Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Décellularisation comparable d’Explants de tissu cardiaque foetale et adulte en 3D-comme des plateformes pour les études In Vitro

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/56924
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,5, 4,6, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

ERRATUM NOTICE

Summary

La cardiaque matrice extracellulaire (ECM) est un réseau complexe de molécules qui orchestrent des processus clés dans les tissus et organes tout en supportant un remodelage physiologique tout au long de la vie. Décellularisation normalisée de coeur foetal et adultes permet des études expérimentales comparatives des deux tissus dans un contexte 3D en capturant l’architecture native et propriétés biomécaniques.

Abstract

Les connaissances actuelles de la matrice extracellulaire (ECM)-communication cellulaire se traduit par études grand bidimensionnel (2D) in vitro culture où les composantes d’ECM sont présentés comme un revêtement de surface. Ces systèmes de culture constituent une simplification de la complexité du tissu ECM qui englobe la composition biochimique, structure et propriétés mécaniques. Pour mieux imiter la communication ECM-cellule mise en forme du microenvironnement cardiaque, nous avons développé un protocole qui permet la décellularisation du coeur entier foetale et tissu adulte ventricule gauche des explants simultanément pour des études comparatives. Le protocole combine l’utilisation d’un tampon hypotonique, un détergent de propriétés tensioactif anionique et le traitement de la DNase sans aucune exigence de compétences spécialisées ou de l’équipement. L’application de la stratégie de décellularisation même dans des échantillons de tissus provenant de sujets d’âge différents est une autre approche pour effectuer des études comparatives. Le présent protocole permet l’identification des différences structurelles uniques entre foetales et adultes ECM maille et biologique cellulaires réponses cardiaques. En outre, la présente méthodologie illustre une application plus large étant appliquée avec succès dans d’autres tissus et les espèces avec des ajustements mineurs, comme dans les biopsies intestins humains et les poumons de souris.

Introduction

La matrice extracellulaire (ECM) est un réseau dynamique de molécules qui régulent les processus cellulaires importants, à savoir sort-décision, prolifération et la différenciation de1,2. L’enquête des interactions cellule-ECM a été effectuée principalement dans deux dimensions (2D) dans les cultures in vitro recouvert de composantes d’ECM, qui constituent une simplification des propriétés natives de ECM dans vivo. Décellularisation génère acellulaire bioscaffolds ECM de style 3D qui conservent en grande partie l’architecture extracellulaire et la composition des tissus natifs et organes3,4. En plus de servir d’échafaudages bioactifs pour l’ingénierie tissulaire, decellularise biomatériaux 3D de ECM se présentent comme nouvelles plates-formes pour évaluer la biologie cellulaire-ECM qui répliquent l’environnement in vivo.

Évaluation du rôle différentiel des composants ECM de différents tissus, organes et l’âge profiteront avec l’utilisation de protocoles similaires de générer bioscaffolds native. Dans le coeur, nous avons développé un protocole polyvalent pour décellularisation des échantillons foetales et dérivés adulte, comme approche alternative pour effectuer des études comparatives du microenvironnement de l’orgue. En utilisant cette méthode, nous avons capturé le microenvironnement cardiaque natif et a montré que ECM foetale favorise des rendements plus élevés de repeuplement des cellules cardiaques5. Décellularisation fournie également une identification des résidents différences structurelles entre ECM foetale et adulte au niveau du sous-sol lamina et péricellulaire arrangement de maille de matrice et fibre composition5. Avant ce travail, une comparaison entre des tissus à différents stades ontogéniques utilisant la même approche de décellularisation signale seulement pour les reins de singe rhésus et coeurs rongeurs. En outre, un nombre limité d’études rapport de tissus ou d’organes foetaux décellularisation soi5,6,7. Ceci a été réalisé à l’aide de SDS comme un agent unique décellularisation ; Cependant, les concentrations distinctes de SDS étaient utilisées pour la décellularisation du tissu cardiaque foetale et adultes7,8. SDS est l’un des plus efficaces détergents ioniques pour le dédouanement du matériel cytoplasmique et nucléaire et largement utilisé dans la décellularisation de différents tissus et spécimens9,10. Des solutions contenant des concentrations élevées de SDS et longues périodes d’exposition ont été corrélées avec la dénaturation des protéines, la perte de glycosaminoglycanes (gag) et perturbation des fibrilles de collagène10,11et donc une équilibre entre la suppression de préservation et de la cellule ECM est nécessaire. Pour appliquer la même procédure au tissu cardiaque foetale et adulte, le protocole décrit ci-après est divisé en trois étapes successives : la lyse de la cellule par choc osmotique (tampon hypotonique) ; solubilisation des interactions lipides-protéines, ADN-protéine et protéine-protéine (0,2 % SDS) ; et enlèvement de matière nucléaire (traitement de DNase).

Notre protocole présente plusieurs avantages : J’ai) la possibilité de décellularisation équivalente de l’âge des tissus cardiaques par l’application de la stratégie de décellularisation même ; II) pas d’exigences pour les méthodes spécialisées ou de l’équipement ; III) adaptation prête à d’autres tissus et les espèces qu’elle a été appliquée avec succès avec des modifications mineures dans la biopsie intestinale humaine12 et souris poumon13; et, surtout, iv) peut adresser des propriétés biomécaniques ECM tout en permettant à l’Assemblée des cultures de style 3D organotypique qu’imite mieux les caractéristiques moléculaires du microenvironnement tissus natifs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ont été approuvées par l’i3S Animal Ethics Committee et Direção de Geral Veterinária (DGAV) et le sont conformément à la Directive 2010/63/UE de la Parlement européen.

1. préparation des solutions décellularisation

Remarque : Tous les décellularisation solutions devraient être filtrées à travers un filtre à membrane de 0,22 μm et conservées pendant un maximum de 3 mois, sauf indication contraire.

  1. Pour PBS 1 x : 8 g de NaCl, 1,01 g Na2HPO4 200 mg de KCl, de mélanger et de 200 mg de KH2PO4 900 ml d’eau désionisée (l’eau distillée). Ajuster le pH de la solution à 7,5 et le volume de la solution finale vers le haut à 1 L. filtre, autoclave et store la solution à température ambiante (RT).
  2. Pour tampon hypotonique (10 mM Tris, EDTA de 0,1 %) : dissoudre 1,21 g de TrisBASE et 1 g d’EDTA dans 900 mL d’eau désionisée. Ajuster le pH de la solution à 7,8 avec NaOH/HCl et le volume de la solution finale à 1 L. filtre, stériliser à l’autoclave et stocker à température ambiante.
  3. Pour une solution de SDS de 0,2 % (0,2 % SDS, 10 mM Tris) : ajouter 0,6 g de TrisBASE et 1 g de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans 400 mL d’eau et remuez à 60 ° C jusqu'à dissolution complète de soluté. Laissez la solution refroidir au pH de la solution RT. Adjust à 7,8 et le volume de la solution finale à 500 mL. Stériliser les solution de filtration.
    Remarque : La solution SDS doit être préparée avant l’utilisation. Solution de filtration ne complète qu’après dissolution du SDS, sinon les particules insolubles SDS vont saturer le filtre, en changeant la concentration finale de SDS et par conséquent touchant l’efficacité décellularisation tissu.
  4. Pour le tampon de lavage hypotonique (10 mM Tris) : mélanger 1,21 g de TrisBASE dans 900 mL de DI de l’eau. Ajuster le pH de la solution à 7,8 et le volume final à 1 L. filtre, stériliser à l’autoclave et stocker à température ambiante.
  5. Pour le traitement de DNase (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 U/mL DNase) : dissoudre 2,42 g de TrisBASE et 2 mL de 1 M du MgCl2 dans 900 mL d’eau de DI. Ajuster le pH à 7,8 et le volume de la solution finale à 1 L. filtre et stériliser la solution par autoclave. Stocker la solution à RT. ajouter DNase I (50 U/mL) avant de les utiliser.
  6. Pour la DNase I solution mère : préparer un tampon de DNase contenant 50 % de glycérol, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM MgCl2et régler un volume de solution finale de 10 mL avec de l’eau distillée. Dans une hotte à flux laminaire, ajoutez la DNase I poudre vers le tampon de la DNase et mélanger doucement jusqu'à dissolution complète. Stériliser solution à travers 0,22 μm. Préparer des aliquotes de 1 mL et conserver à-20 ° C.

2. tissu récolte et cryoconservation

  1. Euthanasier adultes femelles gravides à 18 jours de gestation (E18 foetus) par l’intermédiaire de CO2 asphyxie. Faire une césarienne chez les femelles avec un ciseaux chirurgicaux et recueillir les cornes utérines portant les souris foetales à une boîte de pétri avec du PBS glacée 1 x à l’aide de deux pinces dentelées avec pointes courbées (une pince à chaque extrémité de la corne).
    1. Ouvrez les cornes utérines et le sac amniotique pour isoler les foetus. Transférer les foetus à nouveau pétri avec du PBS glacée 1 x à anesthésier les et décapiter avec un ciseau.
    2. Euthanasier les souris C57BL/6 mâles âgés de 7 à 8 semaines, à l’aide de CO2 asphyxie. Effectuer une incision sur chaque poitrine de souris et de recueillir le cœur.
    3. Brièvement rincer coeurs foetus et adultes avec glace froide 1 x PBS.
  2. Supprimer les oreillettes du coeur adulte à l’aide d’un scalpel. Effectuer une incision sur le ventricule droit et supprimez-la à l’aide de tout droit de petits ciseaux. Exposer la paroi interne du ventricule gauche en enlevant la cloison. Dans une nouvelle boîte de pétri, diviser le mur libre ventriculaire gauche en bandes longitudinales avec 2 mm d’épaisseur et retirer le muscle papillaire à l’aide d’un scalpel et pinces dentelées avec pointes courbées.
    1. D’accise les explants de petits tissus à l’aide d’un scalpel à l’aide d’une grille de 2 x 2 mm (description détaillée complémentaire Figure 15). Brièvement rincer les explants de tissu avec du PBS 1 x.
  3. Ajouter ~ 250 µL de la température de coupe optimale (OCT) composée de tubes de microcentrifuge d’autoclavés 1,5 mL. Transférer les coeurs ensemble foetale et des explants cardiaques adultes aux tubes avec 250 µL de OCT et congelez-les isopentane refroidi à la glace sèche et de conserver à-80 ° C (jusqu'à un maximum de 6 mois).
    Remarque : L’utilisation d’explants de tissu cardiaque cryoconservés pendant plus de 6 mois réduira considérablement l’efficacité de décellularisation, surtout dans les explants de tissu cardiaque adulte.

3. décellularisation tissu

NOTE : Décellularisation de tissu cardiaque est réalisée dans une plaque de culture de tissus de 24 puits auprès d’un échantillon par puits. 1 mL de chaque solution décellularisation est ajouté à chaque puits. Toutes les étapes de décellularisation devraient être effectuées avec agitation à 165 tr/min (shaker incubateur avec un orbital diamètre de 20 mm) et à 25 ° C, sauf indication contraire. Pour plus de détails, veuillez consulter le schéma sur la Figure 1 a. Amphotéricine B (fungizone,par exemple ) et la gentamicine sont fraîchement ajoutés à toutes les solutions de décellularisation avant de l’utiliser à une concentration finale de 2,5 μg/mL et de 0,01 µg/mL, respectivement. Afin de quantifier la quantité d’ADN conservée au sein des tissus decellularise, les besoins de masse échantillon à doser avant de commencer le protocole décellularisation. Le protocole de quantification de l’ADN est plus détaillée dans l’article 5.1.

  1. JOUR 1
    1. Prélèvement d’échantillons de tissus du congélateur à-80 ° C. Laisser les 1,5 mL tubes de microcentrifuge RT jusqu'à OCT devient partiellement fondu. Transférer le bloc de tissu cardiaque de l’OPO encore congelé dans une boîte de pétri avec du PBS 1 x.
    2. Une fois l’OPO fait fondre, mettre le tissu cardiaque sur une nouvelle boîte de pétri avec du PBS 1 x. Échantillons de lavage 1 x PBS et à 60 tr/min avec un shaker pendant 10-15 min. répéter au moins deux fois.
    3. Ajouter 1 mL de tampon hypotonique de travail / puits d’une plaque de culture de tissus de 24 puits stériles. Transfert d’un seul échantillon par puits avec l’aide de pinces.
    4. Déplacer la plaque 24 puits vitroplants avec les échantillons à un agitateur incubateur à 25 ° C et commencer l’incubation de 18 h avec tampon hypotonique.
  2. JOUR 2
    1. Préparer la solution de SDS de 0,2 %, tel que décrit à la section 1.3.
    2. Aspirer le tampon hypotonique et laver les échantillons avec du PBS 1 x pour les temps de 1 h. Répétez 3.
      NOTE : PAUSE POINT : tissu sous décellularisation peut être conservé dans du PBS 1 x à 4 ° C pendant 18 h dans des conditions statiques.
    3. Enlever le PBS 1 x, ajouter 1 mL de solution de SDS fraîchement préparée (point 1.3) chaque puits et incuber les échantillons pendant 24 h.
      NOTE : L’incubation SDS Post (CHECK POINT), s’assurer que les échantillons présentent une apparence translucide ou blanc. À cette étape, SDD traités échantillons sont trempés dans l’ADN, montrant une consistance gélatineuse. Retirez la solution SDS lentement pour éviter l’adhérence d’échantillon de la pipette.
  3. JOUR 3
    1. Laver les échantillons avec le tampon de lavage hypotonique (1 mL / puits) pendant 20 min. Répétez 3 fois.
      NOTE : À cette étape, il est normal d’observer une diminution de la taille de l’échantillon en raison de l’élimination des débris cellulaires. POINT de PAUSE : Tissu sous décellularisation peut être conservé dans le tampon de lavage hypotonique à 4 ° C pendant 18 h dans des conditions statiques.
    2. Ajouter 1 mL de solution de traitement de DNase chaque puits et incuber les échantillons pendant 3 h à 37 ° C.
    3. Aspirer la solution de traitement de la DNase et laver les échantillons avec du PBS 1 x (1 mL / puits) pendant 20 min. Répétez 3 fois. Effectuer un lavage final avec du PBS 1 x (1 mL / puits) du jour au lendemain à RT et secouant à 60 tr/min.
    4. (Check point) Après le traitement de la DNase, veiller à ce que les échantillons decellularise ont perdu la consistance gélatineuse.
      Remarque : Après le traitement de la DNase, enlever et ajouter 1 x PBS doucement puisque les échantillons peuvent être facilement pris au piège et attachés à l’embout de la pipette.

4. évaluation de tissu decellularise cellule enlèvement

  1. Fixer les échantillons dans une plaque de culture de tissus de 24 puits, 1 échantillon par puits, en ajoutant 1 mL de tampon neutre de fraîchement 10 % de formol avec 0,03 % éosine aqueuse pour 2,5 à 3 h à température ambiante.
    Remarque : L’éosine est ajouté au fixateur à tacher le tissu decellularise et pour faciliter la visualisation d’échantillon lors de coupes et de coloration histologique. L’addition de l’eosine que n’interfère avec les colorants histologiques ni avec les techniques d’immunofluorescence. Par ailleurs, la fixation peut être effectuée pendant la nuit à 4 ° C.
  2. Enlever la solution de fixateur et ajouter 1 mL de PBS 1 x à laver l’échantillon.
  3. Encapsuler le bioscaffolds fixe en gel traitement histologie, utiliser un moule de spécimen de vinyle jetables selon les instructions du fabricant.
  4. Retirer le gel de l’histologie avec l’échantillon intégré de la moule et le transfert de Cassettes de traitement/Embedding biopsie avec couvercle.
    NOTE : Une alternative au tissu incorporation en histologie et gel de traitement est de traiter chaque échantillon en deux biopsie éponges avec petits pores. Les échantillons doivent être localisés au centre des éponges de biopsie pour activer la détection. À noter, certains échantillons peuvent être difficiles à localiser à l’aide de cette approche.
  5. Traiter les échantillons pour paraffine incorporation par le biais des incubations successives (30 min par solution) dans la série de concentrations d’alcool (70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100 %), solution d’hydrocarbure aliphatique isoparaffiniques (2 stations de l’incubation) et de la paraffine (incubation 2 les stations) à 56 ° C.
  6. Monter les échantillons dans un bloc de paraffine.
  7. Couper les 3 sections de paraffine μm d’épaisseur sur un microtome et recueillir les sections sur les lames de microscope vitre.
  8. Sections de paraffine sèche durant la nuit à 37 ° C.
    NOTE : Sections de paraffine (PAUSE POINT) sont stockées à 4 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
  9. Pour vérifier l’efficacité du protocole, effectuer l’éosine et éosine (H & E) et Trichrome de Masson (MT) de coloration des sections échantillon decellularise et aux sections de tissu non manipulé conformément aux instructions du fabricant.
    Remarque : H & E de taches de coloration cellulaire noyaux bleu/violet, cytoplasme rose/rouge foncé et rose pâle de collagène et MT taches noir de noyaux, de cytoplasme rouge et de collagène et de mucine bleu. Décellularisation efficace est atteint quand une rose clair poreux (H & E, MT) et réseau de couleur bleue (MT) est observé, en l’absence d’une coloration nucléaire.

5. évaluation de l’enlèvement de matière nucléaire tissu decellularise

Remarque : La quantification de la teneur en ADN sur tissu decellularise doit être exécutée en comparaison avec le tissu non manipulé respectif.

  1. Avant décellularisation, peser un tube de microtubes de 1,5 mL sur une échelle numérique de haute précision. Transférer le tissu cardiaque dans le tube, enlever la quantité supplémentaire de PBS 1 x et peser le tube avec les échantillons. Calculer le poids des échantillons :
    Poids de l’échantillon = poids tube avec échantillons – poids vide tube
  2. Decellularize les échantillons tel que décrit à l’étape 3.
  3. Après décellularisation, prélever les tissus decellularise dans un tube de microcentrifuge.
    1. En raison de la faible encombrement et la masse des échantillons cardiaques individuels et des caractéristiques de la trousse, poule decellularise tissus chaque condition d’échantillon (rythme cardiaque fœtal : 5 coeurs entiers ; adultes explants de LV : 15 explants). Effectuez la même procédure avec le tissu non manipulé.
      NOTE : (PAUSE POINT) les échantillons peuvent être conservés à-20 ° C jusqu'à ce que l’extraction d’ADN et la quantification sont effectuées.
  4. Couper le non manipulé et decellularise tissus petits explants avec l’aide d’un scalpel dans une boîte de Petri propre.
    Remarque : Utiliser un bistouri individuel et la boîte de pétri pour chaque échantillon. Rupture mécanique des échantillons avec un scalpel facilite leur digestion enzymatique postérieure et extraction ultérieure de l’ADN.
  5. Pour l’extraction de l’ADN, utilisez une méthode d’extraction de l’ADN-colonne basée selon les instructions du fabricant.
    1. Recueillez les échantillons mécaniquement dissociés de la boîte de pétri avec le tampon de digestion maître (tampon de la digestion et la protéinase K) selon les instructions du fabricant à l’aide d’un embout large orifice de la pipette.
      NOTE : Lyse tissulaire à la digestion de la protéinase K est plus rapide dans les échantillons de decellularise. Pour traiter les échantillons distincts en même temps, conserver les échantillons lysés sur glace, jusqu'à ce que tous les échantillons sont lysées pour minimiser la dégradation. Lyse complète d’échantillons s’effectue entre 4 à 6 h.
    2. Aller de l’avant avec le protocole selon les instructions du fabricant.
    3. Pour augmenter les rendements de l’ADN extrait d’échantillons de tissus decellularise et non decellularise, éluer l’ADN sur les 25-50 μL et 100 μL de tampon d’élution, respectivement. Recueillir l’ADN éluée et charger la spin-colonne. Incuber pendant 1 min à RT. centrifuger les échantillons selon les instructions du fabricant.
      NOTE : (PAUSE POINT) l’ADN extrait d’échantillons peut être conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
  6. Quantifier l’ADN extrait d’échantillons avec un kit de détection fluorescente dsDNA suivant les instructions du fabricant.
  7. Normaliser le contenu en ADN comme nanogrammes d’ADN par milligramme de poids humide de l’échantillon initial (avant décellularisation).

6. cellule decellularized échafaudages ensemencement

Remarque : Toutes les solutions et les réactifs doivent être stériles et l’ensemble de la procédure exécutée dans des conditions stériles.

  1. Préparer 1 x DPBS avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B et 1 % P/S (pénicilline, 100 U.I. ; streptomycine 100 µg/mL).
  2. Enlever la solution de PBS 1 x à la dernière étape de lavage décellularisation (étape 3.3.3) et ajouter 500 μL / puits du 1 x SPD/2,5 μg/mL d’amphotéricine B/1% P/S solution fraîchement préparée. Conserver les échantillons à 4 ° C de 1 à 7 jours.
    Remarque : Le stockage des échantillons à 4 ° C est important de maintenir la stérilité.
  3. Ajouter P/S vers la cellule basale médias (sans FBS et suppléments) à une concentration finale de 1 %.
  4. Aspirer 1 x SPD/2,5 μg/mL de solution B/1% P/S amphotéricine des échantillons decellularise. Ajouter 500 μL / puits de la cellule basale media/1% P/S et laisser les échantillons à équilibrer pendant 1 h à 37 ° C, ou à 4 ° C pendant plus de 1 h.
  5. Fractionner les cellules d’intérêt et de préparer des petites parties aliquotes de cellules à la densité de la cellule souhaitée.
    Remarque : L’ensemencement de tissu decellularise doit être exécuté sous un microscope stéréoscopique et dans des conditions stériles. Milieux de culture cellulaire doit contenir 1 % P/S.
  6. Distribuer 3-4 μL de SPD au centre d’un puits d’une plaque de 96 puits. Utilisez des pinces fines et droites, transférer les échafaudages decellularise à la baisse du SPD, supprimer le SPD supplémentaire par aspiration et s’assurer que l’échantillon n’est pas plié ou froissé. Qu’elle soit sèche sur les bords d’adhérer à la surface du bien.
    NOTE : Échafaudages détachés ont une efficacité moindre semie.
  7. Ajouter des cellules à l’échafaud en pipettant également, la solution unicellulaires lentement contre les bords du puits.
    NOTE : par exemple, cardiomyocytes de rats néonatals sont ensemencées avec une densité de 7 500 cellules/mm2 et souris immortalisée Lin− Sca-1+ cardiaque des cellules progénitrices (iCPCSca-1) à une densité de 60-1 500 cellules/mm2. Ajuster la densité des cellules selon le raisonnement expérimental.
  8. Ajouter SPD dans les puits voisins pour éviter l’évaporation rapide de médias.
  9. 24 heures après l’ensemencement de cellule, si le type de cellule utilisé ont adhéré aux culture de tissus de plaques en polystyrène (EPTC), passez bioscaffolds dans un nouveau puits. Dans le cas contraire, remplacer le moyen pour enlever les cellules non adhérentes.
  10. Changer soigneusement les médias selon les exigences spécifiques du type cellulaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

L’efficacité de décellularisation devrait être évaluée par le biais de trois techniques principales : observation macroscopique, histologie et quantification de l’ADN. L’aspect macroscopique du traitement post-SDS échantillons agit indirectement sur l’efficacité de l’enlèvement de la cellule. Après incubation de SDS, échantillons doivent apparaître comme translucides à blanchâtre (Figure 1). Foetal (E18) decellularise tissus sont caractérisent par une structure hautement translucide tandis que des explants adultes ont une apparence blanc translucide. Une apparence plus blanche est généralement reliée à un réseau ECM présentant une fibre supérieure et la teneur en collagène, par exemple les vaisseaux vasculaires et ventriculaires adultes ECM mesh (Figure 1). L’hématoxyline et éosine (H & E) et/ou les taches (MT) Trichrome de Masson sont effectués pour confirmer la suppression de la cellule efficace par l’observation d’un maillage poreux (rose clair, H & E ; rose clair et bleu, MT) (Figure 1). En outre, la tache de MT met en évidence le maillage de collagène en bleu5. Dégagement de matières nucléaires après que décellularisation est accessible par la quantification de l’ADN et une diminution d’environ 99,8 % sont généralement obtenus, par rapport aux tissus non manipulé (Figure 1). La présence de matières nucléaires sur des échafauds decellularise a été décrit comme un déclencheur d’une réponse inflammatoire indésirable lors de l’implantation de14. Pour cette raison, la confirmation de décellularisation efficace est essentielle avant les expériences de repeuplement échafaudage 3D natif. Échafaudages decellularise peuvent être stockés dans des conditions stériles jusqu'à l’ensemencement avec les cellules d’intérêt. La viabilité cellulaire est contrôlée tout au long de la culture in vitro de calcéine coloration (Figure 2 a). Néanmoins, tache de calcéine peut être cytotoxique pour les types de cellules sensibles. Analyse terminal de repeuplement de la cellule et répartition entre les échafaudages est effectuée paraffine après transformation ; un instantané de la repopulation bioscaffold évaluée par H & E à une section centrale de bioscaffolds s’affiche (Figure 2 b, 2C).

Figure 1
Figure 1. Foetal (E18) et de tissu cardiaque adulte décellularisation procédure et de confirmation de l’efficacité décellularisation. Vue d’ensemble de protocole (A) . (B) protocole de décellularisation détaillée. (C) analyse macroscopique du tissu cardiaque foetal et adult, avant et après décellularisation. Echelle : 2 mm. (D) Quantification de matières nucléaires en decellularise par rapport aux tissus non manipulé. Données exprimées en moyenne ± du test t de Student SEM., bilatéral * p < 0,05. (E) H & E et de Masson Trichrome analyse histologique du tissu cardiaque foetal et adult, avant et après décellularisation. Echelle : 100 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
La figure 2. Analyse de repeuplement des échafaudages decellularise ensemencé avec Lin - Sca-1+ lignée de cellules souches cardiaques (iCPCSca-1). (A) la viabilité cellulaire haute observés à échafaudages surface au cours de la culture in vitro de calcéine teinté (vert). Echelle : 100 μm. (B) le nombre de cellules et répartition entre les échafaudages évalués par le biais de la coloration H & E. Echelle : 100 μm. (C) la vue orthogonale des cellules intégrées dans l’ECM decellularise. Image confocale de section de paraffine 50μm d’épaisseur. Barre d’échelle : 10 μm (vue orthogonale XZ, YZ) et 40 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Étape Observation Raisons possibles Problème Solution
3.1.2. Tissu avec une couleur brunâtre Échantillon cryofixation ; température de congélation instable Échantillon cryofixation conduira à l’élimination inefficace des protéines cytoplasmiques Stocker des tissus congelés pendant des périodes plus courtes. Vérifier la température du congélateur et la stabilité
3.2.4. Rose et blanc opaques échantillons Solution SDS n’a pas été bien préparée ; explants de LV adultes trop gros Suppression inefficace des protéines cytoplasmiques Assurer la dissolution complète de SDS. Decellularize échantillons de petite taille.
3.3.4. Échantillons avec une apparence de gélatine Enlèvement d’ADN inefficace Dégagement de matière nucléaire inefficace Augmenter le temps de concentration et/ou d’incubation de DNase.
4.6. Compactage de gel histologie Long temps d’attente en PBS1X/éthanol avant traitement de paraffine Altération de la structure du tissu decellularise Commencer histologique traitement dès que possible
6.6. Échantillons séchés decellularise Des échantillons ont été laissés à sécher pendant trop longtemps Effondrement permanente du tissu decellularise. Cellule inefficace l’ensemencement Laisser échantillons légèrement sec que dans la périphérie afin de s’attacher au fond du puits au cours de l’amorçage
6.7. Détachement de decellularise échantillon au cours de l’amorçage Les échantillons ne suffisaient pas sécher avant le semis Cellule inefficace l’ensemencement Augmenter le temps de séchage de ECM pour permettre la meilleure adhérence avant l’ensemencement de cellule

Table 1. Tableau des incidents pour décellularisation parallèle du foetus (E18) et de tissu cardiaque de souris adulte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La matrice extracellulaire (ECM) est un réseau très dynamique et complex de glycoprotéines fibreuses et adhésifs, composé d’un réservoir de nombreux peptides bioactifs et emprisonné des facteurs de croissance. Comme le modulateur majeur de l’adhésion cellulaire, la dynamique du cytosquelette, motilité/migration, prolifération, différenciation et l’apoptose, ECM régule activement comportement et la fonction cellulaire. Sachant que le comportement cellulaire diffère dans les cultures 2D et 3D, y ont été déployés pour élaborer des modèles organotypique roman qui peuvent reproduire avec précision des environnements de tissus naturels. Dans les dernières années, décellularisation tissu a émergé comme une technique alternative pour tissus ingénierie et la médecine régénérative. Ainsi, tissus et organes décellularisation est actuellement l’outil de choix pour mieux disséquer tissu-spécifique des paramètres micro-environnementales (biochimiques, structurales et mécaniques) et l’activité biologique in vitro et in vivo.

Nous avons développé un protocole qui combine l’utilisation d’un tampon hypotonique avec un détergent de propriétés tensioactif anionique, suivie d’une DNase traitement5,12,13. Le présent protocole constitue une méthode simple et reproductible pour effectuer une analyse comparative entre les tissus cardiaques decellularise souris fœtales et adulte. Notre expérience avec les autres tissus, notamment avec des échantillons de tumeur dérivées de résection chirurgicale des patients atteints de cancer et de tissus pulmonaires de souris, montre que ce protocole est facilement adaptable et réussie dans d’autres conditions et modèles12,13. L’application de la même procédure de décellularisation sur différents échantillons permet des études comparatives de la composition, propriétés biomécaniques, architecture et propriétés modulatrices cellulaires ECM dans un contexte 3D.

Un des défis plus difficiles de décellularisation tissulaire est l’équilibre entre la suppression pure et simple cellule, préservation de maillage ECM et biocompatibilité des tissus. Ainsi, plusieurs étapes critiques doivent être soigneusement examinées, notamment le temps de la cryopréservation des tissus avant décellularisation, la taille de l’explant correcte, l’utilisation de solutions fraîches et la manipulation du tissu decellularise final. Au cours de nos études, nous avons observé une corrélation directe entre les durées de conservation longue des tissus cryopréservés et l’utilisation de solutions de SDS depuis longtemps avec l’inefficacité décellularisation. Stockage de tissus à long terme mène aux restes rendu inefficace suppression de contenu cellulaire d’épaisseur zones cellulaires (sans noyaux) parmi le réseau complex des ECM. Un effet indésirable similaire est atteinte lorsque longtemps stockée SDS solutions sont utilisées pour décellularisation tissu, probablement parce que les solutions de SDS ont une stabilité courte en raison de la solubilité réduite, l’hydrolyse et les modifications de pH plus temps de15,16 . L’utilisation d’explants de taille correcte (~1.5 x 1,5 x 1,5 mm) est également essentielle pour décellularisation tissu adulte réussie, puisque les plus grandes résections de tissu sont plus difficiles à decellularize, affichant des débris cellulaires piégé à la surface et arrêté entre le réseau dense de l’ECM. Bien que ce protocole fournit une méthode efficace de décellularisation de tissu cardiaque, une fraction mineure des explants adultes peut présenter des restes cellulaires, en particulier ceux d’une plus grande taille. L’analyse histologique de ces échantillons facilite leur identification et leur exclusion subséquente de l’étude. En fin de compte, le protocole ci-après est polyvalent et facilement applicables aux spécimens distincts avec de légères modifications à la taille de tissu explant, concentration de SDS (0,1 à 0,2 % SDS) ou solution d’incubation temps5,12,13 .

La limitation majeure de la méthode actuelle est que la manipulation des échantillons de petite taille, c'est-à-dire du rythme cardiaque fœtal murin et coeur adulte des explants, nécessite certaines compétences de gestion. En fait, tissus decellularise foetales et adultes sont des structures délicates qui peuvent être déformées en permanence quand séchés au cours de la procédure ou pris au piège par la pipette mince ou lors de la manutention avec pinces5.

La nouveauté majeure de ce protocole, outre la décellularisation parallèle du coeur de foetus de souris et des explants de ventricule gauche adulte pour une évaluation comparative de la composition de l’ECM (analyses biomécaniques) et de la fonction biologique associée, est son simple traduction de différents tissus et modèles5,12,13. La décellularisation de tissus des âges distincts en appliquant la méthodologie normalisée a été décrite uniquement sur le rein de singe rhésus et les coupes transversales de tissus foetus, néonatals et adultes, qui ont été soumis à un traitement de SDS 1 % pendant 10 jours6 . Dans un cadre cardiaque, bien que foetal, tissus néonatals et adultes ont decellularise été, les méthodes divergent sur le degré de déloger mécaniques, les concentrations de SDS et les temps d’application7,8. Comme chaque procédure de décellularisation affecte l’ECM de façon unique, la comparaison d’échantillons decellularise obtenus à partir des protocoles différents peut-être conduire à des conclusions trompeuses. Par conséquent, appliquer la même procédure de décellularisation à travers différents échantillons permet analyse comparative fiable.

La grande majorité des tissus disponibles dans le commerce decellularise dérive de spécimens adultes17. Malgré la reconnaissance croissante pour une capacité accrue de micro-environnements foetales en fournissant des signaux pro-régénérative comparativement à leurs homologues adultes, décellularisation de tissus foetaux rapportait seulement quelques études5, 7 , 18 , 19 , 20 , 21. dynamique de l’ECM de compréhension au cours du processus de vieillissement sera cruciale pour identifier les caractéristiques uniques des micro-environnements pro-régénératrice qui, à son tour, aura un impact le développement d’efficacité supérieur à matériaux biomimétiques.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs sont reconnaissants à tous les membres du laboratoire de Pinto--Ó pour une discussion critique pertinente. Ce travail a été soutenu par MIT-Fundação Programa para Ciência e Tecnologia (FCT) au titre du projet « CARDIOSTEM-ingénierie des tissus cardiaques et thérapies à base de cellules souches pour des applications cardiovasculaires » (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. est récipiendaire d’une bourse de la CFPI [SFRH/BD/88780/2012] et M.J.O. est un camarade de la CFPI (FCT-détective 2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker Orbital Shakers IKA:3510001 Recommended
Fluorimeter - - Equipment available
Digital weight scale - - Equipment available
Inverted Microscope - - Equipment available
Cell culture incubator - - Equipment available
Fridge (4ºC) - - Equipment available
Deep freezer (-80ºC) - - Equipment available
Microtome - - Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge Fine Science Tools 5000-08 Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11254-20 Recommended
Dumont 7 forceps Fine Science Tools 11272-30 Recommended
Dissecting Scissors, straight - - Tool available
Forceps, serrated, curved - - Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped VWR 29442-044 -
96 well plates, individually wrapped VWR 71000-078 -
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized Millipore SE1M179M6 -
Eppendorff - - Material available
15 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430791 -
50 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430829 -
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid Electron Microscopy Science 70075-B -
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 22-037-246 -
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006 -
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) Sigma-Aldrich 277258-1L -
Dry ice - - -
Decellularization
NaCl BDH Prolabo 27810.364 -
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S-31264 -
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-100g -
KCl Sigma-Aldrich P8041-1KG -
TrisBASE Sigma-Aldrich T6066-500G -
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L-4390 -
MgCl2 MERCK 1.05833.1000 -
DNAse I AplliChem A3778,0050 -
Gentamicin Gibco 15710-049 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Deionized water (DI water) - - -
Histology
10 % formalin neutral buffer Prolabo 361387P -
Eosin Y AQUEOUS Surgipath 01592E Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 -
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous Aga 4,006,02,02,00 -
Deionized water (DI water) - - -
Clear Rite 3 Richard-Allan Scientific 6915 -
Shandon Histoplast Thermo Fisher Scientific RAS.6774006 -
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific K182001 -
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit Invitrogen P11496 -
Cell culture
DPBS VWR 45000-434 -
Penicillin-Streptomycin Solution 100X Labclinics L0022-100 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Cell culture media of the cell of interest - - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  3. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  5. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. 3rd Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
  8. Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
  10. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  11. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  12. Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
  13. Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
  14. Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
  15. Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
  16. Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
  17. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
  18. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  19. Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
  20. Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
  21. Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).

Tags

Bio-ingénierie numéro 145 décellularisation matrice extracellulaire échafaudages 3D du rythme cardiaque fœtal cœur adulte ingénierie tissulaire cardiaque

Erratum

Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 04/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

Décellularisation comparable d’Explants de tissu cardiaque foetale et adulte en 3D-comme des plateformes pour les études In Vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, A. C., Oliveira, M. J.,… More

Silva, A. C., Oliveira, M. J., McDevitt, T. C., Barbosa, M. A., Nascimento, D. S., Pinto-do-Ó, P. Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (145), e56924, doi:10.3791/56924 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter