Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Jämförbara Decellularization av Fetal och vuxen hjärtvävnad bladsticklingar som 3D-liknande plattformar för i studier

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/56924
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,5, 4,6, 1,2,3, 1,2, 1,2,3
1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4Gladstone Institute of Cardiovascular Disease, 5Faculty of Medicine, University of Porto, 6University of California San Francisco

ERRATUM NOTICE

Summary

Den kardiella extracellulär Matrixen (ECM) är ett komplext nätverk av molekyler som dirigera nyckelprocesser i vävnader och organ medan bestående fysiologiska remodeling under hela livet. Standardiserade decellularization av fostrets och vuxna hjärtan tillåter jämförande experimentella studier av båda vävnader i ett 3D sammanhang genom att fånga inhemska arkitekturen och biomekaniska egenskaper.

Abstract

Nuvarande kunskaper om extracellulär matrix (ECM)-cellkommunikation översätts till stora tvådimensionell (2D) in vitro-kulturstudier där ECM komponenter presenteras som en ytbeläggning. Dessa kultur-system utgör en förenkling av den komplicerade karaktären av vävnad ECM som omfattar biokemiska sammansättning, struktur och mekaniska egenskaper. För att bättre efterlikna den ECM-cell kommunikation forma den kardiella mikromiljö, utvecklade vi ett protokoll som möjliggör decellularization hela fostrets hjärta och vuxen vänster kammare vävnad explants samtidigt för jämförande studier. Protokollet kombinerar användandet av en hypoton buffert, ett tvättmedel av anjoniska ytaktiva egenskaper och DNAS behandling utan några krav för specialiserad kompetens eller utrustning. Tillämpningen av samma decellularization strategi över vävnadsprover från försökspersoner i olika ålder är en alternativ metod att utföra jämförande studier. Detta protokoll möjliggör identifiering av unika strukturella skillnader över fostrets och vuxen hjärt ECM mesh och biologiska cellulära svar. Dessutom den häri metodik visar ett bredare program tillämpas framgångsrikt i andra vävnader och arter med smärre justeringar, såsom i mänskliga tarmen biopsier och mus lungor.

Introduction

Den extracellulära Matrixen (ECM) är ett dynamiskt nätverk av molekyler som reglerar viktiga cellulära processer, nämligen öde-beslut, proliferation och differentiering1,2. Utredningen av cell-ECM interaktioner har utförts främst i tvådimensionell (2D) i vitro kulturer belagd med ECM komponenter, som utgör en förenkling av infödda ECM boenden i vivo. Decellularization genererar acellulärt 3D-liknande ECM bioscaffolds som i stor utsträckning bevarar extracellulära arkitektur och sammansättningen av infödda vävnader och organ3,4. Förutom att tjäna som bioaktiva ställningar för vävnadsteknik, framträder cell-lösa 3D ECM biomaterial som romanen plattformar att bedöma cell-ECM biologi att parallell Invivo miljön.

Bedömning av ECM komponenter i olika vävnader, organ och ålder differentiell roll kommer att gynna med användning av liknande protokoll generera infödda bioscaffolds. I hjärtat, har vi utvecklat en mångsidig protokoll för decellularization av fetal och vuxen-derived prover, som ett alternativ att utföra jämförande studier av den orgel mikromiljö. Användningen av denna metod, vi fångas den infödda hjärt närmiljön och visade att fostrets ECM främjar högre återinsättning avkastning av hjärtats celler5. Decellularization föreskrivs ytterligare identifiering av bosatta strukturella skillnader mellan foster och vuxen ECM i nivå med källaren lamina och pericellulär matrix mesh arrangemang och fiber sammansättning5. Före detta arbete, har head-to-head jämförelse av vävnader i olika ontogenic skeden med samma decellularization synsätt endast rapporterats för Rhesusapa njurar och gnagare hjärtan. Ett begränsat antal studier uppger dessutom fostrets vävnad/organ decellularization i sig.5,6,7. Detta har uppnåtts med SDS som en unik decellularization agent; dock användes distinkta SDS koncentrationer för decellularization av fetal och vuxen hjärtvävnad7,8. SDS är en av de mest effektiva joniskt rengöringsmedel för clearance av cytoplasmisk och nukleära material och används allmänt i decellularization av olika vävnader och exemplar9,10. Lösningar som innehåller hög koncentration av SDS och längre perioder av exponering har korrelerats med protein denaturering, glykosaminoglykan (gag) förlust och störningar av kollagen fibriller10,11, och därför en balans mellan bevarande och cell borttagning av ECM är nödvändig. Tillämpa samma förfarande på fostrets och vuxen hjärta vävnad genom det protokoll som beskrivs häri är uppdelad i tre sekventiella steg: cell lysis av osmotiska chock (hypotoniska buffert); lösbarhet av lipid-protein, DNA-protein och protein-protein interaktioner (0,2% SDS); och kärnkraft materialförlust (DNAS behandling).

Våra protokoll visar flera fördelar: jag) möjligheten att motsvarande decellularization av Åldersspecifik hjärt vävnader genom tillämpning av samma decellularization strategi; (II) inga krav på specialiserade metoder eller utrustning; (III) redo anpassning till andra vävnader och arter som det har tillämpats framgångsrikt med mindre ändringar i mänskliga tarmen biopsier12 och mus lung13; och, ännu viktigare, iv) kan adressera ECM biomekaniska egenskaper samtidigt som man möjliggör montering av 3D-liknande organotypic kulturer att mer noga härma molekylär funktioner i den infödda vävnad mikromiljö.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla de metoder som beskrivs godkändes av den i3S djur etikkommittén och Direção Geral de Veterinária (DGAV) och är i enlighet med det europeiska parlamentet direktiv 2010/63/EU.

1. beredning av decellularization lösningar

Obs: Alla decellularization lösningar bör filtreras genom ett 0,22 μm membranfilter och lagras i högst 3 månader, utom annat specificeras.

  1. För 1 x PBS: blanda 8 g NaCl, 1,01 g av Na2HPO4 200 mg kaliumklorid, och 200 mg av KH2PO4 med 900 mL avjoniserat vatten (DI). Justera lösning pH 7,5 och slutlig lösning volymen upp till 1 L. Filter, autoklav och store lösningen vid rumstemperatur (RT).
  2. Hypoton buffert (10 mM Tris, 0,1% EDTA): Lös 1,21 g TrisBASE och 1 g EDTA i 900 mL avjoniserat vatten. Justera lösningen pH till 7,8 med NaOH/HCl och slutlig lösning volymen till 1 L. Filter, sterilisera i autoklav och lagra på RT.
  3. 0,2% SDS lösning (0,2% SDS, 10 mM Tris): lägga till 0,6 g TrisBASE och 1 g natriumsulfat natriumdodecylsulfat (SDS) i 400 mL DI vatten och röra vid 60 ° C tills fullständig koncentrationsgradient upplösning. Låt lösningen svalna till RT. Justera lösningen pH till 7,8 och slutlig lösning volymen till 500 mL. Sterilisera lösning genom filtrering.
    Obs: SDS lösningen bör förberedas före användning. Filtrera lösningen komplett först efter SDS upplösning, annars SDS olösliga partiklar kommer att mätta filtrera, ändra slutliga SDS koncentration och följaktligen påverkar vävnad decellularization effektivitet.
  4. För hypoton tvättbuffert (10 mM Tris): Blanda 1,21 g av TrisBASE 900 mL DI vatten. Justera lösningen pH till 7,8 och den slutliga volymen till 1 L. Filter, sterilisera i autoklav och lagra på RT.
  5. DNAS behandling (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 U/mL DNase): lös 2.42 g TrisBASE och 2 mL 1 M MgCl2 i 900 mL DI vatten. Justera pH till 7,8 och slutlig lösning volymen till 1 L. Filter och sterilisera lösning av autoklav. Förvaras på RT. lägga till DNAS jag (50 U/mL) före användning.
  6. För DNAS jag stamlösning: förbereda en DNAS buffert innehållande 50% glycerol, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl2, och anpassa sig till en slutlig lösningsvolym på 10 mL med avjoniseratvatten. I en LAF, lägga till den DNAS jag pulver till DNAS bufferten och blanda försiktigt tills fullständig upplösning. Sterilisera lösning genom 0,22 μm filter. Förbereda 1 mL portioner och förvaras vid-20 ° C.

2. vävnad skörd och frysförvaring

  1. Avliva vuxna gravida kvinnor 18 dagar av dräktigheten (E18 foster) via CO2 kvävning. Utföra ett kejsarsnitt på honorna med en kirurgisk sax och samla livmoderns horn försedda fostrets möss till en petriskål med iskall 1 x PBS med två sågtandade pincett med böjda tips (en pincett till slutet av varje horn).
    1. Öppna livmoderns horn och fostersäcken att isolera fostren. Överföra foster till en ny petriskål med iskall 1 x PBS att söva dem och halshugga med en sax.
    2. Euthanize 7-8 veckor gamla manliga C57BL/6 möss använder CO2 kvävning. Utföra ett snitt på varje mus bröstet och samla hjärtat.
    3. Kort skölj fetal och vuxna hjärtan med is kallt 1 x PBS.
  2. Ta bort atria vuxen hjärta med hjälp av en skalpell. Utföra ett snitt på höger kammare och ta bort den med rak liten sax. Utsätta den vänstra ventrikeln inre väggen genom att ta bort septum. I en ny petriskål, dela upp vänstra ventrikeln gratis-väggen i längsgående remsor med 2 mm tjocklek och ta bort papillär muskeln med en skalpell och sågtandade pincett med böjda tips.
    1. Punktskatt små vävnad bladsticklingar med hjälp av en skalpell med ett 2 mm x 2 mm rutnät (detaljerad beskrivning i kompletterande figur 15). Kort skölj vävnad bladsticklingar med 1 x PBS.
  3. Tillsätt ~ 250 µL av den optimala skärtemperatur (ULT) sammansatta Ånghärdad 1,5 mL mikrocentrifug rör. Överför hela fostrets hjärta och vuxen hjärt bladsticklingar till rören med 250 µL av OCT och frysa dem med torr iskylda isopentan och förvaras vid-80 ° C (max 6 månader).
    Obs: Användningen av hjärtvävnad bladsticklingar mer än 6 månader i fryst tillstånd kommer att avsevärt minska decellularization effektivitet, särskilt i de vuxna hjärta vävnad bladsticklingar.

3. vävnad decellularization

Obs: Hjärt vävnad decellularization utförs i en 24-väl vävnadsodling tallrik med ett prov per brunn. 1 mL av varje decellularization lösning läggs till varje individ väl. Alla decellularization åtgärder ska utföras med agitation vid 165 rpm (inkubator shaker med en orbital diameter 20 mm) och vid 25 ° C, såvida inte annat anges. För mer information, kontakta ordningen på figur 1A. Amfotericin B (e.g. fungizone) och gentamicin läggas nymalen till alla decellularization lösningar före användning till en slutlig koncentration på 2,5 μg/mL och 0,01 μg/mL, respektive. Att kvantifiera mängden DNA kvar inom cell-lösa vävnader, prov massa behov som skall fastställas innan protokollet decellularization. DNA kvantifiering protokollet är ytterligare detaljerad i avsnitt 5.1.

  1. DAG 1
    1. Ta bort vävnadsprover från-80 ° C frysen. Lämna den 1,5 mL mikrocentrifugrör vid RT tills OCT blir delvis smält. Överföra hjärtvävnad blocket fortfarande frysta ULT till en petriskål med 1 x PBS.
    2. Efter ULT smälter, flytta hjärtvävnad till en ny petriskål med 1 x PBS. Tvätta prover i 1 x PBS och vid 60 rpm med en shaker för 10-15 min. Upprepa minst två gånger.
    3. Tillsätt 1 mL arbetar hypoton buffert per brunn sterila 24-väl vävnadsodling platta. Överföra ett prov per brunn med hjälp av tången.
    4. Flytta 24-väl vävnadsodling plattan med prover till en inkubator shaker vid 25 ° C och startar 18 h inkubering med hypoton buffert.
  2. DAG 2
    1. Förbereda 0,2% SDS lösningen som beskrivs i avsnitt 1.3.
    2. Aspirera hypoton bufferten och tvätta av prov med 1 x PBS under 1 h. Upprepa 3 gånger.
      Obs: Paus punkt: vävnaden under decellularization kan förvaras i 1 x PBS vid 4 ° C för 18 h under statiska förhållanden.
    3. Ta bort 1 x PBS, tillsätt 1 mL av nygjorda SDS stopplösningen (steg 1.3) per brunn och inkubera prover för 24 h.
      Obs: (CHECK POINT) Post SDS inkubation, se till att prover uppvisar ett vitt till genomskinligt utseende. I detta steg, SDS behandlade prover är dränkt i DNA, visar en gelatin-liknande konsistens. Ta bort SDS lösningen långsamt för att undvika prov vidhäftning till pipettspetsen.
  3. DAG 3
    1. Tvätta av prov med hypoton tvätta buffert (1 mL per brunn) för 20 min. Upprepa 3 gånger.
      Obs: I detta steg, det är normalt att iaktta en minskning av urvalets storlek på grund av borttagning av cell rester. Pausa punkt: Vävnaden under decellularization kan hållas i hypoton tvättbuffert vid 4 ° C för 18 h under statiska förhållanden.
    2. Tillsätt 1 mL DNAS behandling lösning per brunn och inkubera proverna för 3 h vid 37 ° C.
    3. Aspirera DNAS behandling lösningen och tvätta av prov med 1 x PBS (1 mL per brunn) för 20 min. Upprepa 3 gånger. Utföra en sista tvätt med 1 x PBS (1 mL per brunn) över natten vid RT och skakar vid 60 rpm.
    4. (Check point) Efter DNAS behandling, se till att de cell-lösa proverna har förlorat den gelatin-liknande konsistensen.
      Obs: Efter DNAS behandling, ta bort och lägga till 1 x PBS försiktigt eftersom prover kan enkelt anhållna och bifogas pipettspetsen.

4. bedömning av cell-lösa vävnad cell borttagning

  1. Fixa proverna i en 24-väl vävnadsodling tallrik, 1 prov per brunn, genom att tillsätta 1 mL nygjorda 10% formalin neutrala buffert med 0,03% aqueous eosin för 2,5-3 h på RT.
    Obs: Eosin läggs till fixeringsvätskan fläcken cell-lösa vävnaden och underlätta prov visualisering under snittning och histologiska färgning. Tillägg av den eosin varken interfererar med histologiska fläckar heller med immunofluorescens tekniker. Alternativt, fixering kan göras över en natt vid 4 ° C.
  2. Ta bort fixativ lösningen och tillsätt 1 mL 1 x PBS att tvätta provet.
  3. Kapsla in den fasta bioscaffolds i histologi bearbetning gel med en disponibel vinyl preparatet mögel enligt tillverkarens anvisningar.
  4. Histologi gelen med provet inbäddade från mögel och överföring till biopsi bearbetning/Embedding kassetter med lock.
    Obs: Ett alternativ till vävnad inbäddning i histologi och bearbetning gel är att bearbeta varje prov i två biopsi svampar med små porer. Proverna bör vara lokaliserade till mitten av de biopsi svampar att aktivera identifiering. Notera kan några prover vara svårt att lokalisera använder denna metod.
  5. Bearbeta proverna för paraffin inbäddning genom successiva inkubationer (30 min per lösning) i rad alkohol koncentrationer (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), isoparaffinic alifatiskt kolväte lösning (2 inkubation stationer) och paraffin (2 inkubation stationer) på 56 ° C.
  6. Montera proverna i ett paraffin-block.
  7. Skär 3 μm tjock paraffin avsnitt på en mikrotom och samla avsnitten på glas objektglas.
  8. Torr paraffin avsnitt över natten vid 37 ° C.
    Obs: (Paus punkt) Paraffin avsnitt lagras vid 4 ° C tills vidare användning.
  9. Kontrollera protokollet effektivitet, utföra Hematoxilin och Eosin (H & E) och Masson's Trichrome färgning (MT) av avsnitten cell-lösa prov och att delar av icke-manipulerade vävnader enligt tillverkarens anvisningar.
    Obs: H & E färgning fläckar cell atomkärnor blå/lila, cytoplasman mörk rosa/röd och kollagen blekt rosa och MT fläckar atomkärnor svart, cytoplasman röd, och kollagen och mucin blå. Effektiv decellularization uppnås när en porös ljusrosa (H & E, MT) och blå (MT) nätverk observeras, i avsaknad av en nukleär fläck.

5. bedömning av cell-lösa vävnad nukleära materiell borttagning

Obs: Kvantifiering av DNA innehållet på cell-lösa vävnad måste utföras i jämförelse med respektive icke-manipulerade vävnaden.

  1. Innan decellularization, väga ett 1,5 mL mikrocentrifug rör i hög precision digital skala. Överföra hjärtvävnad till röret, ta bort den extra mängden 1 x PBS och väga röret med proverna. Beräkna den våt vikten av proverna:
    Provavåt vikt = vikt tube med prover – vikt Tom tube
  2. Decellularize proverna som beskrivs i steg 3.
  3. Efter decellularization, samla in cell-lösa vävnader i en mikrocentrifug rör.
    1. På grund av den små dimensioner och massa individuella hjärt prover och kit specifikationer, pool cell-lösa vävnader i varje prov villkor (fostrets hjärta: 5 hela hjärtan; vuxen LV bladsticklingar: 15 bladsticklingar). Utför samma procedur med den icke-manipulerade vävnaden.
      Obs: (Paus) proverna kan vara lagras vid-20 ° C tills DNA-extraktion och kvantifiering utförs.
  4. Skär den icke-manipulerade och cell-lösa vävnader i små bladsticklingar med en hjälp av en skalpell i en ren petriskål.
    Obs: Använd en enskilda skalpell och petriskål för varje prov. Mekaniska störningar av proverna med en skalpell underlättar deras bakre enzymatisk nedbrytning och efterföljande DNA-extraktion.
  5. För DNA-extraktion, Använd en spin-kolumnbaserade DNA extraktion enligt tillverkarens anvisningar.
    1. Samla de mekaniskt dissocierade proverna från petriskål med master matsmältningen bufferten (matsmältning buffert och proteinas K) enligt tillverkarens anvisningar med hjälp av en bred öppning pipettspetsen.
      Obs: Vävnad lysis med proteinas K matsmältningen är snabbare i cell-lösa prover. För att bearbeta olika prover på samma gång, håll lyserat prover på is, tills alla prover är lyserat för att minimera nedbrytning. Kompletta prover lysis uppnås mellan 4-6 h.
    2. Fortsätt med protokollet enligt tillverkarens instruktioner.
    3. För att öka halterna av extraherat DNA av cell-lösa och icke-cell-lösa vävnadsprover, eluera DNA på 25-50 μL och 100 μL av eluering buffert, respektive. Samla de eluerade DNA och ladda spin-kolumnen. Inkubera i 1 min på RT. Centrifugera proverna enligt tillverkarens anvisningar.
      Obs: (Paus punkt) The DNA extraheras från proverna kan vara förvaras vid-20 ° C tills vidare användning.
  6. Kvantifiera den extraherat DNA prover med ett fluorescerande dsDNA upptäckt kit följa tillverkarens instruktioner.
  7. Normalisera det DNA-innehållet som nanogram av DNA per milligram av utfallsprov våtvikt (före decellularization).

6. cell-lösa ställningar cell sådd

Obs: Alla lösningar/reagens måste vara sterila och hela förfarandet utförs under sterila förhållanden.

  1. Förbereda 1 x DPBS med 2,5 μg/mL av amfotericin B och 1% P/S (penicillin, 100 IE; streptomycin 100 µg/mL).
  2. 1 x PBS lösning ta bort det sista decellularization tvätt steget (steg 3.3.3) och tillsätt 500 μl per brunn av nylagade 1 x DPBS/2,5 μg/mL amfotericin B/1% P/S lösning. Lagra prover vid 4 ° C från 1-7 dagar.
    Obs: Prover lagring vid 4 ° C är viktigt att upprätthålla sterilitet.
  3. Lägg till P/S till cell basala media (utan FBS och kosttillskott) till en slutlig koncentration av 1%.
  4. Aspirera 1 x DPBS/2,5 μg/mL amfotericin B/1% P/S lösning cell-lösa prover. Tillsätt 500 μl per brunn av cell basala media/1% P/S och låt prover jämvikta för 1 h vid 37 ° C eller vid 4 ° C för mer än 1 h.
  5. Dela celler av intresse och förbereda små delprover av celler vid cell densiteten önskas.
    Obs: Den cell-lösa vävnad sådd måste utföras under en stereoskopisk Mikroskop och i sterila förhållanden. Cell kulturmassmedia bör innehålla 1% P/S.
  6. Tillsätt 3-4 μL DPBS till mitten av en brunn av en plattan med 96 brunnar. Med tunt och rakt pincett, överföra de cell-lösa ställningar till DPBS drop, ta bort de extra DPBS genom aspiration och se till att provet inte är vikta eller skrynkliga. Låt det bli torr i kanterna att följa väl ytan.
    Obs: Fristående ställningar har lägre sådd effektivitet.
  7. Lägga till celler till schavotten genom pipettering encelliga lösningen långsamt mot kanterna på brunnen.
    Obs: till exempel neonatal råtta hjärtmuskelcellerna är seedade med med en täthet av 7 500 celler/mm2 och förevigade mus Lin− Sca-1+ hjärt stamceller (iCPCSca-1) vid en densitet av 60-1 500 celler/mm2. Justera cell densiteten enligt experimentella motiven.
  8. Lägga till DPBS till de närliggande brunnarna att undvika snabb media avdunstning.
  9. 24 timmar efter cell sådd, om den celltyp som används följs av vävnadsodling polystyren plattor (TCPS), överför bioscaffolds till en ny brunn. Byt annars ut medlet för att ta bort icke-anhängare celler.
  10. Ändra noggrant media enligt specifika krav av celltyp som.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Decellularization effektivitet bör bedömas genom tre huvudsakliga tekniker: makroskopiska observationer, histologi och DNA kvantifiering. Det makroskopiska utseendet prover post-SDS behandling påverkar indirekt effekten av cell borttagning. Efter SDS inkubation, ska prover visas som halvgenomskinliga till vitaktig (figur 1 c). Fetalt (E18) cell-lösa vävnader kännetecknas av ett högt genomskinligt struktur medan vuxna bladsticklingar har en halvgenomskinliga till vita utseende. Ett vitare utseende i allmänhet är kopplat till ett ECM nätverk uppvisar högre fiber och kollagen innehåll, t.ex. de vuxna ventrikulära och vaskulär fartygen ECM mesh (figur 1 c). Hematoxylin och Eosin (H & E) och/eller Massons trikrom (MT) fläckar utförs för att bekräfta effektiv cell borttagning av observationen av en porös mesh (ljus rosa, H & E; ljus rosa och blå, MT) (figur 1 c). Dessutom belyser MT fläcken den kollagen trabekelverket i blå5. Clearance av kärnämne efter decellularization nås genom DNA kvantifiering och en minskning med cirka 99,8% erhålls generellt, jämfört med icke-manipulerade vävnader (figur 1 c). Förekomsten av kärnämne på cell-lösa ställningar har beskrivits som en utlösare av oönskad inflammatorisk reaktion vid implantation14. Av denna anledning är bekräftelse av effektiv decellularization nödvändigt före infödda 3D byggnadsställning återinsättning experiment. Cell-lösa ställningar kan förvaras i sterila förhållanden upp till sådd med celler av intresse. Cellernas viabilitet övervakas under hela in vitro-kultur av calcein färgning (figur 2A). Dock kan calcein fläcken vara cytotoxiska för känsliga celltyper. Terminal analys av cell återinsättning och distribution över byggnadsställningar är utförda efter paraffin behandling; en ögonblicksbild av den bioscaffold återinsättning bedömas av H & E färgning på en central del av bioscaffolds visas (figur 2B, 2 C).

Figure 1
Figur 1. Fetalt (E18) och adult hjärtvävnad decellularization förfarandet och bekräftelse av decellularization effektivitet. (A) protokollet översikt. (B) Decellularization protokoll detaljerad. (C) makroskopisk analys av fostrets och vuxen hjärtvävnad före och efter decellularization. Skalstapeln: 2 mm. (D) kvantifiering av kärnämne i cell-lösa kontra icke-manipulerade vävnad. Data uttryckta menar ± SEM. Students t-test, tvåsidiga * p < 0,05. (E) H & E och Massons trikrom histologisk analys av fostrets och vuxen hjärtvävnad före och efter decellularization. Skalstapeln: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Återinsättning analys av cell-lösa ställningar som ympats med Lin - Sca-1+ hjärt progenitor cell fodrar (iCPCSca-1). (A) hög cellviabilitet observerats vid ställningar yta under in vitro-kultur av calcein fläcken (grön). Skalstapeln: 100 μm. (B) Cell nummer och distribution över byggnadsställningar bedömas via H & E färgning. Skalstapeln: 100 μm. (C) ortogonala Visa celler inbäddade i cell-lösa ECM. Confocal bild av 50μm tjock paraffin avsnitt. Skalstapeln: 10 μm (ortogonala Visa XZ, YZ) och 40 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Steg Observationen Möjlig orsak Problemet Lösning
3.1.2. Vävnad med en brunaktig färg Prov cryofixation; instabila Frystemperaturen Prov cryofixation kommer att leda till ineffektiv borttagning av cytoplasmatiska proteiner Förvaras fryst vävnad under kortare perioder. Kolla frysen temperatur och stabilitet
3.2.4. Rosa till vit ogenomskinlig prover SDS lösning var inte väl beredd; Adult LV bladsticklingar alltför stora Ineffektiva borttagning av cytoplasmatiska proteiner Säkerställa fullständig SDS upplösning. Decellularize prover av mindre storlek.
3.3.4. Prover med ett gelatin-liknande utseende Ineffektiva DNA borttagning Ineffektiva nukleära material clearance Öka DNAS koncentration eller inkubation tid.
4.6. Histologi gel packning Lång väntetid i PBS1X/etanol innan paraffin behandling Ändring av cell-lösa vävnadsstrukturen Starta histologisk bearbetning så snart som möjligt
6.6. Torkade cell-lösa prover Proverna var kvar för att torka för länge Permanent kollaps av cell-lösa vävnad. Ineffektiva cell sådd Tillåta prover till lite torrt bara i periferin för att bli kopplad till botten av brunnen under sådd
6.7. Cell-lösa prov lossnar under sådd Proverna var inte tillräckligt torkat innan sådd Ineffektiva cell sådd Öka ECM torktid att tillåta bättre följsamhet före cellen sådd

Tabell 1. Felsökning för parallella decellularization av fostrets (E18) och vuxen mus hjärtvävnad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den extracellulära Matrixen (ECM) är en mycket dynamisk och komplex meshwork av fibrösa och självhäftande glykoproteiner, bestående av en reservoar av många bioaktiva peptider och anhållna tillväxtfaktorer. Som den stora modulatorn celladhesion, cytoskelettet dynamics, motilitet/migration, proliferation, differentiering och apoptos reglerar ECM aktivt cellulär funktion och beteende. Att veta att cellulära beteendet skiljer sig i 2D och 3D kulturer, har förekommit insatser för att utveckla nya organotypic modeller som exakt kan replikera naturlig vävnad miljöer. Under de senaste åren, har vävnad decellularization vuxit fram som en alternativ teknik för tissue engineering och regenerativ medicin. Vävnads- och decellularization är således för närvarande verktyget val att bättre dissekera vävnad-specifika microenvironmental parametrar (biokemiska, strukturella och mekaniska) och biologisk aktivitet in vitro- och in vivo.

Vi utvecklade ett protokoll som kombinerar användandet av en hypoton buffert med tvättmedel av anjoniska ytaktiva egenskaper följt av en DNAS behandling5,12,13. Detta protokoll utgör en enkel och reproducerbar metod för att utföra jämförande analys mellan cell-lösa fetal och vuxen mus hjärtvävnad. Vår erfarenhet med andra vävnader, nämligen med tumörprover från cancerpatienters kirurgiska resektioner och mus lungvävnad, visar att detta protokoll är lätt anpassningsbar och framgångsrika i andra villkor och modeller12,13. Ansökan av samma decellularization förfarande på olika prover gör jämförande studier av ECM sammansättning, biomekaniska egenskaper, arkitekturen och cellulära immunmodulerande egenskaper i ett 3D sammanhang.

En av de svåraste utmaningarna av vävnad decellularization är balansen mellan direkta cell borttagning, ECM meshwork bevarande och vävnad biokompatibilitet. Därför behöver flera kritiska steg noga övervägas, såsom tiden för vävnad frysförvaring innan decellularization, rätt explant storlek, användning av färska lösningar och manipulering av den slutliga cell-lösa vävnaden. Under våra studier observerade vi en direkt korrelation mellan lång lagring av frysförvarade vävnad och användningen av långvariga SDS lösningar med decellularization ineffektivitet. Långtidsförvaring vävnad leder till ineffektiva borttagning av cellulära innehåll rendering resterna av tjock cellulära områden (utan kärnor) bland de komplexa ECM trabekelverket. En liknande oönskade effekt uppnås när länge lagrade SDS lösningar används för vävnad decellularization, sannolikt eftersom SDS lösningar har en kort stabilitet tack vare minskad löslighet, hydrolys och pH förändringar över tid15,16 . Användningen av bladsticklingar av rätt storlek (~1.5 x 1,5 x 1,5 mm) är också avgörande för framgångsrik vuxen vävnad decellularization, eftersom större vävnad resektioner svårare att decellularize visar cellfragment anhållna på ytan och arresterade mellan det täta ECM-nätverket. Även om detta protokoll ger en effektiv metod av hjärtvävnad decellularization, får en liten bråkdel av vuxen bladsticklingar presentera cell rester, i synnerhet de av större storlek. Histologisk analys av dessa prover underlättar deras identifiering och efterföljande uteslutning från studien. I slutändan protokollet häri är mångsidig och lätt tillämpliga distinkta exemplaren med smärre justeringar till vävnad explant storlek, SDS koncentration (0,1-0,2% SDS) eller lösning inkubation tid5,12,13 .

Den största begränsningen av denna metod är att manipulering av liten storlek prover, dvs murina fostrets hjärta och vuxen hjärta explants, kräver vissa hantering färdigheter. I själva verket är både fetal och vuxen cell-lösa vävnader känsliga strukturer som kan vara permanent deformerade när torkade under förfarandet eller anhållna av tunn pipettspetsen eller under hantering med pincett5.

Den stora nyheten i detta protokoll, förutom den parallella decellularization av fostrets mus hjärta och vuxen vänster kammare bladsticklingar för jämförande bedömning av ECM sammansättning (biomekaniska analyser) och associerad biologisk funktion, är dess enkla översättning till olika vävnader och modeller5,12,13. Decellularization av vävnader i olika åldrar genom att tillämpa standardiserade metoden beskrevs endast om Rhesusapa njuren och tvärgående avsnitten av Foster, nyfödda och vuxna vävnader, som utsattes för en 1% SDS behandling för 10 dagar6 . I en hjärtats inställning, även om det är Foster, nyfödda och vuxna vävnader har varit cell-lösa, metoderna skiljde sig på graden av mekaniska lossnar, SDS koncentrationer och tid för ansökan7,8. Eftersom varje decellularization procedur påverkar ECM på ett unikt sätt, kan jämförelse av cell-lösa produktproverna olika protokoll leda till missvisande slutsatser. Därför möjliggör tillämpa samma decellularization förfarande över olika prover tillförlitlig jämförande analys.

Den stora majoriteten av de kommersiellt tillgängliga cell-lösa vävnaderna härleda från vuxna exemplar17. Trots det växande erkännandet för en ökad förmåga av fostrets mikromiljö att ge pro-regenerativ signaler i jämförelse med sina vuxna motsvarigheter, rapporterades decellularization av fostervävnad endast i fåtal studier5, 7 , 18 , 19 , 20 , 21. förståelse ECM dynamics under åldrandet kommer att vara avgörande för att identifiera unika funktioner i pro-regenerativ mikromiljö, som i sin tur kommer att påverka utvecklingen av högre effektivitet biomimetiska material.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna är skuldsatta till alla medlemmar i Pinto--Ó laboratorium för relevanta kritiska diskussion. Detta arbete stöds av Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) inom ramen för projektet ”CARDIOSTEM-Engineered hjärt vävnader och stem cell-baserade terapier för kardiovaskulära applikationer” (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. är en mottagare av ett FCT-stipendium [SFRH/BD/88780/2012] och M.J.O. är en FCT Karl (FCT-utredare 2012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubated Benchtop Shaker Orbital Shakers IKA:3510001 Recommended
Fluorimeter - - Equipment available
Digital weight scale - - Equipment available
Inverted Microscope - - Equipment available
Cell culture incubator - - Equipment available
Fridge (4ºC) - - Equipment available
Deep freezer (-80ºC) - - Equipment available
Microtome - - Equipment available
Cirurgical Instruments
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge Fine Science Tools 5000-08 Recommended
Dumont 5 Fine Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11254-20 Recommended
Dumont 7 forceps Fine Science Tools 11272-30 Recommended
Dissecting Scissors, straight - - Tool available
Forceps, serrated, curved - - Tool available
Materials
24 well plates, individually wrapped VWR 29442-044 -
96 well plates, individually wrapped VWR 71000-078 -
Steriflip-GV, 0.22µm, PVDF, Radio-Sterilized Millipore SE1M179M6 -
Eppendorff - - Material available
15 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430791 -
50 mL Falcon tubes Fisher Scientific 430829 -
Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding Cassettes with Lid Electron Microscopy Science 70075-B -
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 22-037-246 -
Tissue cryopreservation
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006 -
2-METHYLBUTANE ANHYDROUS 99+% (isopentane) Sigma-Aldrich 277258-1L -
Dry ice - - -
Decellularization
NaCl BDH Prolabo 27810.364 -
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S-31264 -
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379-100g -
KCl Sigma-Aldrich P8041-1KG -
TrisBASE Sigma-Aldrich T6066-500G -
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L-4390 -
MgCl2 MERCK 1.05833.1000 -
DNAse I AplliChem A3778,0050 -
Gentamicin Gibco 15710-049 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Deionized water (DI water) - - -
Histology
10 % formalin neutral buffer Prolabo 361387P -
Eosin Y AQUEOUS Surgipath 01592E Can be replaced by alcoholic eosin
Richard-Allan Scientific HistoGel Specimen Processing Gel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 -
Ethanol ethilic alcohol 99,5% anydrous Aga 4,006,02,02,00 -
Deionized water (DI water) - - -
Clear Rite 3 Richard-Allan Scientific 6915 -
Shandon Histoplast Thermo Fisher Scientific RAS.6774006 -
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit Thermo Fisher Scientific K182001 -
Quant-iT PicoGreen dsDNA kit Invitrogen P11496 -
Cell culture
DPBS VWR 45000-434 -
Penicillin-Streptomycin Solution 100X Labclinics L0022-100 -
Fungizone Gibco BRL 15290-026 -
Cell culture media of the cell of interest - - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
  3. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13 (1), 27-53 (2011).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).
  5. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Williams, C., Quinn, K. P., Georgakoudi, I., Black, L. D. 3rd Young developmental age cardiac extracellular matrix promotes the expansion of neonatal cardiomyocytes in vitro. Acta Biomater. 10 (1), 194-204 (2014).
  8. Fong, A. H., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Eng Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. Tapias, L. F., Ott, H. C. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Curr Opin Organ Transplant. 19 (2), 145-152 (2014).
  10. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  11. Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27 (19), 3675-3683 (2006).
  12. Pinto, M. L., et al. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 124, 211-224 (2017).
  13. Garlikova, Z., et al. Generation of a close-to-native in vitro system to study lung cells-ECM crosstalk. Tissue Eng Part C: Methods. , (2017).
  14. Wong, M. L., Griffiths, L. G. Immunogenicity in xenogeneic scaffold generation: Antigen removal vs. decellularization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 1806-1816 (2014).
  15. Motsavage, V. A., Kostenbauder, H. B. The influence of the state of aggregation on the specific acid-catalyzed hydrolysis of sodium dodecyl sulfate. J Colloid Sci. 18 (7), 603-615 (1963).
  16. Rahman, A., Brown, C. W. Effect of pH on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulphate. J Appl Polymer Sci. 28 (4), 1331-1334 (1983).
  17. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl Res. 163 (4), 268-285 (2014).
  18. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  19. Whitby, D. J., Ferguson, M. W. The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice. Development. 112 (2), 651-668 (1991).
  20. Brennan, E. P., Tang, X. H., Stewart-Akers, A. M., Gudas, L. J., Badylak, S. F. Chemoattractant activity of degradation products of fetal and adult skin extracellular matrix for keratinocyte progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2 (8), 491-498 (2008).
  21. Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Comparison between human fetal and adult skin. Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).

Tags

Bioteknik fråga 145 Decellularization extracellulär matrix 3D ställningar fostrets hjärta vuxen hjärtat hjärt vävnadsteknik

Erratum

Formal Correction: Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies
Posted by JoVE Editors on 04/23/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies.  The affiliations were updated.

The fourth affiliation was corrected from:

Gladstone Institutes, University of California San Francisco

to:

Gladstone Institute of Cardiovascular Disease

An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:

University of California San Francisco

Jämförbara Decellularization av Fetal och vuxen hjärtvävnad bladsticklingar som 3D-liknande plattformar för i studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silva, A. C., Oliveira, M. J.,… More

Silva, A. C., Oliveira, M. J., McDevitt, T. C., Barbosa, M. A., Nascimento, D. S., Pinto-do-Ó, P. Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies. J. Vis. Exp. (145), e56924, doi:10.3791/56924 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter