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Bioengineering

भ्रूण और वयस्क कार्डियक ऊतक Explants के तुलनीय Decellularization 3 डी की तरह प्लेटफार्मों के लिए इन विट्रो अध्ययन में

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/56924
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,5, 4,6, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

ERRATUM NOTICE

Summary

कार्डियक extracellular मैट्रिक्स (ECM) अणुओं का एक जटिल नेटवर्क है कि ऊतकों और अंगों में महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं आर्केस्ट्रा जबकि जीवन भर शारीरिक remodeling टिकाऊ है । भ्रूण और वयस्क दिलों के मानकीकृत decellularization एक 3 डी संदर्भ में दोनों ऊतकों के तुलनात्मक प्रायोगिक अध्ययन के लिए अनुमति देता है देशी वास्तुकला और biomechanical संपत्तियों पर कब्जा ।

Abstract

extracellular मैट्रिक्स (ECM) के वर्तमान ज्ञान-सेल संचार विट्रो संस्कृति अध्ययन में जहां ECM घटक एक सतह कोटिंग के रूप में प्रस्तुत कर रहे है बड़े दो आयामी (2D) के लिए अनुवाद करता है । इन संस्कृति प्रणालियों ऊतक ECM कि जैव रासायनिक संरचना, संरचना, और यांत्रिक गुणों शामिल की जटिल प्रकृति का सरलीकरण का गठन । बेहतर ECM सेल हृदय microenvironment को आकार देने संचार का अनुकरण करने के लिए, हम एक प्रोटोकॉल है कि पूरे भ्रूण दिल और वयस्क के decellularization के लिए अनुमति देता है विकसित वेंट्रिकल ऊतक explants एक साथ तुलनात्मक अध्ययन के लिए छोड़ दिया । प्रोटोकॉल एक अल्पपरासारी बफर के उपयोग को जोड़ती है, एक अनियनिक सर्फेक्टेंट गुण के डिटर्जेंट, और dnase उपचार विशेष कौशल या उपकरणों के लिए किसी भी आवश्यकता के बिना । विभिन्न आयु के विषयों से ऊतक के नमूनों में एक ही decellularization रणनीति के आवेदन तुलनात्मक अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है । वर्तमान प्रोटोकॉल भ्रूण और वयस्क कार्डिएक ECM मेष और जैविक सेलुलर प्रतिक्रियाओं भर में अद्वितीय संरचनात्मक मतभेदों की पहचान की अनुमति देता है । इसके अलावा, इस के साथ ही कार्यप्रणाली को दर्शाता है एक व्यापक आवेदन सफलतापूर्वक अंय ऊतकों और प्रजातियों में मामूली समायोजन के साथ लागू किया जा रहा है, जैसे मानव आंत बायोप्सी और माउस फेफड़ों में ।

Introduction

extracellular मैट्रिक्स (ecm) अणुओं का एक गतिशील नेटवर्क है कि महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं, अर्थात् भाग्य निर्णय, प्रसार और भेदभाव1,2को विनियमित है । सेल की जांच-ECM बातचीत मुख्य रूप से दो आयामी में प्रदर्शन किया गया है (2 डी) विट्रो संस्कृतियों में ECM घटकों के साथ लेपित, जो देशी ECM गुणों का सरलीकरण vivo मेंपाया गठन । decellularization बड़े पैमाने पर बाह्य वास्तुकला और देशी ऊतकों और अंगों3,4की संरचना की रक्षा कि ecm bioscaffolds की तरह अकोशिक 3 डी उत्पन्न करता है । ऊतक इंजीनियरिंग के लिए bioactive मचानों के रूप में सेवा करने के अलावा, decellularized 3D ECM biomaterials उपंयास प्लेटफार्मों के रूप में उभर रहे है सेल का आकलन-ECM जीव विज्ञान है कि समानांतर vivo वातावरण में ।

विशिष्ट ऊतकों, अंगों और आयु के ECM घटकों के अंतर भूमिका का आकलन देशी bioscaffolds पैदा करने के समान प्रोटोकॉल के उपयोग के साथ लाभ होगा । दिल में, हम भ्रूण और वयस्क व्युत्पंन नमूने के decellularization के लिए एक बहुमुखी प्रोटोकॉल विकसित किया है, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में अंग microenvironment के तुलनात्मक अध्ययन करने के लिए । इस पद्धति का प्रयोग, हम देशी कार्डिएक microenvironment पर कब्जा कर लिया और पता चला कि भ्रूण ECM कार्डियक कोशिकाओं के उच्च पुनर्जनसंख्या पैदावार को बढ़ावा देता है5। Decellularization आगे तहखाने लेमिना और परिकोशिकीय मैट्रिक्स जाल व्यवस्था और फाइबर संरचना5के स्तर पर भ्रूण और वयस्क ecm के बीच निवासी संरचनात्मक मतभेदों की पहचान प्रदान की है । इस काम से पहले, एक ही decellularization दृष्टिकोण का उपयोग कर अलग ontogenic चरणों में सिर से सिर के ऊतकों की तुलना केवल रीसस बंदर गुर्दे और रोडेंट दिल के लिए रिपोर्ट किया गया है । इसके अलावा, अध्ययन की एक सीमित संख्या में भ्रूण ऊतक/अंग decellularization प्रति से5,6,7रिपोर्ट । यह एक अद्वितीय decellularization एजेंट के रूप में एसडीएस का उपयोग कर प्राप्त किया गया है; हालांकि, अलग sds सांद्रता भ्रूण और वयस्क कार्डियक ऊतक7,8के decellularization के लिए इस्तेमाल किया गया । एसडीएस कोशिकाद्रव्यी और परमाणु सामग्री की मंजूरी के लिए सबसे प्रभावी आयनिक डिटर्जेंट में से एक है, और व्यापक रूप से विभिन्न ऊतकों और नमूनों9,10के decellularization में इस्तेमाल किया. उच्च एसडीएस सांद्रता और जोखिम की विस्तारित अवधि युक्त समाधान प्रोटीन विकृत्करण के साथ सहसंबद्ध किया गया है, glycosaminoglycan (gags) हानि और कोलेजन तंतुओं का व्यवधान10,11, और इसलिए एक ECM संरक्षण और सेल हटाने के बीच संतुलन आवश्यक है । भ्रूण और वयस्क हृदय ऊतक के लिए एक ही प्रक्रिया लागू करने के लिए, प्रोटोकॉल के साथ साथ वर्णित तीन अनुक्रमिक चरणों में विभाजित है: परासरणी शॉक (hypotonic बफर) द्वारा सेल lysis; लिपिड-प्रोटीन, डीएनए-प्रोटीन और प्रोटीन प्रोटीन इंटरेक्शन्स (०.२% एसडीएस) के सॉल्बिलाइजेशन; और परमाणु सामग्री निकालना (DNase treatment).

हमारे प्रोटोकॉल कई लाभ से पता चलता है: i) एक ही decellularization रणनीति के आवेदन द्वारा आयु विशेष हृदय ऊतकों के समकक्ष decellularization की संभावना; ii) विशेषीकृत विधियों या उपकरणों के लिए कोई आवश्यकताएं नहीं; iii) अन्य ऊतकों और प्रजातियों के लिए तैयार अनुकूलन के रूप में यह सफलतापूर्वक मानव आंत बायोप्सी12 और माउस फेफड़ों13में मामूली परिवर्तन के साथ लागू किया गया है; और, महत्वपूर्ण बात, चतुर्थ) ECM biomechanical संपत्तियों को संबोधित कर सकते है जबकि 3 डी के विधानसभा की तरह organotypic संस्कृतियों कि अधिक बारीकी से देशी ऊतक microenvironment के आणविक सुविधाओं की नकल को सक्षम करने ।

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Protocol

सभी तरीकों का वर्णन i3S पशु नैतिकता समिति और Direção गेरल डे वेवेरिनेरिया (DGAV) द्वारा अनुमोदित किया गया और यूरोपीय संसद निर्देश 2010 के अनुसार कर रहे है/

1. decellularization समाधान की तैयारी

नोट: सभी decellularization समाधान एक ०.२२ μm झिल्ली फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाना चाहिए और 3 महीने की एक अधिकतम के लिए संग्रहीत, अंयथा निर्दिष्ट छोड़कर ।

  1. 1x pbs के लिए: 8 ग्राम nacl, १.०१ g के Na2hpo4 २०० kcl के मिलीग्राम, और २०० ख2पीओ4 के ९०० मिलीलीटर विआयनीकृत पानी (डि पानी) के साथ मिक्स । समाधान pH को ७.५ और अंतिम समाधान वॉल्यूम को 1 L. Filter, ऑटोक्लेव तक समायोजित करें, और समाधान को कमरे के तापमान (RT) पर संग्रहीत कर ।
  2. hypotonic बफर (10 मिमी Tris, ०.१% edta) के लिए: १.२१ ग्राम trisbase और edta के 1 ग्राम विआयनीकृत पानी की ९०० मिलीलीटर में भंग । समाधान pH को NaOH/HCl के साथ ७.८ को समायोजित करें और अंतिम समाधान वॉल्यूम को 1 L. फ़िल्टर, ऑटोक्लेव द्वारा करें, और RT पर स्टोर कर ᱶ ।
  3. ०.२% एसडीएस समाधान के लिए (०.२% एसडीएस, 10 मिमी Tris): डी पानी की ४०० मिलीलीटर में trisbase के ०.६ ग्राम और सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के 1 जी जोड़ें और पूर्ण विलेय विघटन तक ६० डिग्री सेल्सियस पर हलचल । समाधान करने के लिए नीचे शांत RT. समाधान पीएच ७.८ और अंतिम समाधान मात्रा ५०० मिलीलीटर को समायोजित करने के लिए । निस्पंदन द्वारा समाधान ।
    नोट: एसडीएस समाधान उपयोग करने से पहले तैयार किया जाना चाहिए । फिल्टर समाधान केवल पूर्ण एसडीएस विघटन के बाद, अंयथा एसडीएस अघुलनशील कणों फिल्टर संतृप्त, अंतिम एसडीएस एकाग्रता को बदलने और फलस्वरूप ऊतक decellularization दक्षता को प्रभावित करेगा ।
  4. Hypotonic धोने बफर (10 मिमी Tris) के लिए: DI पानी की ९०० मिलीलीटर में TrisBASE के १.२१ जी मिक्स । समाधान पीएच ७.८ और 1 एल फिल्टर करने के लिए अंतिम खंड को समायोजित करें, आटोक्लेव और आरटी में स्टोर द्वारा ।
  5. DNase उपचार के लिए (20 मिमी Tris, 2 मिमी MgCl2, ५० U/एमएल dnase): DI पानी की ९०० मिलीलीटर में TrisBASE के २.४२ ग्राम और 1 मीटर MgCl2 के 2 मिलीलीटर भंग । ७.८ करने के लिए पीएच समायोजित करें और अंतिम समाधान मात्रा 1 L. Filter और आटोक्लेव द्वारा समाधान करने के लिए । संग्रह समाधान RT. DNase मैं (५० U/mL) में उपयोग करने से पहले जोड़ें ।
  6. DNase मैं स्टॉक समाधान के लिए: ५०% ग्लिसरोल युक्त एक DNase बफर तैयार, 20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.५, 1 मिमी MgCl2, और डि पानी के साथ 10 मिलीलीटर की एक अंतिम समाधान मात्रा को समायोजित करें । एक स्तरीय फ्लो हुड में, dnase मैं पाउडर dnase बफर करने के लिए जोड़ें और पूरी तरह से विघटन तक धीरे मिश्रण । समाधान ०.२२ μm फिल्टर के माध्यम से । -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर aliquots और स्टोर तैयार करें ।

2. ऊतक संचयन और cryopreservation

  1. हमल के 18 दिनों (E18 fetuses) में सह2 asphyxiation के माध्यम से वयस्क गर्भवती महिलाओं euthanize । एक शल्य कैंची के साथ महिलाओं पर एक सिजेरियन अनुभाग प्रदर्शन और गर्भाशय बर्फ के साथ एक पेट्री डिश के लिए भ्रूण चूहों असर-ठंड 1x pbs घुमावदार सुझावों के साथ दो दांतेदार चिमटी का उपयोग कर (एक सींग अंत करने के लिए एक चिमटी) इकट्ठा ।
    1. भ्रूण को अलग करने के लिए गर्भाशय के सींग और एमनिओटिक थैली खोलें । एक नई पेट्री डिश के लिए एक बर्फ ठंडा 1x pbs के साथ उंहें anesthetize और एक कैंची के साथ सिर काटना करने के लिए fetuses स्थानांतरण ।
    2. 7-8 सप्ताह पुराने माले C57BL/6 चूहों सह2 asphyxiation का उपयोग कर । प्रत्येक माउस छाती पर एक चीरा प्रदर्शन और दिल इकट्ठा ।
    3. संक्षेप में बर्फ ठंडा 1x PBS के साथ भ्रूण और वयस्क दिल कुल्ला ।
  2. एक स्केलपेल की मदद से वयस्क दिल की अलिंद निकालें । सही वेंट्रिल पर एक चीरा प्रदर्शन और सीधे छोटे कैंची का उपयोग कर इसे हटा दें । septum को हटाने के द्वारा बाएं वेंट्रिकले भीतरी दीवार बेनकाब । एक नई पेट्री डिश में, 2 मिमी मोटाई के साथ अनुदैर्ध्य स्ट्रिप्स में बाएँ वेंट्रिकले मुक्त दीवार फूट डालो और एक स्केलपेल और घुमावदार सुझावों के साथ दांतेदार चिमटी का उपयोग कर इल्लों मांसपेशी को हटा दें ।
    1. 2 मिमी x 2 मिमी ग्रिड (अनुपूरक चित्रा 15में विस्तृत विवरण) का उपयोग कर एक स्केलपेल की मदद से उत्पाद शुल्क छोटे ऊतक explants । संक्षेप में 1x PBS के साथ ऊतक explants कुल्ला ।
  3. जोड़ें ~ २५० μL इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक autoclaved १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के लिए । अक्टूबर के २५० μL के साथ ट्यूबों के लिए पूरे भ्रूण दिल और वयस्क कार्डिएक explants स्थानांतरण और सूखी बर्फ ठंडा आइसोफेंटाने के साथ उन्हें फ्रीज और-८० डिग्री सेल्सियस (6 महीने की एक अधिकतम करने के लिए) पर स्टोर.
    नोट: कार्डिएक ऊतक explants का उपयोग अधिक से अधिक 6 महीनों के लिए cryopreserved काफी decellularization दक्षता कम हो जाएगा, विशेष रूप से वयस्क हृदय ऊतक explants में.

3. ऊतक डिसेल्युलेराइजेशन

नोट: कार्डियक ऊतक डिसेल्युलेराइजेशन अच्छी तरह से प्रति एक नमूना के साथ एक 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति थाली में किया जाता है । प्रत्येक डिसेल्युलेराइजेशन समाधान की 1 मिलीलीटर प्रत्येक व्यक्ति को अच्छी तरह से जोड़ा जाता है । सभी decellularization कदम १६५ rpm पर आंदोलन के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए (20 मिमी के एक कक्षीय व्यास के साथ इनक्बेटर शेखर) और 25 डिग्री सेल्सियस पर, जब तक अंयथा निर्दिष्ट । अधिक जानकारी के लिए, कृपया चित्रा 1aपर योजना से परामर्श करें । एंफोटेरीसिन बी (उदा. फंगीज़ोन) और जेंटॅमिसिन को क्रमशः २.५ μg/ml और ०.०१ μg/ml की अंतिम सांद्रता के उपयोग से पहले सभी डिसेल्युलेराइजेशन समाधानों में जोड़ा जाता है । decellularized ऊतकों के भीतर बनाए रखा डीएनए की मात्रा का आकलन करने के लिए, नमूना द्रव्यमान decellularized प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए । डीएनए परिमाणन प्रोटोकॉल की धारा ५.१ में और विस्तृत है ।

  1. DAY 1
    1. से ऊतक के नमूने निकालें-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर । आर टी पर १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों छोड़ अक्टूबर तक आंशिक रूप से पिघल जाता है । अभी भी जमे हुए अक्टूबर के कार्डियक ऊतक ब्लॉक 1x PBS के साथ एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण ।
    2. के बाद OCT पिघला देता है, 1x PBS के साथ एक नई पेट्री डिश के लिए हृदय ऊतक ले जाएं । 1x PBS में धोने के नमूने और ६० rpm पर 10-15 मिनट के लिए एक शेखर के साथ । कम से दो बार दोहराएं ।
    3. एक बाँझ 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति थाली के अच्छी तरह से प्रति Hypotonic बफर काम के 1 मिलीलीटर जोड़ें । संदंश की मदद से प्रति अच्छी तरह से एक नमूना हस्तांतरण ।
    4. 25 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन शेखर को नमूनों के साथ 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति थाली ले जाएं और Hypotonic बफर के साथ 18 एच ऊष्मायन शुरू ।
  2. दिन 2
    1. ०.२% SDS समाधान खंड १.३ में वर्णित के रूप में तैयार है ।
    2. Hypotonic बफर महाप्राण और 1 एच के लिए 1x PBS के साथ नमूने धोने 3 बार दोहराएँ.
      नोट: ठहराव बिंदु: डिसेल्युलेराइजेशन के तहत ऊतक स्थिर परिस्थितियों में 18 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x PBS में रखा जा सकता है ।
    3. 1x PBS निकालें, नए सिरे से बनाया एसडीएस समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें (चरण १.३) प्रति अच्छी तरह से और सेते नमूने के लिए 24 h.
      नोट: (जांच बिंदु) पोस्ट एसडीएस ऊष्मायन, सुनिश्चित करें कि नमूनों एक सफेद पारभासी उपस्थिति के लिए प्रदर्शन । इस कदम पर, SDS इलाज नमूने डीएनए में भीग रहे हैं, एक जिलेटिन की तरह निरंतरता दिखा । एसडीएस समाधान धीरे से पाइपेट टिप करने के लिए नमूना आसंजन से बचने के लिए निकालें ।
  3. दिन 3
    1. 20 मिनट के लिए Hypotonic धोने बफर (अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर) के साथ नमूनों को धो लें । दोहराएं 3 बार ।
      नोट: इस चरण में, यह कक्ष अवशेषों को हटाने के कारण नमूना आकार में कमी का निरीक्षण करने के लिए सामान्य है । प्वाइंट रोकें: डिसेल्युलेराइजेशन के तहत ऊतक स्थिर परिस्थितियों में 18 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर Hypotonic धोने बफर में रखा जा सकता है ।
    2. अच्छी तरह से प्रति DNase उपचार समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए नमूने सेते ।
    3. महाप्राण DNase उपचार समाधान और 1x PBS के साथ नमूने धोने (अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर) के लिए 20 मिनट. दोहराएं 3 बार । 1x PBS के साथ एक अंतिम धोने प्रदर्शन (अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर) आर टी पर रातोंरात और ६० rpm पर मिलाते हुए ।
    4. (चेक पॉइंट) DNase उपचार के बाद, सुनिश्चित करें कि decellularized नमूने जिलेटिन की तरह निरंतरता खो दिया है ।
      नोट: dnase उपचार के बाद, निकालें और 1x pbs जोड़ें धीरे के बाद से नमूने आसानी से फँस और पिपेट टिप करने के लिए संलग्न किया जा सकता है ।

4. decellularized ऊतक सेल हटाने का आकलन

  1. एक 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति थाली में नमूनों को ठीक करें, 1 एमएल के साथ नए सिरे से बनाया 10% फार्मेलिन तटस्थ बफर के साथ ०.०३% जलीय eosin के लिए 2.5-3 एच आरटी में जोड़कर ।
    नोट: eosin फिक्सर करने के लिए जोड़ा जाता है decellularized ऊतक दाग और परिच्छेदन और ऊतकीय धुंधला के दौरान नमूना दृश्य आसानी । eosin के अलावा न तो ऊतकीय दाग के साथ हस्तक्षेप करता है और न ही इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीकों के साथ । वैकल्पिक रूप से, निर्धारण 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात किया जा सकता है ।
  2. लगानेवाला समाधान निकालें और 1x pbs के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए नमूना धोने ।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक प्रयोज्य vinyl नमूना मोल्ड का उपयोग कर ऊतक विज्ञान प्रसंस्करण जेल में फिक्स्ड bioscaffolds Encapsulate ।
  4. नमूने मोल्ड से एम्बेडेड और बायोप्सी प्रसंस्करण के लिए स्थानांतरण के साथ प्रोटोकॉल जेल निकालें/ढक्कन के साथ कैसेट Embedding.
    नोट: ऊतक के लिए एक विकल्प प्रोटोकॉल और प्रसंस्करण जेल में embedding छोटे pores के साथ दो बायोप्सी स्पंज में प्रत्येक नमूने को संसाधित करने के लिए है । नमूनों का पता लगाने में सक्षम करने के लिए बायोप्सी स्पंज के केंद्र में स्थानीयकृत किया जाना चाहिए । नोट की, कुछ नमूनों को इस दृष्टिकोण का उपयोग कर स्थानीयकरण करने के लिए मुश्किल हो सकता है ।
  5. (2) अल्कोहल सांद्रण (७०%, ८०%, ९०%, १००%, १००%), आइसोपार्फेनिक एल्फेटिक हाइड्रोकार्बन सॉल्यूशन (2 इन्क्यूबेशन स्टेशन) और पैराफिन (२ इन्क्यूबेशन) की श्रृंखला में उत्तरोत्तर इनक्युबेशन (30 मिनट प्रति समाधान) के माध्यम से पैराफिन एम्बेड करने के लिए नमूनों की प्रक्रिया स्टेशनों) पर ५६ डिग्री सेल्सियस ।
  6. एक पैराफिन ब्लॉक में नमूने माउंट ।
  7. एक माइक्रोटोम पर 3 μm-मोटी पैराफिन वर्गों में कटौती और कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों को इकट्ठा ।
  8. सूखी पैराफिन वर्गों ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ।
    नोट: (ठहराव बिंदु) पैराफिन वर्गों 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कर रहे है जब तक आगे का उपयोग करें ।
  9. प्रोटोकॉल दक्षता की पुष्टि करने के लिए, Hematoxilin और Eosin (एच & ई) और Masson Trichrome धुंधला (एमटी) decellularized नमूना वर्गों और गैर के वर्गों के लिए प्रदर्शन निर्माता के निर्देशों के अनुसार ऊतक हेरफेर ।
    नोट: H & E धुंधला दाग सेल नाभिक नीला/बैंगनी, कोशिकाद्रव्य गहरे गुलाबी/लाल और कोलेजन पीला गुलाबी और मीट्रिक टन दाग नाभिक काले, कोशिकाद्रव्य लाल, और कोलेजन और श्लेष्मरस नीला । एक असुरक्षित प्रकाश गुलाबी (एच & ई, एमटी) और नीले (एमटी) नेटवर्क, एक परमाणु दाग के अभाव में मनाया जाता है जब कुशल decellularization हासिल की है ।

5. decellularized ऊतक परमाणु सामग्री को हटाने का आकलन

नोट: decellularized ऊतक पर डीएनए सामग्री का परिमाणन संबंधित गैर-हेरफेर ऊतक की तुलना में किया जाना चाहिए ।

  1. डिसेल्युलेराइजेशन से पहले, एक उच्च परिशुद्धता डिजिटल पैमाने पर एक १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब वजन । ट्यूब के लिए हृदय ऊतक स्थानांतरण, 1x PBS की अतिरिक्त राशि को हटाने और नमूने के साथ ट्यूब वजन । नमूनों के गीले वजन की गणना करें:
    नमूनागीला वजन = नमूने के साथ वजन ट्यूब -वजन खाली ट्यूब
  2. नमूने के रूप में चरण 3 में वर्णित Decellularize ।
  3. डिसेल्युलेराइजेशन के बाद, एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में decellularization ऊतकों को इकट्ठा ।
    1. छोटे आयामों और व्यक्तिगत हृदय के नमूनों और किट विनिर्देशों के द्रव्यमान के कारण, पूल प्रत्येक नमूना स्थिति के ऊतकों decellularized (भ्रूण हार्ट: 5 पूरे दिल; वयस्क LV explants: 15 explants) । गैर-हेरफेर ऊतक के साथ एक ही प्रक्रिया करते हैं ।
      नोट: (ठहराव बिंदु) डीएनए निष्कर्षण और परिमाणन किया जाता है जब तक नमूने-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  4. एक साफ पेट्री डिश में एक स्केलपेल की मदद से गैर हेरफेर और छोटे explants में decellularized ऊतकों में कटौती ।
    नोट: प्रत्येक नमूने के लिए एक व्यक्तिगत स्केलपेल और पेट्री डिश का उपयोग करें । एक स्केलपेल के साथ नमूनों की यांत्रिक व्यवधान उनके पीछे एंजाइमी पाचन और बाद में डीएनए निष्कर्षण की सुविधा ।
  5. डीएनए निष्कर्षण के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक स्पिन-कॉलम आधारित डीएनए निष्कर्षण विधि का उपयोग करें ।
    1. एक व्यापक छिद्र पिपेट टिप का उपयोग कर निर्माता के निर्देशों के अनुसार मास्टर पाचन बफर (पाचन बफर और proteinase कश्मीर) के साथ पेट्री डिश से यंत्रवत् वियोजित नमूने लीजिए ।
      नोट: प्रोटिनेस K पाचन के साथ ऊतक lysis तेजी से decellularized नमूनों में है । एक ही समय में अलग नमूनों को संसाधित करने के लिए, बर्फ पर लीजड ड नमूने रखने के लिए, जब तक सभी नमूनों क्षरण को कम करने के लिए लीजड ड हैं । पूर्ण नमूनों lysis 4-6 एच के बीच प्राप्त की है ।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें ।
    3. decellularized और गैर-decellularized ऊतक के नमूने के निकाले डीएनए की पैदावार बढ़ाने के लिए, डीएनए को 25-50 μL और १०० μL पर elute बफर, क्रमशः elute । eluted डीएनए लीजिए और स्पिन-कॉलम लोड । आरटी में 1 मिनट के लिए सेते । निर्माता के निर्देशों के अनुसार नमूने सेंट्रीफ्यूज ।
      नोट: (ठहराव बिंदु) नमूनों से निकाले गए डीएनए को आगे उपयोग करने तक-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है ।
  6. निर्माता के निर्देशों का पालन एक फ्लोरोसेंट dsDNA जांच किट के साथ नमूनों से निकाले डीएनए Quantify ।
  7. डीएनए सामग्री के रूप में डीएनए के nanograms प्रारंभिक नमूना गीला वजन के प्रति मिलीग्राम के रूप में सामान्य (decellularization से पहले).

6. Decellularized पाड़ो सेल सीडिंग

नोट: सभी समाधान/अभिकर्मकों को बाँझ होने की आवश्यकता है और संपूर्ण प्रक्रिया बाँझ स्थितियों में निष्पादित की जाती है ।

  1. 1x DPBS को २.५ μg/मिलीलीटर की एम्फोटेरीसिन बी और 1% P/S (पेनिसिलिन, १०० I.U.; स्ट्रेप्टोमाइसिन १०० μg/mL) के साथ तैयार करें ।
  2. पिछले decellularization धोने कदम (कदम 3.3.3) से 1x PBS समाधान निकालें और हौसले से तैयार 1x DPBS के प्रति ५०० μL जोड़ें/2.5 μg/एमएल के amphotericin B/1% पी/एस समाधान । 1-7 दिन से 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर नमूने ।
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों का भंडारण बाँझपन बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  3. 1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए सेल बेसल मीडिया (FBS और पूरक के बिना) के लिए पी/एस जोड़ें ।
  4. महाप्राण 1x DPBS/2.5 μg/एमएल के amphotericin B/1% पी/एस समाधान से decellularized नमूने । सेल बेसल मीडिया/1% पी/एस के प्रति अच्छी तरह से ५०० μL जोड़ें और 1 एच से अधिक के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस, या 4 डिग्री सेल्सियस पर एक एच के लिए equilibrate नमूने देते हैं ।
  5. ब्याज की कोशिकाओं को विभाजित और सेल घनत्व वांछित पर कोशिकाओं के छोटे aliquots तैयार करते हैं ।
    नोट: decellularized ऊतक बोने का कार्य एक त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत और बाँझ स्थितियों में किया जाना चाहिए । सेल कल्चर मीडिया में 1% पी/एस होना चाहिए ।
  6. ९६-well थाली के एक कूप के केंद्र के लिए पिपेट 3-4 μL DPBS की । पतली और सीधे चिमटी का उपयोग करना, डीपीबीएस ड्रॉप करने के लिए decellularized मचानों हस्तांतरण, आकांक्षा द्वारा अतिरिक्त DPBS हटाने, और सुनिश्चित करें कि नमूना या नहीं जोड़ झुर्रियों वाली होती है । यह किनारों पर सूखी हो जाने के लिए अच्छी तरह से सतह का पालन करें ।
    नोट: अलग मचानों कम बोने की क्षमता है ।
  7. सुपाड़े के किनारों के खिलाफ धीरे से एकल-कक्ष समाधान को पिख्ता करके कक्षों को जोड़ें ।
    नोट: उदाहरण के लिए, नवजात चूहे cardiomyocytes ७,५०० कोशिकाओं/मिमी2 और अमर माउस लिन− sca-1+ कार्डियक संततित्र कोशिकाओं (icpcsca-1) के घनत्व पर 60-1500 कोशिकाओं/ प्रायोगिक औचित्य के अनुसार कोशिका घनत्व को समायोजित करें ।
  8. पड़ोसी कुओं के लिए DPBS जोड़ें फास्ट मीडिया वाष्पीकरण से बचने के लिए ।
  9. 24 घंटे के बाद सेल बोने, यदि कोशिका प्रकार इस्तेमाल किया ऊतक संस्कृति polystyrene प्लेट्स (TCPS) का पालन, एक नई अच्छी तरह से bioscaffolds हस्तांतरण । अंयथा, गैर-अनुपंद कक्षों को निकालने के लिए मध्यम को प्रतिस्थापित करें ।
  10. कक्ष प्रकार की विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार मीडिया को सावधानीपूर्वक परिवर्तित करें.

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Representative Results

स्थूल प्रेक्षण, ऊतक विज्ञान और डीएनए परिमाणन: तीन मुख्य तकनीकों के माध्यम से डिसेल्युलेराइजेशन दक्षता का मूल्यांकन किया जाना चाहिए । नमूनों के बाद SDS उपचार के स्थूल उपस्थिति अप्रत्यक्ष रूप से कोशिका हटाने की प्रभावकारिता को प्रभावित करता है । एसडीएस ऊष्मायन के बाद, नमूने श्वेताभ (चित्रा 1c) के लिए पारभासी के रूप में दिखाई देना चाहिए । भ्रूण (E18) decellularized ऊतकों एक उच्च पारभासी संरचना की विशेषता है, जबकि वयस्क explants सफेद उपस्थिति के लिए एक पारभासी है । एक whiter उपस्थिति आम तौर पर उच्च फाइबर और कोलेजन सामग्री का प्रदर्शन एक ECM नेटवर्क के लिए सहसंबद्ध है, जैसे वयस्क वेंट्रिकुलर और संवहनी जहाजों ecm मेष (चित्रा 1 सी) । Hematoxylin & Eosin (एच & ई) और/या Masson Trichrome (मीट्रिक टन) दाग एक झरनी जाल (प्रकाश गुलाबी, एच & E; प्रकाश गुलाबी और नीले, मीट्रिक टन) (चित्रा 1C) के अवलोकन द्वारा कुशल सेल हटाने की पुष्टि करने के लिए किया जाता है । इसके अलावा, मीट्रिक टन दाग नीले5में कोलेजन meshwork पर प्रकाश डाला गया । डीसेल्युराइजेशन के बाद नाभिकीय सामग्री की निकासी का अभिगम डीएनए परिमाणन द्वारा किया जाता है और लगभग ९९.८% की कमी सामान्यत गैर-हेरफेर ऊतकों (आंकड़ा 1 ग) की तुलना में प्राप्त की जाती है । decellularized मचानों पर परमाणु सामग्री की उपस्थिति प्रत्यारोपण14पर अवांछित भड़काऊ प्रतिक्रिया के एक ट्रिगर के रूप में वर्णित किया गया है । इस कारण से, कुशल decellularization की पुष्टि मूल 3 डी पाड़ repopulation प्रयोगों से पहले आवश्यक है । Decellularized मचानों बाँझ स्थितियों में ब्याज की कोशिकाओं के साथ बोने की स्थिति में संग्रहित किया जा सकता है । सेल व्यवहार्यता calcein धुंधला करना (चित्रा 2A) द्वारा विट्रो संस्कृति में भर में नजर रखी है । फिर भी, calcein दाग संवेदनशील सेल प्रकार के लिए साइटोटोक्सिक किया जा सकता है । पाड़ो में सेल पुनर्जनसंख्या और वितरण के टर्मिनल विश्लेषण के बाद पैराफिन प्रसंस्करण किया जाता है; bioscaffold के एक केंद्रीय खंड पर H & E धुंधला द्वारा मूल्यांकन bioscaffold पुनर्जनसंख्या का एक स्नैपशॉट दिखाया गया है (चित्रा 2B, 2c) ।

Figure 1
चित्रा 1. भ्रूण (E18) और वयस्क कार्डियक ऊतक decellularization प्रक्रिया और decellularization दक्षता की पुष्टि । (A) प्रोटोकॉल ओवरव्यू । (ख) डीसेल्युलेराइजेशन प्रोटोकॉल विस्तृत है । (ग) डीसेल्युलेराइजेशन से पहले और बाद में कार्डियक भ्रूण और वयस्क ऊतक का स्थूल विश्लेषण । स्केल बार: 2 मिमी । (घ) नाभिकीय सामग्री का परिमाणन बनाम गैर-हेरफेर ऊतक में किया जाता है । माध्य ± SEM के रूप में अभिव्यक्त डेटा. छात्र का t-test, दो-पुच्छ * p < 0.05. (ङ) डीसेल्युलेराइजेशन से पहले और बाद में कार्डियक भ्रूण और वयस्क ऊतक के त्रिक्रोम हिस्टेलॉजिकल एनालिसिस एच & ई और मस्से । स्केल बार: १०० μm । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2. decellularized मचानों की पुनर्जनसंख्या विश्लेषण लिन के साथ वरीयता प्राप्त-एससीए-1+ कार्डियक संतति कोशिका रेखा (Icpcsca-1) । (क) कालसेइन दाग (हरित) द्वारा विट्रो संस्कृति के दौरान पाड़ो की सतह पर उच्च कोशिका व्यवहार्यता देखी गई । स्केल बार: १०० μm । (ख) एच & ई धुंधला के माध्यम से आकलित पाड़ो में सेल संख्या और वितरण । स्केल बार: १०० μm । (ग) decellularized ecm में एंबेडेड कोशिकाओं के लांबिक दृश्य । ५० μm-मोटी पैराफिन खंड की संनाभि छवि । स्केल पट्टी: 10 μm (orthogonal देखें XZ, YZ) और ४० μm । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चरण अवलोकन संभावित कारण समस्या समाधान
3.1.2. एक भूरा रंग के साथ ऊतक नमूना cryofixation; अस्थिर हिमांक ताप नमूना cryofixation अक्षम कोशिकाद्रव्यी प्रोटीन को हटाने के लिए नेतृत्व करेंगे कम अवधि के दौरान जमे हुए ऊतक की दुकान । फ्रीजर तापमान और स्थिरता की जांच करें
3.2.4. गुलाबी से सफेद अपारदर्शी नमूने एसडीएस समाधान अच्छी तरह से तैयार नहीं था; वयस्क LV explants बहुत बड़ा कोशिकाद्रव्यी प्रोटीन का अकुशल निष्कासन पूरा एसडीएस विघटन सुनिश्चित करें । छोटे आकार के नमूने Decellularize ।
3.3.4. एक जिलेटिन की तरह उपस्थिति के साथ नमूने अकुशल डीएनए निकालना अकुशल परमाणु सामग्री निकासी DNase एकाग्रता और/
४.६. ऊतक विज्ञान जेल पेक् टर पैराफिन प्रोसेसिंग से पहले PBS1X/इथेनॉल में लॉन्ग वेटिंग टाइम decellularized ऊतक संरचना में परिवर्तन जितनी जल्दी हो सके ऊतकीय प्रसंस्करण शुरू
६.६. सूख गए नमूने नमूने भी लंबे समय के लिए सूखी छोड़ दिया गया decellularized ऊतक के स्थाई पतन । अकुशल कोशिका बीजरोपण नमूनों को केवल परिधि में थोड़ा शुष्क करने की अनुमति दें ताकि सीडिंग के दौरान कूप के नीचे से जुड़ जाए
६.७. सीडिंग के दौरान Decellularized नमूना टुकड़ी नमूनों को बोने से पहले पर्याप्त सूख नहीं थे अकुशल कोशिका बीजरोपण वृद्धि ECM सुखाने समय सेल बोने से पहले बेहतर पालन की अनुमति देने के लिए

तालिका 1. भ्रूण (E18) और वयस्क माउस कार्डियक ऊतक के समानांतर decellularization के लिए तालिका समस्या निवारण ।

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Discussion

extracellular मैट्रिक्स (ecm) रेशेदार और चिपकने वाला नच के एक अत्यधिक गतिशील और जटिल meshwork है, कई bioactive पेप्टाइड्स के एक जलाशय से मिलकर और वृद्धि कारकों फँस । कोशिका आसंजन के प्रमुख न्यूनाधिक के रूप में, cytoskeleton गतिशीलता, गतिशीलता/प्रवास, प्रसार, भेदभाव और apoptosis, ECM सक्रिय रूप से सेलुलर समारोह और व्यवहार को नियंत्रित करता है । जानते हुए भी कि सेलुलर व्यवहार 2D और 3 डी संस्कृतियों में अलग है, वहां के लिए उपंयास organotypic मॉडल है कि सही ढंग से प्राकृतिक ऊतक वातावरण को दोहराने कर सकते है विकसित करने के प्रयास किए गए हैं । पिछले वर्षों में ऊतक डिसेल्युलेराइजेशन ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए एक वैकल्पिक तकनीक के रूप में उभरा है । इस प्रकार, ऊतक और अंग decellularization वर्तमान में बेहतर ऊतक विशिष्ट microपर्यावरणिक मानकों (जैव रासायनिक, संरचनात्मक और यांत्रिक) और विट्रो में जैविक गतिविधि और vivo में टुकड़े करना करने के लिए पसंद का उपकरण है ।

हम एक प्रोटोकॉल है कि एक डिटर्जेंट के साथ एक अल्पपरासारी बफर के उपयोग को जोड़ती है विकसित किया गया एक dnase उपचार5,12,13के बाद गुण । वर्तमान प्रोटोकॉल का गठन एक सरल और reproducible विधि decellularized भ्रूण और वयस्क माउस कार्डियक ऊतक के बीच तुलनात्मक विश्लेषण करने के लिए । अंय ऊतकों के साथ हमारा अनुभव, अर्थात् ट्यूमर के नमूने के साथ कैंसर ' रोगियों सर्जिकल resections और माउस फेफड़ों के ऊतकों से व्युत्पंन, पता चलता है कि इस प्रोटोकॉल आसानी से अनुकूलनीय है और अंय परिस्थितियों और12मॉडल में सफल13,। विभिंन नमूनों पर एक ही decellularization प्रक्रिया के आवेदन एक 3 डी संदर्भ में ECM संरचना, biomechanical गुण, वास्तुकला और सेलुलर modulatory गुणों के तुलनात्मक अध्ययन की अनुमति देता है ।

ऊतक decellularization के सबसे कठिन चुनौतियों में से एक एकमुश्त सेल हटाने, ECM meshwork संरक्षण और ऊतक biocompatibility के बीच संतुलन है । इसलिए, कई महत्वपूर्ण कदम सावधानी से विचार किया जाना चाहिए, ऐसे decellularization से पहले ऊतक cryopreservation के समय के रूप में, सही एक्सप्लांट size, ताजा समाधान का उपयोग करें, और अंतिम decellularization ऊतक के हेरफेर । हमारे अध्ययनों के दौरान, हमने cryopreserved ऊतक के लंबे समय तक भंडारण और decellularization अक्षमता के साथ पुराने एसडीएस समाधान के उपयोग के बीच एक सीधा संबंध मनाया । दीर्घकालिक ऊतक भंडारण जटिल ECM meshwork के बीच (नाभिक के बिना) मोटी सेलुलर क्षेत्रों के अवशेष प्रदान अक्षम सेलुलर सामग्री को हटाने की ओर जाता है । एक समान अवांछनीय प्रभाव जब लंबे समय संग्रहीत एसडीएस समाधान ऊतक decellularization के लिए उपयोग किया जाता है प्राप्त है, क्योंकि एसडीएस समाधान कम घुलनशीलता, hydrolysis, और पीएच परिवर्तन के कारण एक कम स्थिरता है की संभावना15,16 . सही आकार के explants का उपयोग (~ १.५ मिमी x १.५ मिमी x १.५ मिमी) भी सफल वयस्क ऊतक decellularization के लिए आवश्यक है, के बाद से बड़ा ऊतक resections अधिक decellularization करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं, सेल मलबे प्रदर्शित सतह पर फँस और गिरफ्तार घने ECM नेटवर्क के बीच । हालांकि इस प्रोटोकॉल हृदय ऊतक decellularization, वयस्क explants का एक छोटा सा अंश के एक कुशल विधि प्रदान करता है सेल अवशेष पेश कर सकते हैं, विशेष रूप से एक बड़े आकार के उन । इन नमूनों का ऊतकीय विश्लेषण उनकी पहचान को आसान बनाता है और अध्ययन से बाद में बहिष्करण कर देता है । अंत में, इस प्रोटोकॉल के साथ साथ बहुमुखी और आसानी से ऊतक एक्सप्लांट size करने के लिए मामूली समायोजन के साथ विशिष्ट नमूनों के लिए लागू है, एसडीएस एकाग्रता (0.1-0.2% एसडीएस) या समाधान ऊष्मायन समय5,12,13 .

वर्तमान पद्धति की मुख्य सीमा यह है कि छोटे आकार के नमूनों में हेरफेर, यानी म्यूरिन भ्रूण हार्ट और वयस्क हार्ट explants, कुछ हैंडलिंग कौशल की आवश्यकता है । वास्तव में, दोनों भ्रूण और वयस्क decellularized ऊतकों नाजुक संरचनाओं कि स्थायी रूप से विकृत किया जा सकता है जब प्रक्रिया के दौरान सूख या पतली पिपेट टिप द्वारा फँस या संदंश के साथ हैंडलिंग के दौरान5.

इस प्रोटोकॉल की प्रमुख नवीनता, भ्रूण माउस दिल और वयस्क ECM संरचना के तुलनात्मक मूल्यांकन के लिए वाम वेंट्रिकल explants के समानांतर decellularization के अलावा (बायोकेनिकल विश्लेषण) और जैविक समारोह से जुड़े, अपनी सरल है विशिष्ट ऊतकों और मॉडलों के लिए अनुवाद5,12,13। मानकीकृत पद्धति लागू करने से अलग उंर के ऊतकों के decellularization केवल रीसस बंदर गुर्दे पर वर्णित किया गया था, और भ्रूण, नवजात और वयस्क ऊतकों, जो 10 दिनों के लिए एक 1% एसडीएस उपचार के अधीन थे के अनुप्रस्थ वर्गों6 . एक कार्डिएक सेटिंग में, हालांकि भ्रूण, नवजात और वयस्क ऊतकों decellularized किया गया है, तरीकों यांत्रिक dislodging, एसडीएस सांद्रता और आवेदन के समय7,8की डिग्री पर मतभेद । के रूप में प्रत्येक decellularization प्रक्रिया एक अनूठा तरीके से ECM को प्रभावित करता है, विभिंन प्रोटोकॉल से प्राप्त decellularization नमूनों की तुलना भ्रामक निष्कर्ष के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए, विभिंन नमूनों में एक ही decellularization प्रक्रिया लागू विश्वसनीय तुलनात्मक विश्लेषण सक्षम बनाता है ।

वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध decellularized ऊतकों के बड़े बहुमत वयस्क नमूनों17से प्राप्त । उनके वयस्क समकक्षों की तुलना में समर्थक पुनर्योजी संकेतों प्रदान करने में भ्रूण microवातावरणों की वृद्धि की क्षमता के लिए बढ़ती मांयता के बावजूद, भ्रूण के ऊतकों की decellularization केवल कुछ5अध्ययनों में रिपोर्ट किया गया था, 7 , 18 , 19 , 20 , 21. ईएसएम गतिशीलता को समझना, एजिंग प्रक्रिया के दौरान प्रो-पुनर्योजी सूक्ष्मवातावरण की अनूठी विशेषताओं की पहचान करना महत्वपूर्ण होगा जो, बदले में, उच्च दक्षता जैव-सामग्री के विकास को प्रभावित करेगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

प्रासंगिक आलोचनात्मक चर्चा के लिए लेखक पिंटो-do-Ó प्रयोगशाला के सभी सदस्यों के ऋणी हैं । इस काम Programa एमआईटी द्वारा समर्थित किया गया था-Fundação पैरा Ciência ई Tecnologia (FCT) परियोजना के तहत "कार्डिओस्टेम-इंजीनियर कार्डियक ऊतकों और स्टेम सेल-आधारित चिकित्सा के लिए हृदय अनुप्रयोगों" (MITP-टीबी/ईसीई/0013/2013) । A.C.S. एक एफसीटी अध्येतावृत्ति (एसएफआरएच/बीडी/88780/2012) का प्राप्तकर्ता है और M.J.O. एक एफसीटी फेलो (एफसीटी-अन्वेषक २०१२) है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker Orbital Shakers IKA:3510001 Recommended
Fluorimeter - - Equipment available
Digital weight scale - - Equipment available
Inverted Microscope - - Equipment available
Cell culture incubator - - Equipment available
Fridge (4ºC) - - Equipment available
Deep freezer (-80ºC) - - Equipment available
Microtome - - Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge Fine Science Tools 5000-08 Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11254-20 Recommended
Dumont 7 forceps Fine Science Tools 11272-30 Recommended
Dissecting Scissors, straight - - Tool available
Forceps, serrated, curved - - Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped VWR 29442-044 -
96 well plates, individually wrapped VWR 71000-078 -
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized Millipore SE1M179M6 -
Eppendorff - - Material available
15 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430791 -
50 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430829 -
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid Electron Microscopy Science 70075-B -
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 22-037-246 -
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006 -
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) Sigma-Aldrich 277258-1L -
Dry ice - - -
Decellularization
NaCl BDH Prolabo 27810.364 -
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S-31264 -
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-100g -
KCl Sigma-Aldrich P8041-1KG -
TrisBASE Sigma-Aldrich T6066-500G -
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L-4390 -
MgCl2 MERCK 1.05833.1000 -
DNAse I AplliChem A3778,0050 -
Gentamicin Gibco 15710-049 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Deionized water (DI water) - - -
Histology
10 % formalin neutral buffer Prolabo 361387P -
Eosin Y AQUEOUS Surgipath 01592E Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 -
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous Aga 4,006,02,02,00 -
Deionized water (DI water) - - -
Clear Rite 3 Richard-Allan Scientific 6915 -
Shandon Histoplast Thermo Fisher Scientific RAS.6774006 -
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific K182001 -
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit Invitrogen P11496 -
Cell culture
DPBS VWR 45000-434 -
Penicillin-Streptomycin Solution 100X Labclinics L0022-100 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Cell culture media of the cell of interest - - -

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References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  3. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  5. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. 3rd Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
  8. Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
  10. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  11. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  12. Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
  13. Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
  14. Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
  15. Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
  16. Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
  17. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
  18. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  19. Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
  20. Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
  21. Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).

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Bioengineering मुद्दा १४५ Decellularization extracellular मैट्रिक्स 3 डी मचान भ्रूण हार्ट वयस्क हार्ट कार्डियक ऊतक इंजीनियरिंग

Erratum

Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 04/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

भ्रूण और वयस्क कार्डियक ऊतक Explants के तुलनीय Decellularization 3 डी की तरह प्लेटफार्मों के लिए इन विट्रो अध्ययन में
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Silva, A. C., Oliveira, M. J.,… More

Silva, A. C., Oliveira, M. J., McDevitt, T. C., Barbosa, M. A., Nascimento, D. S., Pinto-do-Ó, P. Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (145), e56924, doi:10.3791/56924 (2019).

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