Summary
मौजूदा प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को प्रोत्साहित करने के लिए मैक्रोफेज को उत्तेजित करने के लिए आणविक कारकों है कि neurite वृद्धि को बढ़ावा देने के रिलीज की क्षमता के साथ संपंन हो । शिविर के ंयूरॉन-मैक्रोफेज सह संस्कृतियों के उपचार के लिए वातानुकूलित माध्यम है कि मजबूत neurite वृद्धि गतिविधि के पास उत्पादन मैक्रोफेज लाती है ।
Abstract
वहां मजबूत सबूत है कि मैक्रोफेज पुनर्जनन या घायल तंत्रिका तंत्र की मरंमत में भाग ले सकते है । यहां, हम एक प्रोटोकॉल जिसमें मैक्रोफेज वातानुकूलित मध्यम (सेमी) है कि neurite वृद्धि को बढ़ावा देने के उत्पादन के लिए प्रेरित कर रहे है का वर्णन । वयस्क पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि (डीआरजी) न्यूरॉन्स तीव्रता से असंबद्ध और चढ़ाया जाता है. के बाद ंयूरॉंस छुरा संलग्न हैं, पेरिटोनियल मैक्रोफेज सह रहे है एक सेल संस्कृति पर एक ही अच्छी तरह से मढ़ा डालने पर संस्कृति । Dibutyryl चक्रीय AMP (डीबी-शिविर) 24 ज के लिए सह संस्कृतियों के लिए लागू किया जाता है, जिसके बाद कोशिका संस्कृति मैक्रोफेज युक्त सम्मिलित करने के लिए एक और अच्छी तरह से ले जाया जाता है 72 एच के लिए मुख्यमंत्री इकट्ठा. सह से CM-संस्कृतियों डीबी के साथ इलाज शिविर, जब एक अलग वयस्क डीआरजी ंयूरॉन संस्कृति के लिए आवेदन किया, मजबूत neurite वृद्धि गतिविधि दर्शाती है । डीबी-शिविर से प्राप्त मुख्यमंत्री अकेले एकल कोशिका प्रकार से मिलकर संस्कृतियों का इलाज किया, या तो डीआरजी ंयूरॉन या पेरिटोनियल मैक्रोफेज, प्रदर्शन neurite वृद्धि गतिविधि नहीं था । यह इंगित करता है कि न्यूरॉन्स और मैक्रोफेज के बीच बातचीत सेमी में neurite वृद्धि गतिविधि के साथ आणविक कारकों स्रावित मैक्रोफेज के सक्रियकरण के लिए अपरिहार्य है. इस प्रकार, हमारे सह संस्कृति प्रतिमान भी एक प्रो-अपक्षयी phenotype के साथ संपंन होने के लिए मैक्रोफेज को उत्तेजित करने के लिए न्यूरॉन-मैक्रोफेज बातचीत में सेलुलर संकेतन अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो जाएगा.
Introduction
अध्ययनों की एक किस्म के लिए रीढ़ की हड्डी या मस्तिष्क की चोटों के बाद सीएनएस axon पुनर्जनन बढ़ाने की मांग की है । भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, अनिवार्य रूप से तंत्रिका तंत्र में चोटों के साथ, पारंपरिक रूप से माध्यमिक रोग प्रक्रियाओं बचके परिणाम1,2के लिए अग्रणी में भाग लेने के लिए सोचा है । दरअसल, methylprednisolone कि भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को दबा सकते हैं तीव्र रीढ़ की हड्डी की चोट के लिए केवल अनुमोदित चिकित्सा है3। हालांकि, अधिक हाल के अध्ययनों से सबूत प्रदान किया है कि मैक्रोफेज, एक प्रतिनिधि भड़काऊ सेल प्रकार, पुनर्जनन या घायल तंत्रिका प्रणाली की मरंमत में भाग ले सकते है4,5,6। उदाहरण के लिए, एक लेंस की चोट के बाद मैक्रोफेज घुसपैठ प्रो-अपक्षयी अणुओं रेटिना नाड़ीग्रंथि न्यूरॉन्स7के उत्थान को बढ़ावा देने के लिए उत्पादन,8. इसके अलावा, प्रत्यारोपित डीआरजी ंयूरॉंस क्षेत्र जहां मैक्रोफेज zymosan9द्वारा सक्रिय किया गया ऊपर axon वृद्धि हुई । इसके अलावा, घाव साइट पर मैक्रोफेज एक विकास बना सकते हैं-घायल परिधीय नसों के लिए स्वतंत्र वातावरण10.
हमारे काम भी मजबूत सबूत है कि मैक्रोफेज से सटे न्यूरॉन्स में axon पुनर्जनन की क्षमता के लिए योगदान कर सकते हैं प्रदान की है । हमें पता चला है कि पृष्ठीय रूट गैंग्लिया (डीआरजी) में मैक्रोफेज के सक्रियकरण डीआरजी संवेदी न्यूरॉन्स की बढ़ी अपक्षयी क्षमता में एक जीर्णोद्वार परिधीय तंत्रिका चोट11के बाद आवश्यक थे । इसी तरह के अनुसंधान स्वतंत्र रूप से एक और प्रयोगशाला12से सूचना दी थी । हम यह भी पता चला है कि intraganglionic इंजेक्शन dibutyryl चक्रीय AMP (db-cAMP), जो एक प्रसिद्ध अणु है axon पुनर्जनन13की क्षमता बढ़ाने के लिए, मैक्रोफेज के सक्रियण प्रेरित. मैक्रोफेज की निष्क्रियता db के प्रभाव को समाप्त-neurite वृद्धि गतिविधि पर शिविर । बाद में एक समर्थक के साथ मैक्रोफेज को उत्तेजित करने के लिए एक संकेत के रूप में न्यूरॉन्स में चोट प्रेरित अभिव्यक्ति CCL2 की पहचान की गई काम करता है-पुनर्जन्म phenotype14,15.
इसके बाद के संस्करण प्रयोगात्मक परिणाम के आधार पर, हम एक इन विट्रो मॉडल आणविक घटनाओं है कि एक शर्त चोट मॉडल11,14के बाद DRGs में घटित जैसी स्थापित किया है । इस मॉडल में, डीबी-शिविर न्यूरॉन-मैक्रोफेज सह-एक प्रो-अपक्षयी phenotype के साथ मैक्रोफेज के सक्रियण की ओर जाता है कि सेलुलर संकेत देने संस्कृतियों के लिए लागू किया जाता है. यहां, हम विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है जिसके द्वारा हम मैक्रोफेज उत्पंन कर सकते है कि आणविक neurite वृद्धि को बढ़ावा देने के कारकों का स्राव (चित्रा 1) । इस प्रयोगात्मक मॉडल एक अवधारणा है कि मैक्रोफेज उत्तेजित या तंत्रिका तंत्र के लिए चोटों के बाद axon पुनर्जनन समर्थन प्रेरित किया जा सकता है दिखाता है । हमारे मॉडल भी सेलुलर संकेत है कि प्रो-अपक्षयी मैक्रोफेज के सक्रियण की ओर जाता में तंत्र का अध्ययन करने में उपयोगी हो जाएगा ।
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Protocol
सभी प्रयोगों पशु शामिल संस्थागत पशु देखभाल और चिकित्सा के Ajou विश्वविद्यालय स्कूल की उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. असंबद्ध एडल्ट डीआरजी न्यूरॉन की कल्चरल तैयारी
- संस्कृति को स्थापित करने से पहले, प्री-कोट एक 6-अच्छी थाली के साथ पाली-डी-lysine और laminin । 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.01% पाली-डी-lysine के साथ एक 6-अच्छी तरह से थाली की मशीन और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस । फिर, प्लेट को दो बार आसुत पानी से धो लें ।
- कमरे के तापमान पर 2 ज के लिए 3 µ जी/एमएल की एकाग्रता पर laminin समाधान के साथ थाली मशीन, और फिर आसुत पानी के साथ दो बार थाली धो लो । कमरे के तापमान पर प्लेट को 1 घंटे के लिए सुखा लें ।
