Summary
Denne protokollen beskriver hvordan du oppretter en enteroid kultur-systemet fra neonatal mus eller tidlig menneskelige tarmen samt effektiv metode å samle melk fra mus.
Abstract
Menneskelige liten intestinal enteroids er avledet fra krypten og når dyrket i en stilk cellen nisje inneholder alle tarmepitelet. Muligheten til å etablere menneskelige enteroid ex vivo kultur systemer er viktig modell intestinal patofysiologi og studere bestemt mobilnettet svarene involvert. De siste årene, er enteroids fra mus og mennesker blir kultivert, passaged og banked bort for fremtidig bruk i flere laboratorier over hele verden. Denne enteroid-plattformen kan brukes til å teste effekten av ulike behandlinger og medisiner og hvilke effekter er legges på ulike celletyper i tarmen. Her en protokoll for å etablere primære Stamcelle-avledet liten intestinal enteroids avledet fra neonatal mus og tidlig menneskelige tarmen er gitt. Dessuten, denne enteroid kultur-systemet ble benyttet for å teste effekten av artsspesifikke morsmelk. Musen morsmelk kan fås effektivt ved hjelp av en modifisert menneskelig brystpumpe og uttrykte musen melk kan brukes for videre forskning eksperimenter. Vi nå viser effekten av uttrykt mus, menneskelig, og donor morsmelk på vekst og spredning av enteroids avledet fra neonatal mus eller tidlig menneskelige tynntarmen.
Introduction
Nekrotiserende enterokolitt er (NEC) den ledende dødsårsaken fra gastrointestinal sykdom i premature barn, påvirker nesten 1 av 10 barn født før 29 uker svangerskapet1,2,3. Halvparten av spedbarn NEC fremdrift til alvorligste skjemaet hvor overlevelse er bare 10-30%4,5. I USA, en anslagsvis 2-3 milliarder dollar/år er brukt til å behandle spedbarn med NEC6,7, men verken overlevelse eller terapi har endret seg over de siste 30 årene. Patogenesen av NEC er preget av intestinal skade og svekket mucosal healing8,9,10,11, men signalveier fører til en forsterket inflammatorisk respons og mekanismer for å reversere betennelse fortsatt ufullstendig forstått.
Administrasjon av morsmelk er funnet for å være bare beskyttende strategien mot NEC for premature barn. Vi har tidligere vist at morsmelk beskytter mot NEC utvikling gjennom hemming av den medfødte immunsystemet reseptor toll-like reseptoren 4 (TLR4) i intestinal epitel via epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) signalering veien11. Tilskudd av brystmelk til en eksperimentell NEC formel dempes betennelsesreaksjon i NEC som demonstrert av hemming av enterocyte apoptose og restaurering av enterocyte spredning på en måte som var avhengig av epidermal vekst faktor (EGF) og EGFR11. I en annen studie, ble det vist som nitrate, en annen komponent i morsmelk, bidrar til sin beskyttende natur av modulerende intestinal perfusjon, i forhold til morsmelkerstatning, som mangler nitrat og kan bidra til den økte frekvensen av NEC i formelen matet spedbarn12,13. Andre forbindelser i morsmelk som har vist seg å være involvert i beskyttelse mot NEC inkluderer morsmelk oligosaccharides, L-arginin, glutamin og Laktoferrin14,15,16, 17,18,19. Disse gunstige elementer av brystmelk avsløre nødvendigheten av dens bruk i forebygging av NEC, men også vekt på å studere mekanismer, signalisering pathways og cellular effekter involvert på hvordan morsmelk er formidling av beskyttelse mot NEC .
For videre studier av beskyttende egenskaper av brystmelk i en musemodell av NEC, vi utviklet en roman, brukervennlig teknikk av hvilke musen morsmelk kan hentes fra en bedøvet dam ved hjelp av en elektrisk menneskelig bryst pumpe11,12 . Denne strategien for musen morsmelk er fordelaktig, ikke bare fordi menneskelig brystpumper er lett tilgjengelig og effektiv i innkjøp av morsmelk, men også fordi denne metoden tillater artsspesifikke bryst melk analyser. Som et resultat vi kan sammenligne effekten av musen morsmelk med de uttrykte morsmelk som pasteurisert menneskelige donor melk fra melk bank i artsspesifikke modeller. Denne teknikken tillater for studier av bryst melk komponenter i forhold til deres bidrag til NEC forebygging. Andre etterforskere har utviklet bryst melk utvinning metoder, men disse teknikkene er manuelle og vanligvis krever flere lab medlem20,21,22. Her vises en enkel teknikk som kan benyttes ved å endre en menneskelig elektrisk brystpumpe å samle melk fra en mus. Denne teknikken kan også brukes til andre arter.
For å tilstrekkelig avhøre signalveier involvert med NEC, for modellere systemer å vurdere alle de ulike celletyper kjent påvirkes i sykdommen prosessen. Her diskuterer vi en slik modellsystem - enteroids- og sin etablering fra mus og menneskelige tynntarmen. Menneskelige intestinal enteroids (HIEs) gi spesielt betydelig løfte, fordi de tilbyr en nyskapende, genetisk ulike ex vivo menneskelige modellen som hjelp til å studere patofysiologiske prosesser som finner sted i fordøyelsessystemet 23. Enteroids har blitt funnet for å kultivert langsiktig og kan fryses for senere bruk23, og i motsetning til menneskelige Intestinal Organoids (HIOs), der kulturer er utviklet fra induserbart pluripotent stamceller, enteroids genereres fra stamceller i isolerte intestinal Krypter24. Enteroids krever mindre vedlikehold, kan være infisert raskt25, og kan etableres lett siden intestinal crypts er mer forskjelligartet enn HIOs23. Derfor tilbyr HIEs mange fordeler over eksisterende teknikkene fordi de kan være utviklet for å viser områdespesifikk komposisjonelle og funksjonelle egenskapene i den menneskelige mage epitel23. Bruk av enteroids er en svært effektiv valg når behov for en menneskelig modell av tarmen, med tilslutning til region-spesifikke begrensninger og lette-av-bruk. Her viser vi teknikken for isolering og opprettholde primære Stamcelle-avledet liten intestinal enteroids fra mus og tidlig menneskelige spedbarn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer i denne studien ble godkjent av enten Washington University i St. Louis institusjonelle Animal Care og bruk Committee (protokollen 20160187) eller University of Pittsburgh institusjonelle dyr omsorg og bruk Committee (protokollen 14103918). Menneskelige fosterets tynntarmen på mindre enn 24-uke svangerskapet ble innhentet i henhold til University of Pittsburgh anatomiske vev innkjøp veiledning etter institusjonelle Review Board godkjenning (protocol PRO14100537) fra Universitetet i Pittsburgh Health Sciences vev Bank gjennom en ærlig megler. De identifiserte morsmelk eller pasteurisert donor morsmelk ble oppnådd med fraskrivelse av samtykke fra University of Pittsburgh institusjonelle Review Board.
1. krypten isolasjon og etablering av Enteroids fra Neonatal mus eller tidlig menneskelige tynntarmen
- Media forberedelse
Merk: Media bør være forberedt i panseret dagen før krypten isolasjon.- Forberede 1.11 L kultur medier. Begynner med 1 L Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) med 4,5 finans glukose og L-glutamin og legge til 110 mL fosterets Bovine Serum (FBS) (siste konsentrasjon 10%), 11 mL Penicillin-Streptomycin (siste konsentrasjon 1%) og 1.1 mL steril insulin (endelig konsentrasjon 0,1%).
- Forbered 500 mL PBS-antibiotikaresistens blanding. Begynne med 500 mL 1 x Dulbeccos fosfat-bufret saltvann (DPBS) med 10% FBS og legge 5 mL Gentamicin (siste konsentrasjon 1%), 1 mL amfotericin B (siste konsentrasjon 0,2%), og 5 mL Penicillin-Streptomycin (siste konsentrasjon 1%).
- Forberede 30 mL celle avbrudd medier #1. Først forberede 30 mL kultur medier. Legge til 600 µL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) (siste konsentrasjon 10 mM), 300 µL Gentamicin (siste konsentrasjon 1%) og 60 µL amfotericin B (siste konsentrasjon 0,2%).
- Forberede 30 mL celle avbrudd Media #2. Først forberede 30 mL kultur medier. Legge til 300 µL 0,5 M EDTA (siste konsentrasjon 5 mM), 300 µL Gentamicin (siste konsentrasjon 1%) og 60 µL amfotericin B (siste konsentrasjon 0,2%).
- Forberede 50 mL krypten kultur medier uten vekstfaktorer. Måle 33.4 mL 1 x avansert DMEM/F-12 og tilsett 10 mL FBS (siste konsentrasjon 20%).
- Legge til 500 µL Penicillin-Streptomycin (siste konsentrasjon 1%), 500 µL L-glutamin (siste konsentrasjon 1%), 500 µL Gentamicin (siste konsentrasjon 1%), 100 µL amfotericin B (siste konsentrasjon 0,2%), 2,5 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonsyre (HEPES) (siste konsentrasjon 0.05 mM), 500 µL 100 mM N-Acetylcysteine (siste konsentrasjon 1 mM), 500 µL 100 x N-2 supplement, 1 mL 50 x serum-free supplement (f.eksB-27) minus Vitamin A og 500 µL 1 mM 100 x Y-27632.
- Forberede 1 mL krypten kultur medier med vekstfaktorer. Først forberede 1 mL av Crypt kultur medier uten vekstfaktorer. Legge til 2,5 µL 40 µg/mL Wnt3a (siste konsentrasjon 100 ng/mL), 1 µL 100 µg/mL Noggin (siste konsentrasjon 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (siste konsentrasjon 500 ng/mL) og 0,5 µL 100 µg/mL EGF (siste konsentrasjon 50 ng/mL).
- Krypten isolasjon
- Sted solubilized kjelleren membran ekstrakt (se Tabell for materiale) på is å tine før du begynner.
Merk: Holde kjelleren membran på is, eller det vil danner. - I henhold til institusjonelle Animal Care og bruk komiteen protokollen for mus større enn 14 dager gammel, euthanize mus med to metoder for eutanasi med andre blir en fysisk prosedyre å sikre død.
Merk: For mus under 14 dager gammel, halshogging er standard prosedyre ved hjelp av saks. - Bruke saks og tang, lage en loddrett snitt ned midtlinjen på magen, gjennom huden og peritoneum, for hele lengden av magen. Avgiftsdirektoratet tynntarmen fra magen til cecum med saks og fjerne mesentery med tang.
Merk: To-uke-gamle mannlige og kvinnelige C57BL/6J musen pups, hver veiing 5.5-7 g, ble brukt til krypten isolasjon. Noen alder eller størrelse musen kan brukes for krypten isolasjon. - For å forberede nylig høstet tynntarmen krypten isolasjon, plasserer tarmen rett og kutte tarmen langs langs hele lengden ved hjelp av saks.
Merk: Mus og menneskelige tarmen kan tilberedes på samme måte. - Ren krakk av tarmen av forsiktig risting tarmen og tilbake i en PBS-antibiotikaresistens blanding-fylt Petriskål ved hjelp av pinsett.
- Legge til 30 mL av celle avbrudd medier #1 i en 50 mL konisk rør. Skjær tarmen i 0,5 cm lengde stykker direkte inn i røret. Sett røret i en isen bøtte og forsiktig røre på shaker laveste hastigheten i 15 min.
- Mens vev på shaker, få 24 - eller 48-godt plater å vokse Krypter hvis enteroids som skal brukes for RNA og DNA protein isolasjon. Bruk 8-vel kammer lysbilder å vokse Krypter hvis enteroids som skal brukes for hele montere AC confocal bildebehandling.
- Legg 15 µL av kjelleren membran i panseret, til bunnen av hver brønn av 24 - eller 48-godt plate. Hvis bruker kammer lysbilder, legge 9 µL av kjelleren membran nederst på hvert kammer.
Merk: Justere volumet av kjelleren membran avhengig av platen hvis nødvendig. - Raskt spre kjelleren membranen pipette spissen slik at kjelleren membranen danner et tynt lag på bunnen av brønnen. Plass platen på 37 ° C i inkubator for 30 min å tillate kjelleren membranen til danner.
Merk: Crypts vil ikke legge hvis kjelleren membranen ikke er et tynt lag eller hvis kjelleren membran inneholder luftbobler. - Etter 15 min på en shaker, filtrere vev gjennom en 100 µm sil. Kast flyten gjennom.
- Legge til 30 mL celle avbrudd Media #2 en ny 50 mL konisk tube. Fjern vev fra sil og legge til røret.
- Sett røret i en isen bøtte og forsiktig røre på shaker laveste hastigheten i 15 min.
- Etter 15 min på shaker, filtrere vev gjennom en 100 µm sil. Hold strømme gjennom på dette trinnet i tilfelle avkastningen er lav i senere trinn.
Merk: Alle strømmer gjennom rør må holdes på is. - Legge 15 mL DMEM med 4,5 finans glukose og L-glutamin til en ny 50 mL konisk tube. Fjern vev fra sil og legge til røret. Kraftig riste røret manuelt 10 s. filteret gjennom en 100 µm sil og samle strømme gjennom. Gjenta til strømme gjennom inneholder ingen partikler.
- I panseret, filtrere flyten gjennom i forrige i en ny 50 mL konisk tube med 70 µm siler for musen vev eller 100 µm siler for menneskelig vev.
Merk: Har ekstra siler på standby, og hell sakte som siler vil tette med rusk. - Sentrifuge røret på 200 x g i 8 min 4 ° C og sted direkte i en isen bøtte i panseret. Fjerne nedbryting av pipette uten å forstyrre pellet. Resuspend pellets med ønsket totalbeløpet av Crypt kultur medier uten vekstfaktorer.
Merk: Beriket crypts er "sand" laget av pellet. Hver krever også 250 µL av Crypt kultur medier uten vekstfaktorer.
- Sted solubilized kjelleren membran ekstrakt (se Tabell for materiale) på is å tine før du begynner.
- Etablering av enteroids
- Plate krypten media blandingen på kjeller membranen.
- Sjekk Krypter med et mikroskop for å sikre isolasjon prosessen var vellykket.
Merk: Celler og baller av celler er ønsket. Omtrent 100 personlige crypts er belagt per brønn. - Inkuber platen på 37 ° C 3 h å tillate Krypter overholder kjelleren membranen.
Merk: Denne inkubasjon er med krypten kultur medier uten vekstfaktorer. - Fjern sakte media og overflødig crypts som kunne legges ved en P-200 pipette.
Merk: Ikke forstyrr kjelleren membranen som vedlagte crypts kan bli forskyves. - Sakte legge til 250 µL av Crypt kultur medier med vekstfaktorer i hver brønn.
Merk: For 24-48-vel plater eller kammer lysbilder, 250 µL av Crypt kultur medier med vekstfaktorer er tilstrekkelig. - Erstatte media hver 2 dager med fersk krypten kultur medier med vekstfaktorer i 5 dager før behandlinger for optimal vedlegg og vekst.
2. musen bryst melk samling
- Skille C57BL/6J ammende demningen postpartum 7-12 dager fra pups 6 h før melking.
- Bedøve ammende dammen med isoflurane via en nesen kjegle og administrere en subcutaneous injeksjon av oxytocin på 0,15 IU/kg kroppsvekt. Vent 3 min før melking prosedyren.
- Rengjør smokker med 70% etanol før melking prosedyre og la tørke.
- Pakke melk fra spenene en samtidig med en elektrisk menneskelig brystpumpe med silikon rør tilpasset musen smokker i en 5 mL samling rør.
Merk: Optimal brystpumper har to innstillinger for hastighet og for sugekraft. Det er best å starte med de laveste innstillingene hver og øke både sakte til melk er utdraget. Ideelt sett totale avkastning blir ~ 500 µL - 1 mL av musen morsmelk per ammende dam. - Umiddelbart aliquot morsmelk og butikk på-80 ° C.
Merk: Unngå fryse/tine sykluser. - Behandle enteroids på dag 5 med 50 µL/mL av musen brystmelk per mL av Crypt kultur medier med vekstfaktorer 24 h på 37 ° C.
3. hele montere farging av Enteroids
-
Forberedelse av reagenser
- Forberede 16 mL 1 x PBS per 8 brønner.
- Forberede 2 mL 4% paraformaldehyde (PFA) i 1 x PBS per 8 brønner.
- Forberede 2 mL 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS per 8 brønner.
- Forberede 24 mL PBS Tween (PBST er 0,1% mellom 20 i 1 x PBS) per 8 brønner.
- Forberede 2 mL 10% normal esel serum (NDS) på 0,1% PBST (10% NDS/PBST) per 8 brønner.
- Forberede 4 mL 1% NDS på 0,1% PBST (1% NDS/PBST) per 8 brønner.
-
Farging dag 1
- Sug opp av behandlinger og vask enteroids med PBS. Legge til 250 µL 4% PFA per brønn. Plasser på omdreiende for 1-2 h på 4 ° C. Fjerne 4% PFA med pipette.
- Vask 4 ganger med 250 µL/vel 1 x PBS. Plasser på omdreiende for 10 min ved romtemperatur (RT).
Merk: Det er mulig å lagre plate for 1-2 dager på 4 ° C om nødvendig. - Legge til 250 µL/vel 0,1% Triton X-100. Inkuber 1t på rett fjerne 0,1% Triton X-100 med pipetter.
- Vask 4 ganger med 250 µL/vel 1 x PBS. Plasser på rotator i 15 min på RT.
- Legge til 250 µL/vel 10% NDS/PBST. Inkuber for 45 min på rett fjerne 10% NDS/PBST med pipetter.
- Legge til 250 µL/vel primære antistoff, utvannet 1/250 i 1% NDS/PBST, og ruge over natten på 4 ° C.
Merk: Den optimale antistoff fortynning varierer avhengig av produsenten.
-
Farging dag 2
- Vask 5 ganger for 4-5 h med 250 µL/godt PBST. Plasser på rotator på 4 ° C mellom hver vask.
- Legge til 250 µL/vel sekundære antistoff, utvannet 1/1000 i 1% NDS/PBST. Pakk platen i folie og ruge over natten på 4 ° C.
-
Farging dag 3
- Legge til 250 µL/vel kjernefysiske flekken 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i 15 min.
Merk: Holde platen i mørket. - Vask 6 ganger med 250 µL/godt PBST. Plasser på omdreiende for 10 min på 4 ° C mellom hver vask.
- Mount dekkglassvæske på chamber lysbilde med montering media.
- Ta bilder med en 40 X objektive AC confocal mikroskop og like gjengis i en rastergrafikk redaktør (se Tabell for materiale).
- Legge til 250 µL/vel kjernefysiske flekken 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i 15 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi først forsøkte å undersøke uttrykte morsmelk eller pasteurisert donor morsmelk hadde en effekt på små intestinal enteroids. Faktisk økt morsmelk og donor morsmelk vekst av neonatal mus (figur 1A) og tidlig menneskelige avledede enteroids (figur 1B).
Siden morsmelk økt veksten av små intestinal enteroids, undersøkt vi neste om morsmelk hadde en effekt på spredning tidlig menneskelige enteroids. Vi viser at morsmelk øker spredning tidlig menneskelige enteroids sammenlignet med kontroll (figur 2A-B, Ki67, røde flekker). Viktigere, økt menneskelige donor morsmelk også enteroid spredning forhold kontroll, men litt mindre grad enn ikke-pasteurisert morsmelk (figur 2B-C). Vi deretter evalueres Ki67 mRNA uttrykket i tidlig menneskelig enteroids og oppdaget at Ki67 ble økt i enteroids behandlet med morsmelk eller donor morsmelk forhold til kontrollen (figur 2D).
Neste ønsket vi å se om disse effektene var artsspesifikke med hensyn til morsmelk. Vi utviklet en måte å samle morsmelk fra ammende mus med en modifisert kommersielt tilgjengelig menneskelig brystpumpe som referanser11,12. Avbildet en bedøvet ammende dam gjennomgår melk samling bruker denne enheten (Figur 3). Den neste rekke eksperimenter ble utført på mus enteroids og vi vurdert spredning effekten av uttrykte morsmelk fra enten mus, menneskelige eller donor morsmelk. Som vist i Figur 4, mus, menneskelige og pasteurisert donor brystmelken økt spredning i mus enteroids i forhold til kontroll (figur 4A-D). Spredning i musen enteroids ble redusert i nærvær av TLR4 ligand, lipopolysakkarid (LPS), sammenlignet med kontrollen (figur 4A, E). Viktigere, mus, menneskelige eller donor bryst melk alle restaurert enteroid spredning i nærvær av LPS som demonstrert av økt Ki67 flekker forhold til LPS alene (figur 4F-H).
Fra våre eksperimenter viser vi at små intestinal enteroids avledet fra neonatal mus og tidlig menneskelige fosterets tarmen kan opprettholdes i kultur. Videre tilbyr vi en roman bryst melk samling metode som gir en effektiv måte å trekke ut brystmelk fra mus, som kan brukes for ulike eksperimenter. Vi oppdaget at uttrykte morsmelk mennesker eller mus økt størrelse, vekst og spredning i musen og menneskelige enteroids. Videre gjenopprettet mus, menneskelige og donor morsmelk enteroid spredning etter LPS eksponering. Dette tyder på at morsmelk kan utøve anti-inflammatoriske effekter på hele tynntarmen av mus og mennesker.
Figur 1. Morsmelk og donor morsmelk øke størrelsen og musen og tidlig menneskelige enteroids. Photomicrographs av små intestinal enteroids fra neonatal mus (p14) eller tidlig menneskelige tarmen behandlet med enten media (kontroll), morsmelk og donor morsmelk (50 µL/mL) for 24 h. tekststørrelse bar: 1000 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette figur.
Figur 2. Morsmelk og donor morsmelk øke spredning tidlig menneskelige enteroids. (A) AC Confocal micrographs av tidlig menneskelige enteroids kultivert for 5 dager, behandlet med morsmelk og pasteurisert donor morsmelk for 24t og farget for spredning markøren Ki67 (rød) og DAPI (kjernefysisk, blå). Tekststørrelse bar: 50 µm. (B) qRT PCR for Ki67 uttrykk for menneskelige enteroids i forhold til housekeeping genet RPLO. n = 5 per gruppe. p < 0.0001 sammenligninger med Student t -test forhold til kontroll. Dataene er gjennomsnittlig ± standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Samling av melk fra en bedøvet musen bruker en modifisert menneskelige brystpumpe. Sterilt menneskelig bryst pumpe rør plassert på smokker bedøvet ammende demningen etter å ha mottatt oksytosin injeksjon. Musen melk samles med den menneskelige brystpumpe på middels hastighet og inn i et 5 mL samling rør. Kollektive volumer utdraget fra alle smokker spenner fra 500 µL til 1 mL per musen postnatal dager 7-12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Mus, menneskelige og pasteurisert donor morsmelk forbedre musen enteroid spredning. (A-H) AC confocal micrographs av p14 liten intestinal mus enteroids (kontroll, A) behandlet med musen morsmelk (MBM, B) morsmelk (BM, C) eller menneskelig donor morsmelk (DBM, D) på 50 µL/mL av medier for 12 h i fravær ( A-D) eller tilstedeværelsen av lipopolysakkarid (LPS) på en dose av 25 µg/mL av medier for 12 h, (Eh) og flekker for spredning markør Ki67 (rød) og DAPI (kjernefysisk, blå). Tekststørrelse bar: 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intestinal epitel består av mange mobilnettet undertypene som er ansvarlig for å gi vert forsvar mot patogener, opprettholde gut barriere integritet, og kan være brutt i patogenesen av flere sykdommer. Mens dyremodeller kan recapitulate noen fasetter av sykdommen, gir ex vivo modell av enteroids fra hele tynntarmen av mus og mennesker en plattform for å teste effekten av ulike behandlinger. Betydningen av enteroid modellen kan forskere kultur og differensiere intestinal stamceller i epithelial mobilnettet undertypene fra naiv eller syke dyr og mennesker som ikke er tilgjengelig med eksisterende metoder. Denne modellsystem kan brukes for infeksjoner med human patogener som ikke kanskje er lett oversettbare til musen, som enterovirus25 eller norovirus26 blant andre. Den enteroid modellen har flere fordeler og bruker; imidlertid må man være forsiktig å sikre konsekvens i reagensene som brukes til å lage media og de spesifikke eksogene vekstfaktorer som er nødvendig for overlevelsen av enteroids.
Innen den enteroid modellen er flere trinn av avgjørende betydning å sikre suksess i å produsere enteroids. For å minimere kald iskemiske tid, skal vev behandles expediently. Enteroids lages opptil 24 timer etter at vevet er høstet Hvis vevet er plassert i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium på 4 ° C. Dette kan forenkle frakt eller transport hvis nødvendig. Etablering av enteroids er kjelleren membranen en tynn, flat lag nederst i hver brønn for crypts å feste og vokse. Hvis kjelleren membranen er ikke flat eller har bobler stede, crypts kan mislykkes å følge og vil bli fjernet når media endres. Etter at enteroids er opprettet, kan de passaged hver 7 dager eller frosset i flytende nitrogen for langtidslagring. Fjerning og tillegg av Crypt kultur medier med vekstfaktorer og administrasjon av hver behandling må gjøres sakte og til kanten av hver brønn som å unngå å forstyrre enteroids. Forstyrrelser i enteroids kanne anledning seg å bli frittliggende og vasket bort når media endres. De beste resultatene, bør utvises å bevare integriteten til kjelleren membranen og den tilknyttede enteroids.
I denne studien rapporterer vi at enteroids avledet fra neonatal mus og premature barn kan vokse og spre seg i nærvær av ulike typer morsmelk. Disse studiene forhånd vår forståelse av effektene av brystmelk på tidlig tarmen. Vi gir en detaljert metode om hvordan å etablere enteroid kulturer i laboratoriet fra mennesker og mus. I tillegg viser vi en effektiv metode for innsamling av brystmelk fra ammende musen bruker en modifisert elektrisk menneskelige brystpumpe. Vi viser at musen, menneskelig, og pasteurisert donor morsmelk forbedrer vekst og spredning av enteroids fra mus og mennesker. I tillegg viser vi redusert enteroid spredning i nærvær av TLR4 ligand LPS, restaurert når musen, menneskelige eller donor morsmelk ble gitt til enteroids. Fremtidige programmer inneholder personlig presisjon medisin med høy gjennomstrømning narkotika skjermer på enteroids innhentet fra spedbarn etter tarm resection å se hvordan visse medisiner kan påvirke bestemt spedbarn. Sammen vi håper andre laboratorier finner potensielle suksess i å utnytte disse teknikkene i mange forskjellige verdener av pediatric sykdommer i tarmen, inkludert NEC, hvor det er et presserende kliniske behov for å utvikle nye strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre og ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
MG støttes av gir K08DK101608 og R03DK111473 fra den National Institutes of Health, mars av Dimes Foundation Grant nr 5-FY17-79, Children's Discovery Institute of Washington University og St. Louis Children's Hospital og departementet Pediatri ved Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL støttes av R01DK104946 (PI: Silverman), Children's Discovery Institute of Washington University og St. Louis barns sykehus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
