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Bioengineering

Vergleichbare Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe Explantaten als 3D-ähnliche Plattformen für In-vitro-Studien

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/56924
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,5, 4,6, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

ERRATUM NOTICE

Summary

Die kardiale extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein komplexes Netzwerk von Molekülen, die Schlüsselprozesse in Geweben und Organen zu orchestrieren, während dauerhafte physiologische Umbau lebenslang. Standardisierte Decellularization der fetalen und adulten Herzen ermöglicht vergleichende experimentelle Studien der beiden Gewebe in einem 3D Kontext durch die Erfassung von native Architektur und biomechanischen Eigenschaften.

Abstract

Aktuelle Kenntnisse der extrazellulären Matrix (ECM)-Zell-Kommunikation führt zu großen zweidimensionalen (2D) in-vitro-Kultur Studien wo ECM-Komponenten als eine Oberflächenbeschichtung präsentiert werden. Diese Kultur-Systeme bilden eine Vereinfachung der komplexen Natur des Gewebes ECM, die biochemische Zusammensetzung, Struktur und mechanischen Eigenschaften umfasst. Um die Gestaltung der kardialen Mikroumgebung ECM-Zell-Kommunikation besser zu emulieren, entwickelten wir ein Protokoll, das für die Decellularization des gesamten fetalen Herzens ermöglicht und Erwachsenen linke Herzkammer Gewebe explants gleichzeitig für vergleichende Studien. Das Protokoll kombiniert die Verwendung von hypotone Puffer, ein Waschmittel von anionischen Tensiden Eigenschaften und DNase-Behandlung, ohne spezielle Fähigkeiten oder Ausrüstung. Die Anwendung der gleichen Decellularization Strategie in Gewebeproben von Themen der unterschiedlichen Alters ist ein alternativer Ansatz zur vergleichende Studien durchführen. Dieses Protokoll ermöglicht die Identifikation von einzigartigen strukturelle Unterschiede in fetalen und adulten kardiale ECM Mesh und biologische zelluläre Reaktionen. Darüber hinaus die hierin Methodik zeigt eine breitere Anwendung erfolgreich in anderen Geweben und Arten mit kleineren Anpassungen, wie z. B. im menschlichen Darm Biopsien und Maus Lungenkrebs angewendet.

Introduction

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein dynamisches Netzwerk von Molekülen, die wichtige zelluläre Prozesse, nämlich Schicksal-Entscheidung, Proliferation und Differenzierung1,2zu regulieren. Die Untersuchung der Zelle-ECM Interaktionen trat hauptsächlich in zweidimensionale (2D) in-vitro-Kulturen beschichtet mit ECM-Komponenten, die darstellen, einer Vereinfachung der native ECM Unterkünfte gefunden in Vivo. Decellularization erzeugt azellulärer 3D-wie ECM-Bioscaffolds, die die extrazelluläre Architektur und Zusammensetzung des nativen Gewebe und Organe3,4weitgehend zu bewahren. Neben seiner Tätigkeit als bioaktive Scaffolds für das Tissue Engineering, entstehen decellularized 3D ECM Biomaterialien als neuartige Plattformen Zelle-ECM Biologie zu bewerten, dass Parallel der in-vivo-Umgebung.

Bewertung der differenziellen Rolle der ECM-Komponenten unterschiedliche Gewebe, Organe und Alter profitieren mit dem Einsatz von ähnliche Protokolle native Bioscaffolds zu erzeugen. Im Herzen entwickelten wir ein vielseitiges Protokoll für Decellularization der fetalen und Erwachsenen stammenden Proben als ein alternativer Ansatz zur vergleichende Studien über die Orgel Mikroumgebung durchführen. Mit dieser Methodik, wir erfasst die native kardiale Mikroumgebung und zeigte, dass fetale ECM Wiederbesiedlung Mehrertrag von Herzzellen5fördert. Decellularization legte weitere Identifizierung ansässigen struktureller Unterschiede zwischen embryonalen und adulten ECM auf der Ebene der Keller Lamina und Pericellular Matrix-Netz-Anordnung und Faser Zusammensetzung5. Vor dieser Arbeit wurde Direktvergleich der Gewebe in den verschiedenen ontogenic Phasen mit dem gleichen Decellularization Ansatz nur für Rhesus-Affen Nieren und Nagetier Herzen berichtet. Eine begrenzte Anzahl von Studien berichten darüber hinaus fetalen Gewebe/Organ Decellularization per se5,6,7. Dies wurde erreicht mit SDS als einen einzigartigen Decellularization-Agent; Allerdings dienten verschiedene SDS-Konzentrationen für die Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe7,8. SDS ist eines der effektivsten Ionischen Reinigungsmittel für die Abfertigung der zytoplasmatischen und nuklearem Material, und am meisten benutzt in den Decellularization der verschiedenen Gewebe und Proben9,10. Lösungen mit hohen Konzentrationen von SDS und längere Exposition wurde mit Protein-Denaturierung, Glykosaminoglykan (GAGs) Verlust und Störung der Kollagen Fibrillen10,11, korreliert und somit eine Gleichgewicht zwischen Erhaltung und Zelle entfernen ECM ist notwendig. Um das gleiche Verfahren auf fetalen und adulten Herzgewebe anzuwenden, das Protokoll beschriebenen gliedert sich in drei aufeinander folgenden Schritten: Zell-Lyse durch osmotischen Schock (hypotone Puffer); Solubilisierung von Lipid-Protein und DNA-Protein-Protein-Protein Interaktionen (0,2 % SDS); und nuklearen Materialabtrag (DNase-Behandlung).

Unser Protokoll zeigt mehrere Vorteile: ich) die Möglichkeit, gleichwertige Decellularization der altersspezifischen kardialen Gewebe durch die Anwendung der gleichen Decellularization-Strategie; (II) keine Anforderungen für spezielle Methoden oder Geräte; (III) Anpassung an andere Gewebe und Arten bereit, wie sie erfolgreich mit geringfügigen Änderungen im menschlichen Darm Biopsien12 und Maus Lunge13angewendet wurde; und vor allem iv) ECM biomechanische Eigenschaften und ermöglicht die Montage von 3D-ähnliche organotypischen Kulturen, dass mehr genau die molekularen Eigenschaften der nativen Gewebe Mikroumgebung imitieren ansprechen können.

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Protocol

Alle beschriebenen Methoden wurden genehmigt durch die i3S Tier-Ethik-Kommission und Direção-Geral de Veterinária (DGAV) und sind im Einklang mit dem Europäischen Parlament Richtlinie 2010/63/EU.

1. Vorbereitung der Decellularization Lösungen

Hinweis: Alle Decellularization Lösungen sollten durch einen 0,22-μm-Membranfilter gefiltert und gespeichert für maximal 3 Monate, außer anders angegeben.

  1. Für 1 X PBS: Mix 8 g NaCl, 1,01 g Na2HPO4 KCl, 200 mg und 200 mg KH2PO4 mit 900 mL entionisiertem Wasser (VE-Wasser). Stellen Sie Lösung pH 7,5 und die endgültige Lösung Volumen bis 1 L. Filter, Autoklaven und laden die Lösung bei Raumtemperatur (RT).
  2. Für hypotone Puffer (10 mM Tris, 0,1 % EDTA): 1,21 g TrisBASE und 1 g EDTA in 900 mL entionisiertem Wasser auflösen. Lösung pH bis 7.8 mit NaOH/HCl und das endgültige Lösung Volume 1 L. Filter anpassen, durch Autoklaven sterilisieren und Lagerung bei RT
  3. Für 0,2 % SDS-Lösung (0,2 % SDS, 10 mM Tris): 0,6 g TrisBASE und 1 g Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) in 400 mL DI Wasser hinzufügen und rühren bis zur vollständigen gelösten Auflösung bei 60 ° C. Lassen Sie Lösung auf RT Adjust Lösung pH bis 7,8 und die endgültige Lösung Volumen 500 mL abkühlen. Lösung durch Filtration zu sterilisieren.
    Hinweis: Die SDS-Lösung sollte vor dem Gebrauch vorbereitet werden. Filterlösung erst nach vollständiger SDS Auflösung, sonst werden die SDS unlösliche Partikel den Filter, ändern die Endkonzentration von SDS und folglich beeinflussen Gewebe Decellularization Effizienz sättigen.
  4. Für hypotone Waschpuffer (10 mM Tris): 1,21 g des TrisBASE in DI 900 mL Wasser mischen. Lösung pH bis 7,8 und der letzte Band, 1 L. Filter anpassen, durch Autoklaven sterilisieren und Lagerung bei RT
  5. Für die DNase-Behandlung (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 U/mL DNase): 2,42 g TrisBASE und 2 mL 1 M MgCl2 in 900 mL VE-Wasser auflösen. PH bis 7,8 und die endgültige Lösung Volume 1 L. Filter anpassen und Lösung von Autoklaven sterilisieren. Lösung bei RT hinzufügen DNase speichern ich (50 U/mL) vor dem Gebrauch.
  6. Für DNase Lager ich Lösung: einen DNase-Puffer mit 50 % Glycerin, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM MgCl2, Vorbereitung und Anpassung an eine endgültige Lösung-Volumen von 10 mL mit VE-Wasser. In einem Laminar-Flow-Haube hinzufügen der DNase I Pulver auf die DNase-Puffer und vorsichtig mischen, bis zur vollständigen Auflösung. Lösung durch 0,22-μm-Filter zu sterilisieren. 1 mL Aliquote Vorbereitung und Lagerung bei-20 ° C.

(2) Gewebe Ernte und Kryokonservierung

  1. Schwangere Weibchen 18 Tage der Schwangerschaft (E18 Föten) über CO2 Erstickung einschläfern. Führen Sie einen Kaiserschnitt auf die Weibchen mit einer chirurgischen Schere und sammeln Sie die uterine Hörner tragen die fetalen Mäuse auf eine Petrischale mit eiskalten 1 X PBS zwei gezahnte Pinzette mit gebogenen Spitzen (eine Pinzette zu jedem Horn-Ende).
    1. Öffnen Sie die uterine Hörner und die Fruchtblase, die Föten zu isolieren. Übertragen Sie die Föten auf eine neue Petrischale mit eiskalten 1 X PBS um sie zu betäuben und mit einer Schere zu enthaupten.
    2. Einschläfern Sie ca. 7-8 Wochen alt männliche C57BL/6 Mäusen mit CO2 Erstickung. Führen Sie einen Schnitt auf jeder Maus-Truhe und sammeln Sie Herzen zu.
    3. Kurz spülen Sie fetalen und adulten Herzen mit Eis kalt 1 X PBS.
  2. Entfernen Sie die Vorhöfe des Erwachsenen Herzens mit Hilfe eines Skalpells. Führen Sie einen Schnitt auf der rechten Herzkammer und entfernen Sie ihn mit gerade kleine Schere. Setzen Sie die innere Wand des linken Ventrikels durch das Septum entfernen. In eine neue Petrischale Teilen der linken Herzkammer frei-Wand in Längs-Streifen mit 2 mm Dicke und Entfernen des papillären Muskels mit einem Skalpell und gezahnte Pinzette mit gebogenen Spitzen.
    1. Verbrauchsteuer kleine Gewebe Explantaten mit Hilfe eines Skalpells mit einem 2 x 2 mm-Raster (ausführliche Beschreibung in ergänzende Abbildung 1-5). Kurz spülen Sie Gewebe Explantaten mit 1 X PBS.
  3. Autoklaviert 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen ~ 250 µL optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung hinzufügen. Gesamte fetalen Herzen und Erwachsenen kardiale Explantaten auf die Rohre mit 250 µL Okt. übertragen und friere sie mit Trockeneis gekühlt Isopentane und Store bei-80 ° C (bis maximal 6 Monate).
    Hinweis: Die Verwendung von Herzgewebe Explantate für mehr als 6 Monate kryokonserviert werden die Decellularization Effizienz, vor allem in den Erwachsenen Herz Gewebe Explantaten deutlich reduzieren.

(3) Gewebe decellularization

Hinweis: Cardiac Gewebe Decellularization erfolgt in einer Gewebekultur 24-Well-Platte mit einer Probe pro Bohrloch. 1 mL der Lösung jeder Decellularization wird für jeden einzelnen ebenfalls hinzugefügt. Alle Decellularization Maßnahmen sollte mit Agitation bei 165 u/min (Inkubator Shaker mit einem orbital Durchmesser von 20 mm) und bei 25 ° C durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Konsultieren Sie für weitere Informationen bitte das Schema auf Abb. 1A. Amphotericin B (z.B. Fungizone) und Gentamicin werden frisch alle Decellularization Lösungen vor Gebrauch, eine Endkonzentration von 2,5 μg/mL und 0,01 μg/mL, bzw. hinzugefügt. Die Menge an DNA in decellularized Geweben, die Probe Masse muss ermittelt werden, bevor Sie beginnen das Decellularization Protokoll beibehalten zu quantifizieren. Das DNA-Quantifizierung Protokoll ist weiter detailliert in Abschnitt 5.1.

  1. TAG 1
    1. -80 ° C Gefrierschrank entnehmen Sie Gewebeproben. Lassen Sie die 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen RT bis OCT teilweise geschmolzen wird. Übertragen Sie den Herzgewebe Block des Office-Anpassungstools noch gefrorenen auf einer Petrischale mit 1 X PBS.
    2. Nachdem das Office-Anpassungstool schmilzt, verschieben Sie das Herzgewebe, eine neue Petrischale mit 1 X PBS. Wash-Proben 1 x PBS und bei 60 u/min mit einem Shaker für 10-15 min. wiederholen mindestens zweimal.
    3. Fügen Sie 1 mL Hypotonische Puffer pro Bohrloch einer sterilen 24-Well-Zellkultur-Platte zu arbeiten. Eine Probe pro Bohrloch mit Hilfe der Zange zu übertragen.
    4. Verschieben Sie die Gewebekultur 24-Well-Platte mit den Proben in einen Inkubator Shaker bei 25 ° C und beginnen Sie 18 h Inkubation mit hypotone Puffer.
  2. TAG 2
    1. Bereiten Sie die 0,2 % SDS-Lösung, wie beschrieben in Abschnitt 1.3.
    2. Aspirieren der hypotone Puffer und die Proben mit PBS 1 X für 1 Stunde wiederholen Sie 3-Mal waschen.
      Hinweis: PAUSENPUNKT: Gewebe unter Decellularization mit 1 X PBS-Puffer bei 4 ° C für 18 h unter statischen Bedingungen gehalten werden.
    3. Entfernen Sie 1 X PBS zu, fügen Sie 1 mL frisch zubereiteten SDS-Lösung (Schritt 1.3) pro Bohrloch und inkubieren Sie Proben für 24 h.
      Hinweis: (CHECK POINT) Post SDS Inkubation, sicherzustellen, dass Proben eine weiße, transluzente aussehen weisen. Bei diesem Schritt SDS behandelt Proben in der DNA, zeigen eine Gelatine-Konsistenz getränkt sind. Entfernen Sie die SDS-Lösung langsam um Probe Adhäsion an der Pipettenspitze zu vermeiden.
  3. TAG 3
    1. Waschen Sie die Proben mit hypotone waschen Puffer (1 mL pro Well) für 20 min. Wiederholen Sie 3-Mal.
      Hinweis: Bei diesem Schritt ist es normal, einen Rückgang der Größe der Stichprobe durch die Entfernung der Zelle Reste zu beobachten. PAUSENPUNKT: Gewebe unter Decellularization kann in hypotone Waschpuffer bei 4 ° C für 18 h unter statischen Bedingungen gehalten werden.
    2. Fügen Sie 1 mL der Lösung der DNase-Behandlung pro Bohrloch und inkubieren die Proben für 3 h bei 37 ° c
    3. Aspirieren Sie die DNase-Behandlung-Lösung und waschen Sie die Proben mit 1 X PBS (1 mL pro Well) für 20 min. Wiederholen Sie 3-Mal. Durchführen Sie eine endgültige waschen mit 1 X PBS (1 mL pro Well) über Nacht bei RT und schütteln bei 60 u/min.
    4. (Checkpoint) Sicherzustellen Sie nach der DNase-Behandlung, dass die decellularized Proben die Gelatine-Konsistenz verloren haben.
      Hinweis: Nach der DNase-Behandlung, entfernen Sie und fügen Sie 1 X PBS sanft hinzu, da Proben leicht gefangen und an der Pipettenspitze befestigt werden.

4. Bewertung der decellularized Zelle Gewebeentnahme

  1. Beheben Sie die Proben in einer 24-Well-Zellkultur-Platte, 1 Exemplar pro Bohrloch, durch Zugabe von 1 mL frisch zubereiteten 10 % Formalin neutral Puffer mit 0,03 % wässrige Eosin für 2,5-3 h bei RT
    Hinweis: Eosin ergänzt das Fixiermittel, das decellularized Gewebe zu beflecken und Probe Visualisierung während schneiden und histologische Färbung zu erleichtern. Die Zugabe von Eosin, die weder mit dem histologischen Flecken noch mit Immunfluoreszenz-Techniken stört. Alternativ kann die Fixierung über Nacht bei 4 ° c durchgeführt werden
  2. Entfernen Sie die Fixativ Lösung, und fügen Sie 1 mL 1 X PBS, die Probe zu waschen.
  3. Kapseln von den festen Bioscaffolds in histologischen Verarbeitung Gel mit einem Einweg-Vinyl Probe Form gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Entfernen Sie die Histologie-Gel mit der Probe vom Schimmel und Transfer zur Biopsie Verarbeitung/Embedding Kassetten mit Deckel eingebettet.
    Hinweis: Eine Alternative zum Gewebe einbetten in Histologie und Verarbeitung Gel ist, jede Probe in zwei Biopsie Schwämme mit kleinen Poren zu verarbeiten. Die Proben sollten in die Mitte der Biopsie Schwämme zur Erkennung aktivieren lokalisiert werden. Der Hinweis können einige Proben schwer zu lokalisieren, mit diesem Ansatz sein.
  5. Die Proben für Paraffin-Einbettung durch aufeinander folgende Inkubationen (30 min pro Lösung) in Reihe von Alkoholkonzentrationen (70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100 %), isoparaffinische aliphatische Kohlenwasserstoff-Lösung (2 Inkubation Stationen) und Paraffin (2 Inkubation zu verarbeiten Stationen) bei 56 ° C.
  6. Montieren Sie die Proben in einem Paraffinblock.
  7. Schneiden Sie 3 μm dicken Paraffin Abschnitte über ein Mikrotom und sammeln Sie in den Abschnitten auf Glas-Objektträger.
  8. Trockenen Paraffin Abschnitte über Nacht bei 37 ° C.
    Hinweis: (PAUSE Punkt) Paraffin Abschnitte werden bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gespeichert.
  9. Überprüfen Sie Protokoll Effizienz, durchführen Sie Hematoxilin und Eosin (H & E) und Masson Trichrome Färbung (MT), der decellularized Probe Abschnitte und Teile der nicht manipulierten Gewebe nach Herstellerangaben.
    Hinweis: H & E Färbung Flecken Zelle Kerne blau/lila, Zytoplasma rosa/dunkelrot und Kollagen blass rosa und MT Flecken Kerne schwarz, rot, Zytoplasma und Kollagen und Mucin blau. Effiziente Decellularization ist erreicht, wenn eine poröse Rosa (H & E, MT) und blau (MT) Netzwerk wird beobachtet, in Ermangelung eines nuklearen Flecks.

5. Bewertung der nuklearen Materialabtrag decellularized Gewebe

Hinweis: Die Quantifizierung von der DNA-Gehalt auf decellularized Gewebe muss im Vergleich zu den jeweiligen nicht manipulierten Gewebe durchgeführt werden.

  1. Wiegen Sie vor Decellularization einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf eine hochpräzise digitale Waage. Übertragen Sie das Herzgewebe auf das Rohr, entfernen Sie den überschüssigen Betrag von 1 X PBS und wiegen Sie das Rohr mit den Proben. Berechnen Sie das Frischgewicht der Proben:
    Probieren SieNassgewicht = Gewicht Rohr mit Proben – Gewicht Leerrohr
  2. Decellularize Sie die Proben, wie in Schritt 3 beschrieben.
  3. Nach Decellularization sammeln Sie das decellularized Gewebe in einem Microcentrifuge Schlauch.
    1. Aufgrund der geringen Abmessungen und Masse des kardialen Einzelproben und Kit Spezifikationen, Schwimmbad decellularized Gewebe von jeder Probe Zustand (fetalen Herzens: 5 ganze Herzen; Erwachsene LV Explantaten: 15 Explantate). Führen Sie die gleiche Prozedur mit dem Gewebe nicht manipuliert.
      Bemerkung: (PAUSENPUNKT) der Proben kann bei-20 ° C gelagert, bis DNA-Extraktion und Quantifizierung durchgeführt werden.
  4. Schneiden Sie die nicht manipuliert und decellularized Gewebe in kleinen Explantaten mit Hilfe eines Skalpells in einer sauberen Petrischale.
    Hinweis: Verwenden Sie eine einzelne Skalpell und Petrischale für jede Probe. Mechanische Störungen der Proben mit einem Skalpell erleichtert ihre hinteren enzymatische Verdauung und anschließende DNA-Extraktion.
  5. Verwenden Sie für DNA-Extraktion Spin-Spalte basierend DNA Extraktion Verfahren nach den Anweisungen des Herstellers.
    1. Sammeln Sie die mechanisch getrennten Proben aus der Petrischale mit dem master Verdauung Puffer (Verdauung Puffer und Proteinase K) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einer breiten Öffnung Pipettenspitze.
      Hinweis: Gewebe Lyse mit Proteinase K-Verdauung ist schneller in decellularized Proben. Um verschiedene Proben gleichzeitig zu verarbeiten, halten Sie lysierten Proben auf Eis, bis alle Proben lysiert werden, um Abbau zu minimieren. Vollständigen Beispielen Lyse wird zwischen 4-6 h erreicht.
    2. Fahren Sie mit dem Protokoll gemäß die Anweisungen des Herstellers.
    3. Um die Erträge der extrahierten DNA von decellularized und nicht decellularized Gewebeproben zu erhöhen, Eluieren Sie die DNA auf 25-50 μL und 100 μL der Elution Puffer bzw.. Sammeln der eluierten DNS und laden Sie die Spin-Spalte. Inkubieren Sie 1 min bei RT. Zentrifuge die Proben nach den Anweisungen des Herstellers.
      Bemerkung: (PAUSE Punkt) der DNA extrahiert aus den Proben kann Shop bei-20 ° C bis zur weiteren Verwendung.
  6. Quantifizieren Sie die extrahierte DNA aus den Proben mit einem fluoreszierenden DsDNA Detection Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
  7. Normalisieren der DNA-Gehalt als Nanogramm DNA pro Milligramm Erstmuster Frischgewicht (vor Decellularization).

6. Decellularized Gerüste Zelle Aussaat

Hinweis: Alle Lösungen/Reagenzien müssen steril sein und das gesamte Verfahren bei sterilen Bedingungen durchgeführt.

  1. Bereiten Sie 1 X DPBS mit 2,5 μg/mL Amphotericin B und 1 % P/S (Penicillin, 100 I.U; Streptomycin 100 µg/mL).
  2. 1 x PBS-Lösung aus der letzten Decellularization Waschschritt (Schritt 3.3.3) entfernen und Hinzufügen von 500 μL pro Well von der frisch zubereiteten 1 x DPBS/2,5 μg/mL Amphotericin B/1% P/S-Lösung. Proben bei 4 ° C von 1-7 Tage zu speichern.
    Hinweis: Lagerung der Proben bei 4 ° C ist wichtig, Sterilität zu erhalten.
  3. Fügen Sie P/S um basale Medien (ohne FBS und Ergänzungen), eine Endkonzentration von 1 % Zelle hinzu.
  4. Aspirieren Sie 1 x DPBS/2,5 μg/mL Amphotericin B/1% P/S-Lösung von den decellularized Proben. 500 μL pro Well der basalen Zelle media/1% P/S und lassen für 1 h bei 37 ° C oder bei 4 ° C für mehr als 1 h equilibrate Proben.
  5. Teilen Sie die Zellen von Interesse und bereiten Sie kleine Aliquote der Zellen an die Zelldichte gewünscht.
    Hinweis: Das decellularized Gewebe seeding muss unter dem stereoskopische Mikroskop und unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Zellkulturmedien sollte 1 % P/S.
  6. Pipette 3-4 μL des DPBS in die Mitte eines Brunnens einer 96-Well-Platte. Dünn und gerade Pinzette, übertragen Sie die decellularized Gerüste bis zum DPBS Tropfen, entfernen Sie die zusätzlichen DPBS durch Absaugen und stellen Sie sicher, dass die Probe nicht gefaltet oder faltig ist. Lassen Sie es trocken an den Rändern an der Oberfläche gut halten werden.
    Hinweis: Freistehende Gerüste haben niedrigeren seeding Effizienz.
  7. Fügen Sie Zellen durch Pipettieren der einzelligen Lösung langsam an den Rändern des Brunnens auf dem Schafott hinzu.
    Hinweis: zum Beispiel sind neonatalen Ratte Herzzellen mit bei einer Dichte von 7.500 Zellen/mm2 und verewigt Maus Lin− Sca-1+ kardialen Vorläuferzellen (iCPCSca-1) bei einer Dichte von 60-1.500 Zellen/mm2ausgesät. Passen Sie Zelldichte nach der experimentellen Logik an.
  8. Fügen Sie DPBS in die benachbarten Vertiefungen um schnelle Medien Verdunstung zu vermeiden.
  9. 24 Stunden post Zelle Aussaat, wenn Zelltyp verwendet die Gewebekultur Polystyrol-Platten (TCPS) eingehalten Bioscaffolds auf einen neuen Brunnen zu übertragen. Andernfalls ersetzen Sie das Medium, um nicht-anhaftende Zellen zu entfernen.
  10. Wechseln Sie sorgfältig das Medium nach spezifischen Anforderungen des Zelltyps.

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Representative Results

Die Decellularization Effizienz bewertet werden sollen, durch drei Haupttechniken: makroskopische Beobachtung, Histologie und DNA-Quantifizierung. Das makroskopische Erscheinungsbild der Proben Post-SDS-Behandlung wirkt sich indirekt die Wirksamkeit der Zelle entfernen. Nach der SDS Inkubation sollte Proben so durchscheinend bis weißlich (Abbildung 1) angezeigt werden. Fetal (E18) decellularized Gewebe durch eine stark durchscheinende Struktur auszeichnen, während Erwachsene Explantaten eine durchscheinende, weißes Aussehen haben. Eine weißere Aussehen ist in der Regel zu einem ECM-Netzwerk ausstellenden höhere Faser und Kollagen Inhalte, z. B. , was die Erwachsenen ventrikuläre und vaskuläre Schiffe ECM mesh (Abbildung 1) korreliert. Hämatoxylin und Eosin (H & E) und/oder Masson Trichrome (MT) Flecken werden durchgeführt, um effiziente Zelle entfernen bestätigen durch die Beobachtung eines porösen Mesh (hellrosa, H & E; hell rosa und blau, MT) (Abbildung 1). Darüber hinaus unterstreicht der MT-Fleck der Kollagen-Geflecht in Blau5. Clearance von nuklearem Material nach Decellularization von DNA Quantifizierung zugegriffen wird und eine Reduktion von ca. 99,8 % werden in der Regel erreicht, wenn im Vergleich zu nicht manipulierten Gewebe (Abbildung 1). Das Vorhandensein von nuklearem Material auf decellularized Gerüsten wurde als Auslöser der unerwünschten Entzündungsreaktion nach Implantation14beschrieben. Aus diesem Grund unbedingt Bestätigung der effizienten Decellularization vor native 3D Gerüst Wiederbesiedlung Experimente. Decellularized Gerüste können unter sterilen Bedingungen bis zu die Aussaat mit den Zellen des Interesses gespeichert werden. Zellviabilität wird im gesamten in-vitro-Kultur von Calcein Färbung (Abbildung 2A) überwacht. Dennoch kann Calcein Fleck zytotoxische, sensible Zelltypen. Terminal Analyse der Zelle Wiederbesiedlung und Verteilung auf Gerüsten ist durchgeführten Post-Paraffin-Verarbeitung; ein Überblick über die Bioscaffold Wiederbesiedlung von H & E Färbung an einem zentralen Abschnitt des Bioscaffolds bewertet wird (Abb. 2 b, 2 C) angezeigt.

Figure 1
Abbildung 1: Fetal (E18) und Erwachsenen Herzgewebe Decellularization Verfahren und Bestätigung der Decellularization Effizienz. (A) Protokoll Übersicht. (B) Decellularization Protokoll detailliert. (C) makroskopische Analyse der fetalen und adulten Herzgewebe vor und nach Decellularization. Maßstabsleiste: 2 mm. (D) Quantifizierung von Kernmaterial in decellularized im Vergleich zu nicht manipulierten Gewebe. Daten zum Ausdruck gebracht als ± SEM Student t-Test, zweiseitige bedeuten * p < 0,05. (E) H & E und Masson Trichrome histologische Analyse der fetalen und adulten Herzgewebe vor und nach Decellularization. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2. Wiederbesiedlung Analyseder decellularized Gerüste ausgesät mit Lin - Sca-1+ kardialen Vorläuferzellen Zelllinie (iCPCSca-1). (A) hohe Zellviabilität beobachtet an Gerüsten Oberfläche bei in-vitro-Kultur von Calcein Fleck (grün). Maßstab: 100 μm. (B) Handy-Anzahl und Verteilung über Gerüste über H & E Färbung bewertet. Maßstab: 100 μm. (C) orthogonale Ansicht der Zellen in der decellularized ECM eingebettet. Konfokale Bild 50μm dicken Paraffin-Abschnitts. Maßstab: 10 μm (orthogonale Ansicht XZ, YZ) und 40 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Schritt Beobachtung Mögliche Ursache Problem Lösung
3.1.2. Gewebe mit einer bräunlichen Farbe Probe Hochdruckgefrierfixierung; instabile Gefriertemperatur Probe Hochdruckgefrierfixierung führt zu ineffizienter Entfernung von zytoplasmatischen Proteinen Speichern Sie gefrorenes Gewebe in kürzeren Zeiträumen. Gefrierschrank-Temperatur und Stabilität prüfen
3.2.4. Rosa-weiß-opake Proben SDS-Lösung war nicht gut zubereitet; Erwachsenen LV Explantaten zu groß Ineffiziente Entfernung von zytoplasmatischen Proteinen Komplette SDS-Auflösung zu gewährleisten. Decellularize Proben von kleiner Größe.
3.3.4. Proben mit einer Gelatine-aussehen Ineffiziente DNA-Entnahme Ineffiziente nukleare Material clearance Erhöhen Sie DNase Konzentration und/oder Inkubation Zeit.
4.6. Histologie Gel Verdichtung Lange Wartezeiten in PBS1X/Ethanol vor der Paraffin-Verarbeitung Änderung der decellularized Gewebestruktur Beginnen Sie histologischen Verarbeitung so bald wie möglich
6.6. Getrocknete decellularized Proben Proben wurden überlassen, um zu lange trocknen Permanente Zusammenbruch des decellularized Gewebes. Ineffiziente Zelle Aussaat Proben können leicht trocken, nur in der Peripherie um während der Aussaat mit der Unterseite des Brunnens verknüpft werden
6.7. Decellularized Probe Ablösung während der Aussaat Proben wurden nicht ausreichend vor der Aussaat getrocknet Ineffiziente Zelle Aussaat ECM Trocknungszeit ermöglicht bessere Einhaltung vor der Aussaat Zelle zu erhöhen

Tabelle 1. Fehlersuchtabelle für parallele Decellularization der fetalen (E18) und Erwachsenen Maus Herzgewebe.

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Discussion

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein äußerst dynamischen und komplexen Geflecht von faserigen und Klebstoff Glykoproteinen, bestehend aus einem Reservoir von zahlreichen bioaktiven Peptiden und eingeschlossene Wachstumsfaktoren. Als die wichtigsten Modulator der Zelladhäsion, Zytoskelett Dynamik, Motilität/Migration, Proliferation, Differenzierung und Apoptose regelt ECM aktiv Zellfunktion und Verhalten. Zu wissen, dass zelluläre Verhalten in 2D und 3D Kulturen unterscheidet, wurden Anstrengungen unternommen, neuartige organotypischen Modelle zu entwickeln, die natürliche Gewebe Umgebungen genau replizieren kann. In den letzten Jahren hat Gewebe Decellularization als eine alternative Technik für Tissue engineering und regenerativer Medizin entstanden. Gewebe und Organ Decellularization deshalb derzeit das Mittel der Wahl, gewebespezifische microenvironmental Parameter (biochemische, strukturellen und mechanischen) besser zu zergliedern und biologische Aktivität in vitro und in vivo.

Wir entwickelten eine Protokoll, die den Einsatz eines hypotone Puffers mit einem Reinigungsmittel von anionischen Tensiden Eigenschaften gefolgt von einer DNase Behandlung5,12,13verbindet. Dieses Protokoll stellt eine einfache und reproduzierbare Methode durchführen vergleichende Analyse zwischen decellularized fetalen und adulten Maus Herzgewebe. Unsere Erfahrung mit anderen Geweben, nämlich mit Tumorproben abgeleitet von Krebs-Patienten chirurgischen Resektionen und Maus Lungengewebe, zeigt, dass dieses Protokoll leicht anpassbar und erfolgreich in anderen Bedingungen ist und12,13-Modelle. Die Anwendung des Verfahrens der gleichen Decellularization an verschiedenen Proben ermöglicht vergleichende Studien der ECM-Zusammensetzung, biomechanischen Eigenschaften, Architektur und zelluläre modulierende Eigenschaften in einem 3D Kontext.

Eine der schwierigsten Herausforderungen der Gewebe Decellularization ist die Balance zwischen geradezu Zelle entfernen, ECM Geflecht Erhaltung und Gewebe Biokompatibilität. Mehrere wichtige Schritte müssen daher sorgfältig geprüft werden, wie z. B. Gewebe Kryokonservierung vor Decellularization, die richtige modellabhängigen Größe, die Verwendung von frischen Lösungen und die Manipulation des endgültigen decellularized Gewebes. Während des Studiums beobachteten wir eine direkte Korrelation zwischen lange Lagerzeit von kryokonservierten Gewebe und die Verwendung von langjährigen SDS-Lösungen mit Decellularization Ineffizienz. Langzeitlagerung Gewebe führt zu ineffizienten zelluläre Inhalt entfernen Rendering Reste der Dicke zelluläre Bereiche (ohne Kerne) unter das komplexe Geflecht von ECM. Eine ähnliche unerwünschte Wirkung wird erreicht, wenn lange gespeicherte SDS-Lösungen, für Gewebe Decellularization, wahrscheinlich eingesetzt werden, weil SDS-Lösungen eine kurzen Stabilität durch geringere Löslichkeit, Hydrolyse und pH-Wert-Änderungen über Zeit15,16 haben . Die Verwendung von Explantaten der richtigen Größe (~1.5 x 1,5 x 1,5 mm) ist auch wichtig für erfolgreiche Erwachsene Gewebe Decellularization, da größere Gewebe Resektionen schwieriger sind zu decellularize, Zellenrückstand Anzeige an der Oberfläche gefangen und verhaftet zwischen dem dichten Netz von ECM. Obwohl dieses Protokoll eine effiziente Methode von Herzgewebe Decellularization bietet, kann ein kleine Bruchteil der Erwachsenen Explantaten Zelle Reste, insbesondere eine größere Größe Anwesenden. Histologische Analyse dieser Proben erleichtert ihre Identifizierung und anschließenden Ausschluss aus der Studie. Letztlich, das Protokoll hierin ist vielseitig und leicht anwendbaren an verschiedene Exemplare mit leichten Anpassungen an die Gewebe modellabhängigen Größe, SDS-Konzentration (0,1-0,2 % SDS) oder Lösung Inkubation Zeit5,12,13 .

Die größte Beschränkung des vorliegenden Verfahrens ist, dass die Manipulation der kleinen Größe Proben, d.h. murinen fetalen Herzens und Erwachsene Herz explants erfordert einige Handhabung Fähigkeiten. In der Tat sind fetalen und adulten decellularized Gewebe filigranen Strukturen, die dauerhaft verformt sein können, wenn während des Verfahrens getrocknet oder gefangen durch die dünne Pipettenspitze oder bei der Handhabung mit Zange5.

Die große Neuerung dieses Protokolls, neben der parallelen Decellularization der fetalen Maus Herz und Erwachsenen linke Herzkammer Explantate für die vergleichende Bewertung der ECM Zusammensetzung (biomechanische Analysen) und der damit verbundenen biologischen Funktion, ist seine einfache Übersetzung in verschiedenen Geweben und Modelle5,12,13. Die Decellularization von Geweben unterschiedlichen Alters durch die Anwendung von standardisierten Methodik wurde beschrieben, nur auf die Rhesus-Affen Niere und die Querschnitte der fetalen, Neugeborene und Erwachsene Gewebe, die zu einer 1 % SDS-Behandlung für 10 Tage6 unterzogen wurden . Eine kardiale Einstellung unterschieden sich in obwohl fötale, neonatale und adulten Geweben decellularized haben, die Methoden nach dem Grad der mechanischen verdrängen, SDS-Konzentrationen und Zeitpunkt der Anwendung7,8. Wie jedes Decellularization Verfahren der ECM auf einzigartige Weise betroffen sind, kann der Vergleich der decellularized Proben aus verschiedenen Protokollen zu irreführenden Ergebnissen führen. Daher ermöglicht die Anwendung des gleichen Decellularization Verfahrens über verschiedene Proben zuverlässig vergleichende Analyse.

Die große Mehrheit der handelsüblichen decellularized Gewebe daraus Erwachsene Exemplare17. Trotz der wachsenden Anerkennung für eine erhöhte Fähigkeit der fetalen Mikroumgebungen bei der Bereitstellung von Pro-regenerative Signale im Vergleich zu Erwachsenen Pendants berichtete Decellularization fetaler Gewebe nur in wenigen Studien5, 7 , 18 , 19 , 20 , 21. Verständnis ECM Dynamik während der Alterungsprozess wird entscheidend sein, Besonderheiten des Pro-regenerative Mikroumgebungen zu identifizieren, die wiederum auf die Entwicklung der höheren Effizienz biomimetischer Materialien Auswirkungen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren sind verpflichtet, alle Mitglieder der Pinto Ó Labor für relevante kritische Diskussion. Diese Arbeit wurde unterstützt von Programa MIT-Fundação Para Ciência e Tecnologia (FCT) im Rahmen des Projekts "CARDIOSTEM-Engineered kardialen Gewebe und stammzellbasierte Therapien für Herz-Kreislauf-Anwendungen" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S ist ein FCT Fellow [SFRH/BD/88780/2012] und M.J.O. ist FCT Fellow (FCT-Investigator 2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker Orbital Shakers IKA:3510001 Recommended
Fluorimeter - - Equipment available
Digital weight scale - - Equipment available
Inverted Microscope - - Equipment available
Cell culture incubator - - Equipment available
Fridge (4ºC) - - Equipment available
Deep freezer (-80ºC) - - Equipment available
Microtome - - Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge Fine Science Tools 5000-08 Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11254-20 Recommended
Dumont 7 forceps Fine Science Tools 11272-30 Recommended
Dissecting Scissors, straight - - Tool available
Forceps, serrated, curved - - Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped VWR 29442-044 -
96 well plates, individually wrapped VWR 71000-078 -
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized Millipore SE1M179M6 -
Eppendorff - - Material available
15 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430791 -
50 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430829 -
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid Electron Microscopy Science 70075-B -
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 22-037-246 -
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006 -
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) Sigma-Aldrich 277258-1L -
Dry ice - - -
Decellularization
NaCl BDH Prolabo 27810.364 -
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S-31264 -
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-100g -
KCl Sigma-Aldrich P8041-1KG -
TrisBASE Sigma-Aldrich T6066-500G -
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L-4390 -
MgCl2 MERCK 1.05833.1000 -
DNAse I AplliChem A3778,0050 -
Gentamicin Gibco 15710-049 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Deionized water (DI water) - - -
Histology
10 % formalin neutral buffer Prolabo 361387P -
Eosin Y AQUEOUS Surgipath 01592E Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 -
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous Aga 4,006,02,02,00 -
Deionized water (DI water) - - -
Clear Rite 3 Richard-Allan Scientific 6915 -
Shandon Histoplast Thermo Fisher Scientific RAS.6774006 -
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific K182001 -
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit Invitrogen P11496 -
Cell culture
DPBS VWR 45000-434 -
Penicillin-Streptomycin Solution 100X Labclinics L0022-100 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Cell culture media of the cell of interest - - -

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References

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Biotechnik Ausgabe 145 Decellularization extrazelluläre Matrix 3D Gerüste fetalen Herzens Erwachsenen Herzen Herzgewebe Engineering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 04/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

Vergleichbare Decellularization von fetalen und adulten Herzgewebe Explantaten als 3D-ähnliche Plattformen für In-vitro-Studien
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Silva, A. C., Oliveira, M. J.,… More

Silva, A. C., Oliveira, M. J., McDevitt, T. C., Barbosa, M. A., Nascimento, D. S., Pinto-do-Ó, P. Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (145), e56924, doi:10.3791/56924 (2019).

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