- एक पारदर्शी सह2 चैंबर में एक माउस Euthanize एक संकुचित सह2 गैस सिलेंडर से जुड़ा । Incise त्वचा कशेरुका कॉलम एक शल्य ब्लेड के साथ और काटना paravertebral मांसपेशियों को द्विपक्षीय कशेरुका हड्डियों को बेनकाब करने के लिए । कशेरुका हड्डियों को सावधानीपूर्वक निकालें एक संकीर्ण-इत्तला दे दी शल्य rongeur का उपयोग जब तक DRGs पूरी तरह से उजागर कर रहे हैं ।
नोट: वयस्क DRGs न्यूरॉन्स वयस्क C57BL6 नर चूहों से प्राप्त कर रहे हैं के बीच आयु वर्ग 8 सप्ताह के लिए 12 सप्ताह पुराना. - DRGs द्विपक्षीय रूप से एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत iridectomy कैंची और ठीक-इत्तला दे दी संदंश का उपयोग कर C1 स्तर तक सभी तरह से ऊपर निकालें । Schwann कोशिकाओं या fibroblasts के संदूषण को कम करने के क्रम में DRGs से पूरी तरह से जड़ों में कटौती करने की कोशिश करो ।
- एक 60 मिमी पेट्री डिश जिसमें ठंडी Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 5 मिलीलीटर बर्फ पर जब तक सभी DRGs एकत्र कर रहे है में विच्छेदित DRGs की दुकान ।
नोट: यह DRGs के रूप में जल्दी संभव के रूप में काटना के लिए महत्वपूर्ण है । एक माउस से सभी DRGs का संग्रह 30 मिनट से अधिक समय नहीं लेना चाहिए 30 ंयूनतम इच्छामृत्यु के बाद, DRGs इकट्ठा करना बंद करो और अगले कदम के लिए आगे बढ़ना भी अगर वहां अभी भी DRGs शेष हैं । - एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब एक ब्लू पिपेट टिप (1000 µ एल) का उपयोग करने के लिए एक कट-ऑफ अंत के साथ DRGs हस्तांतरण । कई सेकंड के लिए एक त्वरित स्पिन के बाद DMEM निकालें एक मिनी केंद्रापसारक का उपयोग कर । DMEM की 1 मिलीलीटर शामिल 125 यू/एमएल प्रकार ग्यारहवीं collagenase और 90 मिनट के लिए एक सौंय रोटेशन के साथ ट्यूब मशीन (35-40 rpm) एक 37 डिग्री सेल्सियस मशीन में एक ट्विस्टर शेखर का उपयोग कर । शेखर फर्श पर ट्यूब स्थिर टेप का उपयोग कर ।
- collagenase-युक्त DMEM को छोड़ें और 1 मिलीलीटर ताज़ा DMEM जोड़ें । जब तक रुको DRGs पूरी तरह से नीचे करने के लिए नीचे सिंक, और फिर ऊतक मलबे के साथ DMEM निकालें । इस वाशिंग स्टेप को कम से छह बार दोहराएं ।
नोट: supernatant को पूरी तरह से छोड़ने का प्रयास न करें । supernatant DMEM के साथ किसी भी DRGs को नहीं हटाने के लिए सावधान रहें । - एक कट-ऑफ अंत के साथ एक नीले पिपेट टिप (1000 µ एल) का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए DRGs हस्तांतरण । फिर पिपेट ऊपर और नीचे धीरे से कम 15 बार एक नीले टिप (1000 µ एल) का उपयोग कर एक सजातीय सेल निलंबन करना । बुलबुले बनाने से बचें और एक पिपेट टिप के साथ शंकु ट्यूब के नीचे को छूने के लिए नहीं की कोशिश करो ।
- 3 मिनट के लिए 239 x g पर ट्यूब केंद्रापसारक और ध्यान से फ्लोटिंग मलबे के साथ supernatant त्यागें । Neurobasal मध्यम B27 (2.0% v/वी के साथ पूरक के 1 मिलीलीटर जोड़ें) और धीरे से ऊपर और नीचे 5 से 10 बार pipetting द्वारा सेल गोली reसस्पेंड ।
- एक 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के शीर्ष पर मढ़ा एक 70-µm सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन पास । 2 मिनट के लिए रुको, और फिर Neurobasal/बी-27 मध्यम एक पिपेट नियंत्रक का उपयोग छलनी पर डालना ।
- प्लेट सभी एकत्र डीआरजी न्यूरॉन्स (अनुमानित 2 x 106 डीआरजी ंयूरॉंस की कुल एक माउस से) 6 के दो कुओं पर अच्छी तरह से थाली । एक वयस्क माउस से डीआरजी न्यूरॉन्स एक 6-अच्छी तरह से थाली में दो कुओं को कवर. फिर मैक्रोफेज सह संस्कृतियों तक 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सह2 मशीन में थाली जगह है ।
2. P rimary पेरिटोनियल मैक्रोफेज की सह संस्कृति एक सेल कल्चर Insert पर
नोट: असंबद्ध डीआरजी न्यूरॉन्स के प्रारंभिक चढ़ाना के बाद सह-संस्कृतियों 4 एच की स्थापना
- प्राथमिक पेरिटोनियल मैक्रोफेज वयस्क C57BL6 पुरुष 8 सप्ताह से 12 सप्ताह के बीच आयु वर्ग के चूहों से तैयार कर रहे हैं । एक सह2 चैंबर में एक जानवर Euthanize । पेट की त्वचा नाजुक Incise, और, और लेवेज तरल पदार्थ के रिसाव को रोकने के लिए एक आँख को काटने से बचने के लिए ।
- एक 22G सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर, और पेरिटोनियल गुहा में बर्फ कोल्ड फॉस्फेट बफर सॉल्व (पंजाब) के 10 मिलीलीटर इंजेक्षन करने के लिए एक आँख पंचर । धीरे से 1-2 मिनट के लिए आँख की मालिश । फिर, सुई बाहर खींच और सुई पंचर साइट के माध्यम से पंजाबियों निचोड़ और एक 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में लेवेज द्रव इकट्ठा ।
नोट: उपयोग करने से पहले, बर्फ पर सिरिंज डाल करने के लिए पंजाबियों की ठंड को बनाए रखने. - 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 239 x g पर लेवेज द्रव केंद्रापसारक सेलुलर घटकों गोली । कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर के 3 मिलीलीटर के साथ गोली reसस्पेंड । फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 239 x g पर सेल सस्पेंशन फिर से केंद्रापसारक । पंजाब के 3 मिलीलीटर के साथ गोली reसस्पेंड और सेल निलंबन केंद्रापसारक फिर से किसी भी शेष आरबीसी lysis बफर हटाने के लिए ।
नोट: सुनिश्चित करें कि आरबीसी lysis बफर पूरी तरह से हटा दिया है । अन्यथा शेष आरबीसी lysis बफर कल्चरल मैक्रोफेज को विषाक्त किया जा सकता है । - Neurobasal/B-27 मध्यम के 1 मिलीलीटर में छर्रों कोशिकाओं को पुनः निलंबित । सभी एकत्र मैक्रोफेज की प्लेट आधा (3 × 106 के लिए 6 x 106 कोशिकाओं की कुल) के प्रभावी क्षेत्र के साथ एक सेल संस्कृति डालने पर 4.2 cm2, जो असंबद्ध डीआरजी के चहेतों के शीर्ष पर रखा गया है ।
नोट: सह संस्कृति अवधि के दौरान, मैक्रोफेज Neurobasal/बी-27 ंयूरॉन संस्कृति माध्यम में उगाया जाता है । इस हालत में मैक्रोफेज के पर्याप्त अस्तित्व की पुष्टि की गई ।
3. डीबी का उपचार-शिविर और मैक्रोफेज सेमी का संग्रह
नोट: शुरू db-cAMP उपचार 4 एच के बाद ंयूरॉन-मैक्रोफेज सह संस्कृतियों ।
- ंयूरॉन-मैक्रोफेज सह संस्कृतियों के लिए 100 µ मीटर डीबी-शिविर समाधान के 2 µ एल जोड़ें । एक नियंत्रण प्रयोग के लिए पंजाब के समान मात्रा में जोड़ें ।
- 24 घंटे के बाद, एक खाली अच्छी तरह से एक ही 6-अच्छी थाली में मैक्रोफेज संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ भरें । कोशिका संस्कृति डालने के ंयूरॉन में स्थानांतरण-मैक्रोफेज सह संस्कृतियों के लिए खाली अच्छी तरह से मैक्रोफेज संस्कृति माध्यम के साथ । मध्यम को बदले बिना 72 एच के लिए एक ही शर्त के तहत कोशिकाओं रखें ।
नोट: हम मुख्यमंत्री संग्रह के दौरान मैक्रोफेज संस्कृति माध्यम के केवल 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए केंद्रित सेमी बनाने के लिए । मुख्यमंत्री संग्रह के दौरान, अगर जरूरत है, हम और अधिक जोड़ने के लिए पूरी तरह से डालने के भीतर मैक्रोफेज कवर । - 72 घंटे के बाद, 5 मिनट के लिए 239 x g पर मैक्रोफेज सेमी के लिए सेलुलर घटकों को दूर करने के लिए । किसी भी शेष सेलुलर मलबे को हटाने के लिए एक 0.2-µm फिल्टर के माध्यम से supernatant पास । संग्रहीत सेमी पर-70 ° c का उपयोग जब तक स्टोर ।
4. एकत्र मुख्यमंत्री के साथ Neurite वृद्धि परख
- एक अलग वयस्क डीआरजी ंयूरॉन संस्कृति, पूर्व कोट स्थापित करने से पहले एक 8 अच्छी तरह से एक ही प्रक्रिया के बाद चैंबर स्लाइड 1.1 और 1.2 में वर्णित है ।
- Neurobasal मध्यम में असंबद्ध वयस्क डीआरजी न्यूरॉन्स प्राप्त एक ही तरीके का उपयोग कर B27 के साथ पूरक 1.3 करने के लिए 1.10 से वर्णित. प्लेट 5 एक्स 104 प्रति अच्छी तरह से पूर्व लेपित 8-अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड पर कोशिकाओं ।
- 2 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस मशीन में चैंबर स्लाइड प्लेस, कोशिकाओं को नीचे करने के लिए संलग्न करने की अनुमति । इसके बाद, कल्चरल मीडियम को 37 डिग्री सेल्सियस पर गरमाने वाले सेमी से बदलें ।
नोट: संस्कृति माध्यम को हटाने और एकत्र मुख्यमंत्री जोड़ने जब 8 अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड के नीचे छूने के लिए नहीं सावधान रहना. - 15 एच प्रारंभिक चढ़ाना के बाद, मध्यम निकालें और एक बार पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें । फिर, कुओं के लिए बर्फ ठंडा 4% paraformaldehyde समाधान के 200 µ एल जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए paraformaldehyde समाधान के साथ कोशिकाओं को मशीन
नोट: neurite वृद्धि परख के लिए डीआरजी ंयूरॉन संस्कृति ठीक 15 एच के लिए प्रतिबंधित किया जाना चाहिए । इस शर्त के तहत, कोई प्रशंसनीय neurite वृद्धि नहीं है । - बर्फ ठंडा पंजाबियों के साथ तीन बार धो और फिर 30 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन-एक्स के साथ 10% सामांय बकरी सीरम (NGS) के साथ अवरुद्ध प्रदर्शन । प्राथमिक एंटीबॉडी (विरोधी-तुज-1) समाधान के साथ तय कोशिकाओं की मशीन 10% NGS के साथ पतला (1 µ जी की एकाग्रता पर) 4 घंटे के लिए कमरे में तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ।
- पंजाबियों के साथ तीन बार धो, और फिर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं की मशीन (बकरी-विरोधी माउस) कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए समाधान । फिर, दो बार पंजाबियों के साथ धोने और एक coverslip (24 × 50 मिमी) बढ़ते समाधान का उपयोग कर के साथ संस्कृति स्लाइड माउंट ।
- एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों neurite वृद्धि कल्पना ले लो ।
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Representative Results
हम एक प्रोटोकॉल है कि neurite वृद्धि गतिविधि के साथ आणविक कारकों स्रावित करने में सक्षम मैक्रोफेज उत्पंन कर सकते है का वर्णन । मैक्रोफेज सह से प्राप्त सेमी--डीबी के साथ इलाज किया-शिविर मजबूत neurite वृद्धि हुई जब एक अलग डीआरजी ंयूरॉन संस्कृति (चित्रा 2a) के लिए आवेदन किया । इसकी तुलना में, मुख्यमंत्री ने पंजाबियों से प्राप्त सह-संस्कृतियों का हमारे 15-एच संस्कृति अवधि (चित्र b) में neurite वृद्धि को प्रेरित नहीं किया । जब डीबी-शिविर अकेले मैक्रोफेज के साथ संस्कृति के लिए इलाज किया जाता है, मुख्यमंत्री इस हालत से प्राप्त neurite की वृद्धि (चित्रा 2c) के समर्थन में प्रभावी नहीं था. यह पता चलता है कि न्यूरॉन-मैक्रोफेज इंटरेक्शन अपरिहार्य है मैक्रोफेज को उत्तेजित करने के लिए एक proregenerative क्षमता के साथ संपंन हो । हम भी अगर मुख्यमंत्री डीबी से प्राप्त परीक्षण-शिविर का इलाज किया ंयूरॉन केवल संस्कृति और कोई neurite वृद्धि (चित्रा 2d) पाया ।
चित्र 1: एक योजनाबद्ध आरेख neurite वृद्धि गतिविधि युक्त वातानुकूलित माध्यम प्राप्त करने के लिए प्रक्रियाओं illustrating. वयस्क डीआरजी न्यूरॉन्स (2 एक्स 106 प्रत्येक अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं) 4 एच के लिए संस्कृति हैं. फिर, पेरिटोनियल मैक्रोफेज डालने में अच्छी तरह से संस्कृति रहे हैं, अच्छी तरह से जो डीआरजी ंयूरॉंस में संस्कृति के ऊपर स्थित है । 4 ज चढ़ाना के बाद या तो पंजाब या dibutyryl शिविर का इलाज किया जाता है । 24 घंटे की मशीन के बाद, संमिलित अच्छी तरह से एक अंय के बारे में 1ml माध्यम से भरा स्थानांतरित है । फिर, तबादला अच्छी तरह से 72 एच के लिए मशीन है । फिर, मशीनी वातानुकूलित मध्यम (सेमी) एकत्र किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: neurite वृद्धि परख के प्रतिनिधि परिणाम वातानुकूलित माध्यम का उपयोग विभिंन स्थितियों से प्राप्त की । (A, B) वयस्क डीआरजी न्यूरॉन्स तीव्रता से असंबद्ध थे और वास्तव में 15 ज .2 ज चढ़ाना के बाद के लिए, संस्कृति माध्यम के साथ प्रतिस्थापित किया गया था वातानुकूलित मध्यम (सेमी) ंयूरॉन से प्राप्त-मैक्रोफेज सह संस्कृतियों या तो पंजाब (एक) या dibutyryl शिविर (डीबी-शिविर) (बी) के साथ इलाज. केवल सेमी डीबी के साथ इलाज-शिविर मजबूत neurite वृद्धि गतिविधि का प्रदर्शन किया । (सी, डी) सेमी या तो मैक्रोफेज से मिलकर संस्कृतियों से प्राप्त (सी) या ंयूरॉन (घ) अकेले है कि डीबी के साथ इलाज किया गया था शिविर neurite वृद्धि का समर्थन नहीं किया । स्केल बार्स 200 µm इंगित करती हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
इस सह संस्कृति प्रणाली की पीढ़ी के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि माउस डीआरजी न्यूरॉन्स और पेरिटोनियल मैक्रोफेज तैयार कर रहे हैं ताजा और स्वस्थ. हम जब सभी DRGs के विच्छेदन 30 मिनट से अधिक लिया मुख्यमंत्री के neurite वृद्धि गतिविधि कम अनुभव किया है । इसके अलावा, पेरिटोनियल मैक्रोफेज में रक्त घटकों के संदूषण भी मुख्यमंत्री में neurite वृद्धि गतिविधि की कमी के लिए नेतृत्व किया । आदेश में मजबूत ंयूरॉन के लिए डीबी-मैक्रोफेज संपर्क शिविर, पूरी तरह से धुलाई भी एक महत्वपूर्ण कदम के लिए ऊतक मलबे और संभावित शेष साइटोटोक्सिक घटकों, जैसे collagenase या आरबीसी lysis बफर के उंमूलन को पूरा हटाने सुनिश्चित किया जाएगा । एक और बात दोहराई जा रही है कि DRGs से जुड़ी जड़ों को जितना हो सके हटाया जाना चाहिए. जड़ों की शेष डिटेल डीआरजी ंयूरॉन संस्कृति में Schwann कोशिकाओं के संदूषण में वृद्धि होगी । Schwann कोशिकाओं के परिणाम को भ्रमित हो सकता है कि संस्कृति में neurotrophic कारकों की उच्च राशि का उत्पादन कर सकते हैं ।
इस प्रोटोकॉल में, असंबद्ध मैक्रोफेज एक कोशिका संस्कृति डीआरजी अच्छी तरह से थाली के तल पर चढ़ाया ंयूरॉंस से अलग डालने पर चढ़ाया गया । हमारे पिछले अध्ययन के प्रत्यक्ष सह संस्कृतियों से एकत्र सीएमएस के बीच neurite वृद्धि गतिविधि की हद में महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा था (दो कोशिका प्रकार के बीच शारीरिक संपर्क की अनुमति) और सह दो सेल प्रकार के साथ संस्कृतियों एक से अलग कक्ष संस् कृति11संमिलित करें । यह परिणाम संकेत दिया कि ंयूरॉंस और मैक्रोफेज एक दूसरे के साथ घुलनशील या तो सेल प्रकार से जारी अणुओं के माध्यम से संवाद कर रहे हैं, प्रत्यक्ष शारीरिक संपर्कों से नहीं । यह दिखाया गया है कि CCL2, डीआरजी ंयूरॉंस से स्रावित, एक समर्थक में मैक्रोफेज सक्रिय करने के लिए जिंमेदार है-इस सह संस्कृति मॉडल14में अपक्षयी phenotype । इस प्रकार, हमारी सह-संस्कृति प्रणाली अधिक विस्तृत सेलुलर संकेत के elucidation की अनुमति देगा कि मध्यस्थता प्रो-reअपक्षयी मैक्रोफेज के सक्रियकरण ।
संस्कृति ठीक 15 इस प्रोटोकॉल में neurite वृद्धि परख के दौरान एच तक ही सीमित था । पायलट प्रयोगों में, हम कई अलग संस्कृति समय की जांच की और पाया कि नियंत्रण हालत (15 एच) में neurite वृद्धि की एक ंयूनतम सीमा के साथ, अत्यधिक मजबूत neurite वृद्धि डीबी-शिविर के साथ मुख्यमंत्री इलाज के साथ हासिल किया गया था । माउस डीआरजी न्यूरॉन्स, अगर शर्त नहीं है, इस समय सीमा के भीतर किसी भी महत्वपूर्ण neurites बढ़ने नहीं है. यदि डीआरजी न्यूरॉन्स से अधिक 15 ज, तथापि, वे भी नियंत्रण में neurite वृद्धि के कुछ डिग्री दिखाने के लिए शुरू कर रहे हैं, नहीं शर्त शर्त है, जो डीबी के किसी भी प्रभाव-शिविर-neurite वृद्धि पर मुख्यमंत्री का इलाज अस्पष्ट होगा । इसी तरह के परिणाम neurite वृद्धि परख में बताया गया था एक पिछले अध्ययन में चूहे डीआरजी ंयूरॉंस का उपयोग16।
कुछ पिछले अध्ययनों zymosan इस्तेमाल किया, एक खमीर सेल दीवार की तैयारी, एक समर्थक के साथ मैक्रोफेज सक्रिय करने के लिए-reअपक्षय phenotype7,9। हालांकि, zymosan द्वारा उत्तेजित मैक्रोफेज न केवल प्रो-अपक्षयी अणुओं पर भी साइटोटोक्सिक कारकों का विमोचन किया । जब मैक्रोफेज सेमी zymosan के साथ इलाज में प्रोटीन घटक जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग किया गया था, मैक्रोफेज व्युत्पंन ≥ 30 केडीए साइटोटोक्सिक थे जबकि फैक्टरियों ≤ 30 केडीए axon पुनर्जनन7पदोन्नत. इसके अलावा, रीढ़ की हड्डी के लिए zymosan इंजेक्शन न्यूरॉन्स और axons के प्रकट मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं9. इसकी तुलना में, हमारे प्रोटोकॉल प्रो पुनर्जंम मैक्रोफेज उत्पंन करने के लिए zymosan का उपयोग कर पिछले एक से अधिक शारीरिक दिखाया गया है । वास्तव में, डीबी-कैंप इंजेक्शन डीआरजी न्यूरॉन्स के लिए अपनी क्षमता वृद्धि axons केंद्रीय शाखा के लिए एक चोट के बाद सेलुलर हर्जाना17पर किसी भी रिपोर्ट के बिना,18. हमारे प्रयोगों की एक श्रृंखला के दौरान, हम db के आवेदन के बाद संस्कृति में डीआरजी ंयूरॉन घनत्व के किसी भी महत्वपूर्ण कमी कभी नहीं देखा-शिविर का इलाज मुख्यमंत्री । हम सोचते है कि हमारे प्रोटोकॉल हमें केवल समवर्ती neurotoxicity के बिना प्रो-अपक्षयी मैक्रोफेज का उत्पादन करने की अनुमति देता है । इसलिए, प्रोटोकॉल और प्रयोगात्मक मॉडल यहां की सूचना के लिए समर्थक के आणविक हस्ताक्षर-अपक्षयी मैक्रोफेज की पहचान करने के लिए और क्या तंत्र प्रो-अपक्षयी phenotype विकसित किया गया है द्वारा समझने के लिए उपयोगी होगा ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस प्रोटोकॉल को विज्ञान, आईसीटी और भविष्य की योजना, कोरिया गणराज्य के मंत्रालय से अनुदान एनआरएफ-2015R1A2A1A01003410 द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
References
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