilfe eines Hemocytometer und Platte 5 x 105 S2-Zellen in jede Vertiefung eines 6 gut Platte in 1 mL/auch von Schneiders Medium mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin ergänzt.
    2. Jedes gut 7,5 µg EGFP- oder Shams DsRNA hinzu und inkubieren Sie bei 25 ° C für 24 h.
    3. Ernte der Kontrolle (EGFP DsRNA behandelt) und Shams S2 DsRNA-behandelten Zellen durch sanfte Pipettieren gefolgt von Pelletierung durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 5 min bei 25 ° C und Verfahren zur RNA-Isolierung mit einer RNA Extraktion Kit nach unten Protokoll des Herstellers.
    4. Quantifizieren die RNA mit einem Spektrophotometer und Prozess 100 ng RNA für die 1-Schritt qRT-PCR mit kommerziellen qPCR Reagenzien und Primer/Sonden und die folgenden PCR Temperaturprofil: Denaturierung (95 ° C, 15 s) und Ausglühen/Verlängerung (60 ° C, 1 min).
      Hinweis: Finden Sie die Tabelle der Materialien für Informationen auf den Primer/Sonden-Sets und das Instrument für Shams und Kontrolle qRT-PCR-Experimente in diesen Studien verwendet.
    5. Berechnen Sie die relative Shams -mRNA-Niveaus mit 2ΔΔCT Methode16.

2. Bewertung der Bindung zwischen den Notch-Rezeptor und Trans-Liganden

  1. Bereiten Sie Signal-Empfang Zellen (S2 mit dem Ausdruck des Notch-Rezeptors vor).
    1. Zählen der Zellen manuell über eine Hemocytometer und Platte 5 x 105 S2 und stabile S2-Notch Zellen in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte in 1 mL/gut des Schneiders Medium mit 10 % FBS und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin ergänzt.
      Hinweis: Für S2-Notch-Zellen, die von Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) verfügbar sind, fügen Sie 200 nM Methotrexat in Medien. Zur Vorbereitung einer 0,5 mM Methotrexat Vorratslösung bereiten Sie zuerst eine 20 mM Methotrexat in 250 µL 1 M NaOH Lösung. Als nächstes verdünnen Sie diese Lösung, um 0,5 mM in 1 M Phosphat-Puffer Kochsalzlösung und Store bei-20 ° C. In S2-Notch Zellen ist Ausdruck des Notch Proteins unter der Kontrolle von Drosophila Metallothionein Promoter in der pMT -Vektor.
    2. Jedes gut 7,5 µg DsRNA hinzu und inkubieren Sie bei 25 ° C für 24 h.
    3. Fügen Sie 0,7 mM CuSO4 zu induzieren die Expression von Notch und 3 Tage bei 25 ° C inkubieren.
      Hinweis: CuSO4 wird verwendet, um die Expression von Proteinen gesteuert durch den Projektträger Metallothionein induzieren.
  2. Bereiten Sie signalisieren Zellen (S2-Zelle mit dem Ausdruck Delta oder Serrate Liganden).
    1. Zählen der Zellen manuell mit Hilfe eines Hemocytometer und Platte ~ 5 x 106 stabile S2-Delta oder S2 gesägtTom Zellen in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte in 1 mL/Brunnen des Schneiders Medium mit 10 % FBS und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin ergänzt.
      Hinweis: Fügen Sie 200 nM Methotrexat für S2-Delta-Zellen und 100 µg/mL Hygromycin für S2 gesägtTom Zellen in den Medien. Ausdruck von Delta und gesägtTom– eine Tomate-Tags, funktionale Version des gesägt12— unter Drosophila Metallothionein Projektträger in der pMT -Vektor ist.
    2. Fügen Sie 0,7 mM CuSO4 zu induzieren die Expression von Liganden und inkubieren Sie bei 25 ° C für 3 h.
  3. Führen Sie Aggregation zwischen Signal aussendet und Signal-Empfang Zellen.
    1. Ernte der DsRNA behandelt S2 (Kontrolle) und S2-Notch Zellen durch sanfte pipettieren und Platte 2,5 x 105 Zellen/Brunnen in einer 24-Well-Platte nach manuellen Auszählung durch Hemocytometer.
    2. 5 x 105 stabile S2-Delta oder S2 gesägtTom Zellen in einem Gesamtvolumen von 200 µL des Schneiders Medium hinzufügen (ergänzt mit 10 % FBS und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin).
      Hinweis: Alle S2-Zellen, die Handhabung (einschließlich Plattieren, Induktion und DsRNA Behandlung) erfolgte unter eine biologische Kabinett.
    3. Legen Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler bei 150 u/min (942,48 rad/min).
    4. Mischen Sie nach 1 min den Inhalt jedes gut und herausnehmen Sie 20 µL, zum zählen der Anzahl der Aggregate.
      1. Gleichzeitig nehmen Sie ein repräsentatives Bild unter umgekehrten Verbindung Mikroskop mit 10 X Vergrößerung (PLL 10/0,25 Ziel).
      2. Manuell zählen die Aggregate (> 6 Zellen) mit einer Hemocytometer.
    5. Legen Sie die Platte auf einem Boston-Shaker.
    6. Wiederholen Sie die Bildaufnahme und zählen nach 5 min und 15 min der Aggregation.
  4. Durchführen der Quantifizierung der Trans-Bindung.
    1. Berechnen Sie die Anzahl der Aggregate pro mL zwischen S2 und S2-Delta oder S2 gesägtTom Zellen als Hintergrund-Steuerelement.
    2. Berechnen Sie die Anzahl der Aggregate pro mL zwischen S2-Kerbe und S2-Delta oder S2 gesägtTom Zellen (Größe der Trans-Bindung).

3.Bewertung der Hemmung der Bindung zwischen Kerbe und Trans-Liganden von Cis-Liganden

  1. Signal-Empfang Zellen vorbereiten.
    1. Platte 5 x 105 S2 Zellen in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte in 1 mL/gut des Schneiders Medium ergänzt mit 10 % FBS und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
    2. Jedes gut 7,5 µg DsRNA hinzu und inkubieren Sie bei 25 ° C für 24 h.
    3. Co transfizieren DsRNA-behandelten Zellen mit pBluescript und PMT-Kerbe11 (DGRC) allein oder mit pMT-Notch und pMT-Delta11 (DGRC) oder PMT gesägt17 für insgesamt DNA-Konzentration von 2 µg/Brunnen mit kommerziellen Transfection Reagens laut Protokoll des Herstellers.
      Hinweis: pBluescript wird als Kontrolle verwendet. Co transfizierten Zellen genannt werden S2-Kerbe & Deltatransiente oder S2-Kerbe & nachstehendflüchtigen Zellen gesägt.
    4. Inkubieren Sie die vorübergehend transfiziert S2-Zellen bei 25 ° C für 24 h.
    5. Fügen Sie 0,7 mM CuSO4 zu induzieren den Ausdruck der Kerbe und die Liganden und 3 Tage bei 25 ° C inkubieren.
  2. Bereiten Sie signalisieren Zellen, wie in 2.2 beschrieben.
  3. Führen Sie Aggregation zwischen Zellen sendet Signal und Signal-Empfang, wie in Abschnitt 2.3 beschrieben.
  4. Quantifizieren, Hemmung der Trans-Bindung von Cis-Liganden.
    1. Berechnen Sie die Anzahl der Aggregate pro mL zwischen S2 und S2-Delta oder S2 gesägt Zellen als Hintergrund-Steuerelement.
    2. Quantifizierung des Ausmaßes der Hemmung von Cis-Liganden wie folgt.
      1. Definieren Sie A Anzahl der Aggregate zwischen S2-Notchtransiente und S2-Delta-Zellen.
      2. B zu definieren, wie Anzahl der Aggregate zwischen S2 Zellen vorübergehend mit Notch und Delta Co transfiziert (S2-Kerbe & Deltatransient) und S2-Delta-Zellen.
      3. Berechnung der relativen Aggregation C = (B X 100) /A
      4. Berechnen von Ausmaß der Hemmung von Cis- Liganden (Delta oder Serrate) als 100- C.
        Hinweis: als Beispiel, wenn relative Aggregation 45 %, dann Cis ist-Liganden werden als hemmen die Trans-Bindung um 55 %.

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Representative Results

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Unsere Beobachtungen in Vivo vorgeschlagen, dass Verlust der Xylosyltransferase gen Shams führt zu Gewinn von Notch Signalisierung durch Delta-vermittelten Transerhöht-Aktivierung des Notch ohne Beeinträchtigung der Cis-Hemmung der Kerbe von Liganden8. Um diese Idee zu testen, wurden in-vitro- Zelle Aggregation Assays durchgeführt. Erstens wurde Shams Ausdruck in S2-Zellen abgerissen mit Shams DsRNA. EGFP DsRNA diente als Kontrolle. Effizienz der Zuschlag (KD) wurde von Real-Time PCR untersucht und zeigte sich mehr als 80 %8sein. Dann, die Bindung des Notch-Rezeptor mit Trans-Delta bei Shams KD war mit Aggregation Assays untersucht. Die Aggregation zwischen S2-Notch und S2-Delta Zellen wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Mischen sie untersucht. Aggregation zwischen einfachen S2 und S2-Delta-Zellen wurde als Hintergrundkontrolle übernommen. Abbildung 3 zeigt das Diagramm zeigt die Anzahl der Aggregate an verschiedenen gebildet Zeitpunkten (1, 5, 15 und 30 min) nach dem mischen. Ein starken Anstieg verzeichneten die Anzahl der Aggregate zwischen 1 und 5 min. danach die Anzahl der Aggregate weiterhin bis 30 min in einem langsameren Tempo zu erhöhen. Daher Aggregatbildung bei 1, 5 und 15 min abgebildet war und die Anzahl der Aggregate wurde nach 5 min der Vermischung quantifiziert.

Abbildung 4A zeigt repräsentative Bilder von Zelle Aggregation Assays zwischen stabilen S2-Notch und S2-Delta-Zellen zur Beurteilung der Auswirkungen von Shams KD auf die Bindung zwischen den Notch-Rezeptor und Trans-Delta. Bilder zeigen die Aggregation zu drei Zeitpunkten (1, 5 und 15 min). Für Hintergrundkontrolle wurden schlichte S2-Zellen (behandelt mit Shams DsRNA) mit S2-Delta-Zellen vermischt. EGFP DsRNA behandelt S2-Notch Zellen gebildet Aggregate mit S2-Delta-Zellen, die in Reihe mit der Zeit zu erhöhen. Im Gegensatz dazu Shams DsRNA behandelt S2-Notch Zellen gebildet Aggregate schneller, und die Aggregate waren größer und zahlreicher als die Kontrollgruppe sind (Abbildung 4 b). Dies, dass die Verminderung der Zahl der Shams Transverbessert-Bindung von Notch mit Delta-8.

Um zu prüfen, ob Shams regelt die inhibitorische Wirkung von Cis-Liganden auf die Bindung zwischen Kerbe und Trans-Delta, wir gegründet, dass Co Expression von Notch und Delta in den Signal-Empfang Zelle kann die Zelle Aggregation verringern Vermittlung der Kerbe und Trans-Delta. Abbildung 5A zeigt das Diagramm zeigt die Anzahl der Aggregate gebildet zwischen S2-Delta und S2-Kerbe & Deltatransiente Zellen mit unterschiedlichen Mengen an Cis-Delta. Transfecting gleiche Mengen von Notch und Delta-Ausdruck Konstrukte in S2-Zellen drastisch verringert die Anzahl der Aggregate, die zwischen diesen Zellen und S2-Delta-Zellen gebildet. Darüber hinaus verringert die Menge von Cis-Delta führt zu einer Erhöhung der Zahl der Aggregate, darauf hinweist, dass im Bereich der Notch /Cis-Delta Verhältnisse verwendet in diesen Tests, Cis-Delta kann hemmen die Bindung zwischen Kerbe und Trans-Delta in einer Dosis-abhängigen Weise. Seit die S2-Kerbe & Deltatransiente Zellen express Notch und Delta, sie könnten homotypische Aggregate bilden, unabhängig von der S2-Delta-Zellen. Zu prüfen, ob die Bildung von homotypische unter S2-Notch Aggregate & Deltatransiente Zellen kann eine verwirrende Faktor in der Cis-Hemmung Assays in Abbildung 5Agezeigt, wir diese Zellen mit S2-Zellen gemischt und quantifiziert die Aggregate. Abbildung 5 b zeigt die Anzahl der Aggregate gebildet nach dem Mischen S2-Zellen mit S2-Kerbe & Deltatransiente Zellen mit dem Ausdruck verschiedener Kerbe /Cis-Delta-Verhältnisse. Eine eher geringe Zahl von homotypische Aggregate im Vergleich zu Zellkulturmodells Aggregate, wie in Abbildung 5A gezeigt wurde beobachtet. Wir schlussfolgern, dass diese Aggregation Assays treu die Wirkung von GUS messen-Delta an der Bindung zwischen Kerbe und Trans-Delta.

Wir als nächstes untersuchte die Wirkung von Shams KD auf die hemmende Fähigkeit des GUS-Delta. Zu diesem Zweck Aggregation zwischen S2-Delta und S2-Kerbe & Deltatransiente Zellen untersucht wurde. Abbildung 6A zeigt repräsentative Bilder der Aggregation zwischen S2-Delta-Zellen und S2-Notchtransient (Kontrolle) oder S2-Kerbe & Deltatransiente Zellen. S2-Delta und EGFP DsRNA behandelt S2-Notchtransiente Zellen gebildet Aggregate, die Erhöhung der Anzahl mit der Zeit, ähnlich wie die Aggregation zwischen S2-Delta und stabile S2-Notch Zellen (Abbildung 4). Vor allem Mischung aus S2-Delta und S2-Kerbe & Deltatransient Co mit gleichen Mengen von Notch und Delta-Ausdruck Plasmide transfiziert gebildet weniger Aggregate auf EGFP KD und Shams KD, was darauf hindeutet, dass sinkende das Niveau der Shams hat keinen Einfluss auf die Fähigkeit des GUS-Delta, Kerbe zu blockieren /Trans-Delta-Bindung. Um die Auswirkungen von Shams KD auf die Aktivität von GUSbesser beurteilen-Delta, das Ausmaß der Hemmung von Cis-Delta wurde gemessen, indem die Berechnung des relativen Aggregation Prozentsatzes über eine Reihe von Kerbe /Cis-Delta Verhältnisse wie im Abschnitt 3.4.2 beschrieben. Quantifizierung der relativen Aggregation zeigten eine vergleichbare Hemmung der Aggregation EGFP und Täuschungen DsRNA Behandlung (Abb. 6 b). Zusammen, diese Beobachtungen empfehlen, dass Verlust von Xylosylation Trans fördert-Bindung ohne GUS-Hemmung8, und bieten einen molekularen Mechanismus für die Flügel Vene Verlust Phänotyp beobachtet in Shams Mutanten.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Zelle Aggregation Assay für Trans-Bindung. Diagramm Induktion von Ligand und Rezeptor (S2-Kerbe) (S2-Delta oder S2 gesägt) mit dem Ausdruck ihrer S2-Zellen von 0,7 mM CuSO4. Induktion von beiden S2-Zellen mischen, folgt die neigt, Aggregate zu bilden. Diese Aggregate (> 6 Zellen) sind abgebildet und quantifiziert.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Zelle Aggregation Assay zu beurteilen, Cis-Hemmung. S2-Zellen wurden vorübergehend mit PMT-Kerbe (S2-Ntransient), PMT-Kerbe und pMT-Delta transfiziert (S2-Kerbe & Deltatransient), oder PMT-Kerbe und PMT-gesägt (S2-Kerbe & Gesägttransient). Nach Induktion von 0,7 mM CuSO4 und mischen mit S2-Delta Zellen aggregiert (> 6 Zellen) quantifiziert werden. Hemmung von Cis-Liganden bemisst sich prozentual relativ Aggregation in an- und Abwesenheit von jedem GUS-Liganden. Die Auswirkungen der Cis-Liganden auf die Bindung zwischen Kerbe und Trans-gesägt durch Mischen der Transient transfizierten Zellen mit S2 gesägtTom Zellen (nicht dargestellt) ermittelt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Aggregation zwischen S2-Kerbe und S2 oder S2-Delta-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten. Diagramm zeigt die Anzahl der Aggregate pro mL zu verschiedenen Zeitpunkten (1, 5, 15 und 30 min.) zwischen den angegebenen Arten von Zellen. Fehlerbalken zeigen Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von drei Wiederholungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Zelle Aggregation vermittelt durch Kerbe und Trans-Delta. (A) Bilder zeigen Aggregation zu verschiedenen Zeitpunkten (1, 5 und 15 min). Aggregation von Shams DsRNA behandelt schlicht S2 und S2-Delta Zellen wurde als Hintergrundkontrolle übernommen. Shams- DsRNA behandelt S2-Notch Zellen zeigen einen Anstieg in der Anzahl und Größe der Aggregate im Vergleich zur EGFP DsRNA behandelt (Kontrolle) S2-Notch Zellen nach dem Mischen mit S2-Delta-Zellen. Maßstabsleiste = 100 µm. (B) Quantifizierung der Anzahl der Zelle Aggregate größer als 6 Zellen nach 5 min der Aggregation. Fehlerbalken zeigen SEM. * P < 0,01 (One-Way Varianzanalyse (ANOVA)). Drei Wiederholungen mit drei unabhängige Wiederholungen es wurden durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Cis-Delta hemmt die Zelle aggregierte Bildung vermittelt durch Kerbe und Trans-Delta in einer Dosis-abhängigen Weise. (A) Graph zeigt die Aggregation (bezogen auf die Zahl der Aggregate/mL) zwischen S2-Delta und S2-Zellen vorübergehend transfiziert mit unterschiedlichen Seitenverhältnissen Expressionsvektoren Kerbe und Cis-Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 und 1:0. 1). Fehlerbalken zeigen SEM. * P < 0,01 (One-Way ANOVA). Drei Wiederholungen mit drei unabhängige Wiederholungen es wurden durchgeführt. Beachten Sie, dass Verringerung der Cis-Delta führt zu einer Zunahme der Aggregation, wahrscheinlich aufgrund der reduzierten Cis-Hemmung. (B) Diagramm homotypische Aggregation (bezogen auf die Zahl der Aggregate pro mL) in S2-Zellen vorübergehend transfiziert mit unterschiedlichen Seitenverhältnissen von Notch und Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 und 1:0. 1) und gemischt mit einfachen S2-Zellen. Fehlerbalken zeigen SEM. Anzahl der Aggregate ist viel kleiner als die Anzahl der heterotypen Aggregate gebildet zwischen S2-Delta und S2-Kerbe & Deltatransiente Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Knockdown von Shams hat keinen Einfluss auf die inhibitorischen Aktivität des GUS-Delta. (A) gezeigt werden repräsentative Bilder der Wirkung von Shams KD auf GUS-Delta-vermittelte Hemmung der Zelle Aggregation vermittelt durch Kerbe /Trans-Delta-Bindung. Bilder zeigen Aggregation zu verschiedenen Zeitpunkten (1, 5 und 15 min). Aggregation von Shams DsRNA behandelt schlicht S2 und S2-Delta Zellen wurde als Hintergrundkontrolle übernommen. Ähnlich stabil transfizierten Zellen S2-Kerbe, Shams KD stieg die Zahl der Aggregate zwischen S2-Delta und S2-Notchtransiente Zellen im Vergleich zur Kontrolle (EGFP DsRNA behandelt). Co Ausdruck von Cis-Delta mit Kerbe im Verhältnis 1:1 führte zu einer vergleichbaren Rückgang der Zahl der Aggregate in der Steuerung (EGFP DsRNA behandelt) sowie in Shams DsRNA behandelt Zellen. Maßstabsleiste = 100 µm. (B) Grafik zeigt relative Aggregation zwischen S2-Delta und S2-Zellen Transient Co transfiziert mit angegebenen Verhältnisse (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 und 1:0. 1) Kerbe und GUS-Delta. EGFP und Täuschungen DsRNA Behandlung zeigen einen vergleichbaren Rückgang der Aggregation in jede Kerbe /Cis-Delta-Verhältnis. Die hier vorgestellte Daten sind repräsentativ für drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Kanonische Notch signaling hängt die Wechselwirkungen zwischen den Notch-Rezeptor und seine Liganden-5. Obwohl die meisten Studien auf der Notch-Signalweg in erster Linie die Bindung von Notch und Liganden in benachbarten Zellen (Trans) betrachten, Kerbe und dieselbe Zelle Liganden wirken zusammen, und diese sogenannten GUS-Interaktionen können eine hemmende Rolle in Aussparung 3,4-Signalisierung. Entsprechend, um die Mechanismen, die die Auswirkungen eines Modifikators auf kanonische Kerbe Signalisierung zu entschlüsseln, ist es oft für beide Arten von Notch-Liganden Interaktionen (Trans- und Cis) zu untersuchen. Jedoch in vielen Kontexten während der tierischen Entwicklung erschwert Beteiligung beider dieser Interaktionen und deren Feedback-Regulation in Vivo Studien1,6. In diesem Protokoll bieten wir eine detaillierte Methode für in-vitro- Zelle Aggregation Assays mit Drosophila S2 Zellen, die Bindung des Notch-Rezeptor mit Trans- Liganden und ihre Hemmung von Cis- bewerten Liganden. Wir haben die Auslastung dieser Methodik zur Beurteilung der Wirkung einer genetischen Modifikatoren von Notch vorgelegt, Signalisierung (die Xylosyltransferase Shams7,8) Rezeptor-Ligand-Bindung.

Zusammenfassung-Assays wurden uraufgeführt zwischen stabilen S2-Delta und EGFP oder Shams DsRNA behandelt stabile S2-Notch Zellen untersuchen die Wirkung von Shams KD auf Trans-Bindung. Aggregation von S2-Delta-Zellen mit Shams DsRNA behandelt schlicht S2 Zellen wurde als Hintergrundkontrolle übernommen. Shams KD verbessert die Aggregation zwischen S2-Kerbe und S2-Delta-Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Es ist wichtig, führen Sie Hintergrund experimentelle Kontrolle Aggregationen zwischen einfachen S2 und Liganden-tragenden S2 Zellen parallel zu den Trans-verbindliche Experimente. Obwohl Drosophila S2 Zellen nicht endogene Notch-Rezeptor und Delta Ligand11ausdrücken, ist Ausdruck eines niedrigen Niveaus von Serrate S2 Zellen13berichtet. Vor diesem Hintergrund wurden schlichte S2-Zellen in Zelle Aggregation Assays als Hintergrundkontrolle verwendet; Diese Zellen zeigen kein Aggregation (Abb. 5 b). Aggregate werden manuell mit einem Hemocytometer gezählt. Zur Gewährleistung der Kohärenz in aggregierten Quantifizierung können 10-20 µL des gemischten Zellpopulation, aus mindestens drei verschiedenen Bereichen pro Bohrloch für die Zählung pipettiert. Diese Tests erfordern gesunde wachsende S2-Zellen. Angesichts der semi-adhärente S2 Zellen, sanft beim Sammeln der Zellen pipettieren und konstante Schütteln während der Aggregation-Assays sind wichtig.

Früher haben wir und andere etablierte, lösliche Liganden-Rezeptor-Bindung-Assays für eine quantitative Beurteilung der Rezeptor-Ligand-Bindung in Trans17,18,19, verwendet 20. da Aggregation Assays semi-quantitativen sind, lösliche Liganden Bindung Assays wurden auch durchgeführt, um untersuchen die Wirkung von Shams KD auf Notch-Liganden Trans-Bindung. Die beobachteten Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen von Aggregation Assays8ähnlich im Trend. Dies bezeugt die treuen Bewertung der Bindung der Kerbe mit Trans-Liganden mit Zelle Aggregation Assays. Zwar die Aggregatbildung ein Auslesen der Rezeptor-Ligand-Bindung, kann es kompliziert, wenn die angegebenen Modifizierer Oberflächenexpression von den Notch-Rezeptor oder seine Liganden betroffen ist. Dies unterstreicht die Begrenzung der Zelle Aggregation Assays, da es nicht unterschieden werden kann, wenn die Veränderung der Aggregatbildung aufgrund veränderter Rezeptor-Ligand-Bindung ist oder Oberflächenexpression geändert. Parallel zur Aggregation-Assays, die Auswirkungen der einzelnen Modifikator auf Oberflächenexpression von Notch und Liganden muss daher in S2-Zellen getestet werden. Im Rahmen unserer Studien waren Oberfläche Ebenen von Notch und Delta in Shams DsRNA behandelt S2 Zellen8nicht betroffen.

Zu prüfen, die Hemmung der Trans-Bindung durch Zugabe von GUS-Liganden, Aggregation Tests wurden durchgeführt, zwischen S2-Delta-Zellen und EGFP oder Shams DsRNA behandelt S2-Kerbe & Deltatransiente Zellen . Die Anzahl der Aggregate gebildet zwischen diesen Zellen wurde mit der Anzahl der Aggregate gebildet zwischen S2-Delta und S2-Notchtransiente Zellen verglichen. Der relative Rückgang in der Anzahl der Aggregate wurde berechnet und verwendet als Indikator für das Ausmaß der Hemmung von Cis-Delta. Die Experimente zeigten, dass GUS-Liganden zeigen eine robuste und Dosis-abhängige Inhibition der Kerbe /Trans-Delta Bindung über eine ziemlich breite Palette Kerbe in GUS-Staaten-Liganden-Verhältnis (1:1, 1:0. 1) (Abb. 5A)8 . Verhältnis 1:1 führte zu den stärksten Grad der Cis-Hemmung und verringert die relative Höhe der Cis-Delta geschwächt Cis-Hemmung. Dementsprechend wurde die KD-Experimente über diesen Bereich der Verhältnisse durchgeführt. Beachten ist wurde die Menge des Notch-Rezeptors und der Gesamtbetrag der transfizierten DNA in allen versuchen konstant gehalten. Dadurch wird sichergestellt, dass Aggregatbildung in erster Linie von der Aktivität der GUSbetroffen ist-Liganden und Ebenen des Ausdrucks der Kerbe durch die Zellen nicht verändert.

Es wurde zuvor gezeigt, dass Co Ausdruck Kerbe und GUS-Liganden in S2-Zellen können dazu führen, dass die Bildung von homotypische Aggregationen14. Prüft, ob ähnliche homotypische Aggregationen unter S2-Kerbe & Deltatransiente oder S2-Kerbe & gesägttransiente Zellen können unsere Interpretationen der aggregierten Quantifizierungen in GUS-Staatengefährden-Liganden Studien eine Kontrolle-Aggregation-Assay erfolgte zwischen S2-Kerbe & Deltatransiente und schlicht S2-Zellen. Die Zahl der in diesen Experimenten verwendeten S2-Zellen war die gleiche wie S2-Delta Zellen in Cis-Delta Experimente. Einige homotypische Aggregation wurde beobachtet, aber Quantifizierung zeigte, dass die daraus resultierenden Aggregate einen geringen Bruchteil der gesamten Aggregate im Vergleich mit der heterotypen Aggregaten zwischen S2-Kerbe beitragen & Deltatransiente und S2-Delta Zellen () Abbildung 5 b).Wir schlussfolgern, dass die Veränderungen in der Anzahl der Aggregate in GUS-Staatenzu beobachten-Liganden-Assays sind in erster Linie durch die hemmende Wirkung von Cis-Liganden auf die Bindung zwischen Kerbe und Trans-Delta.

Zusammenfassend lässt sich sagen, die Aggregation Assays präsentiert in diesem Protokoll bieten eine einfache und unkomplizierte Methode für semi-quantitativen Bewertung der Trans- und Cis-Wechselwirkungen zwischen den Notch-Rezeptor und seine Liganden. Diese Tests können verwendet werden, um die Auswirkungen der genetischen oder pharmakologische Kerbe Weg Modifikatoren auf Notch-Liganden Bindung in Vitro untersuchen und daher können helfen, die Mechanismen, die in Vivo Effekte dieser Modifizierer auf Kerbe zu erläutern Signalisierung.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen Unterstützung von NIH/NIGMS (R01GM084135, HJN) und Mizutani Stiftung für Glycoscience (#110071 Finanzhilfe für HJN) und sind dankbar, Tom V. Lee für Diskussionen und Anregungen auf die Assays und Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine und Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) für Plasmide und Zell-Linien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified Lonza 04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare lifescience  SV30010
CELLSTAR 6 well plate Greiner Bio-One 657 160
CELLSTAR 24 well plate Greiner Bio-One 662160
VWR mini shaker Marshell Sceintific 12520-956
Hemocytometer Fisher Sceintific  267110
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit Ambion AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) Zymo Research R1054
VistaVision Inverted microscope VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software AmScope MU-900 Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
Fetal Bovine Serum GenDepot F0600-050
Methotrexate Sigma-Aldrich A6770-10
Hygromycin B Invitrogen HY068-L6
Copper sulphate Macron Fine Chemicals 4448-02
S2 cells Invitrogen R69007
S2-SerrateTom cells Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells DGRC 152
S2-Notch cells DGRC 154
pMT-Delta vector DGRC 1021 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector DGRC 1022 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit Applied Biosystem 1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) Applied Biosystem Dm02144576_g1  with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) Applied Biosystem Dm02151827_g1 with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 4351405 96-well Block module

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References

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Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der <em>Drosophila</em> Kerbe mit <em>Trans</em>zu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von <em>Cis</em>-Liganden
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Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).More

Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).

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