Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Сопоставимых Decellularization плода и взрослых сердечной ткани эксплантов как 3D-как платформы для в исследованиях in Vitro

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/56924
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,5, 4,6, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

ERRATUM NOTICE

Summary

Сердца внеклеточная матрица (ECM) является сложной сети молекул, которые оркестровать ключевых процессов в органах и тканях при Несокрушимая физиологических ремоделирования на протяжении всей жизни. Стандартизированные decellularization плода и взрослых сердец позволяет сравнительные экспериментальные исследования обеих тканей в условиях 3D, захватив родной архитектуры и биомеханических свойств.

Abstract

Текущий набор знаний внеклеточного матрикса (ECM)-сотовой связи переводится большой двухмерный (2D) в пробирке культуры исследования, где представлены компоненты ECM как покрытие поверхности. Эти культуры системы представляют собой упрощение сложного характера ECM, которая охватывает биохимического состава, структуры и механических свойств ткани. Чтобы лучше подражать ECM-сотовой связи, формирование сердца микроокружения, мы разработали протокол, который позволяет для decellularization сердца всего плода и ткани взрослых левого желудочка эксплантах одновременно сравнительных исследований. Протокол сочетает в себе использование гипотонический буфера, моющее средство анионное ПАВ свойств и DNase лечения без какого-либо требования для специальных навыков или оборудования. Применение той же стратегии decellularization через образцы тканей от субъектов различного возраста является альтернативный подход для проведения сравнительных исследований. Настоящий Протокол позволяет выявление уникальных структурных различий между плода и взрослых сердца ECM сетки и биологического клеточных реакций. Кроме того здесь методологии демонстрирует более широкое применение, успешно применяется в других тканях и видов с незначительными изменениями, таких как в человеческой кишечника биопсии и мыши легких.

Introduction

Внеклеточная матрица (ECM) является динамичной сети молекул, которые регулируют важные клеточные процессы, а именно судьба решение, пролиферации и дифференцировки1,2. Исследование взаимодействий клеток ECM была проведена главным образом в двухмерный (2D) в vitro культур, покрытые компоненты ECM, которые представляют собой упрощение родной ECM, найденных в естественных условиях. Decellularization генерирует бесклеточной ECM 3D-как bioscaffolds, который во многом сохранить внеклеточного архитектуры и состава собственных тканей и органов3,4. В дополнение к качестве биоактивные подмости для тканевой инженерии, decellularized 3D ECM биоматериалов появляются как Роман платформы для оценки биологии клетки ECM параллельных в естественных условиях окружающей среды.

Оценки дифференциальной роли компонентов ECM различных тканей, органов и возраста принесет пользу с использованием аналогичных протоколов генерации родной bioscaffolds. В самом сердце мы разработали универсальный протокол для decellularization плода и взрослого, полученных образцов, в качестве альтернативного подхода для проведения сравнительных исследований орган микроокружения. С использованием этой методологии, мы захватили собственного сердца микроокружения и показал, что плода ECM способствует повышению урожайности заселение сердечной клетки5. Decellularization представлена дополнительная идентификация резидентов структурных различий между плода и взрослых ECM на уровне механизма, подвал пластинки и околоклеточного сетки матрицы и волокна состав5. До этой работы голова к голове сравнения тканей на разных этапах онтогенезе, используя тот же подход decellularization сообщалось только резус почек и сердца грызунов. Кроме того ограниченное количество исследований сообщают плода ткани/орган decellularization per se5,6,7. Это было достигнуто с помощью SDS как уникальный decellularization агент; Однако собственный SDS концентрации были использованы для decellularization плода и взрослых сердечной ткани7,8. SDS является одним из наиболее эффективных ионных моющих средств для разминирования цитоплазмы и ядерных материалов и широко используется в decellularization различных тканей и образцы9,10. Растворы, содержащие высокие концентрации SDS и длительного воздействия были связаны с денатурации белков, потеря Глюкозаминогликан (GAGs) и нарушение фибрилл коллагена10,11и поэтому необходим баланс между удаления сохранение и клеток ECM. Чтобы применить ту же процедуру для ткани сердца плода и взрослых, протокол, описанные здесь делится на три последовательных этапа: сотовый лизис по осмотическим шоком (гипотоническая буфера); солюбилизация липидов белков, ДНК белковых и белок белковых взаимодействий (0,2% SDS); и удаления ядерного материала (DNase лечение).

Наш протокол показывает несколько преимуществ: я) возможность эквивалент decellularization возрасту сердечной ткани путем применения одной и той же стратегии decellularization; II) никаких требований для специализированных методов или средств; III) готовы адаптации для других видов тканей и как она успешно применялась с небольшими изменениями в человеческой кишечника биопсий12 и мыши легких13; и, главное, iv) может адресовать ECM биомеханических свойств позволяя Ассамблея 3D-как organotypic культур, что более тесно имитировать молекулярные особенности родной ткани микроокружения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все описанные методологии были одобрены i3S Комитета по этике животных и Direção Geral де Veterinária (DGAV) и находятся в соответствии с Европейским парламентом Директива 2010/63/ЕС.

1. Приготовление растворов decellularization

Примечание: Все decellularization решения следует фильтруют через мембранный фильтр 0,22 мкм и хранить не более 3 месяцев, за исключением указано иное.

  1. Для ПБС: смесь 8 г NaCl, 1.01 g Na2HPO4 200 мг хлористого калия и 200 мг х2PO4 900 мл деионизированную воду (ди). Отрегулируйте раствор pH 7.5 и окончательное решение объем до 1 л фильтр, автоклавы и магазина решение при комнатной температуре (RT).
  2. Гипотонический буфера (10 мм трис, 0.1% ЭДТА): растворить 1,21 г TrisBASE и 1 г ЭДТА в 900 мл деионизованной воды. Отрегулируйте раствор pH 7,8 с NaOH/HCl и окончательное решение объемом 1 л фильтр, стерилизовать в автоклаве и хранить на RT.
  3. Для SDS 0,2% раствор (0,2% SDS, 10 мм Tris): добавить 0,6 г TrisBASE и 1 g додецилового сульфата натрия (SDS) в 400 мл воды ди и перемешать до полного растворения вещества при температуре 60 ° C. Пусть решение остыть до RT. Adjust раствор pH 7,8 и окончательное решение объемом до 500 мл. Стерилизуйте решения путем фильтрации.
    Примечание: Решение ПБ должен быть подготовлен до использования. Фильтр решение только после завершения ИКБ роспуске, иначе SDS нерастворимых частиц будет насыщать фильтр, изменив конечная концентрация SDS и следовательно влияющих на эффективность decellularization ткани.
  4. Гипотонический мыть буфера (10 мм Tris): смесь 1,21 г TrisBASE в 900 мл ди воды. Отрегулируйте раствор pH 7,8 и окончательный объем до 1 л фильтр, стерилизовать в автоклаве и хранить на RT.
  5. Для лечения DNase (20 мм трис, 2 мм MgCl2, 50 ед/мл DNase): растворить 2.42 g TrisBASE и 2 мл 1 М MgCl2 900 мл воды ди. Скорректировать рН 7,8 и окончательное решение объемом 1 л фильтр и стерилизовать решение в автоклаве. Хранят раствор на RT. Добавить DNase I (50 ед/мл) перед использованием.
  6. Для DNase я складе решение: подготовить DNase буфер, содержащий 50% глицерина, 20 мм трис-HCl рН 7,5, 1 мм2MgCl и приспособиться к окончательного решения объемом 10 мл с ди водой. Ламинарный шкаф добавьте DNase I порошок DNase буфер и осторожно перемешать до полного растворения. Стерилизуйте решение через 0,22 мкм фильтр. Подготовка 1 мл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.

2. ткань уборка и криоконсервацию

  1. Усыпить беременных самок на 18 дней гестации (E18 плодов) через удушение CO2 . Выполнения кесарева сечения на самок с хирургические ножницы и собирать маточные рожки, принимая плода мышей к чашке Петри с ледяной 1 x PBS с помощью двух зубчатыми пинцета с изогнутой советы (один пинцет к каждому концу рога).
    1. Откройте маточные рожки и Амниотический мешок изолировать плодов. Передача плодов в новой Петри блюдо с ледяной ПБС анестезировать их и обезглавить с ножницами.
    2. Усыпить 7-8 недель мужчины C57BL/6 мышей с использованием CO2 удушья. Выполните надрез на каждой мыши груди и собирать сердца.
    3. Кратко промойте плода и взрослых сердец с лед холодной ПБС.
  2. Удаление предсердия взрослых сердца с помощью скальпеля. Выполните надрез на правый желудочек и удалить его с помощью прямо маленькие ножницы. Подвергайте внутренней стенки левого желудочка, удалив перегородки. В новом Петри разделите бесплатно левый желудочек стены в продольные полоски толщиной 2 мм и удалить папиллярных мышц с помощью скальпеля и зубчатыми пинцет с изогнутыми концами.
    1. Акцизный небольшой ткани эксплантов с помощью скальпеля с помощью сетки 2 мм х 2 мм (подробное описание в дополнительных 1 рисунок5). Кратко прополощите ткань эксплантов с ПБС.
  3. Мкл ~ 250 оптимального раскроя температуры (OCT) соединение для газобетона 1.5 мл пробирок microcentrifuge. Передаче всего плода сердца и взрослых сердца эксплантов трубки с 250 мкл OCT и заморозить их с сухим льдом с жидкостным охлаждением изопентана и хранить на-80 ° C (максимум 6 месяцев).
    Примечание: Использование эксплантов сердечной ткани криоконсервированных для более чем 6 месяцев существенно снизит эффективность decellularization, особенно в эксплантов ткани взрослых сердце.

3. ткань decellularization

Примечание: Сердечной ткани decellularization производится в 24-ну тканевые культуры плита с одной пробы в колодец. 1 мл раствора каждого decellularization добавляется к каждому хорошо. Все decellularization шаги должны быть выполнены с агитация на 165 об/мин (шейкер инкубатор с орбитальной диаметром 20 мм) и при 25 ° C, если не указано иное. Для более подробной информации обратитесь к схеме на рисунке 1A. Амфотерицин B (например , fungizone) и гентамицин свежезаваренным добавляются ко всем решениям decellularization перед использованием до конечной концентрации 2,5 мкг/мл и 0,01 мкг/мл, соответственно. Чтобы подсчитать количество ДНК сохраняется в decellularized тканях, образец массовые потребности будут определены до начала decellularization протокола. Протокол количественного определения ДНК является далее подробно говорится в разделе 5.1.

  1. ДЕНЬ 1
    1. Удаление образцов ткани из морозильной камеры-80 ° С. Оставьте по 1,5 мл microcentrifuge трубы на RT, до тех пор, пока Окт становится частично расплавленный. Сердечной ткани блок все еще замороженных OCT передачи в чашке Петри с ПБС.
    2. После октября расплавов, переместите сердечной ткани нового Петри с ПБС. По крайней мере дважды повторить стирки образцов в 1 x PBS и при 60 об/мин с шейкер на 10-15 мин.
    3. Добавьте 1 mL работы гипотонический буфера за хорошо плиты стерильные 24-ну тканевые культуры. Передача одного образца на хорошо с помощью щипцов.
    4. Переместить пластину 24-ну тканевые культуры с образцами в шейкер инкубатор при 25 ° C и начать 18 ч инкубации с гипотонический буфера.
  2. ДЕНЬ 2
    1. Приготовляют раствор 0,2% SDS, как описано в разделе 1.3.
    2. Аспирационная гипотонический буфера и стирать образцы с ПБС за 1 ч. Повторите 3 раза.
      Примечание: Пауза точка: ткани под decellularization может храниться в однократном ПБС на 4 ° C для 18 h в статических условиях.
    3. Удаление ПБС, добавить 1 мл свежеприготовленной SDS раствора (шаг 1.3) в хорошо и Проинкубируйте образцы за 24 ч.
      Примечание: Пост SDS (CHECK POINT) инкубации, убедитесь, что образцы exhibit белый полупрозрачный вид. На этом шаге рассматривается SDS образцы залитые в ДНК, показаны консистенцию желатина как. Удаление решения SDS медленно, чтобы избежать прилипания образец к кончику дозатор.
  3. ДЕНЬ 3
    1. Мыть образцы с гипотонический мыть буфера (1 мл на хорошо) для 20 минут повторите 3 раза.
      Примечание: На данном этапе, это нормально для наблюдать уменьшение размера выборки за счет удаления остатков клеток. ПАУЗЫ точка: Ткани под decellularization может храниться в гипотонический мыть буфера на 4 ° C для 18 h в статических условиях.
    2. Добавить 1 мл раствора DNase лечения в колодец и Проинкубируйте образцы для 3 ч при 37 ° C.
    3. Аспирационная DNase лечение решение и стирать образцы с ПБС (1 мл на хорошо) для 20 минут повторите 3 раза. Выполните окончательный промыть ПБС (1 мл на хорошо) на ночь в RT и тряски на 60 об/мин.
    4. (КПП) После лечения DNase убедитесь, что decellularized образцы потеряли желатин как последовательности.
      Примечание: После лечения DNase, удалить и добавить ПБС осторожно, поскольку образцы могут быть легко захваченного и прилагается к кончику дозатор.

4. Оценка decellularized ткани клеток удаления

  1. Исправить образцы в 24-ну культуры ткани пластины, 1 образец в колодец, добавив 1 мл свежеприготовленной формалина 10% нейтральные буфера с 0,03% водного раствора эозина для 2,5-3 ч в рт.
    Примечание: Эозина добавляется фиксатором пятно в decellularized ткани и для облегчения визуализации образца при резании и гистологической пятнать. Добавление эозином, который не мешает с гистологическим пятна ни с иммунофлюоресценции методов. Кроме того фиксация может быть выполнена на ночь при 4 ° C.
  2. Удалите фиксирующие решения и добавьте 1 mL ПБС мыть образца.
  3. Инкапсуляции фиксированных bioscaffolds в гистологии обработки гель с использованием образца формы Одноразовые виниловые согласно инструкциям производителя.
  4. Удалите гистология гель с образцом, встроенные от плесени и передачи для биопсии обработки/Embedding кассет с крышкой.
    Примечание: Альтернативой ткани встраивания в гистологии и обработки гель является для обработки каждого образца в двух биопсии губки с мелкие поры. Образцы должно быть локализовано в центр биопсии губки для обнаружения. Следует отметить некоторые образцы могут быть трудно локализовать с помощью этого подхода.
  5. Обработка образцов для парафина, встраивание через последовательные инкубаций (30 мин на решение) в серии концентраций алкоголя (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), решение Изопарафиновые алифатических углеводородов (2 инкубации станции) и парафина (2 инкубации станции) на 56 ° C.
  6. Установите образцы в блоке парафина.
  7. Вырежьте 3 мкм густой парафин секции на микротом и собирать разделы на стеклянных скольжениях микроскопа.
  8. Сухой парафиновых срезах в одночасье в 37 ° C.
    Примечание: Разделы парафина (пауза точка) хранятся при температуре 4 ° C до дальнейшего использования.
  9. Чтобы проверить эффективность протокола, выполняют Hematoxilin и эозином (H & E) и Массон Trichrome окрашивание (MT) decellularized образец секций и секций не манипулировать ткани согласно инструкциям производителя.
    Примечание: H & E пятнать пятна ячейки ядер голубой/пурпурный, цитоплазма темно розовый/красный и коллаген бледно розовый и MT пятна ядер черный, красный, цитоплазма и коллагена и муцина синий. Эффективное decellularization достигается при пористой светло-розовый (H & E, MT) и синий (MT) сети наблюдается, в отсутствие ядерных пятно.

5. Оценка decellularized ткани удаления ядерного материала

Примечание: Количественная оценка содержания ДНК на decellularized ткани должны быть выполнены по сравнению с соответствующими не манипулировать ткани.

  1. Перед decellularization весить 1.5 мл microcentrifuge на высокой точностью цифровой шкале. Передать трубку сердечной ткани, удалить дополнительное количество ПБС и весят трубки с образцами. Вычислите сырого веса образцов:
    Образецживого веса = вес трубки с образцами – вес пустой трубки
  2. Decellularize образцы, как описано в шаге 3.
  3. После decellularization собирают decellularized тканям в пробки microcentrifuge.
    1. Из-за малых размеров и массы отдельных сердца образцов и комплект характеристики, бассейн decellularized тканей состояния каждого образца (сердца плода: 5 всего сердца; Взрослый эксплантов LV: 15 эксплантов). Выполните ту же процедуру с ткани-манипулировали.
      Примечание: (Пауза точка) образцы можно хранить при температуре от-20 ° C до тех пор, пока выполняются экстракции ДНК и количественной оценки.
  4. Вырезать, не манипулируют и decellularized тканей в небольших эксплантов с помощью скальпеля в чистой Петри.
    Примечание: Использование индивидуальных скальпель и Петри для каждого образца. Механическое разрушение образцов с помощью скальпеля облегчает их задней ферментативного пищеварения и последующего извлечения ДНК.
  5. Для экстракции ДНК используйте метод экстракции ДНК спин столбца на основе согласно инструкциям производителя.
    1. Соберите механически диссоциированных образцы от Петри с буфером мастер пищеварения (буфер пищеварение и протеиназы K) согласно инструкциям производителя с помощью кончика пипетки широкие отверстия.
      Примечание: Лизис ткани с пищеварением протеиназы K быстре в decellularized образцах. Для обработки различных образцов в то же время, держите лизированных образцы на льду, до тех пор, пока все образцы будут анализироваться для сведения к минимуму деградации. Полные примеры лизис достигается между 4-6 ч.
    2. Продолжите с протоколом, в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Для повышения урожайности ДНК образцов decellularized и не decellularized ткани, элюировать ДНК на 25-50 мкл и 100 мкл буфера, соответственно. Собирать eluted дна и загрузить спин столбец. Инкубируйте 1 мин на RT. центрифуги образцах в соответствии с инструкциями производителя.
      Примечание: (Пауза точка) ДНК, извлеченные из образцы можно хранить при-20 ° C до дальнейшего использования.
  6. Количественного определения ДНК от образцов с комплектом обнаружения флуоресцентные dsDNA следуя инструкциям производителя.
  7. Нормализуют содержание ДНК как нг ДНК на миллиграмм сырого веса исходного образца (до decellularization).

6. decellularized Подмости мобильные посева

Примечание: Все решения/реагенты должны быть стерильными и вся процедура выполняется в стерильных условиях.

  1. Подготовка 1 x DPBS с 2,5 мкг/мл, амфотерицин B и 1% P/S (пенициллин, 100 И.Ю; этамбутол 100 мкг/мл).
  2. Удаление 1 x PBS решение из последнего шага Стиральная decellularization (шаг 3.3.3) и добавьте 500 мкл на хорошо свежеприготовленные 1 x DPBS/2,5 мкг/мл раствора B/1% P/S амфотерицин. Хранить образцы на 4 ° C от 1-7 дней.
    Примечание: Примеры хранения при температуре 4 ° C имеет важное значение для поддержания стерильности.
  3. Добавьте P/S в ячейку базальной СМИ (без FBS и добавки) до конечной концентрации 1%.
  4. Аспирационная 1 x DPBS/2,5 мкг/мл раствора B/1% P/S амфотерицин от decellularized образцов. Добавьте 500 мкл на хорошо клеток базальной media/1% P/S и пусть образцы сбалансировать за 1 ч при 37 ° C, или на 4 ° C для более чем 1 час.
  5. Разделение клетки интереса и подготовить небольшой аликвоты клеток на плотность клеток желаемого.
    Примечание: Заполнение decellularized ткани должны выполняться под стереоскопическим микроскопом и в стерильных условиях. Средства массовой информации культуры клеток должен содержать 1% P/S.
  6. Пипетка мкл 3-4 DPBS в центр хорошо 96-луночных плиты. С помощью пинцета тонкий и прямой передачи decellularized леса на DPBS падение, удалите дополнительные DPBS, стремление и убедитесь, что образец не сложить или морщинистой. Пусть это станет сухой на краях присоединиться к поверхности хорошо.
    Примечание: Частные леса имеют меньше посева эффективность.
  7. Добавление ячеек на эшафот, закупорить одноклеточных раствор медленно против края колодца.
    Примечание: например, новорожденных крыс кардиомиоцитов семенами с на плотности 7500 клеток/мм2 и увековечен мыши Линь− Sca-1+ сердечной клетки-предшественники (МЦППSca-1) на плотность 60-1500 клеток/мм2. Отрегулируйте согласно экспериментальное обоснование плотность клеток.
  8. Добавьте DPBS в соседних скважин, чтобы избежать испарения быстро СМИ.
  9. 24 часа после заполнения ячейки, если используется тип ячейки придерживаться культуры ткани пенополистирольные плиты (ПТС), передать новой скважины bioscaffolds. В противном случае замените средство для удаления не сторонник клеток.
  10. Измените тщательно СМИ согласно конкретным требованиям типа ячейки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Decellularization эффективность должна оцениваться посредством трех основных методов: макроскопический наблюдения, гистология и количественного определения ДНК. Макроскопические появление лечение пост SDS образцов косвенно влияет на эффективность удаления клеток. После инкубации SDS образцы должны появиться как полупрозрачные, чтобы беловатые (рис. 1 c). Фетальный (E18) decellularized тканей характеризуются весьма полупрозрачные структурой, а Взрослый эксплантов полупрозрачный белый вид. Белее внешний вид обычно соотносится к сети ECM экспонируется более высокой волокна и содержание коллагена, например когда взрослый желудочков и сосудистой судов ECM сетки (рис. 1 c). Гематоксилином и эозином (H & E) и/или пятна Массон в Trichrome (MT) выполняются для подтверждения удаления эффективно клеток наблюдения пористых сетки (светло-розовый, H & E; светло-розовый и синий, MT) (рис. 1 c). Кроме того MT пятно подчеркивает коллагена сети в синий5. Обычно получается Распродажа ядерного материала после decellularization осуществляется ДНК количественное определение и сокращение приблизительно 99,8%, по сравнению с не манипулировали ткани (рис. 1 c). Наличие ядерных материалов на decellularized леса был описан как триггер нежелательных воспалительной реакции после имплантации14. По этой причине подтверждение эффективности decellularization важно до родной 3D эшафот заселение экспериментов. Decellularized леса могут храниться в стерильных условиях до посева с клетками интерес. Жизнеспособность клеток контролируется во всем в пробирке культуры Флуорексон окрашивание (рис. 2A). Тем не менее Флуорексон пятно может быть цитотоксических клеток чувствительных типов. Терминал анализ клеток заселения и распределения через леса является выполненной после парафин обработки; снимок bioscaffold заселения, оценены H & E пятнать в центральной секции bioscaffolds показано (Рисунок 2B, 2 C).

Figure 1
Рисунок 1. Фетальный (E18) и взрослых сердечной ткани decellularization процедуры и подтверждение эффективности decellularization. (A) Обзор протокола. (B) Decellularization протокол подробно. (C) макроскопический анализ сердечной ткани плода и взрослых до и после decellularization. Линейки: 2 mm. (D) количественная оценка ядерного материала в decellularized по сравнению с не манипулировали ткани. Данные, выраженные как означает t критерия Стьюдента ± SEM., двустороннее * p < 0,05. (E) H & E и Массон в Trichrome гистологический анализ сердечной ткани плода и взрослых до и после decellularization. Линейки: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Заселение анализ decellularized леса, семенами с Лин - Sca-1+ сердца прогениторных клеток линии (МЦППSca-1). (A) жизнеспособность высокой клеток наблюдается на подмостки поверхности во время экстракорпорального культуры Флуорексон пятно (зеленый). Линейки: 100 мкм. (B) клеток количество и распределение через леса, оценивать через H & E пятнать. Линейки: 100 мкм. (C) ортогональный вид клеток, встроенный в decellularized ECM. Конфокальное изображение 50μm-густой парафин секции. Линейки: 10 мкм (ортогональный вид XZ, YZ) и 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Шаг Наблюдение Возможная причина Проблема Решение
3.1.2. Ткани с коричневого цвета Образец cryofixation; нестабильные температура замерзания Образец cryofixation приведет к неэффективное удаление цитоплазматических белков Храните замороженные ткани более короткие периоды. Проверка температуры морозильной камеры и стабильность
3.2.4. Розово белый непрозрачный образцов Решение ПБ не был хорошо подготовлен; Взрослый LV эксплантов слишком большой Неэффективное удаление цитоплазматических белков Обеспечение полного растворения SDS. Decellularize образцы меньшего размера.
3.3.4. Образцы с желатином-вид Неэффективное удаление ДНК Неэффективные ядерного материала Распродажа Увеличьте время DNase концентрации и/или инкубации.
4.6. Гистология гель уплотнения Долгое время ожидания в PBS1X/этанол до обработки парафином Изменение структуры decellularized ткани Начало гистологической обработки как можно скорее
6.6. Высушенные образцы decellularized Образцы были оставляют сушиться слишком долго Постоянный распад decellularized ткани. Неэффективные клеток посева Разрешить образцов слегка сухой только в периферии для того, чтобы привязываться к нижней части скважины во время посева
6.7. Decellularized образец отряда во время посева Образцы не были достаточно сушат до посева Неэффективные клеток посева Увеличить время сушки ECM позволяет лучше присоединения до заполнения ячейки

Таблица 1. Устранение неполадок таблицы для параллельных decellularization плода (E18) и взрослых мыши сердечной ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Внеклеточная матрица (ECM) является весьма динамичного и сложного сеть волокнистых и клей гликопротеинов, состоящий из водохранилища многочисленные биоактивные пептиды и зависшие факторов роста. Как основных модулятором клеточной адгезии, Цитоскелет динамики, моторики и миграцией, распространения, дифференциация и апоптоз ECM активно регулирует клеточную функцию и поведение. Зная, что сотовой поведение отличается в 2D и 3D культур, предпринимались усилия для разработки моделей Роман organotypic, которые могут точно воспроизвести среды натуральных тканей. В последние годы ткани decellularization возник как альтернативный метод для ткани инженерных и регенеративной медицины. Таким образом, decellularization тканей и органов в настоящее время является инструментом выбора лучше вскрыть microenvironmental Параметры специфичные для ткани (биохимические, структурные и механические) и биологической активности в vitro и in vivo.

Мы разработали протокол, который сочетает в себе использование гипотонический буфера с детергентами свойств анионные ПАВ, следуют DNase лечения5,12,13. Настоящий Протокол представляет собой простой и воспроизводимый метод, чтобы выполнить сравнительный анализ между decellularized плода и взрослых мыши сердечной ткани. Наш опыт с другими тканями, а именно с опухоли образцов, полученных от больных раком хирургической резекции и мыши легочной ткани, показывает, что этот протокол является легко адаптируемых и успешными в других условиях и моделей12,13. Применение же процедуры decellularization на различных образцов позволяет сравнительные исследования состава ECM, биомеханических свойств, архитектуры и клеточных модулирующее свойств в 3D контексте.

Одна из самых сложных задач ткани decellularization является баланс между удаления прямой клеток, ECM сеть сохранения и биосовместимость тканей. Следовательно несколько критических шагов нужно тщательно рассмотреть, например, время Криоконсервация тканей перед decellularization, размер правильный экспланта, использование свежих решений и манипуляции окончательный decellularized ткани. В ходе нашего исследования мы наблюдали прямая корреляция между время длительного хранения криоконсервированных ткани и использование давно SDS решений с decellularization неэффективность. Длительный срок хранения ткани приводит к неэффективных сотовых удаления содержания рендеринга остатки толстые сотовой областей (без ядер) среди сложные сети ECM. Аналогичный нежелательный эффект достигается, когда долго хранимых SDS решения используются для ткани decellularization, вероятно, потому что SDS решения имеют короткий стабильности за счет снижения растворимости, гидролиз и изменения рН за время15,16 . Использование эксплантов правильного размера (~1.5 x 1,5 x 1,5 мм) также имеет важное значение для успешного взрослых ткани decellularization, поскольку больше резекции тканей являются более трудными для decellularize, отображение ячейки мусор в ловушке на поверхности и арестован между густой сетью ECM. Хотя этот протокол обеспечивает эффективный метод сердечной ткани decellularization, мелкие фракции взрослых эксплантов могут представлять остатки клеток, в частности те из большего размера. Гистологический анализ этих образцов облегчает их идентификацию и последующее исключение из сферы исследования. В конечном счете, протокол здесь является универсальным и легко применимы для различных образцов с незначительные коррективы на ткани экспланта размер, концентрация SDS (0,1-0,2% SDS) или раствор инкубации время5,12,13 .

Главным недостатком нынешнего метода, что манипуляции небольших размеров образцов, т.е. мышиных сердца плода и взрослых сердца эксплантах, требует некоторых навыков обработки. В самом деле как взрослых, так и плода decellularized тканей являются тонкие структуры, которые могут быть окончательно деформируется при сушеные во время процедуры или захваченного кончик тонкой пипетки или во время обработки с щипцами5.

Основные новизна данного протокола, помимо параллельного decellularization сердца плода мыши и взрослых левого желудочка эксплантов для сравнительной оценки состава ECM (биомеханический анализ) и связанные биологической функции, является его простой перевод различных тканей и моделей5,12,13. Decellularization тканей различных возрастов, применяя стандартизированной методологии было описано только на резус почек и поперечной секций тканей плода, у новорожденных и взрослых, которые были подвергнуты 1% SDS для лечения 10 дней6 . В сердечной обстановке, хотя плода, было decellularized новорожденных и взрослых тканях, методы отличаются по степени механических выбить, SDS концентрации и времени приложения7,8. Как каждая процедура decellularization влияет на ECM в уникальной манере, сравнение decellularized образцов, полученных из различных протоколов может привести к заблуждение выводами. Следовательно применяя ту же процедуру decellularization через различные образцы позволяет надежный сравнительный анализ.

Подавляющее большинство коммерчески доступных decellularized тканей являются производными от взрослых особей17. Несмотря на растущее признание для повышения способности плода микросреды в предоставлении про восстановительной сигналов по сравнению с их коллегами взрослых decellularization фетальных тканей сообщили только в нескольких исследований5, 7 , 18 , 19 , 20 , 21. ECM понимание динамики во время процесса старения будет иметь решающее значение для определения уникальных особенностей pro восстановительной микросреды, которые, в свою очередь, повлияет на разработку более высокой эффективности biomimetic материалов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы признательны всем членам Пинто ду Ó лаборатории для соответствующих критического обсуждения. Эта работа была поддержана програма MIT-Фонд пункт Ciência e Tecnologia (КГФ) в рамках проекта «CARDIOSTEM-инженерии сердечной ткани и основанного на стволовых клеток лечение сердечно-сосудистых приложений» (MITP-TB/ЕЭК/0013/2013). A.C.S. является получателем стипендий КГФ [SFRH/BD/88780/2012] и M.J.O. является членом КГФ (FCT-следователь 2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker Orbital Shakers IKA:3510001 Recommended
Fluorimeter - - Equipment available
Digital weight scale - - Equipment available
Inverted Microscope - - Equipment available
Cell culture incubator - - Equipment available
Fridge (4ºC) - - Equipment available
Deep freezer (-80ºC) - - Equipment available
Microtome - - Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge Fine Science Tools 5000-08 Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11254-20 Recommended
Dumont 7 forceps Fine Science Tools 11272-30 Recommended
Dissecting Scissors, straight - - Tool available
Forceps, serrated, curved - - Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped VWR 29442-044 -
96 well plates, individually wrapped VWR 71000-078 -
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized Millipore SE1M179M6 -
Eppendorff - - Material available
15 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430791 -
50 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430829 -
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid Electron Microscopy Science 70075-B -
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 22-037-246 -
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006 -
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) Sigma-Aldrich 277258-1L -
Dry ice - - -
Decellularization
NaCl BDH Prolabo 27810.364 -
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S-31264 -
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-100g -
KCl Sigma-Aldrich P8041-1KG -
TrisBASE Sigma-Aldrich T6066-500G -
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L-4390 -
MgCl2 MERCK 1.05833.1000 -
DNAse I AplliChem A3778,0050 -
Gentamicin Gibco 15710-049 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Deionized water (DI water) - - -
Histology
10 % formalin neutral buffer Prolabo 361387P -
Eosin Y AQUEOUS Surgipath 01592E Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 -
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous Aga 4,006,02,02,00 -
Deionized water (DI water) - - -
Clear Rite 3 Richard-Allan Scientific 6915 -
Shandon Histoplast Thermo Fisher Scientific RAS.6774006 -
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific K182001 -
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit Invitrogen P11496 -
Cell culture
DPBS VWR 45000-434 -
Penicillin-Streptomycin Solution 100X Labclinics L0022-100 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Cell culture media of the cell of interest - - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  3. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  5. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. 3rd Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
  8. Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
  10. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  11. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  12. Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
  13. Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
  14. Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
  15. Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
  16. Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
  17. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
  18. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  19. Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
  20. Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
  21. Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).

Tags

Биоинженерии выпуск 145 Decellularization внеклеточного матрикса 3D подмостей сердца плода Взрослый сердца сердечной тканевая инженерия

Erratum

Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 04/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

Сопоставимых Decellularization плода и взрослых сердечной ткани эксплантов как 3D-как платформы для в исследованиях in Vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, A. C., Oliveira, M. J.,… More

Silva, A. C., Oliveira, M. J., McDevitt, T. C., Barbosa, M. A., Nascimento, D. S., Pinto-do-Ó, P. Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (145), e56924, doi:10.3791/56924 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter