Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ديسيلولاريزيشن مماثلة لانسجة القلب الجنين والكبار Explants كمثل 3D منهاجي في المختبر الدراسات

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/56924
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,5, 4,6, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

ERRATUM NOTICE

Summary

المصفوفة خارج الخلية القلبية (ECM) هو شبكة معقدة من الجزيئات التي تنسق العمليات الرئيسية في الأنسجة والأعضاء بينما دائم يعيد البناء الفسيولوجية طوال الحياة. رخص ديسيلولاريزيشن موحدة من قلوب الأجنة والبالغين الدراسات التجريبية المقارنة لكل الأنسجة في سياق 3D التقاط خصائص النشاط الحيوي والهندسة المعمارية الأصلية.

Abstract

المعرفة الحالية بالمصفوفة خارج الخلية (ECM)-الاتصالات خلية يترجم إلى الدراسات الكبيرة الثقافة في المختبر (2D) ثنائي الأبعاد حيث يتم عرض مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة كطلاء سطح. وهذه النظم الثقافة تشكل تبسيطا للطبيعة المعقدة للأنسجة ECM التي تشمل تشكيل البيوكيميائية وهيكل وخصائص ميكانيكية. لمحاكاة أفضل الاتصالات ECM-خلية تشكيل المكروية القلب، قمنا بتطوير بروتوكول يسمح ديسيلولاريزيشن قلب الجنين كله وأنسجة البطين الأيسر الكبار اكسبلانتس في نفس الوقت للدراسات المقارنة. البروتوكول يجمع بين استخدام مخزن مؤقت ناقص التوتر، مطهر خصائص السطح أنيونى، ومعاملة الدناز دون أي اشتراط للمهارات المتخصصة أو المعدات. تطبيق نفس الاستراتيجية ديسيلولاريزيشن عبر عينات الأنسجة من مواضيع عصر مختلف نهج بديل لإجراء دراسات مقارنة. يسمح هذا البروتوكول تحديد الاختلافات الهيكلية فريدة من نوعها عبر الجنين والكبار القلب ECM مش والبيولوجية الخلوية الردود. وعلاوة على ذلك، هذه الوثيقة يوضح منهجية تطبيق أوسع نطاقا يجري تطبيقها بنجاح في أنسجة أخرى والأنواع مع إدخال بعض التعديلات الطفيفة، كما هو الحال في خزعات الأمعاء البشرية والرئة الماوس.

Introduction

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي شبكة دينامية من الجزيئات التي تنظم العمليات الخلوية الهامة، إلا وهي مصير قرار،1،انتشار والتفريق2. وقد أجريت التحقيق في تفاعلات الخلية-ECM أساسا في ثنائي الأبعاد (2D) في الثقافات الأنابيب المغلفة مع مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة، التي تشكل تبسيط خصائص إدارة المحتوى في المؤسسة الأصلية الموجودة في فيفو. ديسيلولاريزيشن يولد اللاخلوي بيوسكافولدس ECM 3D تشبه إلى حد كبير الحفاظ على بنية الخلية وتكوين الأنسجة الأصلية والأجهزة3،4. بالإضافة إلى خدمة السقالات النشطة بيولوجيا لهندسة الأنسجة، الخارجة ديسيلولاريزيد الحيوية ECM 3D كمنصات جديدة لتقييم بيولوجيا الخلية-إدارة المحتوى في المؤسسة هذا التوازي المجراة في البيئة.

تقييم الدور التفاضلية لمكونات ECM أنسجة متميزة وأجهزة والعمر ستستفيد باستخدام بروتوكولات مماثلة لتوليد بيوسكافولدس الأصلية. في القلب، وقمنا بتطوير بروتوكول متعدد الاستخدامات ديسيلولاريزيشن عينات الأجنة والمستمدة من الكبار، كنهج بديل لإجراء دراسات مقارنة المكروية الجهاز. استخدام هذه المنهجية، استولت المكروية القلب الأصلي وأظهرت أن يعزز ECM الجنين غلات تعمير لخلايا القلب5. ديسيلولاريزيشن توفير مزيد من تحديد هوية المقيم الاختلافات الهيكلية بين ECM الجنين والكبار على مستوى ترتيب شبكة مصفوفة الصفيحة الطابق السفلي وبيريسيلولار والألياف تكوين5. قبل هذا العمل، أبلغ مقارنة وجها لوجه للأنسجة في مختلف مراحل التحور باستخدام نفس النهج ديسيلولاريزيشن فقط للقرد الريسوسي الكليتين وقلوب القوارض. وبالإضافة إلى ذلك، يقدم عدد محدود من الدراسات الأنسجة الجنينية/الجهاز ديسيلولاريزيشن في حد ذاتها5،،من67. وقد تم ذلك باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي كعامل ديسيلولاريزيشن فريدة من نوعها؛ ومع ذلك، استخدمت متميزة الحزب الديمقراطي الصربي تركيزات ديسيلولاريزيشن الجنين والكبار من أنسجة القلب7،8. الحزب الديمقراطي الصربي هو واحد من المنظفات الأيونية الأكثر فعالية لإزالة المواد النووية وحشوية، وتستخدم على نطاق واسع في ديسيلولاريزيشن لمختلف الأنسجة والعينات9،من10. المحاليل المحتوية على تركيزات عالية من الحزب الديمقراطي الصربي، وفترات طويلة من التعرض لها قد يرتبط تمسخ البروتين، فقدان glycosaminoglycan (الكمامات) واضطراب ييفات الكولاجين10،11، ومن ثم التوازن بين إزالة الحفاظ عليها وخلية إدارة المحتوى في المؤسسة أمر ضروري. لتطبيق نفس الإجراء على أنسجة قلب الجنين والكبار، يتم تقسيم البروتوكول الموضحة هنا في ثلاث خطوات متتابعة: خلية تفسخ بصدمة ناضح (المخزن المؤقت ناقص التوتر)؛ سولوبيليزاتيون تفاعلات البروتينات الدهنية والبروتين الحمض النووي والبروتين-بروتين (الحزب الديمقراطي الصربي 0.2 ٪)؛ وإزالة المواد النووية (الدناز المعاملة).

لدينا بروتوكول يظهر العديد من المزايا: أنا) إمكانية أي ما يعادل ديسيلولاريزيشن من أنسجة القلب سن معينة من تطبيق نفس الاستراتيجية ديسيلولاريزيشن؛ ثانيا) أي متطلبات للأساليب المتخصصة أو المعدات؛ ثالثا) جاهزة التكيف للأنسجة والأنواع الأخرى كما أنها قد طبقت بنجاح مع تعديلات طفيفة في خزعات الأمعاء البشرية12 والماوس الرئة13؛ والأهم من ذلك، رابعا) يمكن معالجة خصائص النشاط الحيوي ECM حين تمكن الجمعية العامة الثقافات مثل 3D أورجانوتيبيك أكثر عن كثب تحاكي ملامح الجزيئية المكروية الأنسجة الأصلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أقر جميع المنهجيات ووصف i3S لجنة الأخلاقيات الحيوان و Direção دي Geral Veterinária (دجاف)، وهي وفقا للبرلمان توجيه 2010/63/الأوروبي.

1-إعداد الحلول ديسيلولاريزيشن

ملاحظة: ديسيلولاريزيشن جميع الحلول ينبغي تصفيتها من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر والمخزنة لمدة أقصاها 3 أشهر، باستثناء تعيين خلاف ذلك.

  1. لبرنامج تلفزيوني س 1: مزيج ز 8 من كلوريد الصوديوم، ز 1.01 Na2هبو4 200 مغ بوكل، و 200 مغ من خ2ص4 مع 900 مل مياه (المياه دي). ضبط الأس الهيدروجيني الحل إلى 7.5 وحجم الحل النهائي حتى لتصفية ل. 1، اﻷوتوكﻻف، ومخزن الحل في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. ناقص التوتر من المخزن المؤقت (10 ملم تريس، يدتا 0.1 ٪): حل ز 1.21 من تريسباسي وز 1 يدتا في 900 مل مياه. ضبط الأس الهيدروجيني الحل إلى 7.8 مع هيدروكسيد الصوديوم/HCl وحجم الحل النهائي إلى 1 ل. تصفية وتعقيم قبل اﻷوتوكﻻف وتخزينها في الرايت
  3. لحل الحزب الديمقراطي الصربي 0.2% (0.2% الحزب الديمقراطي الصربي، 10 مم تريس): إضافة 0.6 غ من تريسباسي و 1 غ من دوديسيل كبريتات الصوديوم (الحزب الديمقراطي الصربي) في 400 مل مياه دي ويقلب عند 60 درجة مئوية حتى انحلال ذائبة كاملة. السماح لإيجاد حل لتهدئة لضبط الرايت الحل الأس الهيدروجيني إلى 7.8 وحجم الحل النهائي إلى 500 مل. تعقيم الحل عن طريق الترشيح.
    ملاحظة: ينبغي إعداد حل الحزب الديمقراطي الصربي قبل الاستخدام. الحل تصفية فقط بعد إكمال حل الحزب الديمقراطي الصربي، وإلا سوف تشبع الجزيئات غير قابلة للذوبان في الحزب الديمقراطي الصربي عامل التصفية، تغيير تركيز الحزب الديمقراطي الصربي النهائي و وبالتالي يؤثر على كفاءة ديسيلولاريزيشن الأنسجة.
  4. ناقص التوتر من المخزن المؤقت يغسل (10 ملم تريس): مزيج ز 1.21 من تريسباسي في 900 مل دي المياه. ضبط الأس الهيدروجيني الحل إلى 7.8 والحجم النهائي لتصفية ل. 1 وتعقيمها قبل اﻷوتوكﻻف وتخزينها في الرايت
  5. لعلاج الدناز (20 مم تريس، 2 مم مجكل2, 50 يو/مليلتر الدناز): حل ز 2.42 من تريسباسي و 2 مل من م 1 MgCl2 في 900 مل مياه دي. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.8 وحجم الحل النهائي إلى 1 ل. تصفية وتعقيم الحل قبل اﻷوتوكﻻف. تخزين الحل في "الرايت إضافة الدناز" أنا (50 ش مل) قبل استخدامها.
  6. الدناز أنا الأسهم الحل: إعداد المخزن مؤقت الدناز الذي يحتوي على 50% والغليسيرول، 20 مم تريس-HCl درجة الحموضة 7.5، 1 مم مجكل2، وضبط حجم 10 مل مع المياه دي حل نهائي. في غطاء الاندفاق الصفحي، إضافة الدناز مسحوق إلى المخزن المؤقت الدناز، وتخلط بلطف حتى حل كامل. تعقيم الحل عن طريق 0.22 ميكرومتر التصفية. تحضير مختبرين 1 مل وتخزينها في-20 درجة مئوية.

