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Developmental Biology

Célula de ensayos de agregación para evaluar el atascamiento de la muesca de Drosophila con Trans-ligandos y su inhibición por Cis-ligandos

Published: January 2, 2018 doi: 10.3791/56919
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine

Summary

Complejidad de los sistemas en vivo hace que sea difícil distinguir entre la activación y la inhibición del receptor Notch por trans- y cis-ligandos, respectivamente. Aquí, presentamos un protocolo basado en los análisis agregación celular en vitro para la evaluación cualitativa y semicuantitativa de la Unión de la muesca de la Drosophila a trans-ligandos vs cis-ligandos.

Abstract

Señalización de Notch es un sistema de comunicación célula-célula evolutivamente conservado utilizado ampliamente en el desarrollo de animales y mantenimiento del adulto. Interacción del receptor Notch con ligandos de los vecinos células induce la activación de la vía de señalización (trans-activación), mientras que la interacción con ligandos de la misma célula inhibe la señalización (cis-inhibición). Equilibrio adecuado entre trans-activación y cis-inhibición ayuda a establecer niveles óptimos de señalización Notch en algunos contextos durante el desarrollo animal. Debido a los dominios de expresión superpuestos de la muesca y sus ligandos en muchos tipos celulares y la existencia de mecanismos de retroalimentación, estudiando los efectos de una determinada modificación poste-de translación en trans- y cis-interacciones de la muesca y sus ligandos en vivo es difícil. Aquí, describimos un protocolo para el uso de las células S2 de Drosophila en los ensayos de agregación celular para evaluar los efectos de derribar un modificador de la vía de Notch en la Unión de muesca a cada ligando trans y el cis. S2 las células transfectadas estable o transitorio con un vector de expresión de muesca se mezclan con las células que expresan cada ligando de Notch (serrado S2 o S2-Delta). Trans-unión entre los receptores y ligandos resulta en la formación de agregados celulares heterotípicos y se mide en términos del número de agregados por mL compuesto de > 6 células. Para examinar el efecto inhibitorio de cis-ligandos, S2 las células Co muesca y cada ligando se mezclan con las células Delta del S2 o S2-serrado y se cuantificó el número de agregados como se describió anteriormente. La disminución relativa del número de agregados debido a la presencia de cis-ligandos proporciona una medida de cis-ligand-mediada por la inhibición de la trans-vinculante. Estos ensayos sencillos pueden proporcionar datos semi cuantitativos sobre los efectos de manipulaciones genéticas o farmacológicas en la Unión de ranura a sus ligandos y pueden ayudar a descifrar los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos en vivo de tales manipulaciones sobre la señalización de Notch.

Introduction

Canónica de la señalización de Notch es un mecanismo de comunicación de célula a célula de corto alcance que requiere contacto físico de los vecinos a las células para facilitar la interacción entre receptores Notch y sus ligandos1. Interacción del receptor Notch (presente en la superficie de las células receptores de señal) con ligandos (presentes en la superficie de envío de señal de las células) inicia la señalización de Notch y se conoce como trans-activación2. Por otro lado, la interacción entre muesca y sus ligandos en la célula misma conduce a la inhibición de la vía de Notch y es conocido como cis-inhibición de la3. El equilibrio entre trans- y cis-interacciones es necesaria para asegurar la óptima muesca dependiente de ligando señalización4. Drosophila tiene un receptor Notch y dos ligandos (Delta y serrado) a diferencia de los mamíferos, que tienen cuatro receptores Notch y cinco ligandos [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-like 1 (DLL1), DLL3 y DLL4]5. Esta simplicidad, el modelo de Drosophila ofrece la facilidad para diseccionar y estudio de los efectos de los modificadores vía las interacciones ligando de Notch y posteriormente sobre la señalización de Notch. En ciertos contextos durante el desarrollo animal (incluyendo desarrollo de ala de Drosophila), cis- y trans-interacciones participan para lograr la adecuada señalización Notch y células destino1,6 . Es importante distinguir los efectos de los modificadores de la vía de Notch en estos contextos en cis- y trans-las interacciones de la muesca con sus ligandos.

Nuestro grupo reportó anteriormente que además de un residuo de carbohidrato llamado xilosa a Drosophila muesca negativa regula la señalización de Notch en ciertos contextos, incluyendo ala desarrollo7. Pérdida de shams (la enzima que xylosylates muesca) conduce a un fenotipo de «pérdida de vena del ala»7. Más recientemente, experimentos de dosis génica y análisis clonal fueron utilizados para mostrar que pérdida de shams realza señalar muesca mediada por el Delta. Para distinguir si la señalización de Notch mejorada en shams mutantes es el resultado de la disminución de cis-inhibición o aumento de trans-activación, sobreexpresión ectópico estudios de ligandos de muesca en discos imaginal de ala de larvas se realizaron utilizando el controlador de la dpp-GAL4 . Estos experimentos proporcionan evidencias sugiriendo que Shams regula trans-activación de Notch por Delta sin afectar la muesca cis-inhibición por ligandos8. Sin embargo, retroalimentación normativa y efectos de los ligandos endógenos podrían complicar la interpretación de sobreexpresión ectópico estudios1,6,9.

Para resolver este problema, en células S2 de Drosophila 10 fueron utilizados, que preven un sistema simple en vitro ligando de Notch-interacción estudios11,12. Células S2 no expresar endógenos receptor de la muesca y Delta ligando11 y expresar un bajo nivel de Serrate13, que no afecta el ligando de Notch-agregación experimentos8. Por lo tanto, las células S2 pueden ser estable o transitorio transfected por muesca o ligandos individuales (Delta o serrado) para generar las células que expresan exclusivamente el receptor Notch o uno de sus ligandos o una combinación de ellos. Mezcla de células expresando muesca S2 con resultados de S2 ligand-expresar las células en la formación de agregados heterotípicos mediada por receptor-ligando vinculante11,12,14. Cuantificación de la formación agregada provee una medida de trans-vinculante entre la muesca y sus ligandos15 (figura 1). Del mismo modo, las células S2 pueden ser co transfected con muesca y Delta o serrado ligandos (por ejemplo, cis-ligandos). CIS-ligandos en estas células expresando muesca S2 derogar el atascamiento de la muesca con trans-ligandos y resultado en disminución de agregado formación8,12,14. La disminución relativa de formación agregada causada por cis-ligandos proporciona una medida del efecto inhibitorio de cis-ligandos de unión entre la muesca y trans-ligandos (figura 2). Por consiguiente, se utilizaron estudios de agregación de células para examinar el efecto de la pérdida de xylosylation de trans- y cis-interacciones entre la muesca y sus ligandos.

Aquí, presentamos un protocolo detallado para estudios de agregación de células para evaluar el atascamiento de la muesca con trans-ligandos y su inhibición por cis-ligandos utilizando células S2 de Drosophila . Por ejemplo, ofrecemos los datos que nos permitieron determinar el efecto de la muesca xylosylation de enlace entre la muesca y trans-Delta8. Estos ensayos sencillos proporcionan una evaluación semi-cuantitativa de las interacciones ligando-muesca en vitro y determinar los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos en vivo de los modificadores de la vía de Notch.

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Protocol

1. preparación de doble trenzado RNA (dsRNA) por caída de Shams

  1. Amplificación por PCR de los productos
    1. Utilice tipo salvaje blanco amarillo (w y) la DNA genomic y pAc5.1-EGFP como plantilla y las siguientes combinaciones de primer para amplificar los fragmentos de ADN utilizados en síntesis de dsRNA. Utilice el siguiente perfil térmico de PCR: desnaturalización (95 ° C, 30 s), recocido (58 ° C, 30 s) y extensión (72 º C, 1 min).
      Mejorada de la proteína verde fluorescente Cartillas de dsRNA (EGFP) (5' - 3')-
      Primer avance-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Revertir la cartilla-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Impostores de dsARN cebadores (5' - 3')-
      Primer avance-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Revertir la cartilla-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      Nota: EGFP dsARN se utiliza como control negativo.
  2. Gel-purificar los productos de la reacción en cadena (PCR) de polimerasa usando un kit de potabilización de gel comercial según protocolo del fabricante.
  3. Realizar en vitro transcripción utilizando un producto comercial capaz de transcripción desde un promotor T7 según protocolo del fabricante.
  4. Purificar el dsRNA utilizando un kit de purificación de RNA según protocolo del fabricante y almacenar a-80 ° C.
  5. Evaluar la eficiencia de shams caída siguiendo los siguientes pasos (1.5.1-1.5.5).
    1. Cuenta las celdas manualmente usando un hemocitómetro y placa de 5 x 105 S2 células en cada pozo de 6 bien placa 1 mL/pozo de medio de Schneider suplementado con 10% suero bovino Fetal (FBS) y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
    2. Añadir 7,5 μg de EGFP- o impostores de dsRNA a cada pozo e incubar a 25 ° C durante 24 h.
    3. Cosecha el control (EGFP tratados de dsRNA) y shams dsRNA-S2 las células tratadas mediante pipeteo suave seguida de granulación abajo por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min a 25 ° C y el proceso para el aislamiento de RNA usando un kit de extracción de RNA según Protocolo del fabricante.
    4. Cuantificar el ARN utilizando un espectrofotómetro y proceso 100 ng de ARN para paso 1 qRT-PCR utilizando reactivos comerciales qPCR y puntas de prueba de la cartilla y el siguiente perfil térmico de PCR: desnaturalización (95 ° C, 15 s) y recocido/extensión (60 ° C, 1 min).
      Nota: Consulte la Tabla de materiales de información en el primer punta de prueba y el instrumento utilizado para experimentos de qRT-PCR shams y control en estos estudios.
    5. Calcular los niveles de mRNA de relativa shams usando 2–ΔΔCT método16.

2. evaluación de la unión entre el Receptor Notch y Trans-ligandos

  1. Preparar recepción de señal (células S2 expresando el receptor Notch).
    1. Contar las celdas manualmente utilizando un hemocitómetro y placa de 5 x 105 S2 y estables células S2-muesca en cada pocillo de una placa de 6 pozos en 1 mL/pozo de medio de Schneider suplieron con 10% FBS y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
      Nota: Para las células S2-Notch, que dispone de centro de recursos de genómica de Drosophila (DGRC), agregue 200 metotrexato nM en los medios de comunicación. Para preparar una solución stock de metotrexato 0,5 mM, en primer lugar, preparar una solución de metotrexato de 20 mM en 250 μl de 1 M NaOH. A continuación, diluir esta solución a 0,5 mM en 1 M fosfato buffer salino y almacenar a-20 ° C. En células S2-muesca, expresión de la proteína Notch está bajo el control del promotor de la metalotioneína de Drosophila en el vector de la pMT .
    2. Añadir 7,5 μg de dsRNA a cada pozo e incubar a 25 ° C durante 24 h.
    3. Añada 0,7 mM CuSO4 inducen la expresión de la muesca e incubar a 25 ° C durante 3 días.
      Nota: CuSO4 se utiliza para inducir la expresión de proteínas controladas por el promotor de la metalotioneína.
  2. Preparar el envío de señal de las células (S2 célula expresan ligandos Delta o serrado).
    1. Cuenta las celdas manualmente usando un hemocitómetro y placa de ~ 5 x 106 estable Delta S2 o S2-serradoTom células en cada pozo de una placa de 6 pozos en 1 mL/pozo de medio de Schneider suplementado con 10% FBS y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
      Nota: Agregue 200 metotrexato nM para células S2-Delta y 100 μg/mL Higromicina para serrado de S2Tom células en medios de comunicación. Expresión de Delta y SerrateTom— una versión funcional etiquetado tomate de Serrate12— está bajo el promotor de la metalotioneína de Drosophila en el vector de la pMT .
    2. Añada 0,7 mM CuSO4 inducir la expresión de ligandos e incubar a 25 ° C durante 3 horas.
  3. Realizar la agregación entre las células enviando señales y receptores de señal.
    1. Cosecha el S2 de dsARN tratados (control) y las células S2-muesca por pipeteo suave y placa de 2.5 x 105 células/pozo en un plato 24-well después de conteo manual por hemocitómetro.
    2. Añadir 5 x 105 células estables Delta S2 o S2-serradoTom en un volumen total de 200 μL de medio de Schneider (suplementado con 10% FBS y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina).
      Nota: Todas las células del S2 manejo (incluyendo el tratamiento de la galjanoplastia, la inducción y el dsRNA) se realizó bajo un gabinete de bioseguridad.
    3. Colocar la placa sobre un agitador orbital a 150 rpm (942,48 rad/min).
    4. Después de 1 minuto, mezcle el contenido de cada pocillo y saque 20 μl para contar el número de agregados.
      1. Al mismo tiempo coger una imagen representativa bajo microscopio invertido compuesto de 10 aumentos (objetivo PLL 10/0.25).
      2. Contar manualmente los agregados (> 6 células) usando un hemocitómetro.
    5. Coloque la placa en una coctelera Boston.
    6. Repetir la adquisición de la imagen y contar después de 5 min y 15 min de la agregación.
  4. Realizar cuantificación de trans-vinculante.
    1. Calcular el número de agregados por mL entre células S2 y S2-Delta o serrado S2Tom como un control de fondo.
    2. Calcular el número de agregados por mL entre S2-muesca y las células Delta del S2 o S2-serradoTom (magnitud de trans-enlace).

3.Evaluación de la inhibición de la unión entre la muesca y Trans-ligandos por Cis-ligandos

  1. Preparar las células receptores de señal.
    1. Células de placa de 5 x 105 S2 en cada pocillo de una placa de 6 pozos en 1 mL/pozo de medio de Schneider suplieron con 10% FBS y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
    2. Añadir 7,5 μg de dsRNA a cada pozo e incubar a 25 ° C durante 24 h.
    3. Co transfectar las células tratadas con dsRNA pBluescript y PMT-muesca11 (DGRC) solo o con Muesca de pMT y pMT-Delta11 (DGRC) o Serrado pMT17 para un total Concentración de DNA de 2 μg/pocillo utilizando un reactivo de transfección comercial según protocolo del fabricante.
      Nota: pBluescript se utiliza como un control. Las células transfected Co se llamará S2-muesca & Deltatransitoria o S2-muesca & serrado las célulastransitorias de ahora en adelante.
    4. Incube las células transfected transitorio S2 a 25 ° C durante 24 h.
    5. Añada 0,7 mM CuSO4 inducen la expresión de Notch y los ligandos e incubar a 25 ° C durante 3 días.
  2. Preparar envío de señal de las células como se describe en 2.2.
  3. Realizar la agregación entre las células enviando señales y receptores de señal como se describe en la sección 2.3.
  4. Cuantificar la inhibición de la trans-vinculante por cis-ligandos.
    1. Calcular el número de agregados por mL entre células S2 y S2-Delta o serrado S2 como un control de fondo.
    2. Cuantificar la magnitud de la inhibición por cis-ligandos como sigue.
      1. A se define como número de agregados entre S2-muescatransitorio y las células Delta S2.
      2. Definir B como el número de agregados entre las células S2 Co transfectadas transitoriamente con muesca y Delta (S2-muesca & Deltatransitorio) y las células Delta de S2.
      3. Calcular la agregación relativa C = (B x 100) /A
      4. Calcular la magnitud de la inhibición por cis- ligando (Delta o serrado) como 100- C.
        Nota: como ejemplo, si la agregación relativa es 45%, cis-se consideran ligandos inhiben la trans-vinculante en un 55%.

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Representative Results

Nuestras observaciones en vivo sugirieron que pérdida de la xylosyltransferase gene shams en el aumento de la señalización de Notch debido a aumentado mediada por Delta trans-activación de Notch sin afectar a la cis-inhibición de la Muesca por ligandos8. Para probar esta idea, fueron realizados en vitro estudios de agregación de células. En primer lugar, expresión de shams en células S2 fue derribado con shams dsRNA. EGFP dsARN se utilizó como control. Eficiencia de la precipitación (KD) fue examinado por PCR en tiempo real y fue demostrado para ser superior a 80%8. Entonces, el atascamiento del receptor de la muesca con trans-Delta a shams KD fue examinado usando análisis de agregación. La agregación entre las células Notch S2 y S2-Delta fue examinada en varios puntos del tiempo después de mezclarlos. Agregación entre llano células S2 y S2-Delta se tomó como control de fondo. Figura 3 muestra la gráfica que indica el número de agregados formada en diferentes puntos (1, 5, 15 y 30 min) de tiempo después de la mezcla. Se observó un aumento sostenido en el número de agregados entre 1 y 5 minutos después, el número de agregados continuada aumentando hasta 30 min a un ritmo más lento. Por lo tanto, formación agregada era reflejada en 1, 5 y 15 min y se cuantificó el número de agregados después de 5 minutos de mezclado.

Figura 4A muestra imágenes representativas de la célula de ensayos de agregación entre células Notch S2 y S2-Delta estables para evaluar los efectos de shams KD en la unión entre el receptor Notch y trans-Delta. Las imágenes muestran la agregación en tres puntos (1, 5 y 15 min). Para el control del fondo, llano células S2 (tratadas con shams dsRNA) se mezclaron con células S2-Delta. EGFP dsRNA-S2-muesca las células tratadas forman agregados de células S2-Delta, que aumentan en número con el tiempo. En cambio, shams dsRNA-S2-muesca las células tratadas forman agregados más rápido, y los agregados fueran más grandes y mayor en número que el control de los (Figura 4B). Esto indica que disminuyendo los niveles de Shams mejora del trans-atando de la muesca con el Delta8.

Para examinar si Shams regula el efecto inhibitorio de cis-ligandos de unión entre la muesca y trans-Delta, primero establecida que coexpresión de Notch y Delta en la recepción de señal de celular puede disminuir la agregación celular mediada por Notch y trans-Delta. Figura 5A muestra el gráfico que indica el número de agregados formados entre Delta de S2 y S2-muesca & célulastransitorias Delta con diferentes cantidades de cis-Delta. Transferencia de cantidades iguales de Notch-Delta-expresión y construcciones en células S2 dramáticamente disminuye el número de agregados formados entre estas células y las células Delta de S2. Por otra parte, disminuyendo la cantidad de cis-Delta resulta en un aumento en el número de agregados, lo que indica que en la gama de muesca /cis-coeficientes Delta utilizados en estos ensayos, cis-Delta puede inhibir el atascamiento entre ranura y Trans-Delta de forma dosis-dependiente. Desde la muesca S2 & célulastransitorias de Delta expresan muesca y Delta, podría forman agregados homotípicos independientemente de las células S2-Delta. Para examinar si la formación de homotípicos agregados entre S2-muesca & Delta célulastransitorias pueden ser un factor de confusión en el cis-ensayos de inhibición se muestra en la figura 5A, mezcla estas células con células de S2 y cuantificado el agregados. La figura 5B muestra el número de agregados formados después de mezclar las células S2 con S2-muesca & Deltatransitorio las células con muesca varios /cis-ratios de Delta. Se observó un número más bien pequeño de homotípicos agregados en comparación con agregados heterotípicos como se muestra en la figura 5A . Concluimos que estos ensayos de agregación medir fielmente el efecto del cis-Delta en unión entre la muesca y trans-Delta.

A continuación examinamos el efecto de shams KD en la capacidad inhibitoria de cis-Delta. Para ello, la agregación entre Delta de S2 y S2-muesca & célulastransitorias de Delta fue examinado. La figura 6A muestra imágenes representativas de la agregación entre células Delta S2 y S2-muescatransitoria (control) o S2-muesca & célulastransitorias de Delta. S2-Delta y EGFP dsARN células tratadas con S2-muescatransitorio forman agregados, que aumentan en número con el tiempo, similar a la agregación entre S2-Delta y células S2-muesca estables (figura 4). En particular, mezcla Delta del S2 y S2-muesca & célulastransitorias Delta Co transfectadas con cantidades iguales de plásmidos de expresión de la muesca y la Delta forman menos agregados EGFP KD y shams KD, sugiriendo que disminuye el nivel de los impostores no afecta a la capacidad de cis-Delta para bloquear Notch /trans-enlace Delta. Para evaluar mejor los efectos de shams KD en la actividad de cis-Delta, la magnitud de la inhibición por cis-Delta se midió calculando el porcentaje relativo de agregación sobre una gama de muesca /cis-Delta proporciones como se explica en la sección 3.4.2. Cuantificación de la agregación relativa mostró una inhibición comparable de la agregación sobre el tratamiento de dsARN EGFP y shams (Figura 6B). En conjunto, estas observaciones sugieren fuertemente que promueve la pérdida de xylosylation trans-vinculante sin afectar a cis-inhibición8y proporcionan un mecanismo molecular para el fenotipo de pérdida ala vena observado en shams mutantes.

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática de los análisis de agregación de la célula para Trans-vinculante. Diagrama que muestra la inducción del receptor (S2-Notch) y ligando (Delta del S2 o S2-serrado) expresando las células del S2 de los 0.7m m CuSO4. Inducción de las células de S2 es seguida por mezcla, que tiende a hacer agregados. Estos agregados (> 6 células) son imágenes y cuantificado.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representación esquemática de los análisis de agregación de la célula para evaluar Cis-inhibición. Células S2 fueron transitorio transfected con Muesca de pMT (S2 Ntransitoria), Muesca de pMT y pMT-Delta (S2-muesca & Deltatransitorio), o Muesca de la pMT y Serrado de pMT (S2-muesca & Serratetransitoria). Después de la inducción por 0,7 mM de CuSO4 y mezcla con células S2-Delta, agregados (> 6 células) se cuantifican. Inhibición por cis-ligandos se mide en términos de porcentaje relativo de la agregación en presencia y ausencia de cada cis-ligando. Los efectos de la cis-ligandos de unión entre la muesca y trans-serrado puede determinarse mediante la mezcla de las células transfectadas transitoriamente con células S2-serradoTom (no mostradas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: agregación entre muesca S2 y S2 o S2-Delta células en diferentes puntos del tiempo. Gráfico muestra el número de agregados por mL en momentos diferentes (1, 5, 15 y 30 min) entre los indicados tipos de células. Barras de error indican el error estándar de la media (SEM) de tres repeticiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Celda agregación mediada por Notch y trans-Delta. (A) las imágenes muestra agregación en momentos diferentes (1, 5 y 15 min). Agregación entre shams dsRNA-llano S2 las células tratadas y células Delta S2 se tomó como control de fondo. Shams- dsRNA tratada S2-muesca células muestran un aumento en el número y tamaño de los agregados en comparación con EGFP dsARN tratados (control) células S2-muesca después de mezclar con células S2-Delta. Barra de escala = 100 μm. (B) cuantificación de número de celular agrega mayor que 6 celdas después de 5 min de la agregación. Barras de error indican SEM. * P < 0.01 (análisis de varianza (ANOVA unidireccional)). Se realizaron tres repeticiones con tres repeticiones independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Cis-Delta inhibe la agregación formación mediada por células por Notch y trans-Delta de forma dosis-dependiente. (A) el gráfico muestra la agregación (en términos de número de agregados/mL) entre las células Delta S2 y S2 en células transfectadas transitoriamente con diversos cocientes de los vectores de expresión para la muesca y cis-Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 y 1:0. 1). Barras de error indican SEM. * P < 0.01 (One-Way ANOVA). Se realizaron tres repeticiones con tres repeticiones independientes. Tenga en cuenta que disminuye el nivel de cis-Delta resulta en un aumento en la agregación, probablemente debido a la reducida cis-inhibición. (B) gráfico muestra agregación homotípicos (en términos de número de agregados por mL) en células S2 transitorio transfected con diversos cocientes de la muesca y Delta (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 y 1:0. 1) y mezclado con células S2 llano. Barras de error indican número SEM. de agregados es mucho menor que el número de agregados heterotípicos formada entre Delta de S2 y S2-muesca & célulastransitorias de Delta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Caída de shams no afecta a la actividad inhibitoria de cis-Delta. (A) se muestra son imágenes representativas del efecto de shams KD en cis-Delta-mediada por la inhibición de la agregación de células mediada por Notch /trans-enlace Delta. Las imágenes muestran agregación en momentos diferentes (1, 5 y 15 min). Agregación entre shams dsRNA-llano S2 las células tratadas y células Delta S2 se tomó como control de fondo. Similar a estable transfected las células S2-muesca, shams KD aumentaron el número de agregados entre S2-Delta y célulastransitorio S2-muesca en comparación con el control (EGFP tratados de dsRNA). Coexpresión de cis-Delta con la muesca en una proporción 1:1 dio lugar a una disminución comparable en el número de agregados en control (EGFP tratados de dsRNA) así como en las células de dsARN tratado shams . Barra de escala = 100 μm. (B) gráfico muestra relativa agregación entre células Delta S2 y S2 transitoriamente Co transfectadas con proporciones indicadas (1:0, 1:1, 1:0. 5, 1:0.2 y 1:0. 1) de muesca y cis-Delta. EGFP y shams dsARN tratamiento mostró una disminución comparable de agregación en cada muesca /cis-cociente del Delta. Los datos presentados aquí son representativos de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Canónica de la señalización de Notch depende de las interacciones entre el receptor Notch y sus ligandos5. Aunque la mayoría de los estudios sobre la vía de Notch considera principalmente la Unión de ranura y ligandos de células vecinas (trans), muesca y misma célula ligandos interactúan y estos llamados cis-interacciones pueden desempeñar un papel inhibitorio en la muesca señalización de3,4. Por consiguiente, para descifrar los mecanismos subyacentes a los efectos de un modificador sobre la señalización de notch canónica, a menudo es pertinente examinar ambos tipos de interacciones ligando-muesca (trans y cis). Sin embargo, en muchos contextos durante el desarrollo animal, implicación de ambas de estas interacciones y su regulación de feed-back complica en vivo estudios1,6. En el presente Protocolo, proporcionamos una metodología detallada para en vitro ensayos de agregación celular, usando células S2 de Drosophila para evaluar el atascamiento del receptor de la muesca con trans- ligandos y su inhibición por cis- ligandos. Hemos presentado la utilización de esta metodología para evaluar el efecto de un modificador genético de muesca señalización (xylosyltransferase Shams7,8) en el receptor-ligando.

En primer lugar, se realizaron ensayos de agregación entre S2-Delta estable y EGFP o impostores de dsARN estable S2-muesca células tratadas para examinar el efecto de shams KD en trans-vinculante. Agregación de células S2-Delta con shams dsRNA-llano S2 las células tratadas se tomó como control de fondo. Shams KD mejora la agregación entre muesca S2 y S2-Delta células en comparación con el control. Es importante realizar agregaciones de control experimental de fondo entre lisas células de S2 y S2 ligand-llevar en paralelo a la trans-vinculante experimentos. Aunque no lo expresen las células S2 de Drosophila endógenos receptor de la muesca y Delta ligando11, expresión de bajos niveles de serrado se divulga en S2 células13. Teniendo en cuenta esto, células S2 llano fueron utilizadas en los ensayos de agregación celular como control de fondo; Estas células no presentaron ninguna agregación (figura 5B). Agregados se cuentan manualmente usando un hemocitómetro. Para asegurar la consistencia en la cuantificación agregada, 10-20 μl de la población de células mixta se puede pipetearse hacia fuera de por lo menos tres diferentes áreas por pozo para contar. Estos ensayos requieren células sanas de S2 creciente. Teniendo en cuenta la naturaleza semi-adherente de S2 células suaves pipetear durante la percepción de las células y constante agitación durante el ensayo de agregación es importante.

Previamente, nosotros y otros hemos usado ensayos de Unión ligando-receptor soluble, bien establecidos para una evaluación cuantitativa de receptor-ligando en trans17,18,19, 20. ensayos de agregación son semi-cuantitativos, ensayos de unión de ligando soluble se realizaron para analizar el efecto de shams KD en el ligando de Notch- trans-vinculante. Los resultados observados fueron similares en tendencia con los obtenidos de los análisis de agregación8. Esto atestigua la evaluación fiel de enlace de la muesca con trans-ligandos usando análisis de agregación de la célula. Aunque la formación agregada es una lectura de receptor-ligando, puede ser complicado si la expresión superficial del receptor Notch o sus ligandos es afectada por los modificadores dados. Esto pone de relieve la limitación de los ensayos de agregación celular, como no se pueden distinguir si el cambio en la formación de agregados es debido a la alteración del receptor-ligando o alterada la expresión superficial. Por lo tanto, paralelamente a los ensayos de agregación, los efectos de cada modificación en la expresión superficial de la muesca y ligandos necesita ser probado en células S2. En el contexto de nuestros estudios, los niveles superficiales de Notch y Delta no fueron afectados en shams tratados de dsARN S2 células8.

Para examinar la inhibición de la trans-enlace por la adición de cis-ligandos, agregación de pruebas se realizaron entre células S2-Delta y EGFP o shams tratados de dsARN S2-muesca & célulastransitorias Delta . El número de agregados formados entre estas células se comparó con el número de agregados formados entre células Delta S2 y S2-muescatransitoria . La disminución relativa del número de agregados fue calculada y utilizada como un indicador de la magnitud de la inhibición por cis-Delta. Los experimentos de control demostraron que cis-ligandos muestran una inhibición robusta y dependiente de la dosis de la muesca /trans-enlace Delta sobre una gama bastante amplia de muesca a cis-ratios de ligando (1:1 a 1:0. 1) (figura 5A)8 . Resultó una relación 1:1 en el grado más fuerte de cis-inhibición y disminuyendo el nivel relativo de cis-Delta debilitado cis-inhibición. Por consiguiente, se realizó los experimentos de KD en este rango de ratios. De la nota, la cantidad de receptor Notch y la cantidad total de DNA transfected se mantuvieron constantes en todos los experimentos. Esto asegurará que agregada la formación es principalmente afectada por la actividad de cis-ligandos y no por niveles de expresión de la muesca por las células.

Previamente fue demostrado eso coexpresión de Notch y cis-ligandos en células S2 pueden resultar en la formación de agregaciones de homotípicos14. Examinar si similar homotípicos agregaciones entre S2-muesca & Deltatransitoria o S2-muesca & Serratetransitoria de las células pueden comprometer nuestras interpretaciones de las cuantificaciones agregadas en cis-estudios de ligando, se realizó un ensayo de agregación de control entre S2-muesca & Deltatransitorio y llano S2 las células. El número de células S2 utilizadas en estos experimentos fue la misma como células S2-Delta usadas en cis-experimentos de Delta. Se observó cierta agregación homotípicos, pero cuantificación demostró que los agregados resultantes contribuyen a una baja fracción de los agregados totales en comparación con los agregados heterotípicos entre S2-muesca & Deltatransitorio y S2-Delta células () Figura 5B).Se concluye que los cambios observaron en el número de agregados en cis-ensayos de ligando son principalmente debido al efecto inhibitorio de cis-ligandos de unión entre la muesca y trans-Delta.

En Resumen, los ensayos de agregación presentados en este protocolo proporcionan una metodología fácil y sencilla para la evaluación semicuantitativa de la trans- y cis-interacciones del receptor de la muesca y sus ligandos. Estos ensayos pueden utilizarse para examinar los efectos de genéticos o farmacológicos modificadores de vía Notch muesca-ligando vinculante en vitro y por lo tanto pueden ayudar a dilucidar los mecanismos subyacentes a los efectos en vivo de estos modificadores en muesca señalización.

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Disclosures

Los autores no tienen conflicto de interés.

Acknowledgments

Los autores reconocen apoyo de NIH/NIGMS (R01GM084135 a HJN) y Fundación Mizutani Glycoscience (grant #110071 a HJN) y están agradecido a Tom V. Lee por discusiones y sugerencias sobre los ensayos y Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine y el Drosophila genómica recursos centro (DGRC) para líneas celulares y plásmidos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified Lonza 04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare lifescience  SV30010
CELLSTAR 6 well plate Greiner Bio-One 657 160
CELLSTAR 24 well plate Greiner Bio-One 662160
VWR mini shaker Marshell Sceintific 12520-956
Hemocytometer Fisher Sceintific  267110
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit Ambion AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) Zymo Research R1054
VistaVision Inverted microscope VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software AmScope MU-900 Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
Fetal Bovine Serum GenDepot F0600-050
Methotrexate Sigma-Aldrich A6770-10
Hygromycin B Invitrogen HY068-L6
Copper sulphate Macron Fine Chemicals 4448-02
S2 cells Invitrogen R69007
S2-SerrateTom cells Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells DGRC 152
S2-Notch cells DGRC 154
pMT-Delta vector DGRC 1021 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector DGRC 1022 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit Applied Biosystem 1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) Applied Biosystem Dm02144576_g1  with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) Applied Biosystem Dm02151827_g1 with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 4351405 96-well Block module

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References

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  20. Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).

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Células de la biología del desarrollo número 131 Drosophila S2 agregación celular enlace de trans cis-inhibición muesca
Célula de ensayos de agregación para evaluar el atascamiento de la muesca de <em>Drosophila</em> con <em>Trans</em>-ligandos y su inhibición por <em>Cis</em>-ligandos
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Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell… More

Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).

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