Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Sammenlignelige Decellularization af føtale og voksne hjerte væv Explants som 3D-lignende platforme til i Vitro undersøgelser

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/56924
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,5, 4,6, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

ERRATUM NOTICE

Summary

Den kardiale ekstracellulære matrix (ECM) er et komplekst netværk af molekyler, der orkestrere centrale processer i væv og organer mens enduring fysiologiske remodeling hele livet. Standardiseret decellularization af føtale og voksne hjerter tillader sammenlignende eksperimentelle undersøgelser af både væv i forbindelse med 3D ved at indfange indfødte arkitektur og biomekaniske egenskaber.

Abstract

Nuværende viden af ekstracellulære matrix (ECM)-celle kommunikation kan oversættes til store todimensionale (2D) in vitro kultur studier hvor ECM komponenter er præsenteret som en overfladebehandling. Systemerne kultur udgør en forenkling af den komplekse karakter af væv ECM, der omfatter biokemiske sammensætning, struktur og mekaniske egenskaber. For at bedre emulere ECM-celle kommunikation forme den kardiale mikromiljø, vi udviklede en protokol, der giver mulighed for decellularization af den hele fosterets hjerte og voksen venstre ventrikel væv explants samtidigt for sammenlignende undersøgelser. Protokollen kombinerer brugen af et hypotonic buffer, et rengøringsmiddel af anioniske overfladeaktive egenskaber, og DNase behandling uden krav til specialiserede færdigheder eller udstyr. Anvendelse af den samme decellularization strategi på tværs af vævsprøver fra fag af forskellige alder er en alternativ metode til at udføre sammenlignende undersøgelser. Denne protokol giver mulighed for identifikation af unikke strukturelle forskelle på tværs af føtale og voksne hjerte ECM mesh og biologiske cellulære svar. Desuden, den heri metode viser et bredere program anvendes med succes i andre væv og arter med mindre justeringer, som i human tarmen biopsier og mus lunge.

Introduction

Den ekstracellulære matrix (ECM) er en dynamisk netværk af molekyler, der regulerer vigtige cellulære processer, nemlig skæbne-beslutning, spredning og differentiering1,2. Undersøgelsen af celle-ECM interaktioner er udført primært i todimensionale (2D) i vitro kulturer belagt med ECM komponenter, der udgør en forenkling af indfødte ECM egenskaber findes i vivo. Decellularization genererer acellulær 3D-lignende ECM bioscaffolds, der i høj grad bevarer den ekstracellulære arkitektur og sammensætningen af indfødte væv og organer3,4. Ud over at fungere som bioaktive stilladser for vævsmanipulering, decellularized 3D ECM biomaterialer fremstår som nye platforme at vurdere celle-ECM biologi at parallel in vivo miljø.

Vurdering af ECM komponenter af forskellige væv, organer og alder differential rolle vil gavne med brug af lignende protokoller at generere indfødte bioscaffolds. I hjertet, har vi udviklet en alsidig protokol for decellularization af føtale og voksne-afledte prøver, som en alternativ tilgang til at udføre sammenlignende undersøgelser af orgel mikromiljø. Du bruger denne metode, vi fanget den indfødte hjerte mikromiljø og viste, at fostrets ECM fremmer højere genindsættelse udbytter af cardiac celler5. Decellularization fastsat yderligere identifikation af hjemmehørende strukturelle forskelle mellem føtale og voksne ECM på niveau med kælder lamina og pericellular matrix mesh arrangement og fiber sammensætning5. Forud for dette arbejde, er head-to-head sammenligning af væv på forskellige ontogenic faser ved hjælp af den samme decellularization tilgang kun blevet rapporteret til rhesus abe nyrer og gnaver hjerter. Derudover rapport et begrænset antal undersøgelser føtalt væv/organ decellularization i sig selv5,6,7. Dette er opnået ved hjælp af SDS som en unik decellularization agent; dog blev særskilt SDS koncentrationer brugt til decellularization af føtale og voksne hjerte væv7,8. SDS er en af de mest effektive Ioniske detergenter for clearance af cytoplasmatisk og nukleart materiale, og udbredt i decellularization af forskellige væv og prøver9,10. Opløsninger indeholdende høje SDS koncentrationer og længere perioder af eksponering er blevet korreleret med protein denaturering, glykosaminoglykan (gag) tab og forstyrrelser af kollagen fibriller10,11, og derfor en balance mellem ECM bevarelse og celle fjernelse er nødvendige. For at anvende samme procedure føtale og voksne hjerte væv, protokollen beskrevet heri er opdelt i tre sekventielle trin: celle lysering af osmotisk chok (hypotonic buffer); oploesning af lipid-proteiner, DNA-protein og protein-protein interaktioner (0,2% SDS); og nukleare materialeaftagning (DNase behandling).

Vores protokollen viser flere fordele: Jeg) muligheden for tilsvarende decellularization af aldersspecifikke hjerte væv ved anvendelse af den samme decellularization strategi; II) ingen krav til specialiserede metoder eller udstyr; III) klar tilpasning til andre væv og arter, som det har været anvendt med succes med mindre ændringer i human tarmen biopsier12 og mus lunge13; og, vigtigst, iv) kan løse ECM biomekaniske egenskaber samtidig med at forsamlingen af 3D-lignende organotypic kulturer, mere nøje efterligne de molekylære funktioner af den oprindelige væv mikromiljø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoderne beskrevet blev godkendt af de i3S dyr etiske komité og Direção Geral de Veterinária (DGAV) og er i overensstemmelse med det europæiske Parlamentet direktiv 2010/63/EU.

1. forberedelse af decellularization løsninger

Bemærk: Alle decellularization løsninger skal filtreres gennem et 0,22 μm membranfilter og gemt i en periode på højst 3 måneder, medmindre andet angives.

  1. For 1 x PBS: Bland 8 g NaCl, 1,01 g Na2HPO4 200 mg af KCl, og 200 mg KH2PO4 med 900 mL deioniseret vand (DI vand). Justere opløsning pH 7,5 og den endelige løsning volumen op til 1 L. Filter, autoklave og store løsning ved stuetemperatur (RT).
  2. For Hypotonic Buffer (10 mM Tris, 0,1% EDTA): opløses 1,21 g af TrisBASE og 1 g af EDTA i 900 mL deioniseret vand. Justere opløsning pH til 7,8 med NaOH/HCl og den endelige løsning volumen til 1 L. Filter, sterilisere af autoklave, og opbevar ved RT.
  3. 0,2% SDS løsning (0,2% SDS, 10 mM Tris): tilføje 0,6 g af TrisBASE og 1 g natriumsulfat teknisk dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS) i 400 mL Deioniseret vand og omrøres ved 60 ° C indtil komplet opløste opløsning. Lad løsning at køle ned til RT. Juster løsning pH til 7,8 og den endelige løsning volumen til 500 mL. Sterilisere løsning ved filtrering.
    Bemærk: SDS løsning bør være forberedt før brug. Filter løsning kun efter komplet SDS opløsning, ellers SDS uopløselige partikler vil mætte filter, ændre den endelige SDS koncentration og dermed påvirker væv decellularization effektivitet.
  4. For Hypotonic vaskebuffer (10 mM Tris): Bland 1,21 g af TrisBASE i 900 mL DI vand. Justere opløsning pH til 7,8 og endelige mængden til 1 L. Filter, sterilisere af autoklave og gemme på RT.
  5. For DNase behandling (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 U/mL DNase): 2.42 g TrisBASE og 2 mL 1 M MgCl2 i 900 mL Deioniseret vand opløses. Justere pH til 7,8 og den endelige løsning volumen til 1 L. Filter og sterilisere løsning af autoklave. Gemme løsningen på RT. tilføje DNase jeg (50 U/mL) før anvendelsen.
  6. For DNase jeg lagerfører løsning: forberede en DNase-buffer, som indeholder 50% glycerol, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM MgCl2, og tilpasse sig til en endelig løsning volumen på 10 mL med Deioniseret vand. I en laminar flow hætte, tilføje DNase jeg pulver til DNase buffer og bland forsigtigt indtil fuldstændig opløsning. Sterilisere løsning gennem 0,22 μm filter. Forberede 1 mL alikvoter og opbevares ved-20 ° C.

2. Vævscentre høst og kryopræservering

  1. Aflive voksne gravide kvinder på 18 dage af drægtighedsperioden (E18 fostre) via CO2 kvælning. Udfør en kejsersnit på hunner med en kirurgisk saks og indsamle uterin horn bærer de føtale mus til en petriskål med iskold 1 x PBS ved hjælp af to savtakket pincet med buede tips (en pincet til hver horn ende).
    1. Åbn uterin horn og fosterhinden at isolere fostrene. Overføre fostrene til en ny petriskål med iskold 1 x PBS bedøver dem og Hug hovedet af med en saks.
    2. Aflive 7-8 uger gamle mandlige C57BL/6 mus ved hjælp af CO2 kvælning. Udfør et snit på hver mus bryst og indsamle hjertet.
    3. Kort skyl føtale og voksne hjerter med is koldt 1 x PBS.
  2. Fjerne forkamre af voksne hjerte ved hjælp af en skalpel. Udføre et snit på højre hjertekammer og fjerne det ved hjælp af lige lille saks. Udsætte den venstre ventrikel væg ved at fjerne septum. I en ny petriskål, opdele den venstre ventrikel gratis-mur i længderetningen strimler med 2 mm tykkelse og fjerne papillær muskel ved hjælp af en skalpel og savtakket pincet med buede tips.
    1. Punktafgifter lille væv explants ved hjælp af en skalpel, ved hjælp af en 2 mm x 2 mm gitteret (detaljeret beskrivelse i tillægs figur 15). Kort skyl væv explants med 1 x PBS.
  3. Tilføje ~ 250 µL af optimal opskæring temperatur (OCT) sammensatte autoklaveres 1,5 mL microcentrifuge rør. Overføre hele føtal hjerter og voksne hjerte explants til rør med 250 µL i OLT og fryse dem med tøris-kølet isopentane og opbevares ved-80 ° C (til et maksimum på 6 måneder).
    Bemærk: Brugen af hjertets væv explants befrugtede i mere end 6 måneder vil reducere decellularization effektivitet, især i voksen hjerte væv explants.

3. Vævscentre decellularization

Bemærk: Hjerte væv decellularization er udført i en 24-godt vævskultur plade med én prøve pr. brønd. 1 mL af hver decellularization løsning er føjet til hver enkelt godt. Alle decellularization trin skal udføres med agitation på 165 rpm (inkubator shaker med orbital diameter på 20 mm) og ved 25 ° C, medmindre andet er angivet. For flere detaljer, henvises til ordningen på figur 1A. Amphotericin B (f.eks. fungizone) og gentamycin er frisk tilføjet alle decellularization løsninger før brug til en endelig koncentration på 2,5 μg/mL og 0,01 μg/mL, henholdsvis. At kvantificere mængden af DNA i decellularized væv, at prøven masse skal bestemmes før du starter decellularization-protokollen. DNA kvantificering protokol er yderligere beskrevet i afsnit 5.1.

  1. DAG 1
    1. Fjerne vævsprøver fra-80 ° C fryser. Forlade 1,5 mL microcentrifuge rør på RT indtil OCT bliver delvis smeltet. Overføre hjerte væv blok stadig frosne OLT til en petriskål med 1 x PBS.
    2. Når OLT smelter, flytte den hjerte væv til en ny petriskål med 1 x PBS. Vask prøver i 1 x PBS og ved 60 rpm med en shaker i 10-15 min. Gentag mindst to gange.
    3. Der tilsættes 1 mL arbejder Hypotonic Buffer pr. hul med en steril 24-godt vævskultur plade. Overføre én stikprøve pr. brønd ved hjælp af pincet.
    4. Flytte 24-godt vævskultur pladen med prøverne til en inkubator shaker ved 25 ° C og starte 18 h inkubation med Hypotonic Buffer.
  2. DAG 2
    1. Forberede 0,2% SDS løsning, som beskrevet i afsnit 1.3.
    2. Opsug den Hypotonic Buffer og vaske prøver med 1 x PBS for 1 h. Gentag 3 gange.
      Bemærk: PAUSE punkt: vævet under decellularization kan holdes i 1 x PBS ved 4 ° C for 18 h under statiske forhold.
    3. Fjerne 1 x PBS, tilsættes 1 mL af frisklavet SDS løsning (trin 1,3) pr. brønd og Inkuber prøver i 24 timer.
      Bemærk: (CHECK POINT) Post SDS inkubation, sikre, at prøverne udviser en hvid gennemskinnelig udseende. På dette trin, SDS behandlet prøver er dyngvåd i DNA, viser en gelatine-lignende konsistens. Fjerne SDS løsning langsomt for at undgå prøve vedhæftning til pipette spids.
  3. DAG 3
    1. Vask prøver med Hypotonic vask Buffer (1 mL pr. brønd) for 20 min. Gentag 3 gange.
      Bemærk: På dette trin er det normalt at observere et fald i stikprøvestørrelse celle rester fjernes. PAUSE punkt: Vævet under decellularization kan holdes i Hypotonic vaskebuffer ved 4 ° C for 18 h under statiske forhold.
    2. Tilsættes 1 mL DNase behandling pr. brønd og Inkuber prøver i 3 timer ved 37 ° C.
    3. Opsug DNase behandling løsning og vaske prøver med 1 x PBS (1 mL pr. brønd) for 20 min. Gentag 3 gange. Udføre en afsluttende vask med 1 x PBS (1 mL pr. brønd) natten over på RT og ryster ved 60 rpm.
    4. (Check point) Efter DNase behandling, sikre at de decellularized prøver har mistet gelatine-lignende konsistens.
      Bemærk: Efter DNase behandling, fjerne og tilføje 1 x PBS forsigtigt, da prøver kan let lokket i en fælde og knyttet til pipette tip.

