Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

דומה Decellularization של רקמת הלב העוברי ומבוגרים Explants כמו פלטפורמות דמויי תלת-ממד עבור לימודי חוץ גופית

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/56924
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,5, 4,6, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

ERRATUM NOTICE

Summary

מטריצה חוץ-תאית הלב (ECM) היא רשת מורכבת של מולקולות שננהל את מפתח בתהליכי רקמות ואיברים שתישא את שיפוץ פיזיולוגיים לאורך החיים. Decellularization מתוקננת לב העובר, למבוגרים היתרי השוואתי ניסיוני של שתי רקמות בהקשר תלת-ממד על-ידי לכידתו ארכיטקטורה מקורית ומאפיינים ביו-מכני.

Abstract

הידע הנוכחי של מטריצה חוץ-תאית (ECM)-תקשורת התא מתרגמת ללימודים רב מימדי תרבות במבחנה (2D) שבו רכיבי ה-ECM מוצגות כחלק משטח ציפוי. מערכות התרבות אלו מהווים של פישוט של האופי המורכב של הרקמה ECM שמקיף את ההרכב הביוכימי, מבנה, תכונות מכניות. לחקות טוב יותר של תקשורת ECM בעיצוב של microenvironment לב, פיתחנו פרוטוקול המאפשר decellularization של הלב העוברי לגמרי, החדר השמאלי למבוגרים רקמת explants במקביל ללימודי השוואתי. הפרוטוקול משלב את השימוש מאגר היפוטוניק, חומר ניקוי של מאפיינים anionic חומרים פעילי שטח, וטיפול DNase ללא כל דרישת כישורים מיוחדים או ציוד. היישום של האסטרטגיה decellularization אותו על פני דגימות רקמה מן הנבדקים של גיל שונות היא גישה אלטרנטיבית לביצוע מחקרים השוואתיים. בפרוטוקול הנוכחי מאפשר זיהוי הבדלים מבניים ייחודי על פני העובר למבוגרים לב ECM עם רשת שינוי, ביולוגיים הסלולר תגובות ו. יתר על כן, בזאת מתודולוגיה מדגים יישום רחבה יותר בהצלחה ליישם רקמות ומינים אחרים עם התאמות קלות, כגון ביופסיות במעי האדם, הריאות העכבר.

Introduction

מטריצות (ECM) היא רשת דינמית של מולקולות המסדירים חשוב תהליכים תאיים, כלומר הגורל-החלטה, התפשטות ובידול1,2. החקירה של התא-ECM אינטראקציות בוצעו בעיקר דו מימדי (2D) בתרבויות חוץ גופית מצופה עם רכיבים ECM, אשר מהווים של פישוט של מאפייני ECM יליד נמצאו vivo. Decellularization יוצר acellular bioscaffolds ECM תלת ממד זה בעיקר לשמר את אדריכלות חוץ-תאית קומפוזיציה של יליד רקמות, איברים3,4. בנוסף להיותם פיגומים ביואקטיביות עבור הנדסת רקמות, decellularized 3D ECM biomaterials מתגלים כמו פלטפורמות הרומן להעריך ביולוגיה של התא-ECM העוברים במקביל הסביבה ויוו.

הערכה של תפקיד דיפרנציאלית של רכיבי ה-ECM של רקמות שונות, איברים, גיל ייהנו עם השימוש של פרוטוקולים דומה של יצירת bioscaffolds מקורי. בלב, פיתחנו פרוטוקול רב-תכליתי עבור decellularization של העובר, מבוגר-derived דגימות, כגישה חלופית לביצוע מחקרים השוואתיים של microenvironment איברים. באמצעות מתודולוגיה זו, אנו כבשו את microenvironment לב מקורית, הראה כי העובר ECM מקדמת את תשואות גבוהות איכלוס של תאי לב5. Decellularization הוסיפה זיהוי של תושב מבניים ההבדלים בין ECM עוברית ומבוגרים ברמה של סידור רשת מטריקס פרופריה המרתף, pericellular סיבים הרכב5. לפני שזה יעבוד, עפות. השוואה של רקמות בשלבים אונטוגנית שונים, באמצעות גישה decellularization אותו רק דווח על הכליות קוף רזוס ולבבות מכרסמים. בנוסף, מספר מצומצם של מחקרים מדווחים רקמות/איבר בעובר decellularization כשלעצמה5,6,7. זו הושגה באמצעות מרחביות כסוכן decellularization ייחודי; עם זאת, ריכוז מרחביות שונות שימשו את decellularization של רקמת הלב העוברי ומבוגרים7,8. למען חברה דמוקרטית היא לאחד חומרי ניקוי יוניים היעיל ביותר לאישור של חומר cytoplasmic וגרעיני, בשימוש נרחב decellularization שונים רקמות, דגימות9,10. פתרונות המכילה ריכוז גבוה מרחביות, ממושכות של חשיפה יש היה בקורלציה עם דנטורציה של חלבונים, ואובדן גליקוזאמינוגליקן (GAGs) שיבוש קולגן הסיבים10,11, ולכן האיזון בין שימור ECM והסרת תאים הכרחי. כדי להחיל את ההליך על רקמת הלב העוברי, למבוגרים, פרוטוקול המתוארים בזאת מחולקת לשלושה שלבים רציפים: תא פירוק על ידי שוק אוסמוטי (מאגר היפוטוניק); solubilization של אינטראקציות חלבון השומנים, חלבון-דנ א, חלבון (0.2% מרחביות); הסרת חומרים גרעיניים (טיפול DNase).

פרוטוקול שלנו מראה מספר יתרונות: אני) האפשרות של decellularization המקביל של רקמות הלב גיל ספציפי על-ידי היישום של האסטרטגיה decellularization אותו; ii) שאין דרישות שיטות מיוחדות או ציוד; iii) שמוכן ההסתגלות רקמות ו מינים אחרים כמו זה יושם בהצלחה עם שינוי קטן ביופסיות במעי האדם12 ו העכבר ריאות13; ו, וחשוב, הרביעי) יכול לפנות מאפיינים biomechanical ECM תוך מתן אפשרות ההרכבה של תרבויות דמויי תלת-ממד organotypic יותר מקרוב לחקות התכונות מולקולרית של microenvironment הרקמה הטבעית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל למתודולוגיות תיאר אושרו על-ידי i3S ועדת האתיקה חיה ואני מחפשת Geral דה Veterinária (DGAV) והן על פי אירופה הפרלמנט דירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי.

1. הכנת הפתרונות decellularization

הערה: כל decellularization פתרונות צריך להיות מסונן דרך פילטר ממברנה μm 0.22 ומאוחסנת לתקופה מקסימלית של 3 חודשים, למעט צוין אחרת.

  1. עבור 1 x PBS: לערבב 8 גרם של NaCl, 1.01 גר' נה2HPO4 200 מ ג אשלגן כלורי, ו- 200 מ ג2פו ח'4 עם 900 מ ל מים יונים (DI מים). התאם פתרון pH 7.5, האחסון הפתרון הסופי את מסנן ל' 1, החיטוי של החנות הפתרון בטמפרטורת החדר (RT).
  2. עבור מאגר היפוטוניק (10 מ"מ. טריס, 0.1% EDTA): להמיס 1.21 g של TrisBASE ו- 1g של EDTA ב 900 מ ל מים יונים. להתאים את פתרון ה-pH ל 7.8 עם NaOH/HCl ונפח הפתרון הסופי למסנן ל' 1 לחטא על ידי תא לחץ, לאחסן ב- RT.
  3. לפתרון מרחביות 0.2% (0.2% מרחביות, 10 מ מ טריס): להוסיף 0.6 גרם של TrisBASE ו- 1 גר' נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) ב- 400 מ ל מים DI ומערבבים ב 60 מעלות צלזיוס עד פירוק מלא ממס. תן פתרון להתקרר RT. התאם פתרון ה-pH ל 7.8, האחסון הפתרון הסופי עד 500 מ"ל. לעקר את הפתרון על-ידי סינון.
    הערה: הפתרון מרחביות צריך להיות מוכן לפני השימוש. פתרון סינון להשלים רק לאחר פירוק מרחביות, אחרת החלקיקים לא מסיסים מרחביות להרוות את המסנן, שינוי הריכוז מרחביות הסופי, כתוצאה מכך המשפיעים על יעילות decellularization רקמות.
  4. בשביל לשטוף היפוטוניק מאגר (10 מ מ טריס): מערבבים 1.21 גר' TrisBASE ב 900 מל של די מים. להתאים את פתרון ה-pH ל 7.8 ואת אמצעי האחסון הסופי למסנן ל' 1, לחטא על ידי תא לחץ ולאחסן ב RT.
  5. לטיפול DNase (20 מ"מ טריס, 2 מ מ MgCl2, 50 DNase U/mL): להמיס 2.42 g של TrisBASE ו- 2 מ של 1 מ' MgCl2 900 מ ל מים DI. להתאים את ה-pH ל 7.8 ונפח הפתרון הסופי למסנן ל' 1, לעקר את הפתרון על ידי תא לחץ. לאחסן פתרון RT. להוסיף DNase אני (50 U/mL) לפני השימוש.
  6. עבור DNase אני מדמין פתרון: להכין מאגר DNase המכיל 50% גליצרול, 20 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 1 מ MgCl2, ולהתאים את נפח הפתרון הסופי של 10 מ"ל מים DI. תא למינארי, הוסף את DNase אני לפדר את המאגר DNase ומערבבים בעדינות עד התפרקות מוחלטת. לחטא פתרון דרך מסנן μm 0.22. להכין 1 מ"ל aliquots ולאחסן ב-20 ° C.

2. רקמת קציר, הקפאה קריוגנית

  1. המתת חסד הבוגרת בהריון-18 ימים של ההיריון (E18 העוברים) באמצעות חנק2 CO. לבצע ניתוח קיסרי על הנקבות עם מספריים כירורגיים ולאסוף את הקרניים הרחם הנושאת עוברי עכברים צלחת פטרי עם PBS קר כקרח 1 x באמצעות מלקחיים משוננות שני עם טיפים מעוקל (פינצטה אחד בכל צד של קרן).
    1. פתח את הקרניים הרחם ואת שק שפיר לבודד את העוברים. העברת העוברים צלחת פטרי חדש עם PBS קר כקרח 1 x עזים ומתנגד להם, לכרות עם מספריים.
    2. המתת חסד עכברים C57BL/6 זכר בן 7-8 שבועות באמצעות חנק2 CO. לבצע חתך על כל החזה העכבר ולאסוף את הלב.
    3. לשטוף בקצרה ליבם עוברי ומבוגרים עם PBS קר 1 x קרח.
  2. הסר אטריה לב למבוגרים בעזרת אזמל. לבצע חתך על החדר הימני, להסיר אותו באמצעות מספריים קטנות ישר. לחשוף את הדופן הפנימית של החדר השמאלי על-ידי הסרת מחצה. בצלוחית חדש, לחלק את החדר השמאלי חינם-הקיר רצועות האורך בעובי 2 מ מ ולהסיר את השריר papillary באמצעות אזמל פינצטה משונן עם טיפים מעוקל.
    1. בלו explants רקמה קטנה בעזרת אזמל באמצעות רשת 2 מ"מ x 2 מ"מ (תיאור מפורט איור 1משלים5). לשטוף בקצרה רקמת explants עם 1 x PBS.
  3. להוסיף ~ 250 µL של חיתוך אופטימאליים הטמפרטורה (אוקטובר) מתחם mL 1.5 בלוק microcentrifuge צינורות. להעביר הצינורות עם 250 µL של OCT לבבות כל עוברית, explants לב למבוגרים ומקפיאים עם קרח יבש מקורר איזופנטאן וחנות ב-80 מעלות צלזיוס (עד למקסימום של 6 חודשים).
    הערה: השימוש ברקמת הלב explants cryopreserved במשך יותר מ-6 חודשים תפחית באופן משמעותי את יעילות decellularization, ובמיוחד explants רקמות הלב למבוגרים.

3. רקמת decellularization

הערה: decellularization רקמות הלב מבוצעת בצלחת תרביות רקמה 24-ובכן עם דוגמא אחת לכל טוב. 1 מ"ל של כל פתרון decellularization נוסף לכל אדם טוב. כל השלבים decellularization צריכה להתבצע עם עצבנות 165 סל ד (שייקר אינקובטור בקוטר אורביטל של 20 מ מ) וכן ב- 25 ° C, אלא אם צוין אחרת. לקבלת פרטים נוספים, נא עיין להחיל את הערכה על איור 1A. B שהוא גוסס (למשל fungizone) ו גנטמיצין טרי יתווספו כל הפתרונות decellularization לפני השימוש כדי ריכוז סופי של 2.5 μg/mL ו- 0.01 μg/mL, בהתאמה. כדי לכמת את כמות ה-DNA נשמר בתוך רקמות decellularized, לצרכי המוני מדגם נקבע לפני תחילת פרוטוקול decellularization. פרוטוקול כימות הדנ א הוא יותר מפורט ב סעיף 5.1.

  1. יום 1
    1. להסיר דגימות רקמה מהמקפיא-80 ° C. יוצאים 1.5 mL microcentrifuge צינורות RT עד אוקטובר הופך להיות מותך. להעביר את הבלוק ברקמת הלב של ה-OCT עדיין קפוא צלחת פטרי עם 1 x PBS.
    2. לאחר OCT נמס, להעביר את רקמת הלב צלחת פטרי חדש עם 1 x PBS. שטיפת דגימות 1 x PBS ו- 60 סל ד עם מטרף במשך 10-15 דקות לחזור לפחות פעמיים.
    3. להוסיף 1 מ"ל של עובד היפוטוניק מאגר לכל טוב של צלחת סטרילי תרביות רקמה 24-. טוב. העברת דוגמא אחת לכל טוב בעזרת מלקחיים.
    4. להעביר לצלחת תרביות רקמה 24-ובכן עם הדגימות שייקר אינקובטור 25 ° c ולהתחיל הדגירה 18 h עם מאגר היפוטוניק.
  2. יום 2
    1. הכינו את הפתרון מרחביות 0.2% כמתואר בסעיף 1.3.
    2. תשאף המאגר היפוטוניק ולשטוף את הדגימות עם PBS 1 x 1 ה' חוזר 3 פעמים.
      הערה: השהה נקודה: רקמות מתחת decellularization ניתן לשמור ב- 1 x PBS ב 4 ° C עבור 18 h בתנאים סטטי.
    3. הסר את PBS 1 x, להוסיף 1 מ"ל של פתרון מרחביות טרי (שלב 1.3) לכל טוב, דגירה בדגימות במשך 24 שעות ביממה.
      הערה: (סמן את נקודת) פוסט מרחביות דגירה, להבטיח כי דגימות תערוכת לבן מראה שקוף. בשלב זה, התייחסו מרחביות דגימות הן שטוף ב- DNA, מראה עקביות דמוי ג'לטין. הסרת פתרון מרחביות לאט כדי להימנע מדגם אדהזיה לקצה פיפטה.
  3. יום 3
    1. לשטוף את הדגימות עם מאגר לשטוף היפוטוניק (1 מ"ל לכל טוב) במשך 20 דקות חוזר 3 פעמים.
      הערה: בשלב זה, זה נורמלי לצפות לירידה גודל המדגם הודות להסרת שאריות תאים. נקודת PAUSE: רקמות מתחת decellularization יכול להישמר במאגר לשטוף היפוטוניק ב 4 ° C עבור 18 h בתנאים סטטי.
    2. להוסיף 1 מ"ל של טיפול DNase פתרון לכל טוב, דגירה בדגימות עבור h 3-37 מעלות צלזיוס.
    3. וארוקן את הפתרון לטיפול DNase ולשטוף את הדגימות עם 1 x PBS (1 מ"ל לכל טוב) במשך 20 דקות חוזר 3 פעמים. לבצע שטיפה סופית עם 1 x PBS (1 מ"ל לכל טוב) בן לילה-RT, ומנענע ב 60 סל ד.
    4. (צ'ק פוינט) לאחר הטיפול DNase, ודא כי הדגימות decellularized איבדו את עקביות דמוי ג'לטין.
      הערה: לאחר טיפול DNase, להסיר ולהוסיף 1 x PBS בעדינות מאז יכול להיות בקלות לכודים ודוגמאות המחוברות לקצות פיפטה.

4. הערכה של הסרת רקמות decellularized תא

  1. לתקן את הדגימות לתוך צלחת תרביות רקמה 24-ובכן, לדוגמה 1 לכל טוב, על-ידי הוספת 1 מ"ל טרי 10% פורמלין מאגר ניטרליים עם אאוזין מימית 0.03% עבור 2.5-3 h-RT.
    הערה: אאוזין מתווסף מקבע כתם הרקמה decellularized וכדי להקל על מדגם להדמיה במהלך חלוקתה, צביעת היסטולוגית. התוספת של eosin שאף אחד לא מתערב עם שהכתמים היסטולוגית, ולא עם טכניקות immunofluorescence. לחלופין, הקיבעון יכול להתבצע בין לילה על 4 מעלות צלזיוס.
  2. להסיר את הפתרון מקבע ולהוסיף 1 מ"ל של PBS 1 x לשטוף את הדגימה.
  3. לתמצת את bioscaffolds קבוע בג'ל היסטולוגיה עיבוד באמצעות תבנית הדגימה ויניל חד פעמיות בהתאם להוראות היצרן.
  4. להסיר את הג'ל היסטולוגיה עם הדגימה מוטבע עובש, העברה ל קלטות עיבוד/Embedding ביופסיה עם מכסה.
    הערה: אלטרנטיבה רקמות הטמעה במסמכי היסטולוגיה ועיבוד ג'ל הוא כדי לעבד כל דגימה של שני ספוגים ביופסיה עם נקבוביות קטנות. צריך להיות מקומי הדגימות למרכז הספוגים ביופסיה כדי לאפשר זיהוי. ראוי לציין, דגימות יכול להיות קשה להתאים לשפה שימוש בגישה זו.
  5. לעבד את הדגימות פרפין הטמעה דרך incubations רצופים (30 דקות לכל פתרון) בסדרה של ריכוז אלכוהול (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), isoparaffinic פחמימן אליפטיות פתרון (דגירה-2 תחנות), פרפין (2 דגירה תחנות) ב 56 ° C.
  6. הר הדגימות בבלוק פרפין.
  7. לחתוך 3 סעיפים פרפין μm-עבה על מיקרוטום ולאסוף את המקטעים בשקופיות זכוכית מיקרוסקופ.
  8. פרפין יבש מקטעים לילה ב 37 º C.
    הערה: (PAUSE נקודה) פרפין והמקטעים נשמרים ב 4 ° C עד שימוש נוסף.
  9. כדי לוודא את יעילות פרוטוקול, לבצע Hematoxilin ואת אאוזין (H & E) Trichrome של מאסון מכתים (MT) של הסעיפים מדגם decellularized, למקטעים של רקמות ללא מניפולציות על פי הוראות היצרן.
    הערה: H & E צביעת כתמי תא גרעינים כחול/סגול, הציטופלסמה ורוד/אדום כהה, ורוד חיוור קולגן ו- MT כתמי גרעינים שחורים, הציטופלסמה אדום, ואת קולגן mucin כחול. Decellularization יעיל מושגת כאשר ורוד בהיר נקבובי (H & E, MT), כחול רשת (MT) הוא ציין, בהיעדרו של כתם גרעינית.

5. הערכה של הסרת חומרים גרעינית decellularized רקמה

הערה: כימות של תוכן ה-DNA על רקמות decellularized חייב להתבצע בהשוואה הרקמה הלא-מניפולציות בהתאמה.

  1. לפני decellularization, שוקל צינור microcentrifuge 1.5 mL בסולם דיגיטלית ברמת דיוק גבוהה. להעביר את רקמת הלב הצינור, להסיר את הסכום הנוסף של PBS 1 x ולשקול את הצינור עם הדגימות. לחשב את המשקל הרטוב של הדגימות:
    לטעוםמשקל רטוב = משקל צינור עם דוגמאות – משקל שפופרת ריק
  2. Decellularize את הדגימות כמתואר בשלב 3.
  3. לאחר decellularization, לאסוף את הרקמות decellularized לתוך צינור microcentrifuge.
    1. עקב מידות קטנות בנפח גדול של דוגמאות בודדות הלב ואת ערכת מפרטים, בריכה רקמות decellularized של כל תנאי לדוגמה (פעימות לב העובר: 5 כל ליבם; explants LV למבוגרים: 15 explants). בצע את ההליך אותו עם הרקמות ללא מניפולציה.
      הערה: (PAUSE הצבע) הדגימות יכולה להיות מאוחסנים ב-20 ° C עד מיצוי הדנ א, כימות מבוצעות.
  4. לחתוך את הלא-מניפולציות ו decellularized רקמות explants קטן עם עזרה של אזמל בצלוחית נקי.
    הערה: להשתמש באזמל בודדים פטרי עבור כל דגימה. הפרעה מכנית של הדגימות עם איזמל מקלה על עיכול אנזימטי האחורי שלהם, מיצוי DNA הבאים.
  5. להפקת DNA, להשתמש בשיטה מיצוי DNA ספין-עמודה מבוסס על פי הוראות היצרן.
    1. לאסוף דגימות dissociated באופן מכני צלחת פטרי עם המאגר עיכול מאסטר (מאגר עיכול, proteinase K) על פי הוראות היצרן באמצעות טיפ פיפטה דיזה רחב.
      הערה: פירוק רקמת Proteinase K עיכול הוא מהר יותר דגימות decellularized. כדי לעבד דוגמאות שונות באותו הזמן, שמור דוגמאות lysed על הקרח, עד lysed הם כל דוגמאות כדי למזער את השפלה. פירוק דגימות מלאה מושגת בין 4-6 שעות.
    2. להמשיך עם הפרוטוקול לפי ההוראות היצרן.
    3. כדי להגדיל את התשואות של DNA שחולץ של דגימות רקמה decellularized ו- decellularized, elute ה-DNA על μL 25-50 ו- 100 μL • תנאי מאגר, בהתאמה. לאסוף את ה-DNA eluted וטען הספין-העמודה. תקופת דגירה של 1 דקות ב- RT. צנטריפוגה הדגימות בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: (PAUSE נקודה) הדנ א שחולצו מן הדגימות ניתן לחנות ב-20 ° C עד שימוש נוסף.
  6. לכמת את הדנ א שחולצו מן הדגימות עם ערכת זיהוי dsDNA פלורסנט ההוראות של היצרן.
  7. לנרמל את התוכן DNA כמו ננוגרם של ה-DNA לכל מיליגרם של משקל רטוב הדגימה הראשונית (לפני decellularization).

6. פיגומים decellularized תא זריעה

הערה: כל פתרונות/ריאגנטים צריך להיות סטרילי, כל ההליך בנטילת בתנאים סטריליים.

  1. להכין x DPBS 1 עם 2.5 μg/mL ב' שהוא גוסס, 1% P/S (פניצילין, 100 I.U.; סטרפטומיצין 100 µg/mL).
  2. להסיר את 1 x PBS פתרון לשלב הכביסה decellularization האחרון (שלב 3.3.3) ולהוסיף μL 500 לכל טוב 1 שזה עתה הוכנו x DPBS/2.5 μg/mL של פתרון B/1% P/S שהוא גוסס. חנות דגימות ב 4 ° C 1-7 ימים.
    הערה: דגימות אחסון ב 4 ° C חשוב לשמור על עקרות.
  3. הוסף P/S לתא מדיה הבזליים (ללא FBS ותוספי מזון) ריכוז סופי של 1%.
  4. האחות 1 x DPBS/2.5 μg/mL בפתרון B/1% P/S שהוא גוסס בין דגימות decellularized. להוסיף 500 μL לכל טוב של התאים הבזליים media/1% P/S ותנו דוגמאות equilibrate עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס, או 4 ° C עבור יותר מ 1 h.
  5. לפצל את התאים עניין ולהכין aliquots קטן של תאים על צפיפות התא הרצוי.
    הערה: הרקמה decellularized זריעה חייב להתבצע תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, בתנאים סטריליים. תא תרבות המדיה להכיל 1% P/S.
  6. Pipette μL 3-4 של DPBS למרכז טוב של צלחת 96-ובכן. באמצעות פינצטה דק וישר, העברת פיגומים decellularized לירידה DPBS להסיר את DPBS הנוסף על-ידי שאיפה, ודא כי המדגם אינו מקופל או מקומט. . תן לזה להיות יבש בקצוות לדבוק פני השטח היטב.
    הערה: פיגומים מנותקת יש יעילות זריעה נמוכה יותר.
  7. הוסף תאים לגרדום מאת pipetting הפתרון תא בודד לאט כנגד קצוות הבאר.
    הערה: לדוגמה, עכברוש neonatal cardiomyocytes הם נזרע עם-צפיפות של תאים/מ מ2 7,500 ועכבר מונצחים לין− Sca-1+ לב ובתאים (iCPCSca-1)-צפיפות של תאים/מ מ 60-1,5002. להתאים את צפיפות התאים לפי הרציונל ניסיוני.
  8. להוסיף DPBS הבארות הסמוכים כדי למנוע אידוי מהיר מדיה.
  9. 24 שעות לכתוב תא זריעה, אם סוג התא המשמש דבקה הלוחות פוליסטירן תרביות רקמה (TCPS), להעביר bioscaffolds באר חדשה. אחרת, החלף את המדיום כדי להסיר תאים שאינם מחסידי.
  10. לשנות בקפידה התקשורת על פי דרישות ספציפיות של סוג התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

וצריך להעריך את יעילות decellularization דרך שלוש טכניקות הראשי: תצפית מאקרוסקופית, היסטולוגיה, כימות הדנ א. המראה מאקרוסקופית של דגימות פוסט-מרחביות הטיפול משפיע בעקיפין את היעילות של הסרת תאים. לאחר דגירה מרחביות, דגימות אמור להופיע גם שקוף כדי לבנבן (איור 1C). עוברית (E18) ברקמות decellularized מאופיינים על ידי מבנה שקוף מאוד בעוד explants למבוגרים יש מראה לבן שקוף למחצה. מראה לבן הוא בדרך כלל מתואם לרשת ה-ECM מפגין סיבים גבוהה, תוכן קולגן, למשל רשת שינוי המבוגרים חדרית ואת כלי הדם כלי ECM (איור 1C). Hematoxylin & אאוזין (H & E) ו/או כתמים Trichrome (MT) של מאסון מבוצעים לאשר תא יעיל להסרת ע י התבוננות רשת נקבובי (ורוד בהיר, H & E; בהיר ורוד וכחול, MT) (איור 1C). בנוסף, הכתם MT מדגיש את meshwork קולגן כחול5. סיווג חומרים גרעיניים לאחר decellularization מתבצעת באמצעות DNA כמת, ירידה של-99.8% בדרך כלל מתקבל, בהשוואה רקמות ללא מניפולציות (איור 1C). הנוכחות של חומר גרעיני על פיגומים decellularized תואר כגורם מפעיל מתגובה דלקתית רצויה על ההשתלה14. מסיבה זו, אישור של decellularization יעיל חיוני לפני ניסויים איכלוס לגרדום 3D מקורי. ניתן לאחסן פיגומים decellularized בתנאים סטריליים עד זריעה עם תאי עניין. תא הכדאיות נמצא בפיקוח ברחבי תרבות במבחנה calcein מכתים (איור 2 א). למרות זאת, calcein הכתם ניתן ציטוטוקסיות לסוגי תאים רגישים. ניתוח מסוף של התא איכלוס והפצה ברחבי פיגומים הוא עיבוד פרפין לאחר שבוצעו; תמונה של איכלוס bioscaffold מוערך על ידי H & E מכתים-קטע מרכזי של bioscaffolds מוצג (איור 2B, ג 2).

Figure 1
איור 1. עוברית (E18) ואת ברקמת הלב למבוגרים decellularization הליך האישור של יעילות decellularization. מבט כולל על פרוטוקול (א) . פרוטוקול Decellularization (B) מפורט. (ג) אנליזה מאקרוסקופית של רקמה עוברית ומבוגרים הלב לפני ואחרי decellularization. סרגל קנה מידה: 2 מ מ. (ד) כימות של חומר גרעיני ב decellularized לעומת רקמות ללא מניפולציה. נתונים הביע אומר t-test ± ב- SEM. הסטודנט, דו-זנבית * p < 0.05. (ה) H & E ומאסון Trichrome היסטולוגית ניתוח של רקמה עוברית ומבוגרים הלב לפני ואחרי decellularization. סרגל קנה מידה: 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. ניתוח איכלוס של פיגומים decellularized עם לין - Sca-1+ לב תאים בטור (iCPCSca-1). (א) תא גבוהה הכדאיות ציין על פיגומים השטח במהלך תרבות במבחנה על ידי הכתם calcein (ירוק). סרגל קנה מידה: 100 μm. (B) בתא מספר והפצה ברחבי פיגומים העריך באמצעות צביעת המטוקסילין. סרגל קנה מידה: 100 μm. (ג) מבט אורתוגונלית תאים שמוטבע על ECM decellularized. תמונה קונאפוקלית של סעיף 50μm-עבה פרפין. סרגל קנה מידה: 10 μm (אורתוגונלית נוף XZ, yz ימאהה) ו- 40 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שלב תצפית סיבה אפשרית הבעיה פתרון
3.1.2. רקמה בצבע חום מדגם cryofixation; טמפרטורת הקיפאון לא יציב מדגם cryofixation יוביל הסרת לא יעיל של חלבונים cytoplasmic חנות קפוא רקמות בתקופות קצרות יותר. בדוק טמפרטורת המקפיא ויציבות
3.2.4. ורוד ללבן אטום דגימות הפתרון מרחביות לא היה ערוך היטב; explants LV למבוגרים גדול מדי הסרת לא יעיל של חלבונים cytoplasmic ודא התפרקות מוחלטת מרחביות. Decellularize דגימות של גודל קטן יותר.
3.3.4. דוגמאות עם מראה דמוי ג'לטין הסרת ה-DNA לא יעיל לא יעיל סיווג חומרים גרעיניים להגדיל את זמן ריכוז ו/או הדגירה DNase.
4.6. דחיסת ג'ל היסטולוגיה זמן זמן ההמתנה PBS1X/אתנול עיבוד פרפין שינוי של מבנה רקמות decellularized להתחיל היסטולוגית עיבוד במהירות האפשרית
6.6. דוגמאות decellularized יבשים דוגמאות נותרו לייבוש במשך זמן רב מדי קבוע קריסה של רקמת decellularized. תא לא יעיל זריעה לאפשר דגימות מעט יבש רק בפריפריה כדי להיות מצורף בתחתית הבאר במהלך זריעה
6.7. ניתוק מדגם decellularized במהלך זריעה דוגמאות לא היו מספיק יבשים לפני זריעה תא לא יעיל זריעה להגדיל את זמן ייבוש ECM כדי לאפשר הדבקות טובה יותר לפני תא זריעה

טבלה 1- פתרון בעיות טבלה עבור decellularization מקבילים של העובר (E18) ורקמות הלב העכבר למבוגרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מטריצות (ECM) הוא meshwork דינמיות ומורכבות מאוד של glycoproteins סיבי, דביק, המכיל מאגר של פפטידים ביו הרבות כלואה גורמי גדילה. כמו אפנן העיקריים של התא אדהזיה, שלד התא dynamics, תנועתיות/הגירה, התפשטות, התמיינות אפופטוזיס, ECM מסדיר באופן פעיל תפקוד התאים והתנהגות. בידיעה כי התנהגות הסלולר שונה בתרבויות מימד, היו מאמצים לפתח מודלים חדשניים organotypic יכולים במדויק לשכפל סביבות הרקמה הטבעית. בשנים האחרונות, התפתחה טכניקה חלופית עבור הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית רקמות decellularization. לפיכך, רקמות, איברים decellularization נמצא כעת הכלי לבחירה לנתח יותר פרמטרים microenvironmental רקמות ספציפיות (הביוכימי, מבניים מכניים), פעילות ביולוגית במבחנה, ויוו.

פיתחנו פרוטוקול שמשלב את השימוש חיץ היפוטוניק עם חומר ניקוי של חומרים פעילי שטח anionic מאפיינים ואחריו DNase טיפול5,12,13. בפרוטוקול הנוכחי מהווה שיטה פשוטה לשחזור לביצוע ניתוח השוואתי בין ברקמת הלב העוברי decellularized העכבר למבוגרים. הניסיון שלנו עם רקמות אחרות, כלומר עם דגימות הגידול נגזר כריתות כירורגיות של חולי סרטן, רקמת הריאה העכבר, מראה כי פרוטוקול זה בקלות להתאמה ומצליחה בתנאים אחרים, מודלים12,13. היישום של ההליך decellularization אותו על דגימות השונות מאפשרת השוואתית של ECM קומפוזיציה, מאפייני ביו-מכני, אדריכלות מאפיינים modulatory הסלולר בהקשר תלת-ממד.

אחד האתגרים הקשים ביותר של רקמת decellularization הוא את האיזון בין הסרת תאים על הסף, ECM meshwork שימור הביו רקמות. לפיכך, מספר שלבים קריטיים צריך להישקל בזהירות, כגון תקופת הקפאה קריוגנית רקמות לפני decellularization, הגודל הנכון explant, השימוש של פתרונות טריים, המניפולציה של רקמות decellularized הסופי. במהלך הלימודים שלנו, ראינו קשר ישיר בין אחסון ממושך של רקמת cryopreserved וזמן השימוש של פתרונות מרחביות ארוכת שנים עם יעילות decellularization. לטווח ארוך רקמת אחסון מוביל לא יעיל להסרת תוכן סלולרי עיבוד שרידי אזורים הסלולר עבה (ללא גרעינים) בין meshwork ECM מורכבים. אפקט לא רצוי דומה מושגת כאשר פתרונות מרחביות מאוחסנות זמן משמשים decellularization רקמות, סביר כי פתרונות מרחביות יציבות קצר עקב מסיסות, הידרוליזה, והשינויים pH מעל הזמן15,16 . השימוש explants של הגודל הנכון (~1.5 מ מ x 1.5 מ"מ x 1.5 מ"מ) חיונית גם רקמות למבוגרים מוצלח decellularization, מאז גדול יותר כריתות רקמה קשה יותר decellularize, הצגת שאריות תאים לכודים על פני השטח ועצרו בין הרשת ECM צפופה. למרות פרוטוקול זה מספק דרך יעילה ברקמת הלב decellularization, שבריר קטן explants למבוגרים עשוי להציג תא שרידים, בפרט אלו של גדול יותר. ניתוח היסטולוגית של דגימות אלה מקל על הזיהוי שלהם להדרה הבאים מן המחקר. בסופו של דבר, פרוטוקול בזאת היא תכליתי בקלות החלים דגימות ברורים עם התאמות קלות עד לגודל explant רקמות, ריכוז מרחביות (0.1-0.2% מרחביות) או פתרון הדגירה זמן5,12,13 .

המגבלה העיקרית של השיטה הנוכחית היא המניפולציה של גודל קטן ודוגמאות, קרי לב העובר מאתר הלב למבוגרים explants, דורש מיומנויות טיפול. למעשה, רקמות decellularized עוברית והן למבוגרים הם מבנים עדין זה יכול להיות לצמיתות מעוות כאשר מיובש במהלך ההליך או לכודים על ידי פיפטה דק או במהלך הטיפול עם מלקחיים5.

החידוש העיקרי של פרוטוקול זה, מלבד decellularization מקבילים של החדר השמאלי למבוגרים explants להערכה השוואתית של הרכב ECM (ניתוחים ביו-מכני) ואת תפקוד ביולוגי משויך, והלב העכבר העובר הוא שלה פשוט תרגום ברורים רקמות ומודלים5,12,13. Decellularization של רקמות בגילאים שונים על-ידי החלת מתודולוגיה מתוקננת תוארה רק על הכליה קוף רזוס, הסעיפים רוחבי של רקמות העובר, neonatal, למבוגרים, אשר עברו טיפול מרחביות 1% למשך 10 ימים6 . באווירה הלב, למרות העובר, יש כבר decellularized רקמות neonatal ומבוגרים, השיטות שונה לגבי מידת מוציאים מכני, מרחביות ריכוז וזמן של יישום7,8. כמו כל הליך decellularization משפיע על ECM בצורה ייחודית, ההשוואה של דגימות decellularized המתקבל פרוטוקולים שונים עלול להוביל למסקנות מטעות. לפיכך, החלת את ההליך decellularization מדגמים שונים מאפשרת ניתוח השוואתי אמינים.

רובם המכריע של הרקמות decellularized זמינים מסחרית שואבים דגימות למבוגרים17. למרות ההכרה הגוברת על יכולת מוגברת של microenvironments עוברי במתן אותות משובי pro לעומת עמיתיהם המבוגרים שלהם, decellularization של רקמות העובר דווח רק מחקרים מעטים5, 7 , 18 , 19 , 20 , 21. הבנה ECM dynamics במהלך תהליך ההזדקנות תהיה מכרעת לזהות תכונות ייחודיות של microenvironments pro-רגנרטיבית אשר, בתורו, משפיע על התפתחות ביונים יעילות גבוהה יותר-חומרים....

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים אסירי תודה לכל חברי מעבדה פינטו-דו-Ó לדיון ביקורתי רלוונטית. עבודה זו נתמכה על ידי MIT פרוגרמה-Fundação פארא Ciência e Tecnologia (FCT) תחת הפרויקט "מהונדסים CARDIOSTEM רקמות הלב, טיפולים מבוססי תאי גזע עבור יישומים לב וכלי דם" (MITP-טרה-בתים/ECE/0013/2013). אגש ח הוא זוכת מלגת FCT [SFRH/BD 88780 2012] והוא M.J.O. בחור FCT (FCT-חוקר 2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker Orbital Shakers IKA:3510001 Recommended
Fluorimeter - - Equipment available
Digital weight scale - - Equipment available
Inverted Microscope - - Equipment available
Cell culture incubator - - Equipment available
Fridge (4ºC) - - Equipment available
Deep freezer (-80ºC) - - Equipment available
Microtome - - Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge Fine Science Tools 5000-08 Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11254-20 Recommended
Dumont 7 forceps Fine Science Tools 11272-30 Recommended
Dissecting Scissors, straight - - Tool available
Forceps, serrated, curved - - Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped VWR 29442-044 -
96 well plates, individually wrapped VWR 71000-078 -
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized Millipore SE1M179M6 -
Eppendorff - - Material available
15 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430791 -
50 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430829 -
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid Electron Microscopy Science 70075-B -
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 22-037-246 -
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006 -
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) Sigma-Aldrich 277258-1L -
Dry ice - - -
Decellularization
NaCl BDH Prolabo 27810.364 -
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S-31264 -
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-100g -
KCl Sigma-Aldrich P8041-1KG -
TrisBASE Sigma-Aldrich T6066-500G -
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L-4390 -
MgCl2 MERCK 1.05833.1000 -
DNAse I AplliChem A3778,0050 -
Gentamicin Gibco 15710-049 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Deionized water (DI water) - - -
Histology
10 % formalin neutral buffer Prolabo 361387P -
Eosin Y AQUEOUS Surgipath 01592E Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 -
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous Aga 4,006,02,02,00 -
Deionized water (DI water) - - -
Clear Rite 3 Richard-Allan Scientific 6915 -
Shandon Histoplast Thermo Fisher Scientific RAS.6774006 -
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific K182001 -
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit Invitrogen P11496 -
Cell culture
DPBS VWR 45000-434 -
Penicillin-Streptomycin Solution 100X Labclinics L0022-100 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Cell culture media of the cell of interest - - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  3. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  5. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. 3rd Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
  8. Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
  10. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  11. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  12. Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
  13. Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
  14. Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
  15. Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
  16. Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
  17. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
  18. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  19. Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
  20. Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
  21. Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 145 Decellularization מטריצה חוץ-תאית פיגומים תלת-ממד פעימות לב העובר הלב למבוגרים הנדסת רקמות הלב

Erratum

Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 04/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

דומה Decellularization של רקמת הלב העוברי ומבוגרים Explants כמו פלטפורמות דמויי תלת-ממד עבור לימודי חוץ גופית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, A. C., Oliveira, M. J.,… More

Silva, A. C., Oliveira, M. J., McDevitt, T. C., Barbosa, M. A., Nascimento, D. S., Pinto-do-Ó, P. Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (145), e56924, doi:10.3791/56924 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter