Summary
Complessità dei sistemi in vivo rende difficile distinguere tra l'attivazione e l'inibizione del recettore Notch di trans- e cis-ligandi, rispettivamente. Qui, presentiamo un protocollo basato su in vitro saggi l'aggregazione delle cellule per la valutazione qualitativa e semiquantitativa del legame di Drosophila tacca alla trans-ligandi vs cis-ligandi.
Abstract
Tacca di segnalazione è un sistema di comunicazione cellula-cellula evolutivamente conservati utilizzato largamente in sviluppo degli animali e manutenzione dell'adulto. Interazione del recettore Notch con ligandi da cellule vicine induce l'attivazione del pathway di segnalazione (trans-attivazione), mentre l'interazione con ligandi dalla stessa cellula inibisce la segnalazione (cis-inibizione). Giusto equilibrio tra trans-attivazione e cis-inibizione aiuta a stabilire i livelli ottimali di tacca di segnalazione in alcuni contesti durante lo sviluppo degli animali. A causa dei domini di espressione sovrapposti di tacca ed i suoi ligandi in molti tipi cellulari e l'esistenza di meccanismi di feedback, studiando gli effetti di una determinata modifica alberino-translational su trans- versus cis-interazioni della tacca e suoi ligandi in vivo è difficile. Qui, descriviamo un protocollo per l'utilizzo della drosofila S2 cellule nelle analisi di aggregazione cellulare per valutare gli effetti di abbattere un modificatore di pathway di Notch nell'associazione della tacca ogni legante in trans e cis. S2 cellule stabilmente o transitoriamente trasfettate con un vettore che esprimono Notch sono mescolate con le cellule che esprimono ogni ligando Notch (S2-Delta o S2-dentellato). Trans-associazione tra i recettori e ligandi provoca la formazione di aggregati cellulari eterotipiche e viene misurata in termini di numero di aggregati / mL composto > 6 celle. Per esaminare l'effetto inibitorio di cis-ligandi, S2 cellule cheesprimono tacca e ogni ligando sono mescolate con le cellule S2-Delta o S2-dentellato e il numero degli aggregati è quantificato come descritto sopra. La relativa diminuzione del numero degli aggregati per la presenza di cis-ligandi fornisce una misura della cis-ligando-mediato l'inibizione di trans-associazione. Queste analisi semplice sugli effetti delle manipolazioni genetiche o farmacologici sull'associazione della tacca per suoi ligandi in grado di fornire dati semi-quantitativi e possono aiutare a decifrare i meccanismi molecolari sottostanti gli effetti in vivo di tali manipolazioni sulla tacca di segnalazione.
Introduction
Canonico tacca di segnalazione è un meccanismo di comunicazione tra cellule a corto raggio che richiede il contatto fisico delle cellule per facilitare l'interazione tra recettori Notch e loro ligandi1vicine. Interazione del recettore Notch (presente sulla superficie delle cellule di segnale di ricezione) con ligandi (presenti sulla superficie di invio di segnale celle) avvia la tacca di segnalazione ed è conosciuta come trans-attivazione2. D'altra parte, l'interazione tra tacca ed i suoi ligandi nella stessa cella conduce all'inibizione del pathway Notch ed è conosciuta come cis-inibizione3. L'equilibrio tra trans- e cis-interazioni è necessaria per garantire l'ottima tacca di ligando-dipendenti di segnalazione4. Drosophila ha un recettore Notch e due ligandi (Delta e dentellato) al contrario di mammiferi, che hanno quattro tacca recettori e cinque ligandi [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-simile 1 (DLL1), DLL3 e DLL4]5. Avendo questa semplicità, il modello di Drosophila offre la facilità per sezionare/studio gli effetti dei modificatori di percorso su interazioni ligando Notch e successivamente su tacca di segnalazione. In determinati contesti durante lo sviluppo degli animali (tra cui lo sviluppo dell'ala in Drosophila), entrambi cis- e trans-interazioni sono coinvolti per ottenere adeguata tacca di segnalazione e delle cellule a destino1,6 . È importante distinguere gli effetti dei modificatori di pathway di Notch in questi contesti il cis- e trans-interazioni della tacca con suoi ligandi.
Il nostro gruppo ha precedentemente segnalato che l'aggiunta di un residuo di carboidrato chiamato xilosio di Drosophila tacca negativamente regola tacca di segnalazione in determinati contesti, tra cui ala sviluppo7. Perdita di shams (l'enzima che xylosylates tacca) conduce ad un fenotipo di "perdita della vena di ala"7. Più recentemente, gli esperimenti di dosaggio del gene e l'analisi clonale sono stati utilizzati per mostrare che la perdita di shams migliora tacca Delta-mediata individuazione. Distinguere se la tacca di segnalazione avanzata nei mutanti di shams è il risultato di una riduzione cis-inibizione o aumentata trans-attivazione, studi di sovraespressione ectopica di ligandi di Notch in dischi immaginali larvale ala sono state effettuate utilizzando il driver di dpp-GAL4 . Questi esperimenti fornito prova che suggerisce che Shams regola trans-attivazione di tacca da Delta senza intaccare la tacca cis-inibizione di ligandi8. Tuttavia, feed-back regolamenti e gli effetti dei ligandi endogeni potrebbero complicare l'interpretazione di sovraespressione ectopica studi1,6,9.
Per risolvere questo problema, drosofila S2 cellule10 sono stati utilizzati, che fornisce un sistema semplice in vitro per tacca-ligando interazione studi11,12. S2 cellule non esprimono endogeno del recettore Notch e Delta ligando11 ed esprimere un basso livello di dentellato13, che non influisce tacca-ligando aggregazione esperimenti8. Pertanto, le cellule S2 possono essere stabilmente o transitoriamente transfected di Notch e/o singoli ligandi (Delta o dentellato) per generare le cellule che esprimono esclusivamente il recettore Notch o uno dei suoi ligandi o una loro combinazione. Miscelazione delle cellule che esprimono Notch S2 con ligando-esprimendo risultati di cellule S2 nella formazione degli aggregati eterotipiche mediata da recettore-ligando associazione11,12,14. Quantificazione della formazione aggregata fornisce una misura della trans-associazione tra tacca e suoi ligandi15 (Figura 1). Allo stesso modo, le cellule S2 possono essere co-trasfettate con ligandi tacca e Delta o Serrate (cioè cis-ligandi). CIS-ligandi in queste cellule che esprimono Notch S2 abrogare l'associazione della tacca con trans-ligandi e risultato in diminuzione formazione aggregata8,12,14. Il relativo calo in formazione aggregata causata da cis-ligandi fornisce una misura dell'effetto inibitorio di cis-ligandi sull'associazione tra tacca e trans-ligandi (Figura 2). Di conseguenza, le analisi di aggregazione delle cellule sono state utilizzate per esaminare l'effetto di perdita di xylosylation trans- e cis-interazioni tra tacca ed i suoi ligandi.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per saggi di aggregazione cellulare finalizzata a valutare l'associazione della tacca con trans-ligandi e la sua inibizione di cis-ligandi usando le cellule della drosofila S2. Ad esempio, forniamo i dati che ci ha permesso di determinare l'effetto di xylosylation tacca sull'associazione tra tacca e trans-Delta8. Queste analisi semplice forniscono una valutazione semi-quantitativa del tacca-ligando interazioni in vitro e consentono a determinare i meccanismi molecolari sottostanti gli effetti in vivo di modificatori del pathway di Notch.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparazione del doppio incagliato RNA (dsRNA) per atterramento di Shams
- Amplificazione di PCR dei prodotti
- È possibile utilizzare il DNA genomico di selvaggio-tipo bianco giallo (y w) e pAc5.1-EGFP come modello e le seguenti coppie di primer per amplificare i frammenti di DNA utilizzati nella sintesi di dsRNA. Utilizzare il seguente profilo termico di PCR: denaturazione (95 ° C, 30 s), ricottura (58 ° C, 30 s) ed estensione (72 ° C, 1 min).
Migliorata la proteina fluorescente verde (EGFP) dsRNA primer (5' - 3')-
Forward primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
Reverse primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
Shams dsRNA primer (5' - 3')-
Forward primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
Reverse primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
Nota: EGFP dsRNA viene utilizzato come controllo negativo.
- È possibile utilizzare il DNA genomico di selvaggio-tipo bianco giallo (y w) e pAc5.1-EGFP come modello e le seguenti coppie di primer per amplificare i frammenti di DNA utilizzati nella sintesi di dsRNA. Utilizzare il seguente profilo termico di PCR: denaturazione (95 ° C, 30 s), ricottura (58 ° C, 30 s) ed estensione (72 ° C, 1 min).
- Gel-purificare i prodotti di reazione a catena (PCR) polimerasi utilizzando un kit di purificazione del gel commerciale secondo il protocollo del produttore.
- Eseguire la trascrizione in vitro utilizzando un prodotto commerciale in grado di trascrivere da un promotore T7 secondo il protocollo del produttore.
- Purificare il dsRNA utilizzando un kit di purificazione di RNA secondo il protocollo del produttore e conservare a-80 ° C.
- Valutare l'efficienza di shams atterramento utilizzando la seguente procedura (1.5.1-1.5.5).
- Conteggio celle manualmente utilizzando un emocitometro e piastra 5x105 S2 cellule in ciascun pozzetto di un 6 anche piastra in 1ml/bene di medie di Schneider supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 100 U/mL penicillina-streptomicina.
- Aggiungere 7,5 µ g di EGFP- o dsRNA shams ad ogni pozzetto e incubare a 25 ° C per 24 h.
- Raccolto il controllo (EGFP dsRNA-Trattato) e shams dsRNA-Trattato S2 cellule pipettando dolce seguita da cubettatura giù mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 min a 25 ° C e di processo per l'isolamento di RNA utilizzando un kit di estrazione di RNA secondo protocollo del produttore.
- Quantificare il RNA usando un spettrofotometro e processo di 100 ng di RNA per passaggio 1 qRT-PCR utilizzando reagenti commerciali qPCR e primer/sonde e il seguente profilo termico di PCR: denaturazione (95 ° C, 15 s) e ricottura/estensione (60 ° C, 1 min).
Nota: Vedere la Tabella materiali per informazioni sui set di primer/sonda e lo strumento utilizzato per esperimenti di qRT-PCR shams e controllo in questi studi. - Calcolare i livelli di mRNA di relativo shams utilizzando 2–ΔΔCT metodo16.
2. valutazione dell'associazione tra il recettore Notch e Trans-ligandi
- Preparare il segnale di ricezione (cellule S2 che esprimono il recettore Notch).
- Contare le celle manualmente utilizzando un emocitometro e piastra 5x105 S2 e cellule S2-tacca stabili in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 1ml/bene di medie di Schneider supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina.
Nota: Per le cellule S2-Notch, che sono disponibili da Drosophila Genomics Resource Center (DGRC), aggiungere 200 metotrexato nM nei media. Per preparare una soluzione stock di metotrexato 0,5 mM, in primo luogo preparare una soluzione di metotrexato 20 mM a 250 µ l di 1 M NaOH. Successivamente, diluire questa soluzione a 0,5 mM a 1 M fosfato tampone salino e conservare a-20 ° C. In cellule S2-tacca, espressione della proteina Notch è sotto il controllo del promotore della drosofila metallotioneina nel vettore di pMT . - Aggiungere 7,5 µ g di dsRNA in ogni pozzetto e incubare a 25 ° C per 24 h.
- Aggiungere 0,7 mM CuSO4 inducono l'espressione di Notch e incubare a 25 ° C per 3 giorni.
Nota: CuSO4 viene utilizzato per indurre l'espressione di proteine controllato dal promotore metallotioneina.
- Contare le celle manualmente utilizzando un emocitometro e piastra 5x105 S2 e cellule S2-tacca stabili in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 1ml/bene di medie di Schneider supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina.
- Preparare l'invio segnale celle (cella di S2 esprimendo ligandi Delta o dentellato).
- Contare le celle manualmente utilizzando un emocitometro e piastra ~ 5 x 106 S2-Delta o S2-dentellatoTom cellule stabili in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 1 mL/pozzetto di medie di Schneider supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina.
Nota: Aggiungere 200 nM methotrexate per cellule S2-Delta e 100 µ g/mL igromicina per S2-dentellatoTom cellule nei media. Espressione di Delta e dentellatoTom— una versione funzionante di dentellato12pomodoro-etichetta — è in Drosophila metallotioneina promotore nel vettore di pMT . - Aggiungere 0,7 mM CuSO4 inducono l'espressione di ligandi e incubare a 25 ° C per 3 h.
- Contare le celle manualmente utilizzando un emocitometro e piastra ~ 5 x 106 S2-Delta o S2-dentellatoTom cellule stabili in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 1 mL/pozzetto di medie di Schneider supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina.
- Eseguire l'aggregazione tra le celle di segnale-invio e ricezione di segnale.
- Raccogliere la S2 dsRNA-Trattato (controllo) e cellule S2-tacca di pipettaggio delicato e piastra di 2.5 x 105 cellule/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti dopo il conteggio manuale di un emocitometro.
- Aggiungere cellule stabili 5x105 S2-Delta o S2-dentellatoTom in un volume totale di 200 µ l di terreno di Schneider (supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina).
Nota: Tutte le cellule S2 gestione (compreso il trattamento di cromatura, induzione e dsRNA) è stato fatto sotto una cappa di biosicurezza. - Collocare la piastra su un agitatore orbitale a 150 giri/min (rad 942,48/min).
- Dopo 1 min, mescolare il contenuto di ogni pozzetto e prendere 20 µ l per conteggiare il numero degli aggregati.
- Allo stesso tempo prendere un'immagine rappresentativa sotto microscopio composto invertito con ingrandimento 10x (obiettivo PLL 10/0.25).
- Contare manualmente le aggregazioni (> 6 celle) utilizzando un emocitometro.
- Posizionare la piastra su un agitatore.
- Ripetere l'acquisizione dell'immagine e il conteggio dopo 5 min e 15 min di aggregazione.
- Eseguire la quantificazione di trans-associazione.
- Calcolare il numero di aggregazioni / mL tra cellule S2 e S2-Delta o S2-dentellatoTom come un controllo di sfondo.
- Calcolare il numero di aggregazioni / mL tra S2-Notch e cellule S2-Delta o S2-dentellatoTom (magnitudo di trans-associazione).
3.Valutazione dell'inibizione del legame tra tacca e Trans-ligandi di Cis-ligandi
- Preparare cellule di segnale di ricezione.
- Le cellule di piastra 5x105 S2 in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 1ml/bene di medie di Schneider supplementato con 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina.
- Aggiungere 7,5 µ g di dsRNA in ogni pozzetto e incubare a 25 ° C per 24 h.
- Co-transfect le cellule dsRNA-trattate con pBluescript e PMT-tacca11 (DGRC) da solo o con pMT-Notch e pMT-Delta11 (DGRC) o PMT-dentellato17 per un totale Concentrazione di DNA di 2 µ g/Beh utilizza un reagente di transfezione commerciale secondo il protocollo del produttore.
Nota: pBluescript viene utilizzato come un controllo. Le cellule co-trasfettate saranno chiamate S2-tacca & Deltatransitoria o S2-tacca & dentellato celluletransitoria in seguito. - Incubare le cellule S2 transfected transitoriamente a 25 ° C per 24 h.
- Aggiungere 0,7 mM CuSO4 inducono l'espressione di Notch e i ligandi e incubare a 25 ° C per 3 giorni.
- Preparare l'invio segnale celle come descritto al punto 2.2.
- Eseguire l'aggregazione tra le celle di segnale-invio e ricezione segnale come descritto nella sezione 2.3.
- Quantificare l'inibizione di trans-associazione di cis-ligandi.
- Calcolare il numero di aggregazioni / mL fra le cellule S2 e S2-Delta o S2-dentellato celle come un controllo di sfondo.
- Quantificare la grandezza di inibizione di cis-ligandi come segue.
- Definire A come numero di aggregazioni tra S2-taccatransitoria e cellule S2-Delta.
- Definire B come numero di aggregazioni tra S2 cellule transitoriamente co-trasfettate con tacca e Delta (S2-tacca & Deltatransitoria) e cellule S2-Delta.
- Calcolare la relativa aggregazione C = (B x 100) /A
- Calcolare la grandezza di inibizione di cis- ligando (Delta o dentellato) come 100 – C.
Nota: ad esempio, se la relativa aggregazione è 45%, cis-ligandi sono considerati per inibire la trans-associazione del 55%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le nostre osservazioni in vivo hanno suggerito che la perdita dei risultati di shams xylosyltransferase gene in guadagno di tacca di segnalazione causa di aumentata Delta-mediata trans-attivazione di tacca senza intaccare il cis-inibizione di Tacca di ligandi8. Per testare questo concetto, sono state eseguite analisi di aggregazione in vitro delle cellule. In primo luogo, shams espressione in cellule S2 è stato abbattuto con shams dsRNA. EGFP dsRNA è stato usato come controllo. Efficienza di atterramento (KD) è stato esaminato mediante PCR in tempo reale ed è stato indicato per essere superiore a 80%8. Quindi, il legame del recettore Notch con trans-Delta su shams KD è stato esaminato utilizzando dosaggi di aggregazione. L'aggregazione tra cellule S2-Notch e S2-Delta è stata esaminata in vari momenti dopo la miscelazione loro. Aggregazione tra pianura S2 cellule e cellule S2-Delta è stato preso come controllo dello sfondo. Figura 3 Mostra il grafico che indica il numero di aggregazioni formato alle diverse tempo punti (1, 5, 15 e 30 min) dopo la miscelazione. Un forte aumento è stato osservato nel numero di aggregazioni tra 1 e 5 min. in seguito, il numero degli aggregati ha continuato ad aumentare fino a 30 min ad un tasso più lento. Di conseguenza, formazione aggregata era imaged a 1, 5 e 15 min e il numero degli aggregati è stato quantificato dopo 5 min di miscelazione.
Figura 4A Mostra immagini rappresentative della cella analisi di aggregazione tra cellule stabili S2-Notch e S2-Delta per valutare gli effetti di shams KD sul legame tra recettore Notch e trans-Delta. Le immagini mostrano l'aggregazione a intervalli di tre-tempo (1, 5 e 15 min). Per controllo di sfondo, pianura cellule S2 (trattate con shams dsRNA) sono state mescolate con le cellule S2-Delta. EGFP dsRNA-Trattato S2-tacca cellule formate aggregati con cellule S2-Delta, che aumentano di numero con il tempo. Al contrario, shams dsRNA-Trattato S2-tacca cellule formano aggregati più velocemente, e gli aggregati erano più grandi e più numerosi rispetto al controllo quelli (Figura 4B). Ciò ha indicato che diminuire i livelli di Shams migliora la trans-associazione della tacca con Delta8.
Per esaminare se Shams regola l'effetto inibitorio di cis-ligandi sull'associazione tra tacca e trans-Delta, abbiamo stabilito prima che co-espressione di Notch e Delta in ricezione il segnale cellulare può fare diminuire l'aggregazione delle cellule mediata da Notch e trans-Delta. Figura 5A Mostra il grafico che indica il numero di aggregati formata tra S2-Delta e S2-tacca & celluletransitoria di Delta con diverse quantità di cis-Delta. Trasfezione uguali quantità di costrutti di Notch - e Delta-espressione nelle cellule S2 drasticamente riduce il numero di aggregazioni formate tra queste cellule e le cellule S2-Delta. Inoltre, diminuendo la quantità di cis-Delta si traduce in un aumento del numero degli aggregati, che indica che nella gamma di tacca /cis-rapporti di Delta usati in queste analisi, cis-Delta può inibire il legame tra tacca e Trans-Delta in modo dose-dipendente. Poiché la S2-tacca &transitoria cellule Delta express Delta e Notch, essi potrebbero formare aggregati homotypic indipendentemente le cellule S2-Delta. Per esaminare se la formazione di homotypic aggrega tra S2-tacca &transitoria cellule Delta possono essere un fattore di confusione nel cis-saggi di inibizione mostrati in Figura 5A, abbiamo mescolato queste cellule con le cellule S2 e quantificato il funzioni di aggregazione. Figura 5B Mostra il numero di aggregazioni formate dopo la miscelazione cellule S2 con S2-tacca & celluletransitoria di Delta che esprimono vari tacca /cis-rapporti di Delta. È stato osservato un numero piuttosto ridotto di homotypic aggregati rispetto agli aggregati eterotipiche come mostrato in Figura 5A . Concludiamo che questi saggi di aggregazione misurano fedelmente l'effetto di cis-Delta sull'associazione tra tacca e trans-Delta.
