Summary
Dit protocol wordt beschreven hoe het opzetten van een enteroid cultuur systeem van neonatale muis of voortijdige menselijke darm, alsmede een efficiënte methode voor het verzamelen van melk van muizen.
Abstract
Menselijke kleine intestinale enteroids zijn afgeleid van de crypten en als volwassen in een cel van de stam niche bevatten alle epitheliale celtypen. Het vermogen om menselijke enteroid ex vivo cultuur systemen zijn belangrijk model intestinale pathofysiologie en onderwijs van de betrokken specifieke cellulaire reacties. In de afgelopen jaren worden enteroids van muizen en mensen worden gekweekt, gepasseerd en dwarshelling weg voor toekomstig gebruik in verschillende laboratoria over de hele wereld. Dit enteroid-platform kan worden gebruikt om de effecten van verschillende behandelingen en drugs en wat de gevolgen zijn uitgeoefend op verschillende soorten cellen in de darm te testen. Hier, een protocol voor de vaststelling van primaire stamcel afkomstige kleine intestinale enteroids afgeleid van neonatale muizen en voortijdige menselijke darm wordt verstrekt. Bovendien werd dit enteroid cultuur systeem gebruikt om te testen van de effecten van soortspecifieke moedermelk. Muis moedermelk kan worden verkregen voor het efficiënt gebruik van een gemodificeerde menselijke borst pomp en uitgesproken muis melk kan vervolgens worden gebruikt voor verder onderzoek experimenten. We laten nu zien de gevolgen van uitdrukkelijke muis, menselijke, en donor moedermelk op de groei en de verspreiding van enteroids afgeleid van neonatale muizen of voortijdige menselijke dunne darm.
Introduction
Necrotiserende enterocolitis is (NEC) de belangrijkste doodsoorzaak van gastro-intestinale aandoeningen bij premature zuigelingen, bijna 1 op 10 baby's geboren vóór 29 weken zwangerschap1,2,3te beïnvloeden. De helft van de zuigelingen met NEC vooruitgang aan de meest ernstige vorm, waar overleven slechts 10-30%4,5 is. In de Verenigde Staten, een geschatte 2-3 miljard USD per jaar zijn uitgegeven behandeling van zuigelingen met NEC6,7, maar noch de therapie de overlevingskans is veranderd in de afgelopen 30 jaar. De pathogenese van NEC wordt gekenmerkt door intestinale letsel en verminderde mucosal helende8,9,10,11, echter de signaalroutes leidt tot een hevige inflammatoire respons en mechanismen om te keren van de ontsteking blijven onvolledig begrepen.
Het beheer van de menselijke moedermelk is gebleken dat de alleen beschermende strategie tegen NEC voor premature zuigelingen. Wij hebben eerder aangetoond dat moedermelk tegen NEC ontwikkeling door remming van het aangeboren immuun receptor toll-like receptor 4 (TLR4) in het intestinaal epitheel via de epidermale groeifactor receptor (EGFR beschermt) signalering traject11. Suppletie van moedermelk naar een experimentele formule van NEC verzwakt de inflammatoire respons in NEC zoals aangetoond door remming van enterocyte apoptosis en herstel van enterocyte proliferatie op een wijze die afhankelijk van epidermale groei was gezien factor (EGF) en EGFR11. In een andere studie, werd aangetoond dat nitraat, een ander onderdeel van moedermelk, draagt bij aan het beschermende karakter door modulerende intestinale perfusie, in vergelijking met zuigelingenvoeding, die ontbreekt nitraat en kan bijdragen aan het verhogen van de frequentie van NEC in formule gevoed zuigelingen12,,13. Andere verbindingen in de moedermelk aanwezig die hebben aangetoond te worden betrokken bij de bescherming tegen NEC bevatten menselijke melk oligosacchariden, L-arginine en glutamine lactoferrine14,15,16, 17,18,19. Deze positieve elementen van moedermelk onthullen de noodzaak van het gebruik ervan in de preventie van NEC, maar ook het belang benadrukken van het bestuderen van de mechanismen, trajecten en cellulaire effecten betrokken in het hoe moedermelk is het bemiddelen van de bescherming tegen NEC-signalering .
Om verdere studie de beschermende eigenschappen van moedermelk in een muismodel van NEC, ontwikkelden we een techniek van het nieuwe, gemakkelijk te gebruiken door welke muis moedermelk kan worden geëxtraheerd uit een narcose dam met behulp van een elektrische menselijke borst pomp11,12 . Deze strategie van het verwerven van muis moedermelk is gunstig, niet alleen omdat de menselijke borst pompen zijn gemakkelijk beschikbaar en efficiënt in de aanschaf van moedermelk, maar ook omdat deze methode voor soortspecifieke borst melk analyses zorgt. Dientengevolge, wij kunt vergelijken met de effecten van muis moedermelk met die van uitgedrukt menselijke moedermelk, evenals gepasteuriseerde melk van de menselijke donor van een bank van de melk in soortspecifieke modellen. Deze techniek maakt het mogelijk voor de studie van de melkbestanddelen van de borst met betrekking tot hun bijdrage aan de preventie van NEC. Andere onderzoekers borst melk extractiemethoden hebben ontwikkeld, maar deze technieken zijn handmatige en vergen doorgaans meer dan één lab lid20,21,22. Hier is een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt door het wijzigen van een menselijke elektrische borstkolf voor het verzamelen van melk van een muis wordt gepresenteerd. Deze techniek kan ook worden toegepast op andere soorten.
Om voldoende ondervragen de signaalroutes betrokken bij NEC, zijn modelsystemen nodig om alle van de verschillende soorten cellen bekend worden beïnvloed in het ziekteproces worden geëvalueerd. Hier bespreken we een dergelijk modelsysteem - enteroids- en de oprichting van de muis en de menselijke dunne darm. Menselijke intestinale enteroids (HIEs) bieden in het bijzonder belangrijke belofte, omdat ze een innovatieve, genetisch divers ex vivo menselijke model bieden als hulpmiddel bij de studie van de pathofysiologische processen die in het maag-darmstelsel plaatsvinden 23. Enteroids bleken te worden gekweekt op lange termijn en kan ingevroren worden voor later gebruik23, en in tegenstelling tot menselijke intestinale Organoids (Spa), wiens culturen zijn ontwikkeld op basis van afleidbare pluripotente stamcellen, enteroids zijn gegenereerd op basis van stamcellen binnen geïsoleerde intestinale crypten24. Enteroids vergen minder onderhoud, kan besmet snel25, en kan gemakkelijk worden vastgesteld aangezien intestinale crypten zijn meer gedifferentieerd dan Oberhof23. Daarom, HIEs bieden veel voordelen ten opzichte van bestaande technieken omdat ze kunnen worden ontwikkeld om de land / regiospecifieke compositorische en functionele eigenschappen van het menselijk gastro-intestinaal epitheel23vertonen. Het gebruik van enteroids is een zeer effectieve keuze wanneer u behoefte aan een menselijke model van de darm, met naleving van de land / regiospecifieke beperkingen en gemak-of-gebruik. Hier tonen we de techniek van het isoleren en onderhouden van primaire stamcel afkomstige kleine intestinale enteroids uit muizen en voortijdige menselijke zuigelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures in deze studie werden goedgekeurd door ofwel de Washington University in St. Louis institutionele Animal Care gebruik Comité (20160187 Protocol) of institutionele dierenverzorgers van de Universiteit van Pittsburgh en gebruik Comité (Protocol 14103918). Menselijke foetale dunne darm op minder dan 24 weken zwangerschap is verkregen overeenkomstig de richtsnoeren voor het verkrijgen van de Universiteit van Pittsburgh anatomische weefsel na institutionele Review Board goedkeuring (protocol PRO14100537) aan de University of Pittsburgh Health Sciences weefselbank via een bemiddelaar-systeem. De geïdentificeerde menselijke moedermelk of gepasteuriseerde donor moedermelk werd verkregen met een opheffing van de toestemming van de Universiteit van Pittsburgh institutionele Review Board.
1. crypt isolatie en oprichting van Enteroids van neonatale muizen of voortijdige menselijke dunne darm
- Voorbereiding van de media
Opmerking: Media moet worden voorbereid op de motorkap eergisteren crypt isolatie.- 1.11 L voedingsbodems bereiden. Beginnen met 1 L Dulbecco van bewerkt Eagle's medium (DMEM) met 4,5 g/L glucose en L-glutamine en voeg 110 mL foetale runderserum (FBS) (eindconcentratie 10%), 11 mL penicilline-streptomycine (eindconcentratie 1%) en 1.1 mL steriele insuline (finale concentratie 0,1%).
- 500 mL PBS-antibioticum mengsel te bereiden. Beginnen met 500 mL 1 x Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) met 10% FBS en voeg 5 mL gentamicine (eindconcentratie 1%), 1 mL amfotericine B (eindconcentratie 0,2%), en 5 mL penicilline-streptomycine (eindconcentratie 1%).
- 30 mL cel verstoring Media #1 voor te bereiden. Eerst voorbereiden 30 mL voedingsbodems. Toevoegen van 600 µL 0.5 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (eindconcentratie 10 mM), 300 µL gentamicine (eindconcentratie 1%) en 60 µL amfotericine B (eindconcentratie 0,2%).
- 30 mL cel verstoring Media #2 voor te bereiden. Eerst voorbereiden 30 mL voedingsbodems. Toevoegen van 300 µL 0.5 M EDTA (eindconcentratie 5 mM), 300 µL gentamicine (eindconcentratie 1%) en 60 µL amfotericine B (eindconcentratie 0,2%).
- 50 mL Crypt voedingsbodems zonder groeifactoren te bereiden. Meten van 33.4 mL 1 x geavanceerde DMEM/F-12 en voeg 10 mL FBS (eindconcentratie 20%).
- Voeg 500 µL penicilline-streptomycine (eindconcentratie 1%), 500 µL L-glutamine (eindconcentratie 1%), 500 µL gentamicine (eindconcentratie 1%), 100 µL amfotericine B (eindconcentratie 0,2%), 2,5 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonzuur (HEPES) (eindconcentratie 0.05 mM), 500 µL 100 mM N-Acetylcysteïne (eindconcentratie 1 mM), 500 100 µL x N-2 supplement 1 mL 50 x serumvrij supplement (bvB-27) verminderd met vitamine A en 500 µL 1 mM 100 x Y-27632.
- Bereiden 1 mL Crypt voedingsbodems met groeifactoren. Eerst bereiden 1 mL van de crypte voedingsbodems zonder groeifactoren. Voeg 2.5 µL 40 µg/mL Wnt3a (eindconcentratie 100 ng/mL), 1 µL 100 µg/mL Noggin (eindconcentratie 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (eindconcentratie 500 ng/mL) en 0,5 µL 100 µg/mL EGF (eindconcentratie 50 ng/mL).
- Crypt isolatie
- Plaats ontbindend kelder membraan extract (Zie Tabel van materialen) op ijs te ontdooien voordat u begint.
Opmerking: Houd kelder membraan op ijs of het zal polymeriseren. - In overeenstemming met de institutionele Animal Care en gebruik Comité protocol voor muizen meer dan 14 dagen oud, euthanaseren muizen met twee methoden van euthanasie met de tweede wordt een fysieke procedure om dood.
Opmerking: Voor muizen minder dan 14 dagen oud, onthoofding is de standaard procedure met behulp van schaar. - Maak een verticale insnijding van de middellijn van de buik, door de huid en buikvlies, over de volledige lengte van de buik met schaar en pincet. Accijnzen van de dunne darm van de maag naar de blindedarm met een schaar, en het mesenterium verwijderen met pincet.
Opmerking: Twee weken oude mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J muis pups, elke wegende 5.5-7 g, werden gebruikt voor isolatie van de crypte. Elke leeftijd of grootte muis kan worden gebruikt voor isolatie van de crypte. - Vers geoogste dunne darm voorbereidt crypt isolatie, positie darm recht, en de darm lengterichting over de gehele lengte met behulp van schaar te knippen.
Opmerking: Muis en de menselijke darm kunnen bereid worden op dezelfde manier. - Schone ontlasting uit de darm door de darm zachtjes heen en weer te schudden in een petrischaal PBS-antibioticum mengsel gevuld met pincet.
- Voeg 30 mL cel verstoring Media #1 aan een conische buis van 50 mL. Snijd de darm in 0.5 cm lengte stukken rechtstreeks in de buis. Instellen van de buis in een ijsemmer en zachtjes doorroeren op shaker op de laagste snelheid gedurende 15 minuten.
- Terwijl de weefsels in het roteerapparaat, verkrijgen 24 - of 48-Wells-platen crypten groeien als de enteroids moeten worden gebruikt voor RNA, DNA of eiwit isolatie. Gebruik dia's 8-well kamer crypten groeien als de enteroids moeten worden gebruikt voor hele mount confocal imaging.
- Voeg 15 µL van kelder membraan naar de onderkant van elk putje van de plaat 24 - of 48-goed in de kap. Als kamer dia's gebruikt, voeg 9 µL van kelder membraan naar de onderkant van elke kamer.
Opmerking: Volume van kelder membraan volgens de grootte van de plaat indien nodig aanpassen. - Verspreidde zich snel het membraan van de kelder met de pipet tip zodat het membraan van de kelder een dunne laag op de bodem van de put vormt. Plaats de plaat bij 37 ° C in de incubator voor 30 min dat het membraan van de kelder te polymeriseren.
Opmerking: De crypten zal niet hechten als kelder membraan niet een dun laagje is of als kelder membraan Luchtbellen bevat. - Na 15 min op een shaker, het weefsel wordt gefiltreerd door een zeef van 100 µm. Gooi de stroom door.
- Voeg 30 mL cel verstoring Media #2 toe aan een nieuwe conische tube van 50 mL. Weefsel verwijderen zeef en voeg aan de buis.
- Instellen van de buis in een ijsemmer en zachtjes doorroeren op shaker op de laagste snelheid gedurende 15 minuten.
- Na 15 minuten op het schudapparaat, weefsel wordt gefiltreerd door een zeef van 100 µm. Bewaar stroom door bij deze stap, voor het geval dat rendement is laag in latere stappen.
Opmerking: Alle stroom door buizen moet worden gehouden op het ijs. - Voeg toe 15 mL DMEM met 4,5 g/L glucose en L-glutamine aan een nieuwe conische tube van 50 mL. Weefsel verwijderen zeef en voeg aan de buis. Krachtig schudden met de hand de buis voor 10 s. Filter door een zeef van 100 µm en verzamelen van stroom door. Herhaal totdat stroom door geen deeltjes bevat.
- Filteren in de kap, de stroom door vanaf vorige stap in een nieuwe 50 mL conische buis met behulp van 70 µm vulinrichtingen voor muis weefsel of 100 µm vulinrichtingen voor menselijk weefsel.
Opmerking: Extra vulinrichtingen hebben op stand-by, en giet langzaam zoals vulinrichtingen met puin verstoppen zal. - Centrifugeer de buis bij 200 x g gedurende 8 min bij 4 ° C en plaats direct in een ijsemmer in de kap. Verwijder het supernatant Pipetteer zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet met gewenste totaalbedrag van de crypte voedingsbodems zonder groeifactoren.
Opmerking: De verrijkte crypten zijn de 'zand' laag van de pellet. Elk vereist goed 250 µL van de crypte voedingsbodems zonder groeifactoren.
- Plaats ontbindend kelder membraan extract (Zie Tabel van materialen) op ijs te ontdooien voordat u begint.
- Oprichting van enteroids
- Plaat van de crypte media mengsel direct op het membraan van de kelder.
- Controleer de crypten met een microscoop om isolatie proces was succesvol.
Opmerking: Cellen en ballen van cellen zijn gewenst. Ongeveer 100 individuele crypten zijn vergulde per putje. - Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 3 uur toe crypten vast te houden aan het membraan van de kelder.
Opmerking: Deze incubatie is met de crypte voedingsbodems zonder groeifactoren. - Verwijder langzaam de media en de overtollige cryptes dat niet te koppelen met behulp van een precisiepipet P-200.
Opmerking: Niet storen de kelder-membraan zoals de bijgevoegde crypten kunnen worden verdreven. - Voeg langzaam 250 µL van de crypte voedingsbodems met groeifactoren toe aan elk putje.
Opmerking: Voor 24-, 48-Wells-platen of kamer dia's, 250 µL van de crypte voedingsbodems met groeifactoren is voldoende. - Vervang de media om de 2 dagen met verse Crypt voedingsbodems met groeifactoren voor 5 dagen vóór de behandelingen te voorzien in optimale gehechtheid en groei.
2. muis Breast melk collectie
- Een C57BL/6J zogende dam postpartum 7-12 dagen van haar pups gedurende 6 uur vóór het melken scheiden.
- Anesthetize de zogende dam met Isofluraan via een neus kegel en beheren van een subcutane injectie van oxytocine op 0,15 IU/kg lichaamsgewicht. 3 min wachten voordat u probeert het melken van de procedure.
- Spenen met 70% ethanol vóór het melken van de procedure schoon en laten drogen.
- Pak melk uit spenen één tegelijk met behulp van een elektrische menselijke borstkolf met silicone slangen formaat aangepast aan spenen van de muis in een tube van 5 mL collectie.
Opmerking: Optimale borst pompen zijn twee instellingen, één voor snelheid en één voor de zuigkracht. Het is het beste om te beginnen met de laagste instellingen van elk en beide langzaam te verhogen tot melk wordt geëxtraheerd. Ideaal, totale opbrengst zal worden ~ 500 µL - 1 mL moedermelk muis per zogende dam. - Onmiddellijk aliquoot moedermelk en winkel bij-80 ° C.
Opmerking: Voorkomen vorst/dooi cycli. - Behandelen van enteroids op dag 5 met 50 µL/mL moedermelk muis per mL van Crypt voedingsbodems met groeifactoren gedurende 24 uur bij 37 ° C.
3. hele Mount kleuring van Enteroids
-
Bereiding van reagentia
- 16 mL 1 x PBS per 8 putten voor te bereiden.
- 2 mL 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS per 8 putten bereiden.
- Bereiden van 2 mL 0,1% Triton X-100 in 1 x PBS per 8 putten.
- Bereiden van 24 mL PBS-Tween (PBST is 0,1% Tween-20 in 1 x PBS) per 8 putten.
- Bereiden van 2 mL 10% normale ezel serum (NDS) in 0,1% PBST (10% NDS/PBST) per 8 putten.
- Bereiden van 4 mL 1% NDS in 0,1% PBST (1% NDS/PBST) per 8 putten.
-
Kleuring van dag 1
- Gecombineerd uit behandelingen en wassen van enteroids met PBS. Voeg 250 µL 4% PFA per putje. Plaats op de rotator gedurende 1-2 uur bij 4 ° C. Verwijderen van 4% PFA met pipet.
- Wassen 4 keer met 250 µL per putje 1 x PBS. Plaats op de rotator gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
Opmerking: Het is mogelijk om op te slaan van plaat voor 1-2 dagen bij 4 ° C, indien nodig. - Toevoegen van 250 µL per putje 0.1% Triton X-100. Incubeer gedurende 1 h RT. verwijderd 0,1% Triton X-100 met pipet.
- Wassen 4 keer met 250 µL per putje 1 x PBS. Plaats op de rotator gedurende 15 minuten op RT.
- Voeg 250 µL per putje 10% NDS/PBST. Incubeer gedurende 45 min RT. verwijderd 10% NDS/PBST met pipet.
- Voeg 250 µL per putje primair antilichaam, verdund 1/250 in 1% NDS/PBST, en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
Opmerking: De optimale antilichaam verdunning varieert afhankelijk van de fabrikant.
-
Kleuring van dag 2
- Wassen ten minste 5 keer voor 4-5 h met 250 µL per putje PBST. Plaats op de rotator bij 4 ° C tussen elke wassen.
- Voeg toe 250 µL per putje secundair antilichaam, verdund 1/1.000 in 1% NDS/PBST. De plaat in folie wikkelen en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
-
Kleuring van dag 3
- Voeg toe 250 µL per putje nucleaire vlek 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) gedurende 15 minuten.
Opmerking: Houd de plaat in het donker. - 6 keer wassen met 250 µL per putje PBST. Plaats op de rotator gedurende 10 minuten bij 4 ° C tussen elke wassen.
- Mount dekglaasje aan op kamer dia met de montage van de media.
- Beelden met een 40 X objectieve confocal microscoop nemen en even maken in een raster grafische editor (Zie Tabel van materialen).
- Voeg toe 250 µL per putje nucleaire vlek 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) gedurende 15 minuten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij willen eerst onderzoeken of de menselijke moedermelk uitgedrukt of gepasteuriseerde donor moedermelk een effect gehad op de kleine intestinale enteroids. Inderdaad, menselijke moedermelk en donor moedermelk steeg de groei van neonatale muis (figuur 1A) en voortijdige menselijke afgeleide enteroids (figuur 1B).
Omdat menselijke moedermelk steeg de groei van kleine intestinale enteroids, onderzochten we volgende als moedermelk had een effect op de proliferatie van voortijdige menselijke enteroids. We laten zien dat menselijke moedermelk de verspreiding van voortijdige menselijke enteroids in vergelijking met controle (figuur 2A-B, Ki67, rode kleuring verhoogt). Belangrijker, verhoogd menselijke donor moedermelk ook enteroid proliferatie ten opzichte van de controle, maar een iets mindere mate dan niet gepasteuriseerd menselijke moedermelk (figuur 2B-C). Wij vervolgens de expressie Ki67 mRNA in de voortijdige menselijke enteroids geëvalueerd en ontdekt dat Ki67 in de enteroids behandeld met moedermelk of donor moedermelk ten opzichte van controle (figuur 2D) werd verhoogd.
We wilden vervolgens zien alsof deze effecten soortspecifieke met betrekking tot de moedermelk. We ontwikkeld, een manier voor het verzamelen van moedermelk van zogende muizen met behulp van een gemodificeerde verkrijgbare menselijke borstkolf zoals verwijzingen11,12. Afgebeeld is een narcose zogende dam melkophaling ondergaan met behulp van dit apparaat (Figuur 3). De volgende reeks experimenten werd uitgevoerd op muis enteroids en we de effecten van de proliferatie van uitgedrukt moedermelk van muis, mens of donor moedermelk geëvalueerd. Zoals blijkt uit Figuur 4, muis, menselijke en gepasteuriseerde donor borst melk verhoogde proliferatie in de enteroids van de muis ten opzichte van de controle (figuur 4A-D). Proliferatie in de muis enteroids werd afgenomen in het bijzijn van de TLR4 ligand, lipopolysaccharide (LPS), in vergelijking met controle (figuur 4A, E). Belangrijker, muis, mens of donor borst melk alle gerestaureerd enteroid proliferatie in aanwezigheid van LPS zoals aangetoond door verhoogde Ki67 kleuring t.o.v. LPS alleen (figuur 4F-H).
Uit onze experimenten, laten we zien dat kleine intestinale enteroids afgeleid van neonatale muizen en voortijdige menselijke foetale darm kan worden gehandhaafd in de cultuur. Verder bieden wij een nieuwe borst melk collectie methode waarmee een efficiënte manier om moedermelk uittreksel van muizen, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor verschillende experimenten. We hebben ontdekt dat uitgedrukt moedermelk van mens of muizen de grootte, de groei en de verspreiding in muizen en menselijke enteroids toegenomen. Bovendien, muis, mens en donor moedermelk hersteld de proliferatie van de enteroid na LPS blootstelling. Dit suggereert dat moedermelk anti-inflammatoire effecten op de dunne darm van muizen en de mens kan uitoefenen.
Figuur 1. Moedermelk en donor moedermelk vergroten de grootte en de groei van de muis en voortijdige menselijke enteroids. Photomicrographs van kleine intestinale enteroids van neonatale muizen (p14) of voortijdige menselijke darm behandeld met media (Control), moedermelk of donor moedermelk (50 µL/mL) voor 24 h. grootte bar: 1.000 µm. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Figuur 2. Moedermelk en donor moedermelk verhogen de proliferatie van voortijdige menselijke enteroids. (A) Confocal microfoto van voortijdige menselijke enteroids gekweekt voor 5 dagen, menselijke moedermelk en gepasteuriseerde donor moedermelk gedurende 24 uur behandeld en gekleurd voor de proliferatie marker Ki67 (rood) en de DAPI (nucleaire, blauw). Grootte bar: 50 µm. (B) qRT-PCR Ki67 uitdrukking van menselijke enteroids ten opzichte van het huishouden gen RPLO. n = 5 per groep. p < 0.0001 vergelijkingen met de Student t -test t.o.v. controle. Gegevens zijn gemiddelde ± standaardafwijking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Collectie van melk van een narcose muis met behulp van een gemodificeerde menselijke borstkolf. Steriele menselijke borst pomp buis geplaatst op spenen van narcose zogende dam na ontvangst van oxytocine injectie. Muis melk wordt verzameld met behulp van de menselijke borst pomp op middellange snelheid en kracht in een tube van 5 mL collectie. Collectieve volumes worden geëxtraheerd uit alle spenen variëren van 500 µL tot 1 mL per muis op postnatale dagen 7-12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Muis, menselijke en gepasteuriseerde donor moedermelk verbeteren muis enteroid proliferatie. (A-H) Confocale microfoto van p14 kleine intestinale muis enteroids (besturingselement, een) behandeld met muis moedermelk (MBM, B), menselijke moedermelk (BM, C), of moedermelk menselijke donor (DBM, D) bij 50 µL/mL van media voor 12u in de afwezigheid ( A-D) of aanwezigheid van het lipopolysaccharide (LPS) bij een dosis van 25 µg/mL van media voor 12u, (E-H) en gekleurd voor de proliferatie marker Ki67 (rood) en de DAPI (kernenergie, blauw). Grootte bar: 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het intestinaal epitheel bestaat uit vele cellulaire subtypen die verantwoordelijk zijn voor het verstrekken van host afweer tegen ziekteverwekkers, behoud van de integriteit van de barrière van de darm, en in de pathogenese van verschillende ziekten kunnen worden geschonden. Hoewel diermodellen sommige facetten van de ziekte recapituleren kunnen, biedt de ex vivo -model van enteroids die zijn afgeleid van de dunne darm van muizen en mensen een platform om te testen van de effecten van verschillende behandelingen. De betekenis van het enteroid-model kan onderzoekers cultuur te onderscheiden van intestinale stamcellen in alle epitheliale cellulaire subtypen van naïef of zieke dieren en mensen die niet beschikbaar zijn met de bestaande methoden. Dit modelsysteem kan worden gebruikt voor infecties met menselijke pathogenen die niet gemakkelijk omgezet in de muis, zoals enterovirus25 of norovirus26 onder anderen worden wellicht. Het enteroid model heeft een aantal voordelen en toepassingen; echter moet worden gezorgd voor consistentie in de reagentia die worden gebruikt voor het maken van de media en de specifieke exogene factoren die de groei die nodig voor het voortbestaan van enteroids zijn.
Binnen het enteroid model zijn de verschillende stappen van essentieel belang zijn voor het verzekeren van succes in het produceren van enteroids. U wilt koude ischemische tijd minimaliseren, moet weefsel expediently worden verwerkt. Enteroids kan geproduceerd worden tot 24 uur nadat het weefsel wordt geoogst als het weefsel wordt geplaatst in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) medium bij 4 ° C. Dit kan de mogelijkheid van verzending of vervoer vergemakkelijken indien nodig. Voor de oprichting van enteroids moet het membraan van de kelder een dunne, platte laag op de bodem van elk putje voor de crypten te koppelen en te groeien. Als de kelder membraan bubbels aanwezig heeft of niet plat is, de crypten houden en zal mogelijk niet worden verwijderd wanneer de media wordt gewijzigd. Nadat de enteroids zijn gevestigd, kunnen ze worden gepasseerd om 7 dagen of bevroren in vloeibare stikstof voor lange termijn opslag. Verwijdering en toevoeging van Crypt voedingsbodems met groeifactoren en het beheer van elke behandeling moeten gebeuren langzaam en aan de rand van elk putje wordt voorkomen van verstoring van de enteroids. Verstoring van de enteroids kan leiden tot hen te worden losgemaakt en weggewassen toen de media wordt gewijzigd. Voor de beste resultaten, moet worden gewaakt voor het behoud van de integriteit van het membraan van de kelder en de bijgevoegde enteroids.
In de huidige studie melden wij dat enteroids afgeleid van neonatale muizen en premature zuigelingen kunnen groeien en vermenigvuldigen in de aanwezigheid van verschillende soorten moedermelk. Deze studies verder ons begrip van de gevolgen van moedermelk op de voortijdige darm. Wij bieden een gedetailleerde methode op hoe om enteroid culturen in het laboratorium van mensen en muizen. Daarnaast tonen we een efficiënte methode van het verzamelen van moedermelk van een zogende muis met behulp van een gemodificeerde elektrische menselijke borstkolf. We laten zien dat muis, menselijke en gepasteuriseerde donor moedermelk de groei en de verspreiding van enteroids van muizen en mensen versterken. Bovendien tonen we verminderde enteroid proliferatie in aanwezigheid van de TLR4 ligand LPS, die werd gerestaureerd als muis, mens of donor moedermelk werd toegediend aan de enteroids. Toekomstige toepassingen bevatten gepersonaliseerde precisie geneeskunde met hoge doorvoersnelheid drug schermen op enteroids zuigelingen verkregen na intestinale resectie om te zien hoe bepaalde medicijnen kunnen beïnvloeden het bepaalde kind. Samen genomen, we hopen dat andere laboratoria vindt potentiële succes in met behulp van deze technieken in vele verschillende rijken van pediatrische ziekten van de darm, met inbegrip van de NEC, waarbij er klinische dringend nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen en geen belangenconflicten.
Acknowledgments
MG wordt ondersteund door subsidies, K08DK101608 en R03DK111473 van de National Institutes of Health, maart van dubbeltjes Stichting Grant No. 5-FY17-79, het Children's Discovery Institute of Washington University en St. Louis Children's Hospital en de afdeling Kindergeneeskunde aan de Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL wordt ondersteund door R01DK104946 (PI: Silverman), het Children's Discovery Institute of Washington University en St. Louis Children's Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
