Summary
该协议描述了如何建立从新生鼠或早肠的 enteroid 培养系统以及从小鼠收集牛奶的有效方法。
Abstract
人小肠 enteroids 来自于墓穴, 当生长在一个干细胞的利基包含所有的上皮细胞类型。建立人类 enteroid 体外培养系统的能力对于模拟肠道病理生理学和研究所涉及的特定细胞反应非常重要. 近年来, 来自老鼠和人类的 enteroids 正在被培养、传代, 并在世界各地的几个实验室中被储存起来供将来使用。这个 enteroid 平台可以用来测试各种治疗和药物的影响, 以及对不同的肠道细胞类型的影响。在此基础上, 建立了从新生小鼠和早肠中提取的原发性干细胞衍生小肠 enteroids 的方法。此外, 利用这种 enteroid 培养系统来检测特定品种母乳的效果。用改良的人乳泵可以有效地获得小鼠母乳, 并表达小鼠乳可以用于进一步的研究实验。我们现在展示了表达的小鼠, 人和供体母乳对新生小鼠或早产人小肠 enteroids 的生长和增殖的影响。
Introduction
坏死性小肠结肠炎 (NEC) 是早产儿胃肠道疾病死亡的主要原因, 影响近 1 10 婴儿出生前29周妊娠1,2,3。有一半的婴儿与 NEC 进展到最严重的形式, 其中生存只有 10-30%4,5。在美国, 估计有 2-30亿美元/年用于治疗婴儿与 NEC6,7, 但在过去30年中, 存活率和治疗都没有改变。NEC 的发病特点是肠道损伤和黏膜愈合受损8,9,10,11, 然而, 信号通路导致恶化炎症反应和机制逆转炎症仍然不完全地被了解。
人类母乳的管理已被发现是唯一的保护策略, 针对 NEC 早产儿。我们以前已经表明, 母乳通过表皮生长因子受体 (EGFR) 信号通路11抑制肠道上皮中先天免疫受体 4 (TLR4), 从而防止 NEC 的发展。将母乳补充到一个实验 nec 公式中, 通过抑制 enterocyte 细胞凋亡和恢复 enterocyte 增殖的方式, 减弱了 nec 中所看到的炎症反应, 这种方法依赖于表皮生长因子 (EGF) 和 EGFR11。另一项研究表明, 母乳中的另一成分硝酸盐通过调节肠道灌注来促进其保护性, 与缺乏硝酸盐的婴儿配方奶粉相比, 这可能有助于提高 NEC 的频率。公式喂养婴儿12,13。母乳中含有的其他化合物包括人乳寡糖、l-精氨酸、谷氨酰胺和乳铁蛋白14,15,16, 17,18,19。母乳中的这些有益成分揭示了它在预防 nec 方面的必要性, 同时也强调了研究母乳如何调解对 nec 的保护所涉及的机制、信号通路和细胞效应的重要性。.
为了进一步研究 NEC 的小鼠模型中母乳的保护特性, 我们开发了一种新颖的、易于使用的技术, 用电动人乳泵从麻醉大坝中提取小鼠母乳的方法11,12.这项获取小鼠母乳的策略是有利的, 这不仅是因为人类母乳泵在母乳的采购方面是现成的, 而且还因为这种方法允许对特定种类的母乳进行分析。因此, 我们可以比较小鼠母乳与表达的人母乳的影响, 以及巴氏杀菌的人供奶从牛奶银行在物种特定的模型。这项技术允许研究母乳成分与他们对 NEC 预防的贡献。其他调查人员已经开发出母乳提取方法, 但是, 这些技术是手动的, 通常需要多个实验室成员20,21,22。这里提供了一个简单的技术, 可用于修改人的电动母乳泵从鼠标收集牛奶。这种技术也可以应用于其他物种。
为了充分审问与 NEC 有关的信号通路, 需要建立模型系统, 以评估已知受疾病影响的所有不同细胞类型。在这里, 我们讨论一个这样的模型系统-enteroids 和他们的建立从老鼠和人类小肠。人类肠道 enteroids (HIEs) 特别是提供了重要的承诺, 因为它们提供了一个创新的, 基因多样的前体人类模型, 以帮助研究在胃肠道发生的病理生理过程23. Enteroids 已被发现长期养殖, 可冷冻供以后使用23, 与人类肠道 Organoids (HIOs) 不同, 其培养方法来自诱导多潜能干细胞, Enteroids 是由干细胞产生的。在孤立的肠道墓穴中24。Enteroids 需要较少的维护, 可以快速感染25, 并且可以很容易地建立, 因为肠道墓穴比 HIOs23更加区分。因此, HIEs 提供了许多优势超过现有的技术, 因为它们可以被开发展示区域特定的成分和功能性质的人胃肠上皮23。使用 enteroids 是一个非常有效的选择, 当需要一个人的肠道模型, 坚持区域特定的限制和易用性。在这里, 我们展示了从小鼠和早产儿中分离和维持原发性干细胞源性小肠 enteroids 的技术。
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Protocol
这项研究的所有动物程序都是由圣路易斯大学动物保育和使用委员会 (20160187 号议定书) 或匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会 (14103918 号议定书) 批准的。人类胎儿小肠在不到24周的妊娠是根据匹兹堡大学解剖组织采购指南后, 机构审查委员会批准 (礼宾 PRO14100537) 从大学匹兹堡健康科学组织银行通过一个诚实的经纪系统。未经匹兹堡大学机构审查委员会的同意, 获得了不确定的人母乳或巴氏杀菌捐赠母乳。
1. 从新生小鼠或早产人小肠 Enteroids 的隐窝分离和建立
- 媒体准备
注: 介质应在盖窝隔离前的前一天准备好。- 准备 1.11 L 文化媒介。从1升 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 与4.5 克/升葡萄糖和 l-谷氨酰胺, 并添加110毫升胎牛血清 (血清) (最终浓度 10%), 11 毫升青霉素-链霉素 (最终浓度 1%), 1.1 毫升无菌胰岛素 (最终浓度 0.1%)。
- 准备500毫升的 PBS-抗生素混合物。开始与500毫升 1x Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 与10% 的血清和添加5毫升庆大霉素 (最终浓度 1%), 1 毫升两性霉素 B (最终浓度 0.2%), 和5毫升青霉素-链霉素 (最终浓度 1%)。
- 准备30毫升细胞分裂介质 #1。首先准备30毫升培养基。添加600µL 0.5 米乙二胺四乙酸 (EDTA) (最终浓度10毫米), 300 µL 庆大霉素 (最终浓度 1%), 60 µL 两性霉素 B (最终浓度 0.2%)。
- 准备30毫升细胞分裂介质 #2。首先准备30毫升培养基。添加300µL 0.5 米 EDTA (最终浓度5毫米), 300 µL 庆大霉素 (最终浓度 1%), 60 µL 两性霉素 B (最终浓度 0.2%)。
- 准备50毫升的隐窝培养基, 无生长因子。测量33.4 毫升1x 先进 DMEM/F-12 和添加10毫升血清 (最后浓度 20%)。
- 添加500µL 青霉素-链霉素 (最终浓度 1%), 500 µL l-谷氨酰胺 (最终浓度 1%), 500 µL 庆大霉素 (最终浓度 1%), 100 µL 两性霉素 B (最后浓度 0.2%), 2.5 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane磺酸 (HEPES) (最终浓度0.05 毫米), 500 µL 100 毫米 n-乙酰半胱氨酸 (最终浓度1毫米), 500 µL 100x N-2 补充剂, 1 毫升50x 无血清补充剂 (例如, B-27) 减去维生素 A, 500 µL 1 毫米 100x Y-27632。
- 用生长因子制备1毫升的隐窝培养基。首先准备1毫升无生长因子的隐窝培养基。添加2.5 µL 40 µg/毫升 Wnt3a (最终浓度 100 ng/毫升), 1 µL 100 µg/毫升 (最终浓度 100 ng/毫升), 2 µL 250 µg/毫升 R Spondin (最终浓度 500 ng/毫升), 0.5 µL 100 µg/毫升 EGF (最终浓度 50 ng/毫升)。
- 隐窝隔离
- 将可溶性基底膜萃取物 (见材料表) 放在冰层开始解冻前。
注: 将基底膜放在冰上, 否则会聚合。 - 按照机构动物护理和使用委员会的协议, 为老鼠超过14天的年龄, 弄死小鼠与两种方法的安乐死, 第二个是一个物理程序, 以确保死亡。
注: 对于14天以下的小鼠, 斩首是使用剪刀的标准程序。 - 使用剪刀和镊子, 垂直切开腹部中线, 通过皮肤和腹膜, 为整个腹部的长度。用剪刀将小肠从胃部切除到盲肠, 用镊子将肠系膜切除。
注: 两周大的雄性和雌性 C57BL/6J 鼠幼崽, 每重 5.5-7 克, 被用于隐窝隔离。任何年龄或大小的鼠标都可以用于隐窝隔离。 - 准备新鲜收获的小肠为地穴隔离, 位置肚腑平直, 并且切开肚腑沿它的整个长度使用剪刀。
注意: 老鼠和人肚腑可以相似地被准备。 - 用镊子在 PBS-抗生素混合填充培养皿中来回轻轻摇动肠道, 清洁大便。
- 添加30毫升细胞中断介质 #1 到50毫升圆锥管。将肠道切成0.5 厘米长的块, 直接入管。把管子放在冰桶里, 以最低的速度在振动筛上轻轻搅动15分钟。
- 当这些组织在振动筛上时, 如果将 enteroids 用于 RNA、DNA 或蛋白质的分离, 则获得24或48的钢板来生长墓穴。使用8井室幻灯片生长的地窖, 如果 enteroids 将用于整个安装共聚焦成像。
- 在引擎盖中, 在24或48井板的每个井的底部添加15µL 的基底膜。如果使用腔片, 在每个腔的底部添加9µL 的基底膜。
注: 如有需要, 根据板材尺寸调整基底膜容积。 - 用吸管尖迅速地将基底膜传播, 使基底膜在井底形成薄薄的层。把盘子放在37摄氏度的孵化箱里30分钟, 让基底膜聚合。
注: 如果基底膜不是薄层, 或基底膜含有气泡, 则该墓穴不会附着。 - 15分钟后, 在一个振动筛, 过滤组织通过一个100µm 过滤器。丢弃流。
- 添加30毫升细胞中断介质 #2 到一个新的50毫升圆锥管。从过滤器中取出组织并添加到管中。
- 把管子放在冰桶里, 以最低的速度在振动筛上轻轻搅动15分钟。
- 经过15分钟的振动筛, 过滤组织通过一个100µm 过滤器。在这一步保持流量, 以防在以后的步骤中产量低。
注: 所有流过管子的管道必须放在冰上。 - 添加15毫升 DMEM 与4.5 克/升葡萄糖和 l-谷氨酰胺到一个新的50毫升锥管。从过滤器中取出组织并添加到管中。十年代用手大力摇动管子. 过滤通过100µm 过滤器和收集流程通过。重复, 直到流不包含微粒。
- 在引擎盖中, 过滤从上一步到一个新的50毫升圆锥管的流动, 使用70µm 过滤器为小鼠组织或100µm 过滤器为人体组织。
注: 在待机状态下有额外的过滤滤器, 慢慢地倒入过滤体将堵塞杂物。 - 离心管在 200 x g 为8分钟在4°c 并且直接地在冰桶在敞篷。用吸管除去上清液, 不干扰颗粒。并用重悬颗粒与总期望数量的隐窝培养基培养基没有生长因子。
注: 富集的墓穴是颗粒的 "沙质" 层。每一个井都需要250µL 的隐窝文化媒体, 没有生长因子。
- 将可溶性基底膜萃取物 (见材料表) 放在冰层开始解冻前。
- enteroids 的建立
- 将墓穴介质混合物直接放在基底膜上。
- 用显微镜检查地穴, 确保隔离过程成功。
注意: 细胞的细胞和球是需要的。大约100个单独地窖被镀每井。 - 在37摄氏度处孵化出3小时的钢板, 让墓穴附着在基底膜上。
注: 这种孵化是与隐窝培养基培养基没有生长因子。 - 慢慢地移除没有使用 P-200 吸管连接的介质和多余的墓穴。
注: 请勿扰乱基底膜, 因为附着的墓穴可能会脱落。 - 慢慢地添加250µL 的隐窝培养基和生长因子给每个井。
注: 对于 24, 48 井板, 或会议厅幻灯片, 250 µL 的隐窝培养基培养基与生长因子是足够的。 - 每2天用新鲜的地穴培养基和生长因子在治疗前5天更换培养基, 以获得最佳附着和生长。
2. 鼠标母乳收集
- 在产后 7-12 天从幼崽中分离出一 C57BL/6J 泌乳大坝, 在挤奶前6小时。
- 麻醉的泌乳大坝与异氟醚通过鼻锥, 并管理皮下注射催产素0.15 的体重。在尝试挤奶过程前等待3分钟。
- 在挤奶过程前用70% 乙醇清洁奶嘴, 让干燥。
- 一次性从奶嘴中提取乳汁, 使用带有硅胶导管的电动人乳泵, 将小鼠奶嘴放入5毫升收集管中。
注: 最佳的母乳泵有两个设置, 一个为速度和一个为吸力。最好从每一个最低的设置开始, 并慢慢增加, 直到牛奶被提取。理想情况下, 总产量将是500µL-1 毫升的小鼠母乳每泌乳大坝。 - 立即整除母乳和存储在-80 摄氏度。
注意: 避免冻结/解冻循环。 - 治疗 enteroids 5 天与50µL/毫升的小鼠母乳每毫升的隐窝培养基与生长因子24小时在37摄氏度。
3. Enteroids 的全装染色
-
试剂的制备
- 每8井准备16毫升 1x PBS。
- 在 1x PBS 中准备2毫升4% 多聚甲醛 (粉煤灰), 每8口井。
- 在 1x PBS 中准备2毫升0.1% 海卫 X-100 每8口井。
- 准备24毫升的 pbs (PBST 是0.1% 吐温20在 1x PBS) 每8口井。
- 2毫升10% 正常驴血清 (nds) 在 0.1% PBST (10% NDS/PBST) 每8口井。
- 在 0.1% PBST (1% NDS/PBST) 中, 每8个井准备4毫升 1% nds。
-
染色日1
- 吸掉治疗, 用 PBS 洗 enteroids。每井加250µL 4% 粉煤灰。在转子上放置 1-2 小时, 在4摄氏度。用吸管取出4% 只粉煤灰。
- 洗4次与250µL/井 1x PBS。在室温下 (RT) 在转子上放置10分钟。
注: 如果需要, 可以在4摄氏度储存 1-2 天的板材。 - 添加250µL/井0.1% 海卫 X-100。在 RT 中孵化1小时. 用吸管去除 0.1% X-100。
- 洗4次与250µL/井 1x PBS。在 RT 上放置15分钟的旋转。
- 添加250µL/井 10% NDS/PBST。在 RT 中孵化45分钟. 用吸管去除 10% NDS/PBST。
- 添加250µL/井原抗体, 稀释 1/250 1% NDS/PBST, 并在4摄氏度过夜。
注: 最佳抗体稀释根据制造商而异。
-
染色日2
- 洗涤至少5次为 4-5 h 与250µL/井 PBST。在每个洗涤之间的4°c 放置在转子上。
- 添加250µL/井次抗体, 稀释 1/1000 1% NDS/PBST。包装在箔板和孵化隔夜在4摄氏度。
-
染色日3
- 添加250µL/井核染色 4 ', 6-diamidino 2-苯基吲哚 (DAPI) 15 分钟。
注意: 把盘子放在黑暗中。 - 洗6次与250µL/井 PBST。在每个洗涤间, 在4摄氏度的旋转处放置10分钟。
- 将盖玻片安装在带安装介质的室内滑动上。
- 在光栅图形编辑器 (请参阅材料表) 中, 采用40X 目标共聚焦显微镜和同样渲染图像。
- 添加250µL/井核染色 4 ', 6-diamidino 2-苯基吲哚 (DAPI) 15 分钟。
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Representative Results
我们首先试图调查表达的人母乳或巴氏杀菌供乳是否对小肠 enteroids 有影响。事实上, 人类母乳和捐赠母乳增加了新生鼠的生长 (图 1A) 和过早的人类衍生 enteroids (图 1B)。
由于人类母乳增加小肠 enteroids 的生长, 我们接下来研究是否母乳对过早人类 enteroids 的增殖有影响。我们证明, 人类母乳增加过早人类 enteroids 的增殖与控制 (图 2AB, Ki67, 红色染色) 相比。重要的是, 与控制相比, 人类供体母乳也增加了 enteroid 的增殖, 但比非巴氏杀菌母乳 (图 2BC) 的程度略低。我们接下来评估的 Ki67 mRNA 表达在过早的人类 enteroids, 并发现 Ki67 增加了 enteroids 治疗母乳或捐奶者母乳相对控制 (图 2D)。
接下来, 我们想看看这些效果是否是特定于母乳的物种。我们开发了一种方法, 从哺乳小鼠收集母乳, 使用改良的商用母乳泵作为参考11,12。描述的是一个麻醉泌乳大坝使用此设备进行牛奶收集 (图 3)。接下来的一系列实验是在小鼠 enteroids 上进行的, 我们评估了从老鼠, 人, 或供体母乳中所表达的乳汁的增殖效应。如图 4所示, 鼠标、人体和巴氏杀菌供体母乳与控制 (图 4A-D) 相比, 在鼠标 enteroids 中增加了增殖。与控制 (图 4A, E) 相比, 在 TLR4 配体、脂多糖 (LPS) 的存在下, 小鼠 enteroids 的增殖减少。重要的是, 老鼠, 人, 或供体母乳都恢复了 enteroid 在脂多糖存在的情况下增加 Ki67 染色比 LPS 单独 (图 4F-H) 显示。
从实验中我们可以发现, 从新生小鼠和早产人胎儿肠道中提取的小肠 enteroids 可在培养中保持。我们进一步提供了一种新的母乳收集方法, 提供了一种有效的方法来提取母乳从小鼠, 然后可以用于各种实验。我们发现, 从人类或小鼠身上表达的乳汁增加了小鼠和人类 enteroids 的大小、生长和增殖。此外, 小鼠、人和供体母乳恢复了 LPS 暴露后的 enteroid 增生。这表明母乳可以对小鼠和人类小肠产生抗炎作用。
图1。母乳和供体母乳增加小鼠和过早人类 enteroids 的大小和生长.用培养基 (控制)、母乳或供体母乳 (50 µL/毫升) 治疗新生小鼠 (p14) 或早产小肠 enteroids 的显微照片24小时. 尺寸条: 1000 µm.请单击此处查看此图.
图2。母乳和捐赠母乳增加过早人类 enteroids 的增殖.(A) 5 天前培养的过早人 enteroids 的共焦显微照片, 用人母乳和巴氏杀菌供体母乳治疗24小时, 染色 Ki67 (红) 和 DAPI (核、蓝)。大小酒吧:50 µm (B) qRT PCR Ki67 人类 enteroids 相对于家政基因 RPLO 的表达。n = 每组5。p < 0.0001 与学生t测试相比, 与控件进行比较。数据均为标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。用改良的人乳泵从麻醉鼠身上收集牛奶.在接受催产素注射后, 在麻醉泌乳大坝的奶头上放置无菌的人乳泵导管。鼠标牛奶是收集使用人体母乳泵的中等速度和功率成5毫升收集管。从所有奶嘴范围提取的集体卷从500µL 到1毫升每只老鼠在产后天 7-12。请单击此处查看此图的较大版本.
图4。老鼠, 人, 和巴氏杀菌供乳增强小鼠 enteroid 增殖.(A H)p14 小肠小鼠 enteroids 的共焦显微照片 (控制, A) 用鼠标母乳 (MBM、 B)、母乳 (BM、 C) 或人体供体母乳 (DBM、 D) 在50µL/毫升介质中进行处理 (a D) 或存在的脂多糖 (LPS) 剂量为25µg/毫升的介质为 12 h, (E h) 和染色的增殖标记 Ki67 (红色) 和 DAPI (核, 蓝色)。大小酒吧:50 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
肠道上皮是由许多细胞亚型组成的, 负责为病原体提供宿主防御, 维持肠道屏障完整性, 并可在多种疾病的发病机制中被突破。虽然动物模型可以重述这一疾病的某些方面, 但从小鼠和人类小肠中提取的 enteroids 的前体模型为测试各种治疗效果提供了一个平台。enteroid 模型的意义使研究人员能够将肠道干细胞培养并区分为所有上皮细胞亚型, 从幼稚或患病的动物和没有现有方法的人类。这种模型系统可用于感染的人病原体, 可能不容易翻译成鼠标, 如肠病毒25或诺如病毒26 等。enteroid 模型具有多种优点和用途;然而, 必须注意确保用于制造培养基的试剂的一致性, 以及 enteroids 生存所需的特定外源生长因子。
在 enteroid 模型中, 几个步骤对于确保生产 enteroids 的成功至关重要。为了尽量减少冷缺血时间, 应方便地处理组织。如果组织被放置在罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 培养基上4摄氏度, Enteroids 可能会在组织被收获24小时后产生。这可以方便航运或运输的选择, 如有必要。为建立 enteroids, 基底膜必须是一个薄, 扁平层在每个井的底部, 以附着和生长。如果基底膜不平坦或有气泡存在, 则墓穴可能无法粘附, 当介质发生变化时将被移除。在 enteroids 建立后, 它们可能每7天传代一次或冷冻在液氮中, 长期贮存。用生长因子去除和添加隐窝培养基, 每种处理方法的管理必须缓慢地进行, 以避免干扰 enteroids。enteroids 的中断会使它们在媒体发生更改时变得分离并被冲走。为了取得最佳效果, 应注意保持基底膜的完整性和附着的 enteroids。
在目前的研究中, 我们报告说, 来自新生小鼠和早产儿的 enteroids 可以在不同类型的乳汁存在的情况下生长和增殖。这些研究提高了我们对母乳对小肠的影响的认识。我们提供了一个详细的方法, 如何建立 enteroid 文化在实验室从人类和小鼠。此外, 我们还展示了一种有效的方法来收集母乳从哺乳鼠标使用改良电动人乳泵。我们表明, 老鼠, 人类, 和巴氏杀菌的捐赠母乳增强了 enteroids 的生长和增殖的小鼠和人类。此外, 我们显示 TLR4 配体 LPS 的存在减少了 enteroid 增殖, 当老鼠、人或供体母乳被管理到 enteroids 时恢复。未来的应用可能包括个性化的精密医学与高通量的药物屏幕上的 enteroids 从婴儿获得的肠道切除, 看看如何某些药物可以影响特定的婴儿。同时, 我们希望其他实验室在肠道儿科疾病的许多不同领域, 包括 NEC, 在临床上有迫切需要制定新的治疗策略时, 能够成功地利用这些技术。
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Disclosures
作者没有什么可透露的, 也没有利益冲突。
Acknowledgments
MG 由国家卫生研究院赠款 K08DK101608 和 R03DK111473 支助, 3月的硬币基金会赠款 5-FY17-79, 华盛顿大学儿童发现研究所和圣路易斯儿童医院和部圣路易斯华盛顿大学医学院儿科。CJL 是由 R01DK104946 (PI:), 华盛顿大学儿童发现研究所和圣路易斯儿童医院支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