Dopo abbiamo esaminato l'effetto di shams KD la capacità inibitoria dei cis-Delta. A tal fine, l'aggregazione tra S2-Delta e S2-tacca & celluletransitoria di Delta è stato esaminato. Figura 6A Mostra immagini rappresentative di aggregazione tra cellule S2-Delta e S2-taccatransitoria (controllo) o S2-tacca & celluletransitoria di Delta. S2-Delta ed EGFP dsRNA-Trattato S2-taccatransitoria cellule formate aggregati, che aumentano di numero con il tempo, simile all'aggregazione tra S2-Delta e cellule S2-tacca stabili (Figura 4). In particolare, miscelazione S2-Delta e S2-tacca & celluletransitorie co-trasfettate con uguali quantità di plasmidi di espressione di Notch e Delta Delta formano meno aggregati su entrambi EGFP KD e shams KD, suggerendo che diminuendo il livello di Shams non pregiudica la possibilità di cis-Delta per bloccare tacca /trans-associazione di Delta. Per valutare meglio gli effetti di shams KD sull'attività di cis-Delta, la grandezza di inibizione di cis-Delta è stata misurata calcolando la percentuale relativa aggregazione sopra una gamma di Notch /cis-Delta rapporti come spiegato nella sezione 3.4.2. Quantificazione della relativa aggregazione hanno mostrato un'inibizione comparabile di aggregazione previo trattamento di dsRNA EGFP e shams (Figura 6B). Insieme, queste osservazioni suggeriscono forte che promuove la perdita di xylosylation trans-associazione senza influenzare cis-inibizione8e forniscono un meccanismo molecolare per il fenotipo di perdita di vena ala osservato a shams mutanti.
Figura 1: Rappresentazione schematica dell'analisi di aggregazione delle cellule per Trans-associazione. Diagramma mostra induzione del recettore (S2-Notch) e ligando (S2-Delta o S2-dentellato) che esprimono le cellule S2 da 0,7 mM CuSO4. Induzione di entrambe le cellule S2 è seguita da miscelazione, che tende a rendere inerti. Questi aggregati (> 6 cellule) sono imaged e quantificato.Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione schematica dell'analisi di aggregazione delle cellule per valutare Cis-inibizione. S2 cellule transfected transitoriamente con PMT-tacca (S2-Ntransitoria), pMT-Notch e pMT-Delta (S2-tacca & Deltatransitoria), o pMT-Notch e PMT-dentellato (S2-tacca & Dentellatotransitoria). Dopo induzione di 0,7 mM di CuSO4 e la miscelazione con le cellule S2-Delta, aggregati (> 6 cellule) sono quantificati. Inibizione di cis-ligandi è misurata in termini di percentuale relativa aggregazione in presenza ed assenza di ogni cis-ligando. Gli effetti di cis-ligandi sull'associazione tra tacca e trans-dentellato può essere determinato miscelando le cellule transfected transitoriamente con cellule S2-dentellatoTom (non mostrate). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: aggregazione tra S2-tacca e S2 o cellule S2-Delta a diversi intervalli di tempo. Il grafico mostra il numero di aggregati / mL in diversi momenti (1, 5, 15 e 30 min) tra i tipi indicati delle cellule. Barre di errore indicano l'errore standard della media (SEM) di tre replicati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Cella aggregazione mediata da Notch e trans-Delta. (A) immagini Mostra aggregazione in diversi momenti (1, 5 e 15 min). Aggregazione tra cellule shams dsRNA-Trattato pianura S2 e S2-Delta è stato preso come controllo dello sfondo. Shams- dsRNA Trattato S2-tacca cellule mostrano un aumento del numero e dimensione degli aggregati rispetto al EGFP dsRNA-Trattato (controllo) cellule S2-tacca dopo la miscelazione con le cellule S2-Delta. Barra della scala = 100 µm. (B) quantificazione del numero di cellulare aggrega maggiore di 6 celle dopo 5 min di aggregazione. Barre di errore indicano SEM. * P < 0,01 (unidirezionale analisi della varianza (ANOVA)). Sono stati effettuati tre replicati con tre ripetizioni indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Cis-Delta inibisce la cellula formazione aggregazione mediata dalla tacca e trans-Delta in modo dose-dipendente. (A) grafico mostra l'aggregazione (in termini di numero di aggregati/mL) tra S2-Delta e S2 cellule transfettate transitoriamente con differenti rapporti di vettori di espressione per tacca e cis-Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 e 1:0. 1). Barre di errore indicano SEM. * P < 0,01 (One-way ANOVA). Sono stati effettuati tre replicati con tre ripetizioni indipendenti. Si noti che diminuendo il livello di cis-Delta si traduce in un aumento nell'aggregazione, probabilmente a causa di ridotta cis-inibizione. (B) grafico risultati homotypic aggregazione (in termini di numero di aggregati per millilitro) in cellule S2 transitoriamente transfected con differenti rapporti di Notch e Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 e 1:0. 1) e mescolato con le cellule S2 pianura. Barre di errore indicano SEM. numero degli aggregati è molto più piccola rispetto al numero degli aggregati eterotipiche tra S2-Delta e S2-tacca & celluletransitoria di Delta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Atterramento di shams non influisce l'attività inibitoria di cis-Delta. (A) mostrato sono immagini rappresentative dell'effetto di shams KD su cis-Delta-mediato l'inibizione di aggregazione cellulare mediata da Notch /trans-associazione di Delta. Le immagini mostrano aggregazione in diversi momenti (1, 5 e 15 min). Aggregazione tra cellule shams dsRNA-Trattato pianura S2 e S2-Delta è stato preso come controllo dello sfondo. Simile a trasfettata stabilmente cellule S2-tacca, shams KD aumentato il numero di aggregazioni tra S2-Delta e celluletransitorie S2-Notch rispetto al controllo (EGFP dsRNA-Trattato). Co-espressione di cis-Delta con tacca in un rapporto 1:1 ha provocato una diminuzione paragonabile nel numero degli aggregati nel controllo (EGFP dsRNA-Trattato) anche come nelle cellule di dsRNA Trattato shams . Barra della scala = 100 µm. (B) grafico mostra relativa aggregazione tra S2-Delta e cellule S2 transitoriamente co-trasfettate con i rapporti indicati (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 e 1:0. 1) di Notch e cis-Delta. Trattamento di dsRNA EGFP e shams mostrano una diminuzione paragonabile nell'aggregazione a ogni tacca /cis-rapporto di Delta. I dati presentati qui sono rappresentante di tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Canonico tacca di segnalazione dipende le interazioni tra il recettore Notch e i suoi ligandi5. Anche se la maggior parte degli studi sul pathway di Notch considera principalmente l'associazione della tacca e ligandi in cellule vicine (trans), Notch e leganti delle stesse cellule interagiscono e questi cosiddetti cis-interazioni possono giocare un ruolo inibitorio nella tacca segnalazione di3,4. Di conseguenza, a decifrare i meccanismi per gli effetti di un modificatore il canonico tacca di segnalazione, spesso è pertinente esaminare entrambi i tipi di interazioni ligando Notch (trans e cis). Tuttavia, in molti contesti durante lo sviluppo animale, coinvolgimento di entrambe queste interazioni e loro regolazione feed-back complica in vivo studi1,6. Nel presente protocollo, forniamo una dettagliata metodologia per analisi aggregazione in vitro delle cellule, usando le cellule di Drosophila S2 per valutare l'associazione del recettore Notch con trans- ligandi e la sua inibizione di cis- ligandi. Abbiamo presentato l'utilizzo di questa metodologia per valutare l'effetto di un modificatore genetico della tacca di segnalazione (xylosyltransferase Shams7,8) il recettore-ligando.
In primo luogo, analisi di aggregazione sono state eseguite tra stabile S2-Delta ed EGFP o shams dsRNA stabile S2-tacca cellule trattate per esaminare l'effetto di shams KD su trans-associazione. Aggregazione delle cellule S2-Delta con cellule shams dsRNA-trattate pianura S2 è stato preso come controllo dello sfondo. Shams KD migliorato l'aggregazione tra S2-Notch e cellule S2-Delta rispetto al controllo. È importante eseguire le aggregazioni di controllo sperimentale di sfondo tra pianura S2 e ligando-trasportare cellule S2 in parallelo con la trans-esperimenti di associazione. Anche se drosofila S2 cellule non esprimono endogeno del recettore Notch e Delta ligando11, espressione di bassi livelli di Serrate è segnalato in S2 cellule13. Considerando questo, pianura S2 cellule sono state utilizzate nelle analisi di aggregazione delle cellule come controllo di sfondo; Queste cellule non hanno mostrato alcuna aggregazione (figura 5B). Gli aggregati sono contati manualmente utilizzando un emocitometro. Per garantire la coerenza nella quantificazione aggregazione, 10-20 µ l della popolazione cellulare mista può essere dispensato fuori da almeno tre diverse aree per pozzetto per il conteggio. Queste analisi richiedono cellule S2 crescente sane. Considerando la natura semi-aderente della S2 cellule, gentle pipettaggio durante la raccolta delle cellule e costante agitazione durante il dosaggio di aggregazione è importanti.
In precedenza, noi ed altri abbiamo usato analisi obbligatorie ben consolidata, solubile ligando-recettore per una valutazione quantitativa del recettore-ligando in trans17,18,19, 20. poiché sono semi-quantitativa test di aggregazione, analisi obbligatorie ligando solubile sono state effettuate anche per esaminare l'effetto di shams KD su tacca-ligando trans-associazione. I risultati osservati erano simili in tendenza con quelli ottenuti da aggregazione saggi8. Questo attestato la valutazione fedele di associazione della tacca con trans-ligandi usando analisi di aggregazione delle cellule. Anche se la formazione di aggregati è una lettura del recettore-ligando, può essere intricato se l'espressione di superficie di recettore Notch o suoi ligandi è influenzato dai modificatori specificati. Ciò evidenzia la limitazione delle analisi di aggregazione della cella, come non è possibile distinguere se il cambiamento nella formazione aggregata a causa di alterata del recettore-ligando o alterata espressione di superficie. Pertanto, parallelamente ai saggi di aggregazione, gli effetti di ogni modificatore sulla espressione di superficie di Notch e ligandi deve essere testato in cellule S2. Nel contesto dei nostri studi, superfici livelli di Notch e Delta non sono stati colpiti in shams dsRNA-Trattato S2 cellule8.
Per esaminare l'inibizione di trans-associazione tramite l'aggiunta di cis-ligandi, saggi di aggregazione sono stati effettuati tra cellule S2-Delta ed EGFP o shams dsRNA-Trattato S2-tacca &transitoria cellule Delta . Il numero degli aggregati formati fra queste cellule è stato confrontato con il numero di aggregazioni formate tra S2-Delta e celluletransitorie S2-tacca. La relativa diminuzione del numero degli aggregati è stata calcolata e utilizzata come un indicatore per la grandezza di inibizione da cis-Delta. Gli esperimenti di controllo hanno mostrato quello cis-ligandi mostrano un'inibizione robusta e dosaggio-dipendente di Notch /trans-associazione Delta sopra una gamma piuttosto ampia di Notch a cis-rapporti di ligando (1:1 a 1:0. 1) (Figura 5A),8 . Un rapporto di 1:1 ha provocato il più forte grado di cis-inibizione e diminuendo il livello relativo di cis-Delta indebolito cis-inibizione. Di conseguenza, gli esperimenti di KD in questo range di rapporti è stato effettuato. Della nota, la quantità di recettore Notch e la quantità totale di DNA transfected è state mantenute costante in tutti gli esperimenti. Questo farà sì che la formazione aggregata è principalmente influenzata dall'attività del cis-leganti e non da alterato i livelli di espressione di Notch da parte delle cellule.
Precedentemente è stato indicato che il co-espressione di tacca e cis-ligandi in cellule S2 possono provocare la formazione di aggregazioni di homotypic14. Esaminare se simili homotypic aggregazioni tra S2-tacca & Deltatransitoria o S2-tacca & cellule dentellatotransitoria possono compromettere nostre interpretazioni dell'aggregazione quantificazioni in cis-studi di ligando, un saggio di aggregazione del controllo è stato effettuato tra S2-tacca & Deltatransitoria e pianura S2 cellule. Il numero di cellule S2 utilizzati in questi esperimenti era lo stesso di cellule S2-Delta utilizzate in cis-esperimenti di Delta. Alcuni homotypic è stato osservato, ma quantificazione ha mostrato che gli aggregati risultanti contribuiscano una bassa frazione degli aggregati totale rispetto con gli aggregati eterotipiche tra S2-tacca & S2-Delta e Deltatransitoria celle ( Figura 5B).Concludiamo che i cambiamenti osservati nel numero degli aggregati in cis-ligando saggi sono principalmente dovuto l'effetto inibitorio di cis-ligandi sull'associazione tra tacca e trans-Delta.
In sintesi, i saggi di aggregazione presentati in questo protocollo forniscono una metodologia semplice e lineare per valutazione semi-quantitativa del trans- e cis-interazioni del recettore Notch ed i suoi ligandi. Queste analisi possono essere usate per esaminare gli effetti della genetici o farmacologici modificatori di pathway di Notch sulla tacca-ligand binding in vitro e pertanto possono contribuire a delucidare i meccanismi alla base gli effetti in vivo di questi modificatori su tacca segnalazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono supporto da NIH/NIGMS (R01GM084135 a HJN) e Mizutani Foundation per Glycoscience (grant #110071 a HJN) e sono grato a Tom V. Lee per discussioni e suggerimenti sui saggi e Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine e la Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) per plasmidi e linee cellulari.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
References
- de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
- Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
- del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
- Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
- Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).
- Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).
- Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
- Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
- Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
- Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
- Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
- Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
- Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).
