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Bioengineering

Descelularización comparable de explantes de tejido cardíaco Fetal y adulto como 3D-como plataformas para estudios In Vitro

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/56924
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,5, 4,6, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

ERRATUM NOTICE

Summary

La matriz extracelular cardiaca (ECM) es una compleja red de moléculas que orquestar procesos clave en los tejidos y órganos mientras aguantando remodelación fisiológica durante toda la vida. Descelularización estandarizado del corazón fetal y adulto permite estudios experimentales comparativos de ambos tejidos en un contexto 3D mediante la captura de arquitectura original y propiedades biomecánicas.

Abstract

Conocimiento actual de la matriz extracelular (ECM)-comunicación celular se traduce en estudios grandes bidimensional (2D) cultivo in vitro donde se presentan componentes de ECM como una capa superficial. Estos sistemas de cultivo constituyen una simplificación de la compleja naturaleza de la ECM que abarca la composición bioquímica, estructura y propiedades mecánicas del tejido. Para imitar mejor la comunicación ECM-la célula que forma el microambiente cardiaco, hemos desarrollado un protocolo que permite la descelularización del corazón entero fetal y tejido adulto ventrículo izquierdo explantes simultáneamente para estudios comparativos. El protocolo combina el uso de un tampón hipotónico, un detergente de características de surfactante aniónico y el tratamiento de DNasa sin ningún requisito de conocimientos especializados o equipos. La aplicación de la misma estrategia de descelularización en muestras de tejido de sujetos de edad diferentes es una alternativa para realizar estudios comparativos. El presente Protocolo permite la identificación de diferencias estructurales únicas en adulto y fetales cardiaca ECM malla y biológico respuestas celulares. Además, la presente metodología muestra una aplicación más amplia siendo aplicada con éxito en otros tejidos y especies con ajustes menores, como en las biopsias del intestino humanas y en pulmón de ratón.

Introduction

La matriz extracelular (ECM) es una red dinámica de moléculas que regulan importantes procesos celulares, es decir, decisión de la suerte, proliferación y diferenciación de1,2. La investigación de las interacciones célula-ECM se ha realizado principalmente en dos dimensiones (2D) en vitro culturas recubierto con componentes de ECM, que constituyen una simplificación de las propiedades nativas de ECM en vivo. Descelularización genera acelular bioscaffolds de ECM como 3D que conservan en gran medida la arquitectura extracelular y composición de los tejidos nativos y órganos3,4. Además de servir como andamios bioactivos para ingeniería de tejidos, biomateriales de ECM 3D decellularized surgen como nuevas plataformas para evaluar biología celular-ECM eso paralelo el ambiente en vivo.

Evaluación de la función diferencial de los componentes de la ECM de distintos tejidos, órganos y edad se beneficiará con el uso de protocolos similares de generar bioscaffolds nativo. En el corazón, hemos desarrollado un protocolo versátil de la descelularización de muestras derivadas de adulto y fetales, como una alternativa para realizar estudios comparativos del microambiente de órgano. Utilizando esta metodología, Capturamos el microambiente cardiaco nativo y demostró que la ECM fetal promueve mayores rendimientos de la repoblación de células cardíacas5. Descelularización dispone identificación de residente diferencias estructurales entre ECM fetal y adultos a nivel de la lámina basal y pericelular arreglo de malla de matriz y fibra composición5. Antes de este trabajo, la comparación directa de los tejidos en las diferentes etapas ontogenic utilizando el mismo enfoque de descelularización se ha divulgado solamente para roedores corazones y riñones de mono rhesus. Además, un número limitado de estudios Informe tejido/órgano fetal descelularización propiamente5,6,7. Esto se ha logrado utilizando SDS como agente único descelularización; sin embargo, diferentes concentraciones de SDS se utilizaron para la descelularización de tejido cardíaco fetal y adulto7,8. SDS es uno de los detergentes iónicos más eficaces para la remoción de material citoplásmico y nuclear y ampliamente utilizado en la descelularización de diferentes tejidos y muestras de9,10. Soluciones que contienen altas concentraciones de SDS y largos períodos de exposición se han correlacionado con la desnaturalización de la proteína, pérdida de glicosaminoglicanos (GAGs) y alteración de las fibrillas de colágeno de10,11y por lo tanto un equilibrio entre preservación y celular la eliminación de ECM es necesario. Para aplicar el mismo procedimiento al tejido del corazón fetal y adulto, el protocolo descrito en este documento se divide en tres pasos secuenciales: lisis de células por choque osmótico (tampón hipotónico); solubilización de lípidos y proteínas, DNA-proteína y proteína-proteína interacciones (0.2% SDS); y remoción de material nuclear (tratamiento de DNasa).

Nuestro protocolo muestra varias ventajas: i) la posibilidad de descelularización equivalente de tejidos cardiacos específicos de la edad mediante la aplicación de la misma estrategia de descelularización; II) no hay requisitos para métodos especializados o equipos; III) listo adaptación a otros tejidos y especies como se ha aplicado con éxito con menores alteraciones en las biopsias del intestino humano12 y ratón pulmonar13; y, sobre todo, iv) puede abordar propiedades biomecánicas ECM permitiendo el montaje de las culturas organotypic de 3D como que más imitan muy de cerca las características moleculares del microambiente del tejido nativo.

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Protocol

Todas las metodologías descritas fueron aprobadas por el i3S Comité de ética Animal y Direção Geral de Veterinária (DGAV) y están de acuerdo con Parlamento Europeo Directiva 2010/63/UE.

1. preparación de las soluciones de descelularización

Nota: Todos descelularización soluciones deben ser filtradas a través de un filtro de membrana de 0,22 μm y almacenadas por un máximo de 3 meses, excepto se especifique lo contrario.

  1. De 1 x PBS: mezclar 8 g de NaCl, 1,01 g de Na2HPO4 200 mg de KCl y 200 mg de KH2PO4 con 900 mL de agua desionizada (agua desionizada). Ajustar el pH de la solución a 7.5 y el volumen de solución final hasta 1 L. filtro, autoclave y tienda la solución a temperatura ambiente (RT).
  2. Para el tampón hipotónico (10 mM Tris, EDTA 0,1%): disolver 1,21 g de TrisBASE y 1 g de EDTA en 900 mL de agua desionizada. Ajustar el pH de la solución a 7.8 con NaOH/HCl y el volumen de solución final a 1 L. filtro, esterilizar en autoclave y almacenar a TA.
  3. Para la solución de SDS 0,2% (0.2% SDS, 10 mM Tris): Añadir 0,6 g de TrisBASE y 1 g de sulfato de sodio dodecyl (SDS) en 400 mL de agua desionizada y mezclar a 60 ° C hasta disolución completa del soluto. Deje que la solución se enfríe a RT. ajuste solución pH a 7.8 y el volumen de solución final a 500 mL. Esterilizar la solución por filtración.
    Nota: La solución de SDS se prepara antes de usar. Solución de filtrado sólo tras completar disolución SDS, de lo contrario las partículas insolubles de la SDS saturan el filtro, variando la concentración final de SDS y afectando, en consecuencia, eficacia de descelularización de tejido.
  4. Para el tampón de lavado hipotónica (10 mM Tris): mezcla de 1,21 g de TrisBASE en 900 mL de DI agua. Ajustar el pH de la solución a 7.8 y el volumen final de 1 L. filtro, esterilizar en autoclave y almacenar a TA.
  5. Para el tratamiento de DNasa (20 mM Tris, 2 mM de MgCl2, 50 U/mL DNasa): disolver 2,42 g de TrisBASE y 2 mL de 1 M de MgCl2 en 900 mL de agua desionizada. Ajustar pH a 7.8 y el volumen de solución final a 1 L. filtro y esterilizar la solución por autoclave. Almacene la solución en RT. agregar ADNasa I (50 U/mL) antes de usarlo.
  6. Para DNase stock solución: preparar un tampón de DNasa que contiene 50% glicerol, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM MgCl2y se ajustan a un volumen de solución final de 10 mL con agua desionizada. En campana de flujo laminar, agregue la ADNsa I polvo al buffer de DNasa y mezclar suavemente hasta disolución completa. Esterilizar la solución a través de 0.22 μm filtro. Preparar alícuotas de 1 mL y almacenar a-20 ° C.

2. tejidos y criopreservación

  1. Eutanasia a las hembras embarazadas adultas a los 18 días de gestación (fetos E18) a través de CO2 asfixia. Realizar una cesárea en las mujeres con una tijera quirúrgica y recoger los cuernos uterinos con los ratones fetales a una placa Petri con helada 1 x PBS utilizando dos pinzas dentadas con punta curvada (una pinzas en cada extremo del cuerno).
    1. Abrir los cuernos uterinos y el saco amniótico para aislar a los fetos. Transferencia de los fetos a una nueva caja Petri con helada 1 x PBS para anestesiarlos y decapitar con una tijera.
    2. Eutanasia a ratones C57BL/6 machos 7-8 semanas de edad, uso de CO2 asfixia. Realizar una incisión en el pecho de cada ratón y recoge el corazón.
    3. Enjuague el corazón fetal y adulto con PBS 1 x frío de hielo.
  2. Retire las aurículas del corazón adulto con la ayuda de un bisturí. Realizar una incisión en el ventrículo derecho y extraerlo con unas tijeras recta pequeñas. Exponer la pared interna del ventrículo izquierdo quitando el tabique. En una nueva placa de Petri, dividir el ventrículo izquierdo libre de la pared en tiras longitudinales con 2 mm de espesor y retirar el músculo papilar usando un bisturí y pinzas dentadas con puntas curvas.
    1. Impuestos especiales explantes pequeños de tejido con la ayuda de un bisturí con una cuadrícula de 2 x 2 mm (Descripción detallada en el suplementario figura 15). Enjuague explantes de tejido con PBS 1 x.
  3. Añadir 250 μl de la temperatura de corte óptima (OCT) compuesta para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL esterilizado. Transfer corazones todo fetal y adulto explantes cardíacos a los tubos con 250 μl de OCT y congelar con isopentano enfriado con hielo seco y conservar a-80 ° C (hasta un máximo de 6 meses).
    Nota: El uso de explantes de tejido cardiaco congelados por más de 6 meses reducirá significativamente la eficiencia de la descelularización, especialmente en los explantes de tejido del corazón adulto.

3. descelularización tejido

Nota: Descelularización de tejido cardiaco se realiza en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con una muestra por pozo. 1 mL de cada solución de descelularización se añade a cada pocillo. Todos los pasos de descelularización deben realizarse con agitación a 165 rpm (coctelera de la incubadora con un diámetro orbital de 20 mm) y a 25 ° C, a menos que se especifique lo contrario. Para más detalles, consulte el esquema de la figura 1A. Anfotericina B (fungizonepor ejemplo ) y gentamicina son recién añadidos a todas las soluciones de descelularización antes del uso a una concentración final de 2,5 μg/mL y 0.01 μg/mL, respectivamente. Cuantificar la cantidad de ADN conservado dentro de los tejidos decellularized, la muestra masa deben determinarse antes de iniciar el protocolo de descelularización. El protocolo de cuantificación de ADN es más detallada en 5.1.

  1. DÍA 1
    1. Extraer muestras de tejido del congelador de-80 ° C. Dejar 1,5 mL tubos de microcentrífuga en RT hasta OCT se convierte parcialmente derretido. Transferir el bloque de tejido cardiaco del OCT congelado a una placa de Petri con PBS 1 x.
    2. Después del OCT se derrite, hacia el tejido cardiaco una nueva placa de Petri con PBS 1 x. Las muestras de lavado de 1 x PBS y a 60 rpm con un agitador de 10-15 minutos repetición al menos dos veces.
    3. Añadir 1 mL de trabajo tampón hipotónico por pozo de una placa de cultivo estériles para tejidos 24-bien. Transferir una muestra por pozo con la ayuda de fórceps.
    4. Mover la placa de cultivo de tejido de 24 pocillos con las muestras a una coctelera de la incubadora a 25 ° C y comenzar la incubación de 18 h con tampón hipotónico.
  2. DÍA 2
    1. Preparar la solución de SDS 0,2% como se describe en la sección 1.3.
    2. Aspirar el tampón hipotónico y lavar las muestras con PBS 1 x por veces 1 h. repetir 3.
      Nota: Pausa punto: tejido bajo descelularización puede conservarse en PBS 1 x a 4 ° C por 18 h en condiciones estáticas.
    3. Retirar el PBS 1 x, agregue 1 mL de solución de SDS recién hecha (paso 1.3) por pozo e incubar las muestras durante 24 horas.
      Nota: Incubación (CHECK POINT) Post SDS Asegúrese de que las muestras exhiben un blanco de aspecto translúcido. En este paso, SDS tratadas las muestras son bañadas en el ADN, mostrando una consistencia gelatinosa. Eliminar la solución de SDS lentamente para evitar la adherencia de la muestra a la punta de la pipeta.
  3. DÍA 3
    1. Lavar las muestras con tampón de lavado hipotónica (1 mL por pozo) por 20 minutos, repetir 3 veces.
      Nota: En este paso, es normal observar una disminución en el tamaño de la muestra debido a la eliminación de restos celulares. PUNTO de pausa: Tejido bajo descelularización puede conservarse en tampón de lavado hipotónica a 4 ° C por 18 h en condiciones estáticas.
    2. Añadir 1 mL de solución de tratamiento de DNasa por bien e incubar las muestras durante 3 h a 37 ° C.
    3. Aspire la solución de tratamiento de DNasa y lavar las muestras con PBS 1 x (1 mL por pozo) por 20 minutos, repetir 3 veces. Realizar un último lavado con PBS 1 x (1 mL por pozo) durante la noche en RT y agitación a 60 rpm.
    4. (Check point) Después del tratamiento de DNasa, asegúrese de que las muestras decellularized han perdido la consistencia de gelatina.
      Nota: Después del tratamiento de DNasa, retirar y añadir 1 x PBS suavemente desde muestras pueden ser fácilmente atrapadas y atadas a la punta de la pipeta.

4. evaluación de la extracción de células de tejido decellularized

  1. Fijar las muestras en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos, 1 muestra por pozo, añadiendo 1 mL de tampón neutro recién hecha de formalina al 10% con eosina acuosa 0,03% por 2.5-3 h a TA.
    Nota: Eosina se agrega al fijador para teñir los tejidos decellularized y para facilitar la visualización de la muestra durante el seccionamiento y la coloración histológica. La adición de la eosina que ni interfieren con las manchas histológicas ni con técnicas de inmunofluorescencia. Por otra parte, la fijación puede realizarse durante la noche a 4 ° C.
  2. Retirar la solución fijadora y añadir 1 mL de PBS 1 x a lavar la muestra.
  3. Encapsular el bioscaffolds fijo en procesamiento histología gel usando un molde de muestra desechables de vinilo según las instrucciones del fabricante.
  4. Retirar el gel de la histología con la muestra incrustada del molde y la transferencia a biopsia procesamiento/incrustación Cassettes con tapa.
    Nota: Una alternativa al tejido de incrustar en la histología y tratamiento gel es para procesar cada muestra en dos esponjas de biopsia con poros pequeños. Las muestras deben localizarse en el centro de las esponjas de la biopsia para habilitar la detección. De nota, algunas muestras pueden ser difíciles de localizar utilizando este enfoque.
  5. Procesar las muestras de parafina inclusión a través de incubaciones sucesivas (30 min por solución) en serie de concentraciones de alcohol (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), solución de hidrocarburo alifático isoparaffinic (2 estaciones de incubación) y parafina (incubación 2 estaciones) a 56 ° C.
  6. Montar las muestras en un bloque de parafina.
  7. Cortar 3 tramos de parafina μm de espesor en un micrótomo y recoger las secciones sobre portaobjetos de vidrio.
  8. Secciones de la parafina seca durante la noche a 37 ° C.
    Nota: Las secciones de parafina (pausa punto) se almacenan a 4 ° C hasta su uso posterior.
  9. Para verificar la eficacia del Protocolo, realizar hematoxilina y eosina (H & E) y TRICROMICA de Masson (TM) la coloración de las secciones de la muestra decellularized y a las secciones de tejido no manipulados según las instrucciones del fabricante.
    Nota: H & E tinción manchas celular núcleos azul/violeta, citoplasma rosado/rojo oscuro y colágeno pálido rosado y MT las manchas negras de los núcleos, citoplasma rojo y colágeno y mucina azul. Descelularización eficiente se logra cuando un poroso rosa (H & E, MT) y se observa red azul (MT), en ausencia de una tinción nuclear.

5. evaluación de remoción de material nuclear de tejido decellularized

Nota: Debe realizarse la cuantificación del contenido de ADN en el tejido decellularized en comparación con el tejido respectivo no manipulado.

  1. Antes de descelularización, pesar un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL en una balanza digital de alta precisión. Transferir el tejido cardiaco al tubo, retire la cantidad extra de 1 x PBS y pese el tubo con las muestras. Calcular el peso húmedo de las muestras:
    Pesohúmedo = peso del tubo con muestras – peso tubo vacío
  2. Decellularize las muestras como se describe en el paso 3.
  3. Después de descelularización, recoger los tejidos decellularized en un tubo de microcentrífuga.
    1. Debido a las pequeñas dimensiones y masa de las muestras individuales cardiacas y kit especificaciones, piscina decellularized los tejidos de cada condición de la muestra (corazón fetal: 5 corazones enteros; adultos LV de explantes: 15 explantes). Realizar el mismo procedimiento con el tejido no manipulado.
      Nota: (Punto de pausa) las muestras pueden ser almacenadas a-20 ° C hasta que se realizaron la extracción de ADN y cuantificación.
  4. Corte no manipulados y decellularized los tejidos de explantes pequeños con la ayuda de un bisturí en una caja de Petri limpia.
    Nota: Use un bisturí individual y un plato de Petri por cada muestra. Alteración mecánica de las muestras con un bisturí facilita su posterior digestión enzimática y posterior extracción de ADN.
  5. Para la extracción de ADN, usar un método de extracción de ADN de vuelta-columna base según las instrucciones del fabricante.
    1. Recolectar las muestras mecánicamente disociadas de la placa de Petri con el tampón de digestión principal (tampón de digestión y proteinasa K) según las instrucciones del fabricante utilizando una pipeta de amplio orificio.
      Nota: Lisis de tejido con digestión proteinasa K es más rápido en las muestras de decellularized. Para procesar muestras distintas al mismo tiempo, mantener las muestras sometidas a lisis en hielo, hasta que todas las muestras son sometidas a lisis para minimizar la degradación. Lisis de muestras completas se logra entre 4-6 h.
    2. Proceder con el protocolo según las instrucciones del fabricante.
    3. Para aumentar los rendimientos de ADN extraído de muestras de tejido decellularized y no decellularized, eluir el ADN en 25-50 μL y 100 μL de tampón de elución, respectivamente. Recoger el ADN eluído y carga la columna de vuelta. Incubar durante 1 min a RT. centrifugar las muestras según las instrucciones del fabricante.
      Nota: (Pausa punto) el ADN extraído de las muestras puede almacenar a-20 ° C hasta su uso posterior.
  6. Cuantificar el ADN extraído de las muestras con un kit de detección fluorescente dsDNA siguiendo las instrucciones del fabricante.
  7. Normalizar el contenido de ADN como nanogramos de ADN por miligramo de peso húmedo de la muestra inicial (antes de descelularización).

6. celular de andamios decellularized siembra

Nota: Todos los reactivos/soluciones tienen que ser estériles y todo el procedimiento se realiza en condiciones estériles.

  1. Preparar 1 x DPBS con 2.5 μg/mL de anfotericina B y el 1% P/S (100 U.I. penicilina, estreptomicina 100 μg/mL).
  2. Retire la solución PBS 1 x del última descelularización lavado paso (3.3.3) y agregar 500 μL por pocillo de la recién preparado 1 x DPBS/2.5 μg/mL de anfotericina B/1% P/S solución. Almacenar las muestras a 4 ° C de 1-7 días.
    Nota: Almacenamiento de las muestras a 4 ° C es importante para mantener la esterilidad.
  3. Agregar P/S para celular media basal (sin FBS y suplementos) a una concentración final de 1%.
  4. Aspire 1 x DPBS/2.5 μg/mL de anfotericina B/1% P/S solución de las muestras decellularized. Añadir 500 μL por pocillo de célula basal media/1% P/S y dejar muestras equilibre durante 1 h a 37 ° C o a 4 ° C por más de 1 h.
  5. Dividir las celdas de interés y preparar pequeñas alícuotas de células en la densidad celular deseado.
    Nota: La siembra de decellularized tejido debe realizarse en un microscopio estereoscópico y en condiciones estériles. Medios de cultivo celular debe contener 1% P/S.
  6. Pipetear 3-4 μL de DPBS al centro de un pozo de una placa de 96 pocillos. Con unas pinzas finas y rectas, los andamios decellularized de transferencia a la caída DPBS, quitar la DPBS extra por aspiración y asegúrese de que la muestra no está doblada o arrugada. Que se convierten en los bordes se adhieran a la superficie bien seca.
    Nota: Andamios separados tienen menor eficiencia de siembra.
  7. Añadir las células al andamio mediante pipeteo la solución sola célula lentamente contra los bordes del pozo.
    Nota: por ejemplo, cardiomiocitos neonatales de rata son sembradas con a una densidad de 7.500 células/mm2 y ratón inmortalizado Lin− Sca-1+ cardiaco las células progenitoras (CIPCSca-1) con una densidad de 60 1.500 células/mm2. Ajustar la densidad de célula según la lógica experimental.
  8. Añadir DPBS a los pozos vecinos para evitar la evaporación rápida de los medios de comunicación.
  9. 24 horas post siembra celular, si el tipo de célula utilizado adherido a las placas de poliestireno de cultivo de tejidos (TCPS), transfiere bioscaffolds a un nuevo pozo. En caso contrario, sustituir el medio para eliminar las células no adherentes.
  10. Cambie cuidadosamente los medios según los requisitos específicos del tipo de la célula.

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Representative Results

La eficacia de la descelularización debe evaluarse a través de tres técnicas principales: observación macroscópica, la histología y la cuantificación de ADN. El aspecto macroscópico de las muestras post-SDS de trato afecta indirectamente la eficacia de la eliminación de la célula. Después de la incubación de la SDS, las muestras deben aparecer como transparente a blanquecino (figura 1). Fetal (E18) decellularized tejidos se caracterizan por una estructura altamente translúcida explantes adultos tienen un aspecto blanco translúcido. Una apariencia más blanca se correlaciona generalmente a una red de ECM exhibiendo mayor fibra y contenido de colágeno, por ejemplo, los vasos ventriculares y vasculares adulto ECM de malla (figura 1). Hematoxilina y eosina (H & E) o manchas de (MT) Trichrome de Masson se realizan para confirmar la eliminación eficiente de la célula por la observación de una malla porosa (rosa claro, H & E, rosa y azul, MT) (figura 1). Además, la mancha de MT destaca la red de colágeno en azul5. Separación del material nuclear después de descelularización se accede por la cuantificación de ADN y una reducción de aproximadamente 99,8% generalmente se obtienen, en comparación con los tejidos no manipulado (figura 1). La presencia de material nuclear en andamios decellularized ha sido descrita como un disparador de la respuesta inflamatoria indeseable sobre implantación14. Por esta razón, confirmación de descelularización eficiente es esencial antes de experimentos de repoblación de andamio 3D nativo. Decellularized andamios pueden almacenarse en condiciones estériles hasta la siembra con las células de interés. Viabilidad de las células es controlada a través de cultivo in vitro por calceína tinción (figura 2A). Sin embargo, mancha de calceína puede ser citotóxica para los tipos de células sensibles. Análisis terminal de repoblación celular y distribución a través de andamios son realizado de la parafina de procesamiento; una instantánea de la repoblación de bioscaffold por H & E tinción en una sección central de bioscaffolds se muestra (figura 2B, 2C).

Figure 1
Figura 1. Fetal (E18) y procedimiento de la descelularización de tejido cardiaco adulto y confirmación de la eficacia de descelularización. Resumen del Protocolo de (A) . (B) protocolo de descelularización detallado. (C) Análisis macroscópico de tejido fetal y adulto cardiaco antes y después de descelularización. Barra de escala: 2 mm. (D) cuantificación de material nuclear en decellularized versus tejido no manipulado. Datos expresados como media ± de prueba t de Student SEM., dos colas * p < 0.05. (E) H & E y de Masson Trichrome el análisis histológico de tejido cardiaco fetal y adulto antes y después de descelularización. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Análisis de la repoblación de andamios decellularized con Lin - Sca-1+ línea de células cardiacas progenitoras (CIPCSca-1). (A) viabilidad celular alta observada en superficie de andamios durante el cultivo in vitro por la mancha de calceína (verde). Barra de escala: 100 μm. (B) numero de celular y distribución a través de andamios evaluadas por tinción H & E. Barra de escala: 100 μm. (C) vista ortogonal de las células en el ECM decellularized. Imagen confocal de parafina de 50μm de espesor. Barra de escala: (vista ortogonal XZ, YZ) de 10 μm y 40 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Paso Observación Razón posible Problema Solución
3.1.2. Tejido con un color marrón Muestra criofijación; temperatura de congelación inestable Muestra criofijación conducirá a la eliminación ineficiente de proteínas citoplasmáticas Almacenar tejido congelado durante períodos más cortos. Comprobar la estabilidad y la temperatura del congelador
3.2.4. Muestras opacas de color de rosa a blanco Solución de SDS no estaba bien preparado; explantes de LV adultos demasiado grande Eliminación ineficiente de proteínas citoplasmáticas Asegurar la disolución completa de la SDS. Decellularize las muestras de menor tamaño.
3.3.4. Muestras con una apariencia de gelatina Extracción de ADN ineficiente Separación material nuclear ineficaz Aumentar el tiempo de concentración o incubación de DNasa.
4.6. Compactación del gel de la histología Largo tiempo de espera en PBS1X y etanol antes de la transformación de parafina Alteración de la estructura del tejido decellularized Inicio histológica procesamiento tan pronto como sea posible
6.6. Secado de muestras decellularized Las muestras se dejaron secar durante mucho tiempo Permanente colapso de los tejidos decellularized. Celular ineficaz siembra Muestras ligeramente seco solamente en la periferia con el fin de apegarse a la parte inferior del pozo durante la siembra
6.7. Decellularized muestra la separación durante la siembra Las muestras no eran suficientes secado antes de la siembra Celular ineficaz siembra Aumentar el tiempo de secado de ECM para permitir la mejor adherencia antes de la siembra de la célula

Tabla 1. Mesa de resolución de problemas de descelularización paralela de tejido cardiaco de ratón adulto y fetal (E18).

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Discussion

La matriz extracelular (ECM) es una red altamente dinámica y compleja de glicoproteínas fibrosas y adhesivas, que consiste en un depósito de numerosos péptidos bioactivos y atrapado los factores de crecimiento. Como importante modulador de la adhesión celular, dinámica del citoesqueleto, movilidad y migración, proliferación, diferenciación y apoptosis, ECM regula activamente el comportamiento y función celular. Sabiendo que el comportamiento celular difiere en 2D y 3D de las culturas, se han hecho esfuerzos para desarrollar modelos de novela organotypic que exactamente pueden replicar entornos naturales de los tejidos. En los últimos años, descelularización de tejidos ha surgido como una técnica alternativa para la medicina regenerativa e Ingeniería del tejido. Así, la descelularización de órganos y tejidos es actualmente la herramienta de elección para mejor disecar tejidos específicos parámetros microambiental (bioquímicos, estructurales y mecánicos) y la actividad biológica in vitro e in vivo.

Hemos desarrollado un protocolo que combina el uso de un tampón hipotónico con un detergente de características de surfactante aniónico seguido de un tratamiento de DNasa5,12,13. El presente Protocolo constituye un método simple y reproducible para efectuar el análisis comparativo entre el tejido cardiaco fetal y adulto decellularized del ratón. Nuestra experiencia con otros tejidos, es decir, con las muestras de tumor derivadas de resecciones quirúrgicas de pacientes con cáncer y el tejido de pulmón de ratón, muestra que este protocolo es fácilmente adaptable y exitosa en otras condiciones y modelos12,13. La aplicación del mismo procedimiento de descelularización en diferentes muestras permite estudios comparativos de la composición de ECM, propiedades biomecánicas, arquitectura y propiedades moduladores celulares en un contexto 3D.

Uno de los retos más difíciles de la descelularización de tejido es el equilibrio entre la eliminación absoluta de la célula, ECM red preservación y biocompatibilidad de tejido. Por lo tanto, varios pasos críticos deben considerarse con cuidado, como el tiempo de crioconservación de tejido antes de descelularización, el tamaño de explante correcto, el uso de soluciones frescas y la manipulación de los tejidos decellularized final. Durante nuestros estudios, observamos una correlación directa entre el tiempo de almacenaje largo del tejido criopreservado y el uso de soluciones de SDS desde hace mucho tiempo con ineficiencia de descelularización. Almacenamiento de tejidos a largo plazo conduce a restos de prestación ineficiente remoción contenido celular de espesor áreas celulares (sin núcleo) entre el complejo entramado de ECM. Un efecto indeseable similar se alcanza cuando mucho tiempo almacenadas soluciones de SDS se utilizan para descelularización de tejido, probablemente porque SDS soluciones tienen una corta estabilidad debido a la reducida solubilidad, hidrólisis y alteraciones de pH en tiempo15,16 . El uso de explantes del tamaño correcto (~1.5 mm x 1,5 x 1,5 mm) también es esencial para descelularización de tejido adulto exitoso, puesto que grandes resecciones de tejido son más difíciles de decellularize, mostrando restos de células atrapadas en la superficie y detenido entre la densa red de ECM. Aunque este protocolo proporciona un método eficiente de descelularización de tejido cardiaco, una fracción menor de explantes adultos puede presentar restos de células, en particularlos de mayor tamaño. El análisis histológico de las muestras facilita su identificación y posterior exclusión del estudio. En definitiva, el Protocolo adjunto es versátil y fácilmente aplicables a los distintos especímenes con leves ajustes en el tamaño de explantes de tejido, concentración de SDS (0.1-0.2% SDS) o solución incubación tiempo5,12,13 .

La limitación principal del presente método es que la manipulación de muestras de pequeño tamaño, es decir, murino corazón fetal y adulto corazón explantes, requiere algunas habilidades de manipulación. De hecho, los tejidos decellularized fetales y adulto son delicadas estructuras que pueden ser permanentemente deformadas cuando secos durante el procedimiento o atrapados por la punta fina o durante la manipulación con pinzas5.

La novedad principal de este protocolo, además de la descelularización paralelo de corazón de ratón fetal y adulto ventrículo izquierdo explantes para la evaluación comparativa de la composición del ECM (análisis biomecánicos) y función biológica asociada, es su sencilla traducción a distintos tejidos y modelos5,12,13. La descelularización de tejidos de distintas edades, aplicando metodología estandarizada fue descrito solamente en el riñón de mono rhesus y las secciones transversales de los tejidos fetales, neonatales y adultos, que fueron sometidos a un tratamiento de SDS 1% durante 10 días6 . En un entorno cardiaco, aunque fetal, neonatales y adulto los tejidos han sido decellularized, los métodos difieren en el grado de desalojo mecánico, las concentraciones de SDS y tiempo de aplicación7,8. Cada procedimiento de descelularización afecta al ECM de una manera única, la comparación de decellularized muestras obtenidas de diferentes protocolos puede conducir a conclusiones engañosas. Por lo tanto, aplicando el mismo procedimiento de descelularización a través de diferentes muestras permite análisis comparativos confiables.

La gran mayoría de los tejidos decellularized disponibles en el mercado provienen de ejemplares adultos17. A pesar del reconocimiento creciente de una mayor capacidad de microambientes fetales en la provisión de señales pro renovables en comparación con sus contrapartes adultas, descelularización de tejidos fetales se informó sólo en pocos estudios5, 7 , 18 , 19 , 20 , 21. dinámica de ECM de comprensión durante el proceso de envejecimiento será crucial para identificar las características únicas de microambientes pro renovables que, a su vez, afectará el desarrollo de la mayor eficiencia de materiales biomiméticos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores están en deuda con todos los miembros del laboratorio de Pinto-Ó relevante discusión crítica. Este trabajo fue apoyado por el Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) en el proyecto "ingeniería CARDIOSTEM los tejidos cardiacos y terapias basadas en células madre para aplicaciones cardiovasculares" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. es un beneficiario de una beca FCT [SFRH/BD/88780/2012] y M.J.O. es miembro de la FCT (FCT-investigador 2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker Orbital Shakers IKA:3510001 Recommended
Fluorimeter - - Equipment available
Digital weight scale - - Equipment available
Inverted Microscope - - Equipment available
Cell culture incubator - - Equipment available
Fridge (4ºC) - - Equipment available
Deep freezer (-80ºC) - - Equipment available
Microtome - - Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge Fine Science Tools 5000-08 Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11254-20 Recommended
Dumont 7 forceps Fine Science Tools 11272-30 Recommended
Dissecting Scissors, straight - - Tool available
Forceps, serrated, curved - - Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped VWR 29442-044 -
96 well plates, individually wrapped VWR 71000-078 -
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized Millipore SE1M179M6 -
Eppendorff - - Material available
15 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430791 -
50 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430829 -
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid Electron Microscopy Science 70075-B -
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 22-037-246 -
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006 -
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) Sigma-Aldrich 277258-1L -
Dry ice - - -
Decellularization
NaCl BDH Prolabo 27810.364 -
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S-31264 -
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-100g -
KCl Sigma-Aldrich P8041-1KG -
TrisBASE Sigma-Aldrich T6066-500G -
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L-4390 -
MgCl2 MERCK 1.05833.1000 -
DNAse I AplliChem A3778,0050 -
Gentamicin Gibco 15710-049 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Deionized water (DI water) - - -
Histology
10 % formalin neutral buffer Prolabo 361387P -
Eosin Y AQUEOUS Surgipath 01592E Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 -
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous Aga 4,006,02,02,00 -
Deionized water (DI water) - - -
Clear Rite 3 Richard-Allan Scientific 6915 -
Shandon Histoplast Thermo Fisher Scientific RAS.6774006 -
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific K182001 -
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit Invitrogen P11496 -
Cell culture
DPBS VWR 45000-434 -
Penicillin-Streptomycin Solution 100X Labclinics L0022-100 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Cell culture media of the cell of interest - - -

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References

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Bioingeniería número 145 descelularización matriz extracelular andamios 3D corazón fetal corazón adulto ingeniería del tejido fino cardiaco

Erratum

Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 04/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

Descelularización comparable de explantes de tejido cardíaco Fetal y adulto como 3D-como plataformas para estudios In Vitro
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Silva, A. C., Oliveira, M. J.,… More

Silva, A. C., Oliveira, M. J., McDevitt, T. C., Barbosa, M. A., Nascimento, D. S., Pinto-do-Ó, P. Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (145), e56924, doi:10.3791/56924 (2019).

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