4. vurdering af decellularized væv celle fjernelse

  1. Lave prøverne i en 24-godt vævskultur plade, 1 prøve pr. brønd, ved tilsætning af 1 mL af frisklavet 10% formalin neutral buffer med 0,03% vandig eosin for 2,5-3 h på RT.
    Bemærk: Eosin føjes til fiksativ pletten decellularized væv og lette prøve visualisering under skæring og histologiske farvning. Tilføjelsen af eosin hverken interfererer med de histologiske pletter eller immunfluorescens teknikker. Alternativt, fiksering kan udføres natten over ved 4 ° C.
  2. Fjerne den Fikseringsvæske løsning og tilsættes 1 mL af 1 x PBS at vaske prøven.
  3. Indkapsle den faste bioscaffolds i histologi behandling gel ved hjælp af en engangs vinyl modellen skimmel efter fabrikantens anvisninger.
  4. Fjerne histologi gel med prøven indlejret fra mug og overførsel til biopsi forarbejdning/indlejring kassetter med låg.
    Bemærk: Et alternativ til væv indlejring i histologi og behandling gel er at behandle hver prøve i to biopsi svampe med lille porer. Prøverne skal være lokaliseret til midten af biopsi svampe at aktivere registrering. Af note, kan nogle prøver være svært at lokalisere, ved hjælp af denne fremgangsmåde.
  5. Behandle prøver til paraffin indlejring gennem successive inkubationer (30 min per-opløsning) i serien af alkohol koncentrationer (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), isoparaffinic alifatiske kulbrinter løsning (2 inkubation stationer) og paraffin (2 inkubation stationer) på 56 ° C.
  6. Montere prøver i en paraffin blok.
  7. Skær 3 μm tykt paraffinsnit på en mikrotom og indsamle sektionerne på glas objektglas.
  8. Tør paraffinsnit natten over ved 37 ° C.
    Bemærk: (PAUSE punkt) paraffinsnit opbevares ved 4 ° C indtil videre anvendelse.
  9. Du kan kontrollere protokol effektivitet, udføre Hematoxilin og Eosin (H & E) og Masson's Trichrome farvning (MT) af sektionerne decellularized prøve og dele af ikke-manipuleret væv ifølge producentens anvisninger.
    Bemærk: H & E farvning pletter celle kerner blå/lilla, cytoplasma mørk pink/rød og kollagen bleg pink og MT pletter kerner sort, rød, cytoplasmaet og kollagen og mucin blå. Effektiv decellularization opnås, når en porøs lys pink (H & E, MT) og blå (MT) netværk er observeret, i mangel af en nuklear pletten.

5. vurdering af decellularized væv nukleare materialeaftagning

Bemærk: Kvantificering af DNA-indhold på decellularized væv skal udføres i forhold til de respektive ikke-manipuleret væv.

  1. Før decellularization, veje en 1,5 mL microcentrifuge tube på en høj præcision digital skala. Overføre den hjerte væv til røret, fjerne den ekstra mængde 1 x PBS og vejer tube med prøverne. Beregne vådvægt af prøverne:
    Våd vægt = vægt tube med prøver – vægt tomme rør
  2. Decellularize prøver som beskrevet i trin 3.
  3. Efter decellularization, skal du indsamle de decellularized væv ind i et microcentrifuge rør.
    1. På grund af små dimensioner og masse hjerte enkeltprøver og kit specifikationer, pool decellularized væv af hver prøve betingelse (fosterets hjerte: 5 hele hjerter; voksen LV explants: 15 explants). Udføre den samme procedure med den ikke-manipuleret væv.
      Bemærk: (PAUSE punkt) prøverne kan være opbevares ved-20 ° C, indtil DNA-ekstraktion og kvantificering udføres.
  4. Skær den ikke manipuleres og decellularized væv i små explants med hjælp af en skalpel i en ren petriskål.
    Bemærk: Brug en individuel skalpel og petriskål for hver prøve. Mekanisk afbrydelse af prøver med en skalpel letter deres bageste enzymatisk fordøjelse og efterfølgende DNA-ekstraktion.
  5. DNA-ekstraktion, bruge en spin-kolonne baseret DNA ekstraktion metode efter fabrikantens anvisninger.
    1. Indsamle de mekanisk dissocierede prøver fra petriskål med master fordøjelsen buffer (fordøjelsen buffer og proteinase K) ifølge producentens anvisninger ved hjælp af en bred blænde pipette tip.
      Bemærk: Væv lysis med Proteinase K fordøjelsen er hurtigere i decellularized prøver. For at behandle særskilte prøver på samme tid, holde mængden prøver på is, indtil alle prøver er mængden for at minimere nedbrydning. Komplet prøver lysis opnås mellem 4-6 h.
    2. Gå videre med den protokol, ifølge producentens anvisninger.
    3. For at øge udbyttet af ekstraherede DNA af decellularized og ikke-decellularized vævsprøver, elueres DNA på 25-50 μL og 100 μL eluering buffer, henholdsvis. Indsamle de eluted DNA og indlæse spin-kolonne. Inkuber i 1 min på RT. Centrifuge prøveeksemplarer efter fabrikantens anvisninger.
      Bemærk: (PAUSE punkt) The DNA ekstraheret fra prøverne kan opbevares ved-20 ° C indtil videre anvendelse.
  6. Kvantificere den ekstraherede DNA fra prøverne med en fluorescerende dsDNA detection kit efter fabrikantens anvisninger.
  7. Normalisere DNA indhold som nanogram DNA pr milligram af oprindelige stikprøve vådvægt (før decellularization).

6. decellularized stilladser celle såning

Bemærk: Alle løsninger/reagenser skal være sterilt og hele proceduren udføres på sterile forhold.

  1. Forberede 1 x DPBS med 2,5 μg/mL af amphotericin B, og 1% P/S (penicillin, 100 I.U.; streptomycin 100 µg/mL).
  2. Fjerne 1 x PBS løsning fra det sidste decellularization vask trin (trin 3.3.3) og tilsættes 500 μl pr. brønd på den frisklavede 1 x DPBS/2.5 μg/mL af amphotericin B/1% P/S løsning. Opbevare prøver ved 4 ° C fra 1-7 dage.
    Bemærk: Prøver opbevaring ved 4 ° C er vigtigt at bevare steriliteten.
  3. Tilføj P/S til celle basal medier (uden FBS og kosttilskud) til en endelig koncentration på 1%.
  4. Opsug 1 x DPBS/2.5 μg/mL af amphotericin B/1% P/S løsning fra de decellularized prøver. Tilsættes 500 μl pr. brønd af celle basal media/1% P/S og lad prøver Blandingen henstår i 1 h ved 37 ° C, eller ved 4 ° C i mere end 1 h.
  5. Opdel celler af interesse og forberede små prøver af celler med celle tæthed ønskes.
    Bemærk: Decellularized væv såning skal udføres under en stereoskopisk mikroskop og i sterile forhold. Celle Kulturmedier skal indeholde 1% P/S.
  6. Tilsæt 3-4 μl af DPBS til midten af et godt af en 96-brønd plade. Ved hjælp af tynde og lige pincet, overføre de decellularized stilladser til DPBS drop, fjerne den ekstra DPBS ved aspiration, og sørg for, at prøven ikke er foldet eller rynket. Lad det blive tørre på kanten til at overholde de godt overflade.
    Bemærk: Fritliggende stilladser har lavere seeding effektivitet.
  7. Føje celler til skafottet af pipettering encellede løsning langsomt mod kanten af brønden.
    Bemærk: For eksempel, neonatal rotte cardiomyocytes er seedet med med en tæthed på 7.500 celler/mm2 og udødeliggjort mus Lin− Sca-1+ hjerte stamfader celler (iCPCSca-1) med en tæthed på 60-1.500 celler/mm2. Justere celle tæthed ifølge den eksperimentelle rationale.
  8. Føj DPBS til de tilstødende wells at undgå hurtige media fordampning.
  9. 24 timer post celle såning, hvis celletype bruges overholdt vævskultur polystyren plader (TCPS), overføre bioscaffolds til en ny brønd. Ellers, erstatte medium for at fjerne ikke-tilhænger celler.
  10. Ændre omhyggeligt mediet ifølge specifikke krav af typen celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Decellularization effektivitet skal vurderes gennem tre vigtigste teknikker: makroskopisk observation, histologi og DNA kvantificering. Den makroskopiske udseende af prøver post-SDS behandling påvirker indirekte effektiviteten af cellen fjernelse. Efter SDS inkubation, skal prøver vises som gennemsigtige ved hvidlig (figur 1 c). Føtalt (E18) decellularized væv er karakteriseret ved en meget gennemsigtig struktur, mens voksne explants har en gennemskinnelig hvidt udseende. En hvidere udseende er generelt korreleret til en ECM netværk udstiller højere fiber og kollagen indhold, fx de voksne ventrikulære og vaskulære fartøjer ECM mesh (figur 1 c). Hæmatoxylin & Eosin (H & E) og/eller Masson's Trichrome (MT) pletter er udført for at bekræfte effektiv celle fjernelse af observation af en porøs mesh (lys pink, H & E; lys pink og blå, MT) (figur 1 c). Derudover fremhæver MT bejdse kollagen meshwork i blå5. Clearance af nukleart materiale efter decellularization er åbnet ved DNA kvantificering og en reduktion på ca. 99,8% opnås generelt, sammenlignet med ikke-manipuleret væv (figur 1 c). Tilstedeværelsen af nukleart materiale på decellularized stilladser er blevet beskrevet som en udløser af uønskede inflammatorisk respons efter implantation14. Af denne grund er bekræftelse af effektive decellularization vigtigt før native 3D stillads genindsættelse eksperimenter. Decellularized stilladser kan opbevares i sterile forhold op til såning med celler af interesse. Cellernes levedygtighed skal overvåges under hele in vitro kultur af calcein farvning (figur 2A). Ikke desto mindre kan calcein pletten være cytotoksiske til følsomme celletyper. Terminal analyse af celle genindsættelse og distribution på tværs af stilladser er udført efter paraffin behandling; et øjebliksbillede af bioscaffold genindsættelse vurderet af H & E farvning på en central del af bioscaffolds er vist (figur 2B, 2 C).

Figure 1
Figur 1. Føtalt (E18) og voksen hjerte væv decellularization procedure og bekræftelse af decellularization effektivitet. (A) protokol oversigt. (B) Decellularization protokollen detaljeret. (C) makroskopisk analyse af cardiac føtale og voksne væv før og efter decellularization. Skalalinjen: 2 mm. (D) kvantificering af nukleart materiale i decellularized versus ikke-manipuleret væv. Dataene udtrykt som betyder ± SEM. Student's t-test, to-sidede * p < 0,05. (E) H & E og Masson's Trichrome histologiske analyse af cardiac føtale og voksne væv før og efter decellularization. Skalalinjen: 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Genindsættelse analyse af decellularized stilladser seedede med Lin - Sca-1+ hjerte stamfader cellelinje (iCPCSca-1). (A) høj cellernes levedygtighed observeret på stilladser overflade under in vitro kultur af calcein pletten (grøn). Skalalinjen: 100 μm. (B) celle antal og fordeling på tværs af stilladser vurderet via H & E farvning. Skalalinjen: 100 μm. (C) ortogonale visning af celler er integreret i decellularized ECM. Konfokal billede af 50μm-tykke paraffin afsnit. Skalalinjen: 10 μm (ortogonale Se XZ, YZ) og 40 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Trin Observation Mulig årsag Problem Løsning
3.1.2. Væv med en brunlig farve Prøve cryofixation; ustabile indefrysning temperatur Prøve cryofixation vil føre til ineffektive fjernelse af cytoplasmatisk proteiner Gemme frossen væv i kortere perioder. Check fryser temperatur og stabilitet
3.2.4. Rosa til hvid uigennemsigtig prøver SDS løsning var ikke godt forberedt; voksen LV explants for store Ineffektiv fjernelse af cytoplasmatisk proteiner Sikre fuldstændig SDS opløsning. Decellularize prøver af mindre størrelse.
3.3.4. Prøver med en gelatine-lignende udseende Ineffektiv DNA fjernelse Ineffektiv nukleart materiale clearance Øge DNase koncentration og/eller inkubation tid.
4.6. Histologi gel jordpakning Lange ventetider i PBS1X/ethanol før paraffin behandling Ændring af decellularized væv struktur Start histologiske behandling hurtigst muligt
6.6. Tørrede decellularized prøver Prøver var overladt til tørre alt for længe Permanent kollaps af decellularized væv. Ineffektiv celle såning Tillad prøver lidt tør kun i periferien for at blive fastgjort til bunden af brønden under såning
6.7. Decellularized prøve detachement under såning Prøver var ikke tilstrækkelige tørret før såning Ineffektiv celle såning Øge ECM tørretid tillade bedre overholdelse forud for celle såning

Bord 1. Fejlfinding tabel for parallelle decellularization af føtal (E18) og voksen mus hjerte væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den ekstracellulære matrix (ECM) er en meget dynamisk og kompleks meshwork af fiber og klæbende glykoproteiner, bestående af et reservoir af mange bioaktive peptider og fanget vækstfaktorer. Som den store modulator celle vedhæftning, cytoskeleton dynamics, motilitet/migration, spredning, differentiering og apoptose regulerer ECM aktivt cellefunktion og adfærd. Vel vidende at cellulære adfærd afviger i 2D og 3D kulturer, har der været bestræbelser på at udvikle nye organotypic modeller, der kan præcist replikerer naturlige væv miljøer. I de sidste år fremstod væv decellularization som en alternativ teknik til tissue engineering og regenerativ medicin. Væv og orgel decellularization er således i øjeblikket den bedste værktøj til bedre dissekere vævet-specifikke microenvironmental parametre (biokemisk, konstruktions- og maskinmæssigt) og biologiske aktivitet in vitro og in vivo.

Vi udviklede en protokol, der kombinerer brugen af et hypotonic buffer med et rengøringsmiddel af anioniske overfladeaktive egenskaber efterfulgt af en DNase behandling5,12,13. Denne protokol udgør en simpel og reproducerbar metode for at udføre sammenlignende analyse mellem decellularized føtale og voksne mus hjerte væv. Vores erfaring med andre væv, nemlig med tumor prøver stammer fra kræftpatienter kirurgisk resektion og mus lungevæv, viser, at denne protokol er let kan tilpasses og vellykket i andre betingelser og modeller12,13. Anvendelsen af den samme decellularization på forskellige prøver tillader sammenlignende undersøgelser af ECM sammensætning, biomekaniske egenskaber, arkitektur og cellulære modulerende egenskaber i forbindelse med 3D.

En af de mest vanskelige udfordringer af væv decellularization er balancen mellem decideret celle fjernelse, ECM meshwork bevarelse og væv biokompatibilitet. Dermed skal flere kritiske trin overvejes nøje, for eksempel af væv kryopræservering før decellularization, den korrekte eksplantat størrelse, anvendelse af nye løsninger og manipulation af den endelige decellularized væv. Under vores undersøgelser observeret vi en direkte sammenhæng mellem lang fillagring tid befrugtede væv og brugen af mangeårige SDS løsninger med decellularization ineffektivitet. Langtidsopbevaring væv fører til ineffektive cellulære indhold fjernelse rendering rester af tyk cellulære områder (uden kerner) blandt de komplekse ECM meshwork. Tilsvarende uønskede virkning opnås når længe lagrede SDS løsninger anvendes til væv decellularization, sandsynligvis fordi SDS løsninger har en kort stabilitet på grund af nedsatte opløselighed, hydrolyse og pH ændringer over tid15,16 . Brugen af explants af den korrekte størrelse (~1.5 mm x 1,5 mm x 1,5 mm) er også afgørende for vellykket voksen væv decellularization, da større væv resektion er sværere at decellularize, vise celle debris lokket i en fælde på overfladen og anholdt mellem de tætte ECM netværk. Selv om denne protokol giver en effektiv metode til hjerte væv decellularization, kan en mindre brøkdel af voksne explants udgøre celle rester, især dem af en større størrelse. Histologiske analyse af disse prøver letter deres identifikation og efterfølgende udelukkelse fra undersøgelsen. I sidste ende, at protokollen heri er alsidig og let anvendelige særskilte enheder med mindre justeringer af væv eksplantat størrelse, SDS koncentration (0,1-0,2% SDS) eller løsning inkubation tid5,12,13 .

De store begrænsning af den nuværende metode er, at manipulation af lille størrelse prøver, dvs murine fosterets hjerte og voksne hjerte explants, kræver nogle håndtering færdigheder. Føtale og voksne decellularized væv er sarte strukturer, der kan være permanent deformerede når tørret under proceduren eller indesluttet af tynd pipette tip eller under behandling med pincet5.

Den store nyhed i denne protokol, udover den parallelle decellularization af føtal mus hjerte og voksen venstre ventrikel explants til sammenlignende vurdering af ECM sammensætning (Biomekanisk analyser) og dermed forbundne biologiske funktion, er dens simple oversættelse til forskellige væv og modeller5,12,13. Decellularization af væv i forskellige aldre ved at anvende standardiseret metode blev beskrevet kun på rhesus abe nyre, og de tværgående kapitler af føtal, neonatal og voksne væv, som blev udsat for en 1% SDS behandling i 10 dage6 . I hjertets omgivelser, selvom føtal, neonatal og voksne væv har været decellularized, afveg metoderne, der på graden af mekanisk løs, SDS koncentrationer og tid for program7,8. Da hver decellularization procedure påvirker ECM i en unik måde, kan sammenligning af decellularized prøver fra forskellige protokoller føre til misvisende konklusioner. Derfor muliggør anvende den samme decellularization procedure på tværs af forskellige prøver pålidelig sammenlignende analyse.

Det store flertal af de kommercielt tilgængelige decellularized væv stammer fra voksne prøver17. Trods den stigende anerkendelse for en øget evne til fostrets microenvironments i forbindelse med pro-regenererende signaler i forhold til deres voksen modparter, blev decellularization af føtalt væv kun rapporteret i nogle studier5, 7 , 18 , 19 , 20 , 21. forståelse ECM dynamics under modningen bliver afgørende at identificere unikke features i pro-regenererende microenvironments, som til gengæld vil påvirke udviklingen af højere effektivitet biomimetiske-materialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne står i gæld til alle medlemmer af Pinto--Ó laboratorium for relevante kritisk diskussion. Dette arbejde blev støttet af Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) under projektet "CARDIOSTEM-manipuleret hjerte væv og stem cell-baserede terapier for hjerte-kar-programmer" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. er en modtager af en FCT stipendium [SFRH/BD/88780/2012] og M.J.O. er en FCT fyr (FCT-Investigator 2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker Orbital Shakers IKA:3510001 Recommended
Fluorimeter - - Equipment available
Digital weight scale - - Equipment available
Inverted Microscope - - Equipment available
Cell culture incubator - - Equipment available
Fridge (4ºC) - - Equipment available
Deep freezer (-80ºC) - - Equipment available
Microtome - - Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge Fine Science Tools 5000-08 Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11254-20 Recommended
Dumont 7 forceps Fine Science Tools 11272-30 Recommended
Dissecting Scissors, straight - - Tool available
Forceps, serrated, curved - - Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped VWR 29442-044 -
96 well plates, individually wrapped VWR 71000-078 -
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized Millipore SE1M179M6 -
Eppendorff - - Material available
15 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430791 -
50 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430829 -
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid Electron Microscopy Science 70075-B -
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 22-037-246 -
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006 -
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) Sigma-Aldrich 277258-1L -
Dry ice - - -
Decellularization
NaCl BDH Prolabo 27810.364 -
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S-31264 -
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-100g -
KCl Sigma-Aldrich P8041-1KG -
TrisBASE Sigma-Aldrich T6066-500G -
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L-4390 -
MgCl2 MERCK 1.05833.1000 -
DNAse I AplliChem A3778,0050 -
Gentamicin Gibco 15710-049 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Deionized water (DI water) - - -
Histology
10 % formalin neutral buffer Prolabo 361387P -
Eosin Y AQUEOUS Surgipath 01592E Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 -
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous Aga 4,006,02,02,00 -
Deionized water (DI water) - - -
Clear Rite 3 Richard-Allan Scientific 6915 -
Shandon Histoplast Thermo Fisher Scientific RAS.6774006 -
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific K182001 -
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit Invitrogen P11496 -
Cell culture
DPBS VWR 45000-434 -
Penicillin-Streptomycin Solution 100X Labclinics L0022-100 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Cell culture media of the cell of interest - - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  3. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  5. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. 3rd Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
  8. Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
  10. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  11. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  12. Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
  13. Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
  14. Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
  15. Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
  16. Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
  17. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
  18. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  19. Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
  20. Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
  21. Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).

Tags

Bioteknologi sag 145 Decellularization ekstracellulære matrix 3D stilladser fosterets hjerte voksen hjerte hjerte vævsmanipulering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 04/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

Sammenlignelige Decellularization af føtale og voksne hjerte væv Explants som 3D-lignende platforme til i Vitro undersøgelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, A. C., Oliveira, M. J.,… More

Silva, A. C., Oliveira, M. J., McDevitt, T. C., Barbosa, M. A., Nascimento, D. S., Pinto-do-Ó, P. Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (145), e56924, doi:10.3791/56924 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter