Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מערכת התרבות enteroid העכבר neonatal או מוקדמת במעי האדם, כמו גם שיטה יעילה כדי לאסוף חלב עכברים.
Abstract
אדם קטן enteroids מעיים הם נגזרת של כוכים ומכילים כאשר גדל בגומחת תאי גזע כל סוגי תאים אפיתל. ויכולת ליצור אנושי enteroid ex-vivo תרבות מערכות חשובות פתופסיולוגיה מעיים דגם וכדי ללמוד את התגובות הסלולר מסוים מעורב. בשנים האחרונות, enteroids מן בעכברים ובבני אדם להיות מתורבתים, passaged, שהופקד משם לשימוש עתידי במעבדות מספר ברחבי העולם. הפלטפורמה enteroid יכול לשמש כדי לבדוק את ההשפעות של טיפולים ותרופות שונות ואת מה ההשפעות הן המופעל על סוגי תאים שונים במעי. . הנה, פרוטוקול להקמת העיקרי נגזר תאי גזע קטן המעי enteroids נגזר עכברים neonatal, מוקדמת במעי האדם הינו מסופק. יתר על כן, מערכת תרבות זו enteroid היה מנוצל כדי לבחון את ההשפעה של חלב אם ספציפית. חלב אם העכבר ניתן להשיג ביעילות באמצעות משאבה בשד האנושי שונה, ניתן להשתמש בעכבר ביטוי חלב לניסויים מחקר נוסף. כעת נדגים את ההשפעות של העכבר ביטוי, אנושי, התורם חלב על הגדילה ועל התפשטות enteroids נגזר neonatal עכברים או המעי הדק האנושי מוקדמת.
Introduction
דלקת מעי נמקית (NEC) הוא הגורם המוביל למוות ממחלות במערכת העיכול אצל פגים, להשפיע על כמעט 1 ב 10 תינוקות שנולדו לפני 29 שבועות ההיריון1,2,3. חצי של התינוקות עם התקדמות NEC הצורה החמורה ביותר, איפה הישרדות 10-30% רק4,5. בארצות הברית, 2-3 מיליארד USD/שנה משוערת מושקעים בטיפול בתינוקות עם NEC6,7, עדיין לא שיעור ההישרדות ולא טיפול השתנה במשך 30 השנים האחרונות. בפתוגנזה של NEC מאופיין על ידי פגיעה במעיים, ליקויי הרירית המרפא8,9,10,11, עם זאת, המסלולים איתות המובילים החמירה תגובה דלקתית ומנגנונים כדי להפוך את הדלקת נשארים שהיישום מובן.
הממשל של חלב אם אנושי נמצאה להיות האסטרטגיה רק מגן נגד NEC בפגים. אנחנו הראו בעבר כי חלב אם מגן מפני התפתחות NEC באמצעות עיכוב של הקולטן אגרה דמוי קולטן החיסון מולדים 4 (TLR4) של האפיתל במעי באמצעות הקולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR) איתות לשביל11. תוספת של חלב האם על נוסחת NEC ניסיוני attenuated את התגובה דלקתית אצל NEC כפי שמתואר על ידי עיכוב של אפופטוזיס enterocyte ושיקום של התפשטות enterocyte באופן הייתה תלויה גדילה עוריות פקטור (EGF) ו- EGFR11. במחקר אחר, זה הוצג כי טונות, רכיב אחר של חלב אם, תורמת טבעה מגן על ידי להתכוונן זלוף מעיים, לעומת פורמולה, אשר לוקה בחסר חנקתי, עשוי לתרום שכיחות מוגברת של NEC ב הנוסחה האכלת תינוקות12,13. תרכובות אחרות נוכח חלב אם הוכחו להיות מעורב ההגנה נגד NEC כוללים oligosaccharides חלב, L-ארגנין, גלוטמין, לקטופרין14,15,16, 17,18,19. רכיבים אלה מועילות של חלב האם לחשוף את נחיצות השימוש במניעה של NEC, אך גם להדגיש את החשיבות של לימוד המנגנון, איתות המסלולים ואפקטים הסלולר מעורבים כמה חלב היא תיווכה את ההגנה נגד NEC .
סדר כדי להמשיך לחקור תכונות ההגנה של חלב אם במודל של עכברים של NEC, פיתחנו שיטה חדשנית, קל לשימוש על ידי העכבר איזה חלב אם יכול להיות מופק של סכר anesthetized באמצעות חשמל בשד האנושי משאבת11,12 . אסטרטגיה זו של רכישת חלב אם העכבר הוא יתרון, לא רק כי הם השד אנושי משאבות זמינות ולא יעילה על הרכש של חלב אם, אלא גם כי שיטה זו מאפשרת ניתוח חלב השד ספציפית. כתוצאה מכך, אנו יכולים להשוות את ההשפעות של חלב אם העכבר עם אלה של חלב אם אנושי ביטוי כמו גם מפוסטר חלב האדם תורם מבנק חלב במודלים תלויי מין. טכניקה זו מאפשרת לצורך המחקר של רכיבי חלב השד ביחס התרומה שלהם כלפי מניעת NEC. חוקרים אחרים פיתחו שיטות שאיבת חלב השד, לעומת זאת, שיטות אלה נמצאים ידנית, מצריכים בדרך כלל אחד או יותר מעבדה חבר21,20,22. כאן מוצגת טכניקת קל זה יכול להיות מנוצל על ידי שינוי משאבה השד חשמלי אנושי לאסוף חלב מן העכבר. טכניקה זו ניתן להחיל גם למינים אחרים.
לחקור בצורה הולמת את איתות המסלולים מעורב עם NEC, דגם מערכות נדרשים להעריך את כל סוגי תאים שונים ידוע להיות מושפע מתהליך המחלה. כאן נדון אחד כזה מערכת מודל - enteroids - ואת הקמתן של העכבר והמעי הדק אנושי. Enteroids מעיים אנושיים (HIEs) לספק בפרט משמעותי ההבטחה, כי הם מציעים חדשני, מגוונת מבחינה גנטית שמחוץ האנושי מודל לסייע בחקר התהליכים הקשורים pathophysiological המתרחשים במערכת העיכול 23. Enteroids יש כבר מצאו להיות תרבותי לטווח ארוך שיכול להיות קפוא עבור שימוש מאוחר יותר23ו בניגוד האנושי Organoids מעיים (HIOs), אשר תרבויות מפותחות מתאי גזע inducible pluripotent, enteroids נוצרות מתאי גזע בתוך כוכים מעיים מבודד24. Enteroids דורשים תחזוקה פחותה, יכול להיות נגוע במהירות25, ניתן ליצור בקלות מאז כוכים מעיים מובדלים יותר מאשר HIOs23. לכן, HIEs מציעים יתרונות רבים על פני שיטות קיימות כי לפיתוח שהפגינו ספציפיים לאזור ההלחנה ופונקציונליים מאפייני האפיתל אנוש במערכת העיכול23. השימוש enteroids הוא בחירה יעילה ביותר כאשר צריך מודל אנושי של המעי, עם הדבקות ספציפיים לאזור מגבלות וחוסר נוחות השימוש. כאן אנחנו מדגימים את הטכניקה של בידוד ושמירה על ראשי נגזר תאי גזע קטן המעי enteroids עכברים, בפגים אנושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים במחקר זה אושרו על-ידי גם אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס אכפת חיה מוסדיים, שימוש הוועדה (פרוטוקול 20160187) או טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת פיטסבורג, שימוש הוועדה (פרוטוקול 14103918). המעי הדק העובר האנושי-פחות מ 24 שבועות ההיריון הושג בהתאם להנחיות רכש באוניברסיטת פיטסבורג רקמות אנטומיים לאחר אישור ועדה מוסדית (פרוטוקול PRO14100537) מאוניברסיטת פיטסבורג בריאות מדעי בנק עור דרך מערכת מתווכת הוגנת. חלב אם אנושי בטל מזוהה או חלב מפוסטר התורם הושג עם ויתור על הסכמה מן האוניברסיטה של הועד המוסדי פיטסבורג.
1. קריפטה בידוד והקמת Enteroids עכברים Neonatal או המעי הדק האנושי מוקדמת
- הכנה מדיה
הערה: המדיה צריך להיות מוכן בשכונה ביום שלפני קריפטה בידוד.- להכין 1.11 L תרבות המדיה. מתחילים עם 1 ליטר בינוני ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM) עם גלוקוז 4.5 g/L וגלוטמין ולהוסיף 110 מ ל סרום שור עוברית (FBS) (הריכוז הסופי 10%), 11 mL אינסולין סטרילי, פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%), ו- 1.1 mL (סופי בריכוז 0.1%).
- להכין תערובת PBS-אנטיביוטיקה 500 מ"ל. מתחילים עם 500 מ ל 1 x מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) עם 10% FBS ולהוסיף 5 מ"ל גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), 1 מ"ל המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%), ו- 5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%).
- הכנת 30 מ ל תא שיבוש התקשורת #1. להכין תחילה 30 מ ל תרבות המדיה. תוסיף 600 µL 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (הריכוז הסופי 10 מ מ), 300 µL גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), ו- 60 µL המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%).
- הכנת 30 מ ל תא שיבוש התקשורת #2. להכין תחילה 30 מ ל תרבות המדיה. להוסיף 300 EDTA 0.5 M µL (ריכוז סופי 5 מ מ), 300 µL גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), ו- 60 µL המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%).
- להכין 50 מ ל קריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה. למדוד 33.4 מ ל 1 x מתקדם DMEM/F-12 ולהוסיף 10 מ"ל FBS (ריכוז סופי 20%).
- להוסיף 500 µL פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%), 500 µL L-גלוטמין (ריכוז סופי 1%), 500 µL גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), 100 µL המפוטריצין (ריכוז סופי 0.2%), 2.5 µL N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane מ' 1 חומצה sulfonic (HEPES) (ריכוז סופי מ מ 0.05), 500 µL 100 מ מ N-אסטילסיסטיין (ריכוז סופי 1 מ מ), 500 µL 100 x N-2 תוספת 1 מ"ל 50 x תוספת ללא סרום (למשל, B-27) פחות ויטמין A, 500 µL 1 מ מ 100 x Y-27632.
- להכין 1 מ"ל קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה. קודם להכין 1 מ"ל של קריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה. להוסיף 2.5 µL 40 µg/mL Wnt3a (ריכוז סופי 100 ng/mL), 1 µL µg 100/mL הראש (ריכוז סופי 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (ריכוז סופי 500 ng/mL) ו- 0.5 µL 100 µg/mL EGF (ריכוז סופי 50 ng/mL).
- קריפטה בידוד
- המקום solubilized תמצית קרום המרתף (ראה טבלה של חומרים) על הקרח להפשיר לפני תחילתו.
הערה: קרום המרתף לשמור על הקרח או שזה פולימריזציה. - בהתאם בפרוטוקול אכפת לי חיה המוסדית והוועדה לשימוש עבור עכברים גדול מ- 14 ימים של גיל, המתת חסד עכברים עם שתי שיטות של המתת חסד עם השני להיות הליך פיזי כדי להבטיח מוות.
הערה: עבור עכברים מתחת לגיל 14 ימים של גיל, עריפת ראש זה הליך רגיל באמצעות מספריים. - בעזרת מלקחיים ומספריים, עושים חתך אנכי למטה האמצע של הבטן, דרך העור הצפק, עבור לכל אורכה של הבטן. בלו המעי הדק מהקיבה אל המעי עם מספריים ולהסיר את מצע המעי עם מלקחיים.
הערה: בת שבוע שני זכר ונקבה C57BL/6J העכבר הגורים, כל גרם במשקל 5.5-7, שימשו לבידוד הקריפטה. ניתן להשתמש בכל גיל או גודל העכבר לבידוד הקריפטה. - כדי להתכונן המעי הדק שנקטפו זה עתה קריפטה בידוד, מיקום המעי ישר, וחותכים את המעי longitudinally לכל אורכו באמצעות מספריים.
הערה: העכבר והמעי האנושי ניתן להכין באופן דומה. - שרפרף נקי מחוץ המעי ע י ניעור בעדינות המעי הלוך בצלוחית מלא PBS-אנטיביוטיקה תערובת באמצעות מלקחיים.
- להוסיף 30 מ של התא שיבוש התקשורת #1 צינור חרוטי 50 מ. לחתוך את המעי לחתיכות באורך 0.5 ס מ ישירות לתוך הצינור. הגדר את הצינורית בתוך דלי קרח, להתסיס בעדינות על שאכר במהירות הנמוכה ביותר למשך 15 דקות.
- בעוד הרקמות על ניעור, להשיג לוחות 24 או 48-טוב לגדול כוכים אם enteroids כדי לשמש עבור ה-RNA, דנ א או בידוד חלבון. שימוש שקופיות הקאמרית 8-טוב לגדול כוכים אם enteroids כדי לשמש עבור כל הר הדמיה קונפוקלי.
- בשכונה, להוסיף µL 15 של קרום המרתף כל הבאר של צלחת 24 או 48-ובכן. אם משתמש קאמרית שקופיות, להוסיף µL 9 של קרום המרתף לתחתית של כל תא.
הערה: להתאים את עוצמת הקול של קרום המרתף בהתאם לגודל צלחת במידת הצורך. - התפשטה במהירות קרום המרתף עם קצה פיפטה כך קרום המרתף יוצר שכבה דקה בתחתית הבאר. מקם את הצלחת ב 37 ° C בחממה במשך 30 דקות לאפשר קרום המרתף פולימריזציה.
הערה: כוכים לא מייחסים אם קרום המרתף לא שכבה דקה או אם קרום המרתף מכיל בועות אוויר. - לאחר 15 דקות על מטרף, לסנן את הרקמות דרך מסננת 100 מיקרומטר. למחוק את הזרימה.
- להוסיף 30 מ ל תא שיבוש התקשורת #2 צינור חרוטי 50 מ. הסרת רקמת מסננת ומוסיפים הצינור.
- הגדר את הצינורית בתוך דלי קרח, להתסיס בעדינות על שאכר במהירות הנמוכה ביותר למשך 15 דקות.
- לאחר 15 דקות על ניעור, לסנן רקמות דרך מסננת 100 מיקרומטר. תמשיך לזרום דרך בשלב זה, למקרה תשואה נמוכה בשלבים מאוחר יותר.
הערה: כל זרימה דרך צינורות חייב להישמר בקירור. - להוסיף 15 מ"ל DMEM עם גלוקוז 4.5 g/L וגלוטמין צינור חרוטי 50 מ. הסרת רקמת מסננת ומוסיפים הצינור. נמרצות לנער את הצינורית ביד עבור מסנן ס' 10 דרך מסננת 100 מיקרומטר ולאסוף את הזרימה. חזור עד הזרימה מכיל חלקיקים אין.
- בשכונה, לסנן את הזרימה מהשלב הקודם לתוך חדש 50 מ ל חרוט צינור באמצעות מיקרומטר 70 strainers העכבר רקמות או strainers 100 מיקרומטר עבור רקמה אנושית.
הערה: יש נוספת strainers בכוננות, שופכים לאט כמו strainers יסתום עם פסולת. - Centrifuge את הצינור ב- g 200 x עבור 8 דקות 4 ° C ובמקום ישירות בתוך דלי קרח בשכונה. להסיר את תגובת שיקוע בעזרת פיפטה מבלי להפריע בגדר. Resuspend גלולה עם הסכום הרצוי של קריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה.
הערה: כוכים מועשר הם השכבה 'חולית' של בגדר. כל טוב דורשת 250 µL של קריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה.
- המקום solubilized תמצית קרום המרתף (ראה טבלה של חומרים) על הקרח להפשיר לפני תחילתו.
- הקמת enteroids
- צלחת את התערובת התקשורת התת-קרקעי ישירות על קרום המרתף.
- בדוק כוכים עם מיקרוסקופ כדי להבטיח בתהליך בידוד היה מוצלח.
הערה: כדורים של תאים והתאים הם הרצויה. כ-100 כוכים בודדים הם מצופה לכל טוב. - דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות לאפשר כוכים לדבוק קרום המרתף.
הערה: הדגירה הזה הוא עם הקריפטה תרבות המדיה ללא גורמי גדילה. - אט-אט להסיר את התקשורת עודף כוכים נכשל לצרף באמצעות פיפטה P-200.
הערה: נא לא להפריע קרום המרתף כפי יכול להפוך ניתק את כוכים המצורפת. - לאט לאט להוסיף 250 µL של קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה כל טוב.
הערה: עבור 24-, צלחות 48-ובכן, או חדר שקופיות, 250 µL של קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה מספיקה. - להחליף את המדיה כל יומיים עם טרי קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה במשך 5 ימים לפני טיפולים כדי לאפשר החזקה אופטימלית וצמיחה.
2. העכבר השד חלב אוסף
- להפריד סכר C57BL/6J מניקות לאחר לידה 7-12 ימים הגורים שלה במשך 6 שעות לפני חליבה.
- עזים ומתנגד הסכר מניקות עם איזופלוריין באמצעות קונוס האף ולפקח זריקה תת עורית של אוקסיטוצין-0.15 IU/ק"ג משקל גוף. להמתין 3 דקות לפני מנסה לחלוב את ההליך.
- לנקות עטינים עם 70% אתנול לפני חליבה הליך ותנו יבש.
- שואבים חלב עטינים של אחד בכל פעם באמצעות משאבת השד אנושי חשמלי עם צינורות סיליקון בגודל שיתאים עטינים של העכבר לתוך צינור אוסף 5 מ.
הערה: משאבות לשדיים אופטימלי יש שתי הגדרות, עבור מהירות ועוד אחד בשביל שאיבה. עדיף להתחיל עם ההגדרות הנמוך של כל אחד ולהגדיל שניהם לאט עד החלב מופק. באופן אידיאלי, התשואה הכולל יהיה ~ µL 500 - 1 מ"ל חלב אם העכבר לכל סכר מניקות. - חלב אם מיד aliquot וחנות ב-80 מעלות צלזיוס.
הערה: להימנע ההקפאה/ההפשרה מחזורים. - לטפל enteroids ביום 5 עם µL 50/מ"ל חלב אם העכבר לכל mL קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס.
3. כל הר צביעה של Enteroids
-
הכנה של ריאגנטים
- להכין PBS 1 x 16 מ"ל לכל 8 בארות.
- להכין 2 מ ל 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS x 1 לכל 8 בארות.
- להכין 2 מ ל 0.1% טריטון X-100 ב 1 x PBS לכל 8 בארות.
- להכין 24 mL PBS Tween (PBST הוא 0.1% Tween 20 x 1 ב PBS) לכל 8 בארות.
- להכין 2 מ ל 10% חמור נורמלית בסרום (NDS) ב- 0.1% PBST (10% NDS/PBST) לכל 8 בארות.
- להכין 4 מ ל 1% NDS ב- 0.1% PBST (1% NDS/PBST) לכל 8 בארות.
-
צביעת יום 1
- וארוקן את טיפולי ולשטוף enteroids עם PBS. הוסף 250 µL 4% מחברים לכל טוב. מניחים על מסובב עבור h 1-2-4 מעלות צלזיוס. להסיר 4% מחברים עם פיפטה.
- תשטוף 4 פעמים עם µL 250/1 טוב x PBS. מניחים על מסובב 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
הערה: זה אפשרי לאחסון צלחת ימים 1-2-4 ° C, במידת הצורך. - להוסיף 250 µL/טוב 0.1% טריטון X-100. תקופת דגירה של h 1 הסר RT. 0.1% טריטון X-100 עם פיפטה.
- תשטוף 4 פעמים עם µL 250/1 טוב x PBS. מניחים על מסובב למשך 15 דקות ב- RT.
- מוסיפים 250 µL/טוב 10% NDS/PBST. תקופת דגירה של 45 min-הסר RT. 10% NDS/PBST עם פיפטה.
- להוסיף 250 נוגדן ראשוני µL/טוב, מדולל 1/250 ב 1% NDS/PBST, וכן דגירה בין לילה ב 4 º C.
הערה: דילול נוגדן האופטימלי משתנה בהתאם ליצרן.
-
צביעת יום 2
- רחץ לפחות 5 פעמים במשך 4-5 קמ"ש עם µL 250/PBST טוב. מניחים על מסובב ב 4 ° C בין כל כביסה.
- מוסיפים נוגדן µL/טוב משני 250, מדולל 1/1000 ב 1% NDS/PBST. לעטוף את הצלחת בנייר, דגירה בין לילה ב 4 º C.
-
צביעת יום 3
- להוסיף גרעיני µL/טוב 250 כתם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) למשך 15 דקות.
הערה: להחזיק את הצלחת בחשכה. - לשטוף 6 פעמים עם µL 250/PBST טוב. מניחים על מסובב 10 דקות ב 4 ° C בין כל כביסה.
- הר coverslip-הקאמרית שקופיות עם טעינת מדיה.
- תמונות עם 40 X מיקרוסקופ קונפוקלי אובייקטיבית ועיבוד באותה מידה בעורך גרפיקה רסטר (ראה טבלה של חומרים).
- להוסיף גרעיני µL/טוב 250 כתם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) למשך 15 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תחילה חיפשנו לחקור אם הביע האדם חלב או חלב מפוסטר התורם היה השפעה על enteroids במעיים קטן. אכן, חלב אם אנושי, התורם חלב מוגברת הצמיחה של העכבר neonatal (איור 1 א'), enteroids מוקדמת האדם נגזרת (איור 1B).
מאז חלב אם אנושי מוגברת הצמיחה של קטן enteroids מעיים, הבא חקרנו אם חלב אם הייתה השפעה על ההתפשטות של enteroids האנושי מוקדמת. נדגים כי חלב אם אנושי מגביר את התפשטות מוקדמת enteroids האנושי לעומת שליטה (איור 2 א–B, Ki67, כתמים אדומים). חשוב, חלב אם התורם האנושי גדל גם התפשטות enteroid לעומת שליטה, אך פחותה מעט חלב אם אנושי שאינו מפוסטר (איור 2B–C). אנחנו הבא להעריך את הביטוי Ki67 mRNA ב enteroids האנושית מוקדמת וגילה כי Ki67 היה גדל ב- enteroids מטופלים עם חלב או חלב אם התורם באופן יחסי שליטה (איור דו-ממדי).
הבא רצינו לראות אם תופעות אלה ספציפית לגבי חלב אם. פיתחנו דרך איסוף חלב מניקות עכברים באמצעות משאבה זמינים מסחרית בשד האנושי שונה כמו הפניות11,12. מתואר היא סכר מניקות anesthetized שעברו אוסף חלב באמצעות מכשיר זה (איור 3). הסדרה הבאה של הניסויים בוצעה enteroids העכבר, הערכנו את ההשפעות התפשטות של חלב אם ביטוי של חלב אם העכבר, האדם או תורם. כפי שמוצג באיור4, עכבר, אדם, התורם מפוסטר השד חלב מוגברת התפשטות ב enteroids העכבר לעומת שליטה (איור 4A–D). התפשטות ב enteroids העכבר היה ירד בנוכחות ליגנד TLR4, ליפופוליסכריד (LPS), לעומת שליטה (איור 4A, E). חשוב לציין, עכבר, אדם או תורם השד חלב כל שוחזר enteroid התפשטות בנוכחות LPS כפי שמתואר על ידי צביעת Ki67 מוגבר לעומת LPS לבד (איור 4F–H).
מן הניסויים שלנו, אנו מראים כי enteroids במעיים קטן נגזר עכברים neonatal, מוקדמת המעי העובר האנושי יכול להישמר בתרבות. אנו מספקים עוד שיטה אוסף חלב שד מספק דרך יעילה להוציא חלב אם עכברים, אשר יכול לשמש לניסויים שונים. גילינו כי חלב אם ביטוי של בני אדם או עכברים גדל את גודל, צמיחה והתפשטות העכבר, enteroids האנושית. יתר על כן, חלב אם העכבר, אנושי, ולא תורם משוחזר התפשטות enteroid לאחר חשיפה LPS. הדבר מצביע על כי חלב אם יכול להפעיל השפעות אנטי דלקתיות על המעי הדק בעכברים ובבני אדם.
איור 1. חלב, חלב אם התורם להגדיל את גודל ואת הצמיחה של העכבר מוקדמת enteroids אנושי. Photomicrographs של enteroids במעיים קטן מ neonatal עכברים (p14) או במעי האדם מוקדמת שטופלו מדיה (בקרה), חלב או חלב אם התורם (50 µL/mL) עבור ה 24 גודל בר: 1,000 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר מזה איור-
באיור 2. חלב, חלב אם התורם להגדיל את התפשטות מוקדמת enteroids אנושי. (א) micrographs קונאפוקלית של מוקדמת enteroids האנושי תרבותי עבור 5 ימים, מטופלים עם חלב אם אנושי, חלב מפוסטר התורם במשך 24 שעות ביממה, מוכתם דה מרקר התפשטות Ki67 (אדום) ודאפי (גרעיני, כחול). גודל בר: 50 מיקרומטר. (B) לרביעיית-PCR Ki67 ביטוי של enteroids האנושי ביחס הגן משק בית RPLO. n = 5 לכל קבוצה. p < 0.0001 השוואות עם התלמיד במבחן t לעומת שליטה. הנתונים הם הממוצע ± סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. אוסף של חלב העכבר anesthetized באמצעות משאבה השד אנושי שונה. אבובים משאבת השד אנושי סטרילי להנחה על הפטמות של מרדימים סכר מניקות לאחר קבלת הזרקת אוקסיטוצין. העכבר החלב נאסף באמצעות המשאבה השד אנושי על כוח ומהירות בינונית לתוך צינור אוסף 5 מ. אמצעי אחסון קולקטיבית שחולצו מן כל הפטמות נעות בין 500 µL 1 מ"ל לכל העכבר כמחנכת ימים 7-12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. עכבר, אנושי, ולשפר את חלב מפוסטר התורם התפשטות enteroid העכבר. (א-ה) Micrographs קונאפוקלית של p14 העכבר במעיים קטן enteroids (פקד, A) מטופלים עם חלב אם העכבר (MBM, B), חלב אם אנושי (מוניטור, C), או חלב אם התורם אנושי (DBM, יח)-µL/mL 50 של מדיה עבור 12 שעות בהיעדר ( A-D) או נוכחות של ליפופוליסכריד (LPS) במינון של 25 µg/mL של מדיה במשך 12 שעות, (E-H), מיטה עבור הפצת סמן Ki67 (אדום) ודאפי (גרעיני, כחול). גודל בר: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האפיתל במעי מורכב יחוברו הסלולר רבים אחראים למתן מארח הגנה מפני פתוגנים, שמירה על שלמות מחסום המעיים, ואני יכול להפרץ בפתוגנזה של כמה מחלות. בעוד מודלים בעלי חיים יכולים לסכם כמה היבטים של המחלה, הדגם ex-vivo של enteroids נגזר מן המעי הדק בעכברים ובבני אדם מספק פלטפורמה כדי לבדוק את ההשפעות של טיפולים שונים. המשמעות של דגם enteroid מאפשר לחוקרים תרבות, להבדיל מעיים תאי גזע לתוך כל סוגי תאי אפיתל תמים או חולה בבעלי חיים ובבני אדם שאינם זמינים עם שיטות קיימות. מערכת מודל זה יכול לשמש עבור זיהומים עם פתוגנים אנושי זה ייתכן כי לא ניתן לתרגם בקלות לתוך העכבר, כגון שכל25 או norovirus26 בין היתר. המודל enteroid יש מספר יתרונות, שימושים; עם זאת, יש לנקוט כדי להבטיח עקביות ריאגנטים המשמשים כדי להפוך את התקשורת של גורמי צמיחה אקסוגני ספציפיים הנדרשים עבור ההישרדות של enteroids.
המודל enteroid, מספר שלבים בהישג חשיבות קריטית כדי להבטיח הצלחה בהפקת enteroids. כדי לצמצם את זמן איסכמי קר, רקמות תעובד expediently. Enteroids עלולה להיווצר עד 24 שעות לאחר הרקמה האיסוף אם הרקמה ממוקם המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) בינוני-4 מעלות צלזיוס. זה יכול להקל על האפשרות של משלוח או תחבורה במידת הצורך. הקמת enteroids, קרום המרתף חייב להיות שכבה שטוח דק, בחלק התחתון של כל טוב כוכים לצרף ולגדול. אם קרום המרתף אינו שטוח או יש בועות הנוכחי, כוכים עלול להיכשל לדבוק והאם ניתן להסיר כאשר המדיה משתנה. לאחר enteroids מבוססים, הם עשויים להיות passaged כל 7 ימים או קפוא חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. הסרת, תוספת של קריפטה תרבות המדיה עם גורמי גדילה, את הניהול של כל טיפול חייב להתבצע לאט, עד לקצה בכל טוב כדי להמנע מטריד את enteroids. שיבוש enteroids יכול לגרום להם להיות מנותק, שטף המדיה משתנה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להקפיד כדי לשמור על השלמות של קרום המרתף, את enteroids המצורף.
במחקר הנוכחי, מדווחים כי enteroids נגזר עכברים neonatal, בפגים יכול לגדול, להתרבות בנוכחות סוגים שונים של חלב אם. מחקרים אלה לקדם את ההבנה שלנו של ההשפעות של חלב האם על המעי מוקדמת. אנו מספקים שיטה מפורטת כיצד להקים enteroid תרבויות במעבדה של בני אדם ועכברים. בנוסף, נדגים שיטה יעילה של איסוף חלב מעכבר מניקות באמצעות משאבה ששונה בשד האנושי חשמלי. חלב אם אנושי, מפוסטר התורם אנו מראים את העכבר! הזה, לשפר את הצמיחה ואת התפשטות enteroids מ בעכברים ובבני אדם. בנוסף, אנו מראים ירידה enteroid התפשטות בנוכחות ליגנד TLR4 LPS, אשר שוחזר כאשר חלב אם עכבר, האדם או תורם ערכנו את enteroids. יישומים עתידיים עשויים לכלול דיוק אישית ברפואה עם תפוקה גבוהה סמים מסכי ענק enteroids המתקבל תינוקות לאחר כריתה מעיים כדי לראות כיצד תרופות מסוימות יכולות להשפיע על התינוק המסוים. יחדיו אנו מקווים מעבדות אחרות תוכלו למצוא הצלחה פוטנציאל ניצול אלה טכניקות של ממלכות שונות רבות של ילדים מחלות של המעי, כולל NEC, בו יש צורך קליני דחוף לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין מה לגלות שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
MG נתמך על ידי מענקים K08DK101608 ו- R03DK111473 חולים מכוני הבריאות הלאומיים, מרץ של מטבעות קרן מענק מס 5-FY17-79, הילדים גילוי מכון וושינגטון אוניברסיטת וילדים בסנט לואיס, המחלקה לרפואת ילדים בבית באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה, סנט לואיס. האירו נתמך על-ידי R01DK104946 (PI: סילברמן), סנט לואיס לילדים ואוניברסיטת גילוי מכון וושינגטון של הילדים החולים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