2-الأنسجة الحصاد ونعد

  1. Euthanize الكبار من الإناث الحوامل في 18 يوما الحمل (E18 الأجنة) عن طريق الخنق2 CO. القيام العملية قيصرية على الإناث مع مقص جراحية وجمع قرون الرحم آخذة الفئران الجنينية إلى طبق بتري مع برنامج تلفزيوني المثلج 1 x باستخدام الملقط مسنن اثنين مع أطراف منحنية (الملاقط واحد لكل نهاية القرن).
    1. فتح ابواق الرحم والكيس الذي يحيط بالجنين لعزل الأجنة. نقل الأجنة في طبق بتري جديدة مع برنامج تلفزيوني x 1 المثلج تخدير لهم وقطع رأس مع مقص.
    2. Euthanize 7-8 أسابيع من العمر C57BL/6 ذكور الفئران باستخدام الخنق2 CO. تنفيذ شق على كل الصدر الماوس وجمع القلب.
    3. باختصار شطف قلوب الأجنة والبالغين مع الجليد الباردة 1 x برنامج تلفزيوني.
  2. إزالة الاذينين القلب الكبار مع المساعدة من مشرط. تنفيذ شق على البطين الأيمن وإزالته باستخدام مقص صغير مباشرة. تعرض الجدار الداخلي البطين الأيسر عن طريق إزالة الحاجز. في طبق بتري جديد، تقسيم البطين الأيسر مجاناً-الجدار في شرائط طولية بسمك 2 مم وإزالة العضلات الحليمية استخدام المبضع، والملقط مسنن بأطراف منحنية.
    1. المكوس explants النسيج الصغيرة مع المساعدة من مشرط استخدام شبكة 2 × 2 مم (وصف مفصل في تكميلية 1 الشكل5). باختصار شطف الأنسجة explants مع برنامج تلفزيوني 1 x.
  3. إضافة ~ 250 ميليلتر من قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) في مجمع لأنابيب ميكروسينتريفوجي يعقم 1.5 مل. نقل الجنين كله قلوب والكبار explants القلب إلى الأنابيب مع 250 ميليلتر من أكتوبر وتجميدها مع تبريد الثلج الجاف إيسوبينتاني ومخزن في-80 درجة مئوية (بحد أقصى لمدة 6 أشهر).
    ملاحظة: سيقلص استخدام أنسجة القلب explants cryopreserved لأكثر من 6 أشهر كفاءة ديسيلولاريزيشن، لا سيما في explants أنسجة القلب الكبار.

3-الأنسجة ديسيلولاريزيشن

ملاحظة: يتم ديسيلولاريزيشن أنسجة القلب بصفيحة زراعة الأنسجة 24-جيدا مع عينة واحدة كل بئر. يتم إضافة 1 مل من كل حل ديسيلولاريزيشن لكل فرد كذلك. ينبغي إجراء جميع خطوات ديسيلولاريزيشن مع الانفعالات 165 لفة في الدقيقة (حاضنة شاكر مع مداري قطرها 20 مم) وعند 25 درجة مئوية، ما لم يحدد خلاف ذلك. للحصول على مزيد من التفاصيل، الرجاء مراجعة المخطط على الشكل 1A. الامفوتريسين B (مثل فونجيزوني) والجنتاميسين طازجة تضاف إلى جميع الحلول ديسيلولاريزيشن قبل استخدامها لتركيز نهائي 2.5 ميكروغرام/ملليلتر و 0.01 ميكروغرام/مل، على التوالي. لتحديد مقدار الحمض النووي الاحتفاظ داخل الأنسجة ديسيلولاريزيد، واحتياجات عينة جماعية تحدد قبل بدء تشغيل بروتوكول ديسيلولاريزيشن. بروتوكول الكمي الحمض النووي هو زيادة مفصلة في القسم 5.1.

  1. يوم 1
    1. إزالة عينات الأنسجة من الثلاجة-80 درجة مئوية. اترك مل 1.5 أنابيب ميكروسينتريفوجي على RT حتى يصبح ذاب جزئيا في أكتوبر. نقل كتلة أنسجة القلب OCT لا تزال مجمدة على طبق بيتري مع برنامج تلفزيوني 1 x.
    2. بعد أن يذوب أكتوبر، نقل أنسجة القلب إلى طبق بتري جديدة مع برنامج تلفزيوني 1 x. كرر عينات المياه والصرف الصحي في 1 × برنامج تلفزيوني و 60 لفة في الدقيقة مع شاكر عن 10-15 دقيقة على الأقل مرتين.
    3. أضف 1 مل من العمل "ناقص التوتر المخزن المؤقت" كل من صفيحة العقيمة زراعة الأنسجة 24-جيدا جيدا. نقل عينة واحدة كل بئر بمساعدة الملقط.
    4. نقل لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا مع العينات إلى شاكر حاضنة عند 25 درجة مئوية والبدء في الحضانة ح 18 مع "المخزن المؤقت ناقص التوتر".
  2. يوم 2
    1. إعداد حل الحزب الديمقراطي الصربي 0.2% كما هو موضح في الفرع 1-3.
    2. نضح "المخزن المؤقت ناقص التوتر" وغسل العينات مع برنامج تلفزيوني 1 x 1 حاء كرر 3 مرات.
      ملاحظة: نقطة الإيقاف المؤقت: يمكن الاحتفاظ بالنسيج تحت ديسيلولاريزيشن في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية عن ح 18 في ظروف ثابتة.
    3. إزالة برنامج تلفزيوني 1 x وإضافة 1 مل من الحزب الديمقراطي الصربي تقدم طازجة (خطوة 1.3) حل كل بئر واحتضان عينات ح 24.
      ملاحظة: (راجع النقطة) "وظيفة الحزب الديمقراطي الصربي" الحضانة، ضمان أن عينات المعرض بيضاء للمظهر شفافة. في هذه الخطوة، تعامل الحزب الديمقراطي الصربي العينات هي غارق في الحمض النووي، تبين وجود اتساق مثل الجيلاتين. إزالة حل الحزب الديمقراطي الصربي ببطء لتجنب التصاق عينة لنصيحة ماصة.
  3. يوم 3
    1. غسل العينات مع "المخزن المؤقت ناقص التوتر يغسل" (1 مل كل بئر) لمدة 20 دقيقة كرر 3 مرات.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، فإنه من الطبيعي أن نلاحظ انخفاضا في حجم العينة نتيجة لإزالة مخلفات الخلية. نقطة الإيقاف المؤقت: الأنسجة تحت ديسيلولاريزيشن يمكن أن يوضع في "المخزن المؤقت ليغسل ناقص التوتر" عند 4 درجة مئوية عن ح 18 في ظروف ثابتة.
    2. أضف 1 مل من محلول "العلاج الدناز" كل بئر واحتضان هذه العينات ح 3 في 37 درجة مئوية.
    3. نضح الحل "العلاج الدناز" وغسل العينات مع 1 x برنامج تلفزيوني (1 مل كل بئر) لمدة 20 دقيقة كرر 3 مرات. أداء يغسل نهائي مع برنامج تلفزيوني 1 x (1 مل كل بئر) بين عشية وضحاها في الرايت وتهز 60 لفة في الدقيقة.
    4. (نقطة تفتيش) بعد العلاج الدناز، ضمان أن العينات ديسيلولاريزيد فقدوا الاتساق مثل الجيلاتين.
      ملاحظة: بعد العلاج الدناز، إزالة وإضافة 1 x PBS بلطف حيث يمكن بسهولة أكمنة عينات وتعلق على الحافة ماصة.

4-تقييم لإزالة خلايا الأنسجة ديسيلولاريزيد

  1. إصلاح العينات في صفيحة زراعة الأنسجة 24-حسنا، 1 عينة الواحدة وكذلك، عن طريق إضافة 1 مل محايدة تقدم طازجة الفورمالين 10% المخزن المؤقت مع 0.03 في المائة ثم مائي ح 2.5-3 في الرايت
    ملاحظة: يتم إضافة ويوزين إلى مثبت لوصمة عار الأنسجة ديسيلولاريزيد وتخفيف التصور عينة خلال تمزيقها وتلطيخ نسيجية. إضافة ويوزين لا يتداخل مع البقع النسيجي لا مع تقنيات الفلورة. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يتم التثبيت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  2. إزالة الحل مثبت وإضافة 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني لغسل العينة.
  3. تغليف بيوسكافولدس الثابتة في جل معالجة الأنسجة باستخدام قالب عينة الفينيل القابل للتصرف وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  4. إزالة جل علم الأنسجة بالعينة جزءا لا يتجزأ من العفن ونقل إلى خزعة تجهيز/تضمين "أشرطة الكاسيت" مع غطاء.
    ملاحظة: بديل للأنسجة التضمين في علم الأنسجة وتجهيز جل لمعالجة كل عينة في الأسفنج خزعة اثنين مع المسام الصغيرة. يجب أن تكون مترجمة العينات إلى مركز الأسفنج خزعة لتمكين الكشف عن. من المذكرة، يكون من الصعب على ترجمة هذا النهج باستخدام بعض العينات.
  5. معالجة العينات البارافين التضمين من خلال إينكوبيشنز المتعاقبة (30 دقيقة لكل حل) في سلسلة من تركيزات الكحول (70%، 80%، 90%، 100 ٪، 100 ٪)، إيسوبارافينيك الهيدروكربونية الاليفاتيه الحل (مراكز حضانة 2) والكيروسين (الحضانة 2 محطات) في 56 درجة مئوية.
  6. تحميل العينات في كتلة بارافين.
  7. قص 3 ميكرومتر سميكة البارافين الفروع المتعلقة مبضع وجمع المقاطع على الشرائح الزجاجية المجهر.
  8. مقاطع البارافين الجافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم تخزين المقاطع البارافين (وقفه نقطة) في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  9. للتحقق من فعالية البروتوكول، أداء هيماتوكسيلين وويوزين (H & E) و Trichrome ماسون لتلطيخ (طن متري) من المقاطع عينة ديسيلولاريزيد وإلى أجزاء من الأنسجة غير معالجته وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: ح & ه تلوين البقع خلية نويات أزرق/أرجواني، السيتوبلازم الظلام الوردي الأحمر والوردي شاحب الكولاجين والنقل المتعدد الوسائط بقع من نواة سوداء والسيتوبلازم أحمر، والكولاجين والميوسين الأزرق. ديسيلولاريزيشن كفاءة ويتحقق عند وردي الخفيفة المسامية (H & E، طن متري) ويلاحظ الأزرق (MT) شبكة، في غياب وصمة عار النووية.

5-تقييم لإزالة المواد النووية الأنسجة ديسيلولاريزيد

ملاحظة: يجب إجراء التقدير الكمي لمحتوى الحامض النووي في أنسجة ديسيلولاريزيد بالمقارنة مع الأنسجة غير التلاعب بها كل منهما.

  1. قبل ديسيلولاريزيشن، تزن أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل على نطاق رقمية عالية دقة. نقل الأنسجة القلبية إلى الأنبوب وإزالة كمية إضافية من برنامج تلفزيوني 1 x وتزن الأنبوب مع العينات. حساب الوزن الرطب من العينات:
    عينةمن الوزن الرطب = وزن الأنبوبة مع عينات – وزن الأنبوبة فارغة
  2. ديسيلولاريزي العينات كما هو موضح في الخطوة 3.
  3. وبعد ديسيلولاريزيشن، جمع الأنسجة ديسيلولاريزيد في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
    1. بسبب أبعاد صغيرة والجماهيري لعينات القلب فرادى ومجموعة المواصفات، تجمع الأنسجة ديسيلولاريزيد لكل شرط عينة (قلب الجنين: 5 قلوب كله؛ والكبار LV explants: 15 explants). تنفيذ نفس الإجراء مع الأنسجة عدم التلاعب بها.
      ملاحظة: (نقطة الإيقاف المؤقت) العينات التي يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية حتى يتم تنفيذ استخراج الحمض النووي، والتقدير الكمي.
  4. قطع غير التلاعب وديسيلولاريزيد الأنسجة explants الصغيرة مع مساعدة مشرط في طبق بتري نظيفة.
    ملاحظة: استخدام المبضع الفردية وطبق بيتري لكل عينة. اختلال ميكانيكية للعينات مع مشرط يسهل الهضم الأنزيمي الخلفي، واستخراج الحمض النووي اللاحقة.
  5. لاستخراج الحمض النووي، استخدام أسلوب عمود دوران على أساس استخراج الحمض النووي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    1. جمع العينات ميكانيكيا ينتابها من طبق بيتري مع الهضم الرئيسي المخزن المؤقت (المخزن المؤقت الهضم والبروتيناز ك) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة باستخدام تلميح ماصة واسعة فوهة.
      ملاحظة: تحلل الأنسجة مع "ك بروتيناز" الهضم أسرع في عينات ديسيلولاريزيد. لتجهيز عينات متميزة في نفس الوقت، الاحتفاظ بعينات تفكيك على الجليد، حتى يتم تفكيك جميع العينات إلى أدنى حد من التدهور. ويتحقق تحلل عينات كاملة بين ح 4-6.
    2. المضي قدما في البروتوكول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    3. لزيادة الغلة من الحمض النووي المستخرج من عينات الأنسجة ديسيلولاريزيد وغير ديسيلولاريزيد، الوت الحمض النووي في ميكروليتر 25-50 و 100 ميكروليتر من شطف المخزن المؤقت، على التوالي. جمع الحمض النووي الوتيد وتحميل تدور العمود. احتضان لمدة 1 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي الرايت العينات وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: يمكن (وقفه نقطة) المستخرجة من العينات "الحمض النووي" مخزن في-20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  6. تحديد كمية الحمض النووي المستخرج من العينات مع مجموعة كشف دسدنا نيون اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  7. تطبيع محتوى الحمض النووي نانوجرام من الحمض النووي في مليغرام من عينة أولية من الوزن الرطب (قبل ديسيلولاريزيشن).

6-ديسيلولاريزيد السقالات خلية البذر

ملاحظة: جميع الحلول/الكواشف تحتاج إلى أن تكون عقيمة وتنفيذ الإجراءات بأكملها في ظروف معقمة.

  1. إعداد x DPBS 1 مع 2.5 ميكروغرام/مل من الامفوتريسين B و 1% P/S (البنسلين، 100 وحدة دولية؛ ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل).
  2. إزالة 1 × الحل برنامج تلفزيوني من آخر خطوة الغسيل ديسيلولاريزيشن (الخطوة 3.3.3) وإضافة 500 ميكروليتر كل بئر الطازجة (1) x دببس/2.5 ميكروغرام/مل من محلول B/1% P/S الامفوتريسين. تخزين العينات في 4 درجات مئوية من 1-7 أيام.
    ملاحظة: تخزين العينات في 4 درجات مئوية من المهم الحفاظ على العقم.
  3. أضف P/S خلية الإعلام القاعدية (دون FBS والمكملات الغذائية) إلى تركيز نهائي من 1%.
  4. نضح 1 x دببس/2.5 ميكروغرام/مل من محلول B/1% P/S الامفوتريسين من العينات ديسيلولاريزيد. إضافة 500 ميكروليتر كل من الخلية القاعدية media/1% P/S جيدا وترك عينات حجته ح 1 في 37 درجة مئوية، أو عند 4 درجة مئوية لأكثر من ح 1.
  5. تقسيم خلايا اهتمام وتحضير مختبرين صغيرة من الخلايا في خلية الكثافة المرغوب.
    ملاحظة: بذر الأنسجة ديسيلولاريزيد يجب إجراء تحت مجهر مجسمة وفي ظروف معقمة. خلية ثقافة وسائل الإعلام يجب أن يحتوي على 1% P/s.
  6. "الماصة؛" 3-4 ميكروليتر من دببس إلى مركز بئر صفيحة 96-جيدا. استخدام ملاقط رقيقة والمستقيم، نقل السقالات ديسيلولاريزيد لإسقاط دببس وإزالة دببس إضافية بالطموح وتأكد من أن العينة لا مطوية أو التجاعيد. فلتصبح جافة في الحواف لتنضم إلى السطح جيدا.
    ملاحظة: قد فصل السقالات أقل كفاءة البذر.
  7. إضافة خلايا إلى السقالة التي بيبيتينج الحل خلية واحدة ببطء ضد حواف البئر.
    ملاحظة: على سبيل المثال، كارديوميوسيتيس الفئران حديثي الولادة هي المصنف مع كثافة 7500 خلايا/مم2 والماوس مخلدة لين− السلف القلب خلايا Sca-1+ (المركزهيئة الأوراق المالية-1) في كثافة 60-1,500 الخلايا/مم2. ضبط كثافة الخلية وفقا للمنطق التجريبي.
  8. إضافة دببس إلى الآبار المجاورة لتجنب التبخر سريع وسائل الإعلام.
  9. 24 ساعة بعد خلية البذر، إذا انضمت إلى ألواح البوليسترين زراعة الأنسجة (باﻻتصال)، نقل نوع الخلية المستخدمة بيوسكافولدس إلى بئر جديدة. خلاف ذلك، قم باستبدال المتوسط إلى إزالة الخلايا غير ملتصقة.
  10. تغيير بعناية وسائل الإعلام وفقا للمتطلبات المحددة لنوع الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وينبغي تقييم كفاءة ديسيلولاريزيشن من خلال التقنيات الرئيسية الثلاثة: المراقبة العيانية، وعلم الأنسجة والكمي الحمض النووي. ويؤثر العيانية مظهر عينات بوست--الحزب الديمقراطي الصربي العلاج غير مباشر فعالية إزالة خلية. بعد حضانة الحزب الديمقراطي الصربي، يجب أن تظهر العينات شفافة إلى بيضاء (الشكل 1). الجنين (E18) ديسيلولاريزيد الأنسجة تتميز ببنية شفافة جداً بينما explants الكبار شفافة لمظهر اللون الأبيض. مظهر أكثر بياضا يرتبط عموما بشبكة إدارة المحتوى في المؤسسة العارضة أعلى من الألياف والكولاجين المحتوى، مثل سفن البطين والأوعية الدموية الكبار ECM مش (الشكل 1). الهيماتوكسيلين & ويوزين (H & E) و/أو البقع تريتشرومي (MT) ماسون لتتم لتأكيد إزالة خلية فعالة بمراقبة شبكة مسامية (الوردي الخفيفة، ح & ه؛ والضوء الوردي والأزرق، MT) (الشكل 1). وباﻹضافة إلى ذلك، يبرز وصمة عار MT meshwork الكولاجين في الأزرق5. إزالة المواد النووية بعد الوصول إلى ديسيلولاريزيشن بواسطة القياس الكمي الحمض النووي وخفض حوالي 99.8% يتم الحصول عموما، عند مقارنتها بأنسجة غير التلاعب (الشكل 1). قد وصفت وجود المواد النووية على السقالات ديسيلولاريزيد كمشغل للاستجابة الالتهابية غير مرغوب فيها على غرس14. ولهذا السبب، تأكيدا لكفاءة ديسيلولاريزيشن ضروري قبل تجارب إعادة تعمير سقالة 3D الأصلي. ديسيلولاريزيد السقالات قد تكون مخزنة في ظروف معقمة حتى البذر مع خلايا الفائدة. ويرصد بقاء الخلية في جميع أنحاء الثقافة في المختبر كالسين تلطيخ (الشكل 2A). ومع ذلك، يمكن أن تكون وصمة عار كالسين السامة للخلايا لأنواع الخلايا الحساسة. تحليل المحطة الطرفية لتعمير الخلية والتوزيع عبر السقالات هو أداء البارافين بعد المعالجة؛ تظهر لقطة لتعمير بيوسكافولد يقيمها ح & ه تلطيخ في قسم مركزي من بيوسكافولدس (الشكل 2، ج 2).

Figure 1
رقم 1. الجنين (E18) وأنسجة القلب الكبار ديسيلولاريزيشن الداخلي وتأكيد الكفاءة ديسيلولاريزيشن. (أ) نظرة عامة على البروتوكول. (ب) بروتوكول ديسيلولاريزيشن بالتفصيل. (ج) تحليل العيانية للقلب من الأنسجة الجنينية والكبار قبل وبعد ديسيلولاريزيشن. شريط مقياس: 2- (د) القياس الكمي للمواد النووية في ديسيلولاريزيد مقابل عدم التلاعب الأنسجة. بيانات أعرب يعني اختبار t ± sem. الطالب، ثنائي الطرف * p < 0.05. (ه) ح & ه وماسون في Trichrome نسيجية تحليل الأنسجة الجنينية والكبار القلب قبل وبعد ديسيلولاريزيشن. شريط الحجم: 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الرقم 2. تحليل إعادة تعمير السقالات ديسيلولاريزيد المصنف مع خط الخلية السلف القلب لين-الهيئة-1+ (المركزهيئة الأوراق المالية-1). (أ) لاحظ بقاء الخلية عالية في السطح السقالات أثناء الثقافة في المختبر بوصمة عار كالسين (أخضر). شريط الحجم: 100 ميكرومتر. (ب) خلية العدد والتوزيع عبر السقالات تقييمها عن طريق تلطيخ ح & ه. شريط الحجم: 100 ميكرومتر. (ج) عرض متعامد الخلايا المدمجة في إدارة المحتوى في المؤسسة ديسيلولاريزيد. [كنفوكل] الصورة من قسم البارافين 50μm سميكة. شريط الحجم: 10 ميكرومترات (عرض متعامد، XZ YZ) و 40 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الخطوة المراقبة السبب المحتمل المشكلة الحل
3.1.2. الأنسجة بلون البنى كريوفيكسيشن العينة؛ درجة حرارة التجميد غير مستقرة كريوفيكسيشن عينة سوف يؤدي إلى عدم كفاءة إزالة البروتينات هيولى تخزين الأنسجة المجمدة خلال فترات أقصر. فحص درجة حرارة الثلاجة والاستقرار
3.2.4. عينات كامد اللون الوردي إلى الأبيض حل الحزب الديمقراطي الصربي لم يكن مستعدا جيدا؛ الكبار explants LV كبيرة جداً عدم كفاءة إزالة البروتينات هيولى ضمان حل الحزب الديمقراطي الصربي كاملة. ديسيلولاريزي عينات حجم أصغر.
3.3.4. عينات مع مظهر مثل الجيلاتين عدم كفاءة إزالة الحمض النووي عدم كفاءة إزالة المواد النووية زيادة وقت الاعتقال و/أو حضانة الدناز.
4.6. انضغاط جل علم الأنسجة وقت انتظار طويل في PBS1X/الإيثانول قبل تجهيز برافين تغيير بنية الأنسجة ديسيلولاريزيد بدء نسيجية تجهيز أسرع
6.6. عينات ديسيلولاريزيد المجففة وتركت العينات الجافة لفترة طويلة جداً الدائمة من انهيار النسيج ديسيلولاريزيد. عدم كفاءة الخلية البذر تسمح العينات إلى الجاف قليلاً فقط في المحيط كي تصبح تعلق على الجزء السفلي من البئر أثناء البذر
6.7. مفرزة ديسيلولاريزيد عينة أثناء البذر عينات لم تكن كافية المجففة قبل البذر عدم كفاءة الخلية البذر زيادة وقت التجفيف ECM للسماح بانضمام أفضل قبل الخلية البذر

الجدول 1- استكشاف الأخطاء وإصلاحها من الجدول ديسيلولاريزيشن موازية للجنين (E18) وأنسجة القلب الماوس الكبار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هو meshwork ديناميكية للغاية ومعقدة من glycoproteins الليفي ولاصقة، تتكون من خزان من الببتيدات النشطة بيولوجيا وفخ النمو عوامل عديدة. المغير الرئيسية التصاق الخلايا وديناميات cytoskeleton، حركية والهجرة، وانتشار، والتمايز والمبرمج، تنظم إدارة المحتوى في المؤسسة بنشاط وظيفة الخلوية والسلوك. مع العلم أن يختلف سلوك الخلوية في 2D و 3D الثقافات، بذلت جهود لتطوير نماذج أورجانوتيبيك الرواية التي يمكن دقة تحاكي بيئات الأنسجة الطبيعية. في السنوات الأخيرة، برز ديسيلولاريزيشن الأنسجة كأسلوب بديل للطب الهندسة والتجدد في الأنسجة. وهكذا، ديسيلولاريزيشن الأنسجة والجهاز حاليا الأداة المفضلة تشريح أفضل المعلمات الخاصة بالانسجة ميكرونفيرونمينتال (الكيمياء الحيوية والهيكلية والميكانيكية) والنشاط البيولوجي في المختبر والمجراه في.

قمنا بتطوير بروتوكول الذي يجمع بين استخدام المخزن المؤقت ناقص التوتر بمطهر خصائص السطح أنيونى تليها الدناز معاملة5،،من1213. هذا البروتوكول يشكل وسيلة بسيطة واستنساخه لإجراء تحليل مقارن بين أنسجة القلب ديسيلولاريزيد الماوس الجنين والكبار. أن تجربتنا مع الأنسجة الأخرى، أي مع عينات الورم المستمدة من ريسيكتيونس مرضى السرطان الجراحية وأنسجة الرئة الماوس، يظهر أن هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة ونجاحاً في ظروف أخرى ونماذج12،13. يسمح تطبيق نفس الإجراء ديسيلولاريزيشن على عينات مختلفة دراسات مقارنة لتشكيل إدارة المحتوى في المؤسسة وخصائص النشاط الحيوي، والهندسة المعمارية وخصائص مودولاتوري الخلوية في إطار ثلاثي الأبعاد.

واحدة من أصعب التحديات للأنسجة ديسيلولاريزيشن هو التوازن بين إزالة خلية الصريح، والحفاظ على ميشوورك إدارة المحتوى في المؤسسة وتوافق مع نسيج الحياة. ومن ثم، عدة خطوات حاسمة تحتاج إلى النظر بعناية، مثل وقت تجميد الأنسجة قبل ديسيلولاريزيشن وحجم اكسبلانت الصحيح واستخدام حلول جديدة والتلاعب بالانسجة ديسيلولاريزيد النهائية. لاحظنا خلال دراساتنا، علاقة طردية بين وقت التخزين الطويل cryopreserved الأنسجة واستخدام الحلول الحزب الديمقراطي الصربي منذ فترة طويلة مع عدم الكفاءة ديسيلولاريزيشن. التخزين الأنسجة على المدى الطويل يؤدي إلى عدم كفاءة إزالة المحتوى الخلوية تقديم مخلفات المناطق الخلوية سميكة (بدون نوى) بين meshwork ECM المعقدة. يتحقق له أثر غير مرغوب فيه مشابهة عند استخدام المخزن طويل الحزب الديمقراطي الصربي الحلول للأنسجة ديسيلولاريزيشن، عرضه لأن الحزب الديمقراطي الصربي الحلول لها استقرار قصيرة نظراً لانخفاض قابلية الذوبان والتحلل المائي ودرجة الحموضة التعديلات على مر الوقت15،16 . استخدام explants بالحجم الصحيح (~1.5 مم × 1.5 مم × 1.5 مم) ضروري أيضا ديسيلولاريزيشن أنسجة البالغين الناجحة، منذ أكثر من الصعب ديسيلولاريزي أكبر الأنسجة ريسيكتيونس، عرض خلية الحطام أكمنة على السطح والقبض بين الشبكة الكثيفة من إدارة المحتوى في المؤسسة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يوفر طريقة فعالة لانسجة القلب ديسيلولاريزيشن، جزء طفيف من explants الكبار قد يقدم مخلفات الخلية، لا سيما تلك ذات حجم أكبر. يخفف نسيجية تحليل هذه العينات تحديد الهوية والإقصاء اللاحقة من الدراسة. وفي نهاية المطاف، البروتوكول هنا تنوعاً وسهولة المطبقة على العينات متميزة مع تعديلات طفيفة على حجم explant الأنسجة، تركيز الحزب الديمقراطي الصربي (0.1-0.2% الحزب الديمقراطي الصربي) أو حل الحضانة الساعة5،12،13 .

القيد الرئيسي من الأسلوب الحالي هو أن التلاعب بعينات صغيرة الحجم، أي مورين قلب الجنين وقلب الكبار explants، يتطلب مهارات التعامل مع بعض. وفي الواقع، الأنسجة ديسيلولاريزيد الأجنة والبالغين على حد سواء هي الهياكل الحساسة التي يمكن أن تكون مشوهة بشكل دائم عند تجفيفها أثناء الإجراء أو شرك بنصيحة رقيقة ماصة أو أثناء التعامل مع الملقط5.

الجدة الكبرى لهذا البروتوكول، بالإضافة إلى ديسيلولاريزيشن موازية لقلب الجنين الماوس و explants الكبار البطين الأيسر للتقييم المقارن لتكوين إدارة المحتوى في المؤسسة (تحليل النشاط الحيوي) والوظيفة البيولوجية المرتبطة بها، هي بسيطة الترجمة متميزة الأنسجة ونماذج5،،من1213. ووصفت ديسيلولاريزيشن لانسجة إعمار متميزة بتطبيق منهجية موحدة فقط على الكلي الريسوسي القرد، والمقاطع العرضية لانسجة الأجنة والأطفال حديثي الولادة والكبار، التي تعرضت لعلاج مخزونات النشر الاستراتيجي 1% لمدة 10 أيام6 . في القلب، على الرغم من أن الجنين، وقد تم ديسيلولاريزيد أنسجة الأطفال حديثي الولادة والكبار، تختلف الأساليب على درجة إزاحة الميكانيكية وتركيزات الحزب الديمقراطي الصربي ووقت التطبيق7،8. كما يؤثر كل إجراء ديسيلولاريزيشن إدارة المحتوى في المؤسسة بطريقة فريدة من نوعها، مقارنة ديسيلولاريزيد العينات التي تم الحصول عليها من بروتوكولات مختلفة قد يؤدي إلى نتائج مضللة. ومن ثم تطبيق نفس الإجراء ديسيلولاريزيشن عبر عينات مختلفة تمكن التحليل المقارن يمكن الاعتماد عليها.

الغالبية العظمى من أنسجة ديسيلولاريزيد المتاحة تجارياً مستمدة من العينات البالغين17. وعلى الرغم من الاعتراف المتزايد لزيادة قدرة للجنين ميكرونفيرونمينتس في تقديم إشارات برو-التجدد بالمقارنة مع نظرائهم الكبار، أبلغ ديسيلولاريزيشن أنسجة الجنينية فقط في الدراسات القليلة5، 7 , 18 , 19 , 20 , 21-ECM فهم ديناميات أثناء عملية الشيخوخة ستكون حاسمة لتحديد ميزات فريدة من نوعها من ميكرونفيرونمينتس برو التجديدي الذي، بدوره، سوف تؤثر على تطوير كفاءة أعلى المحاكاة البيولوجية-المواد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب مدينون لجميع الأعضاء في مختبر بينتو-دو-Ó للمناقشة الهامة ذات الصلة. هذا العمل كان تدعمها مؤسسة معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا Programa الفقرة Ciência ه تكنولوجيا (إقليم العاصمة الاتحادية) في إطار مشروع "المهندسة كارديوستيم أنسجة القلب والعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية للقلب والأوعية الدموية التطبيقات" (ميتب-السل/اللجنة الاقتصادية لأوروبا/0013/2013). A.C.S. حاصلة على زمالة إقليم العاصمة الاتحادية [سفره/BD/88780/2012] و M.J.O. وهو "زميل إقليم العاصمة الاتحادية" (إقليم العاصمة الاتحادية-المحقق عام 2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker Orbital Shakers IKA:3510001 Recommended
Fluorimeter - - Equipment available
Digital weight scale - - Equipment available
Inverted Microscope - - Equipment available
Cell culture incubator - - Equipment available
Fridge (4ºC) - - Equipment available
Deep freezer (-80ºC) - - Equipment available
Microtome - - Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge Fine Science Tools 5000-08 Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11254-20 Recommended
Dumont 7 forceps Fine Science Tools 11272-30 Recommended
Dissecting Scissors, straight - - Tool available
Forceps, serrated, curved - - Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped VWR 29442-044 -
96 well plates, individually wrapped VWR 71000-078 -
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized Millipore SE1M179M6 -
Eppendorff - - Material available
15 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430791 -
50 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430829 -
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid Electron Microscopy Science 70075-B -
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 22-037-246 -
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006 -
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) Sigma-Aldrich 277258-1L -
Dry ice - - -
Decellularization
NaCl BDH Prolabo 27810.364 -
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S-31264 -
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-100g -
KCl Sigma-Aldrich P8041-1KG -
TrisBASE Sigma-Aldrich T6066-500G -
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L-4390 -
MgCl2 MERCK 1.05833.1000 -
DNAse I AplliChem A3778,0050 -
Gentamicin Gibco 15710-049 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Deionized water (DI water) - - -
Histology
10 % formalin neutral buffer Prolabo 361387P -
Eosin Y AQUEOUS Surgipath 01592E Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 -
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous Aga 4,006,02,02,00 -
Deionized water (DI water) - - -
Clear Rite 3 Richard-Allan Scientific 6915 -
Shandon Histoplast Thermo Fisher Scientific RAS.6774006 -
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific K182001 -
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit Invitrogen P11496 -
Cell culture
DPBS VWR 45000-434 -
Penicillin-Streptomycin Solution 100X Labclinics L0022-100 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Cell culture media of the cell of interest - - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  3. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  5. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. 3rd Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
  8. Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
  10. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  11. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  12. Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
  13. Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
  14. Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
  15. Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
  16. Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
  17. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
  18. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  19. Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
  20. Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
  21. Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).

Tags

الهندسة الحيوية، 145 قضية، ديسيلولاريزيشن، والمصفوفة خارج الخلية، والسقالات 3D، قلب الجنين، وقلب الكبار، هندسة الأنسجة القلبية

Erratum

Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 04/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

ديسيلولاريزيشن مماثلة لانسجة القلب الجنين والكبار Explants كمثل 3D منهاجي في المختبر الدراسات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, A. C., Oliveira, M. J.,… More

Silva, A. C., Oliveira, M. J., McDevitt, T. C., Barbosa, M. A., Nascimento, D. S., Pinto-do-Ó, P. Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (145), e56924, doi:10.3791/56924 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter