Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Enzymatisk Cascade reaktioner för syntesen av kirala Amino alkoholer från L-lysin

Published: February 16, 2018 doi: 10.3791/56926
Automatic Translation
1, 1, 1
1Génomique Métabolique, Genoscope, Institut François Jacob, CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay

Summary

Kirala amino alkoholer är mångsidig molekyler för användning som ställningar i organisk syntes. Start från L-lysin, vi syntetisera amino alkoholer av en enzymatisk cascade reaktion att kombinera diastereoselective C-H oxidation katalyseras av dioxygenas följt av klyvning av den karboxylsyra biexponentiellt av motsvarande hydroxyl aminosyran av en dekarboxylas.

Abstract

Amino alkoholer är mångsidig föreningar med ett brett spektrum av applikationer. Exempelvis har de använts som kiral ställningar i organisk syntes. Sin syntes av konventionella organisk kemi kräver ofta tråkiga flerstegs syntes processer, med svårt kontroll av stereokemiska utfallet. Vi presenterar ett protokoll till enzymatiskt syntetisera amino alkoholer start från den lättillgängliga L-lysin i 48 h. Detta protokoll kombinerar två kemiska reaktioner som är mycket svåra att genomföra av konventionella organisk syntes. I första steget, regio- och diastereoselective oxidation av en oaktiverade C-H bond lysin katalyseras sidokedjan av en dioxygenas; en andra regio- och diastereoselective oxidation katalyseras av en regiodivergent-dioxygenas kan leda till bildandet av de 1,2-dioler. I det sista steget, är karboxylsyror gruppen av alfa aminosyran klyvs av en pyridoxal-fosfat (PLP) dekarboxylas (DC). Detta decarboxylative steg påverkar bara alfa kolet av aminosyran, behålla hydroxi-substituerade stereogenic centrum i beta, gamma ställning. De resulterande amino alkoholerna är därför optiskt berikad. Protokollet tillämpades till semipreparative-skala syntesen av fyra amino alkoholer. Övervakning av reaktionerna genomfördes av högtrycksvätskekromatografi (HPLC) efter derivatisering av 1-fluoro-2,4-dinitrobensen. Okomplicerad rening genom fasta fasen extraktion (SPE) ges de amino alkoholerna med utmärkt avkastning (93% till > 95%).

Introduction

Trots de fördelar som erbjuds av biocatalysis, fortfarande integrationen av biokatalytiska stegen i syntetiska vägar eller totala biokatalytiska vägar mestadels begränsade enzymatisk kinetiska resolutioner. Dessa linjer har använts som ett första steg i asymmetrisk chemo-enzymatisk syntes, men biocatalysis erbjuder många fler möjligheter i funktionell grupp omvandlingar med hög stereoselectivity1,2,3 . Dessutom som biokatalytiska reaktioner genomförs under liknande förhållanden, är det därför möjligt att utföra cascade reaktioner i en one-pot mode4,5.

Kirala amino alkoholer är mångsidig molekyler för användning som assistenter eller ställningar i organisk syntes6. Den amino alkohol biexponentiellt hittas ofta i sekundära metaboliter och aktiva farmaceutiska substanser (API). Primära β-amino alkoholer är lätt tillgängliga från de motsvarande α-amino syrorna av konventionell kemisk syntes, men tillgång till kirala γ-amino alkoholer eller sekundära amino alkoholer kräver ofta tråkiga syntetiska vägar tillsammans med känsliga kontroll av stereokemi7,8,9,10. På grund av dess höga stereoselectivity föreskriva biocatalysis en överlägsen syntetiska rutt till dessa kirala byggstenar11,12,13,14.

Vi har tidigare rapporterat syntesen av mono - och di-hydroxy-L-lysines genom diastereoselective enzymatisk hydroxylering katalyseras av dioxygenases av järn (II) / α-ketoacid-beroende cyklooxygenas familj (αKAO) (figur 1)15. I synnerhet start från L-lysin, den KDO1-dioxygenas katalyserar bildandet av (3S) - hydroxi derivat (1), medan de (4R) - derivat (2) som bildas genom reaktion med KDO2 dioxygenas. Successiva regiodivergent hydroxylations av KDO1 och KDO2 leda till bildandet av (3R, 4R) - dihydroxi - L-lysin (3) i optiskt ren form. Dock hindrar intervallet begränsad substrat för dessa enzymer sin stora användning inom kemisk syntes, särskilt i hydroxylering av enkla aminer, eftersom en karboxylsyra biexponentiellt i α-placera av den amino gruppen är grundläggande för aktivitet16.

Figure 1
Figur 1: biokatalytiska konverteringar av L-lysin. Omvandling till (S3) - hydroxy - L-lysin (1) katalyseras av KDO1 dioxygenas; (4R) - hydroxy - L-lysin (2) katalyseras av KDO2 dioxygenas; och (3R, 4R) - dihydroxi - L-lysin (3) av cascade reaktion katalyseras successivt av KDO1 och KDO2 dioxygenases. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Decarboxylation är en vanlig reaktion i metabolism17. I synnerhet aminosyra DCs (EG 4.1.1) är fritt från kofaktor (pyruvoyl-beroende) eller PLP-beroende enzymer, och katalyserar omvandlingen av aminosyror till de motsvarande polyaminer i bakterier och högre organismer18,19 , 20 , 21 , 22. den mono - dihydroxi föreningar (figur 3) 4–7, 10–11 motsvarar hydroxylerade cadaverine, den diamine erhålls genom decarboxylation av L-lysin. Cadaverine är en viktig byggsten för den kemiska industrin, särskilt det är en komponent av polyamid och polyuretan polymerer. Därför biobaserade produktionen av denna diamine från förnybara resurser har uppmärksammats som ett alternativ till oljebaserade rutten och olika mikroorganismer har konstruerats för detta ändamål. I dessa metaboliska vägar är lysin DC (LDC) det nyckel-enzymet. LDC är en PLP-beroende enzymet tillhör den alanin racemas (AR) strukturella familjära23. PLP-beroende DCs (PLP-DCs) är kända för att vara mycket substrat-specifika. Dock några enzymer äger förmåga att lätt promiskuitet, att vara aktiv mot både L-ornitin och L-lysin aminosyror, som exempelvis LDC från Selenomonas rumirantium (LDCSrum), som har liknande kinetiska konstanter för lysin och ornitin decarboxylation24,25. Detta utökade substrat specificitet gör detta enzym en bra kandidat för decarboxylation av mono - och di-hydroxy-L-lysin. Dessutom, för att hitta DCs aktiva mot hydroxyl derivat av lysin, granskat vi genomisk samband med de gener som kodar αKAO enzymer. Faktiskt i prokaryota genom är de gener som kodar enzymer involverade i samma biosyntetisk väg generellt Co lokaliserade i gen kluster. KDO2 (från Chitinophaga pinensis) genen hittades Co lokaliserade med en gen som kodar för förmodad PLP-DC (figur 2). Däremot har ingen gen kodning för DC hittats vid analys av genomisk ramen för den KDO1-dioxygenas. PLP-DC proteinet från C. pinensis (DCCpin) valdes därför som en lovande kandidat att katalysera steget decarboxylation av cascade reaktionen.

Figure 2
Figur 2: genomisk sammanhang av KDO2 gen i C. pinensis. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Därför har vi utformat enzymatisk cascade reaktioner som involverar dioxygenases och DCs att uppnå syntesen av alifatiska kirala β - och γ-amino alkoholer från aminosyror (figur 3). Som tidigare rapporterats introducerar C-H oxidation katalyseras av αKAO hydroxi-substituerade stereogenic centrum med total diastereoselectivity; den Cβ/γ kiralitet bevaras i decarboxylative steg, som bara påverkar Cα kolet av aminosyra biexponentiellt16.

Figure 3
Figur 3: retrosyntetisk analys. (A) retrosyntes av β - och γ-amino alkoholer (R) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (4) från (5R) - hydroxy - L-lysin, och (S) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (5) och 1,5-diaminopentan-3-ol (6) från L-lysin. (B) retrosyntes av β, γ- och β, δ-amino dioler (2S, 3S) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (10) och (R, 4S2) - 1,5 - diaminopentane-2,4-diol (11) start från (5R)- hydroxy-L-lysin, och (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (7) start från L-lysin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Start från L-lysin och dess (5R)-hydroxi derivat, rapporterar vi häri en två/tre steg, en kruka, enzymatisk förfarande att kombinera dioxygenases och PLP-DCs att få målet amino alkoholer. Tidigare syntes på laboratorieskala av målet molekylerna, metoden utvecklades vid den analytiska skalan att justera de reaktion villkor, t.ex., enzym halterna, krävs för att tillåta full konvertering av utgångsmaterial; Vi presenterar detta förfarande också.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. enzympreparat

  1. Express och rena proteiner som tidigare beskrivits26.
    Obs: Rekombinanta proteiner erhölls med följande slutliga koncentrationer: αKAO från Catenulispora acidiphila, UniProtKB-ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL; ΑKAO från C. pinensis, UniProtKB-ID: C7PLM6 (KDO2), 2.29 mg/mL; PLP-DCs från S. rumirantium, UniProtKB-ID: O50657 (LDCSrum), cell gratis extrahera med totala enzym 12.44 mg/ml; PLP-DC från C. pinensis, UniProtKB-ID: C7PLM7 (DCCpin), 2,62 mg/mL.

2. beredning av lösningar

Obs: Alla lösningarna nedan är beredda i avjoniserat vatten.

  1. Förbereda 1 M av HEPES buffert, pH 7,5; justera med 5 M NaOH.
    Observera: Under pH justering steg, bära skyddshandskar, skyddskläder, ögonskydd och ansiktsskydd (P280). Vid kontakt med ögonen (P305, P351, P338), skölj försiktigt med vatten för flera min. ta bort kontaktlinser om möjligt. Fortsätt skölja och omedelbart kontakta GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller läkare (P310). P koden refererar till Skyddsangivelse (hazard klass och kategori; se, t.ex., pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).
  2. Förbereda 100 mM L-lysine, 100 mM (S5) - hydroxy - L-lysin, 150 mM α-ketoglutaric syra, 100 mM natriumaskorbat, 10 mM ammonium järn(II) sulfat hexahydrat (Mohr salt), 100 mM pyridoxal 5-fosfat (PLP) och 100 mM Ditiotreitol (DTT).
  3. Laga 1 M, 2M och 6M saltsyra (HCl) från en 37% HCl-lösning (approximativt 12 M lösning), följa säkerhetsinstruktionerna för samma som de som beskrivs i 2.1.
    Obs: Lösningar av α-ketoglutaric syra, natriumaskorbat och ammonium järn(II) sulfat hexahydrat måste göras färsk på dagen för användning. Lysin lösningen kan förvaras i flera månader i rumstemperatur. PLP lösningen kan förvaras i en månad vid 4 ° C. DTT lösningen kan förvaras i en månad vid-20 ° C.

3. analytisk-skala reaktioner

  1. Metodutveckling för decarboxylation reaktion (5R) - hydroxy - L-lysin
    1. Tillsätt 11 µL av 1 M lösning av HEPES buffert pH 7.5 (slutlig koncentration 50 mM) till en 2 mL mikrorör. Lägg sedan till 22 µL av 100 mM (S5) - hydroxy - L-lysin (slutlig koncentration 10 mM), 2.2 µL av 100 mM PLP (slutlig koncentration 1 mM), och 2,2 µL av 100 mM DTT (slutlig koncentration 1 mM).
      Obs: Vid reaktion med LDCSrum, tillägg av DTT är inte nödvändigt.
    2. Lägg till de renade PLP-DC (slutlig koncentration 0,1 mg/mL). Komplett med H2O för en slutlig volym av 220 µL.
    3. Skaka reaktionsblandningen vid rumstemperatur, med öppet lock i öppet luftar, vid 300 rpm för 3 h.
      Obs: Skaka reaktionsblandningen med öppet lock i öppen luft garanterar en bra syresättning av reaktion media. Det är därför inte nödvändigt att bubbla syre i reaktion media.
    4. Samla 10 µL av reaktionsblandningen att analyseras enligt reaktion övervakning proceduren som beskrivs i steg 6. Proverna är företrädesvis derivatized och analyseras direkt efter provtagningen.
  2. Metodutveckling för enzymatisk cascade reaktionen att kombinera en hydroxylering steg katalyseras av αKAO med decarboxylation katalyseras av PLP-DC
    1. Tillsätt 11 µL av 1 M av HEPES buffert pH 7.5 (slutlig koncentration 50 mM) till en 2 mL mikrorör. Lägg sedan till 22 µL av 150 mM av α-ketoglutaric syra (slutlig koncentration 15 mM), 5,5 µL av 100 mM från natriumaskorbat (slutlig koncentration 2,5 mM), 22 µL 10 mM av Mohr's salt (slutlig koncentration 1 mM), och 22 µL av 100 mM av L-lysin (slutlig koncentration 10 mM).
    2. Komplett med H2O för en slutlig volym av 220 µL, med hänsyn till volymen av enzymet lösningen ska läggas i steg 3.2.3.
    3. Lägg till enzymet krävs renat αKAO enligt den riktade regioselectivity: KDO1 för hydroxylering i position c-3 eller KDO2 för C-4 till L-lysin. Den slutliga koncentrationen av enzymet renat (0,05-0,5 mg/mL) var fast besluten att möjliggöra en fullständig omvandling i ungefär 3 h.
    4. Skaka reaktionsblandningen vid rumstemperatur, med öppet lock i öppet luftar, vid 300 rpm för 3 h.
    5. Tillsätt 2.2 µL av 100 mM av PLP (slutlig koncentration ~ 1 mM) och 2.2 µL av 100 mM av DTT (slutlig koncentration ~ 1 mM).
      Obs: Vid reaktion med LDCSrum, tillägg av DTT är inte nödvändigt.
    6. Lägg till de renade PLP-DC vid en koncentration som möjliggör fullständig omvandling i 18 h: LDCSrum med en ungefärlig slutlig koncentration på 0,1 mg/mL för cascade reaktionen med KDO1 och DCCpin med en ungefärlig slutlig koncentration på 0,5 mg/mL för den Cascade reaktion med KDO2.
    7. Skaka reaktionsblandningen vid rumstemperatur, med öppet lock i öppen luft vid 300 rpm för 18 h.
    8. Kör ett övervakningsförfarande som i steg 3.1.4.
  3. Metodutveckling för enzymatisk cascade reaktionen att kombinera två hydroxylering steg katalyseras av αKAOs med decarboxylation katalyseras av PLP-DC
    1. Kör steg 3.2.1-3.2.2.
    2. Lägga till KDO1 med en slutlig koncentration på 0,05 mg/mL. Skaka reaktionsblandningen vid rumstemperatur, med öppet lock i öppet luftar, vid 300 rpm för 3h.
    3. Lägga till KDO2 med en ungefärlig slutlig koncentration på 0,5 mg/mL, beräknas volymen första reaktion. Skaka reaktionsblandningen vid rumstemperatur, med öppet lock i öppet luftar, vid 300 rpm för 18 h.
    4. Kör steg 3.2.5.
    5. Lägg till de renade PLP-DC DCCpin med en ungefärlig slutlig koncentration på 0,5 mg/mL, beräknas volymen första reaktion. Skaka reaktionsblandningen vid rumstemperatur, med öppet lock i öppet luftar, vid 300 rpm för 18 h.
    6. Kör övervakningsförfarandet som i steg 3.1.4.

4. semi preparativ One-pot biokatalytiska reaktion

Obs: Enzymatiska reaktioner som utförs på 0,1 mmol av L-lysin i ett open-air 250 mL glas Erlenmeyerkolven för en total volym på 10 mL.

  1. Syntesen av monohydroxylerade derivat
    1. Tillsätt 0,5 mL av 1 M HEPES buffert, pH 7,5 (slutlig koncentration 50 mM) till kolven. Lägg sedan till 1 mL 100 mM L-lysin (slutlig koncentration 10 mM), 1 mL av 150 mM α-ketoglutaric syra (slutlig koncentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM natriumaskorbat (slutlig koncentration 2,5 mM), och 1 mL 10 mM Mohr's salt (slutlig koncentration 1 mM).
    2. Komplett med H2O för en slutlig volym av 10 mL, med hänsyn till volymen av enzymet lösningen ska läggas i steg 4.1.3.
    3. Lägg till enzymet krävs renat αKAO enligt den riktade regioselectivity: KDO1 med en slutlig koncentration på 0,075 mg/mL för hydroxylering i position c-3 eller KDO2 med en slutlig koncentration på 0,5 mg/mL för C-4 till L-lysin. Den slutliga koncentrationen av enzymet renat bestämdes att möjliggöra en fullständig omvandling i ungefär 3 h.
    4. Skaka reaktionsblandningen vid rumstemperatur vid 300 rpm i lämplig längd. När den reaktionsövervakning indikerar en avslutade hydroxylering reaktion (kör alla de steg som beskrivs i steg 6 för reaktionen övervakning protokoll), Fortsätt till steg 4.1.5. En typisk reaktion tid är 3 h.
    5. Tillsätt 100 µL av 100 mM PLP till αKAO reaktionsblandningen (slutlig koncentration ~ 1 mM). Lägg sedan till 100 µL av 100 mM DTT (slutlig koncentration ~ 1 mM), utom när du använder LDCSrum.
    6. Lägg till renat PLP-DC: LDCSrum med en ungefärlig slutlig koncentration på 0,05 mg/mL för cascade reaktionen med KDO1 eller DCCpin med en ungefärlig slutlig koncentration på 0,5 mg/mL för cascade reaktionen med KDO2.
    7. Skaka reaktionsblandningen vid rumstemperatur, 300 rpm, för 18 h och fortsätta direkt till de steg som beskrivs i steg 4,3.
  2. Syntes av dihydroxylated derivatan
    1. Tillsätt 0,5 mL av 1 M HEPES buffert, pH 7,5 (slutlig koncentration 50 mM), 1 mL 100 mM L-lysin (slutlig koncentration 10 mM), 1 mL av 150 mM α-ketoglutaric syra (slutlig koncentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM natriumaskorbat (slutlig koncentration 2,5 mM) , och 1 mL 10 mM Mohr's salt (slutlig koncentration 1 mM). Komplett med H2O för en slutlig volym av 10 mL, med hänsyn till volymen av enzymet lösningen ska läggas i steg 4.2.2.
    2. Lägga till KDO1 till en slutlig koncentration på 0,075 mg/mL. Skaka reaktionsblandningen vid rumstemperatur, vid 300 rpm för lämplig varaktighet.
    3. När den reaktionsövervakning indikerar en avslutade hydroxylering reaktion (se steg 6 för reaktionen övervakning protokoll), Fortsätt till steg 4.2.5. En typisk reaktion tid är 3 h.
    4. Tillsätt 1 mL av 150 mM α-ketoglutaric syra (slutlig koncentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM natriumaskorbat (slutlig koncentration 2,5 mM), och 1 mL 10 mM Mohr's salt (slutlig koncentration 1 mM).
    5. Lägga till KDO2 till en ungefärlig slutlig koncentration på 0,5 mg/mL, beräknas volymen första reaktion. Skaka reaktionsblandningen vid rumstemperatur vid 300 rpm för 18 h.
    6. När den reaktionsövervakning indikerar en ifyllda dihydroxylation-reaktion (se steg 6 för reaktionen övervakning protokoll), Fortsätt till steg 4.2.7. En typisk reaktionstiden är 18 h.
    7. Tillsätt 100 µL av 100 mM av DTT (slutlig koncentration ~ 1 mM), utom när du använder den LDCSrum.
    8. Lägg till de renade DCCpin med en ungefärlig slutlig koncentration på 0,5 mg/mL, beräknas volymen första reaktion.
    9. Skaka reaktionsblandningen vid rumstemperatur vid 300 rpm för 18 h.
  3. Snabbkylning
    1. Kyla ner reaktionsblandningen genom att placera glasets 250 mL Erlenmeyer-kolv i ett isbad.
    2. Tillsätt försiktigt, över approximativt 1 minuters, 0,25 mL 6 M HCl genom att manuellt försiktigt skaka kyls reaktionsblandningen. Följ säkerhetsinstruktionerna för samma som de som beskrivs i steg 2.1.
    3. Överföring i sura blandningen i en 50 mL konisk botten Centrifugera röret med ett glas Pasteur-pipett utrustad med en glödlampa, Centrifugera sedan på 1 680 x g och 4 ° C under 15 minuter.
    4. Återkalla supernatanten och hålla undan i en 250 mL runda-botten.
    5. Tillsätt 10 mL avjoniserat vatten till konisk botten centrifugeringsröret som innehåller pelleten. Vortex att resuspendera pelleten.
    6. Centrifugera vid 1 680 x g, 4 ° C, 15 min.
    7. Återkalla supernatanten och lägga till 250 mL runda-botten kolven som innehåller första supernatanten (steg 4.3.4).
    8. Frysa insamlade supernatanterna genom nedsänkning av kolven i flytande kväve med konstant hand virvlande och överföra kolven omedelbart till en bänkmonterade grenrör frystork att förhindra material från upptining.
    9. Efter frystorkning processen är klar (natten), ta bort kolven från frystork.

5. rening av Amino alkoholer från rå enzymatisk reaktionsblandning

  1. Jonbytare
    1. Lös upp frystorkat produkten i den minsta mängden vattenlösning 0.1 M HCl (approximativt 4 mL) tills fasta partiklar är inte längre naken-ögat.
    2. Skick en sulfonsyra funktionell grupp katjonbytarharts, 200-400 mesh, i en glaskolonn (20 x 250 mm) genom eluering vid atmosfäriskt tryck 1 M HCl (4 kolumn volymer) följt av 0,1 M HCl (4 kolumn volymer; kolumn volym = 10 mL).
    3. Fyll provet noggrant vid toppen av kådan på väggarna i kolumnen glas med en 1000 µL mikropipett. Skölj sedan, konisk botten centrifugröret som innehöll den rå produkten tre gånger med 1 mL 0,1 M HCl-aqueous lösning per tvätta och ladda de resulterande skölj systemvolymerna till kolumnen på samma sätt.
    4. Eluera med en icke-linjär gradient: 4 kolumn volymer av 0,1 M HCl, 4 kolumn volymer vatten, 4 kolumn volymer av 5% NH4OH, 4 kolumn volymer av 10% NH4OH, 4 kolumn volymer 15% NH4Oh, 4 kolumn volymer 20% NH4Oh , 4 kolumn volymer av 25% NH4OH och slutligen 4 kolumn volymer av 28% NH4OH.
    5. Övervaka reningen av HPLC (se steg 6).
    6. Samla de fraktioner som innehåller substansen (NH4OH 20-28%) och kaseinbanden som beskrivs i steg 4.3.8-4.3.9.
      Obs: Jonbytarkolonnen kan återanvändas efter eluering med avjoniserat vatten till neutralisering eluering vatten (approximativt 50 mL) följt av ombyggnad av eluering med 50 mL 1 M HCl.
  2. SPE
    1. Solubilize frystorkade substansen i approximativt 2 mL H3PO4/water (20 µL/mL).
    2. Plats en blandat läge katjon-exchange SPE 6 mL-patron på en extraktion grenrör ansluten till en vattenpump. Villkora patronen genom lottning genom 4 mL metanol under reducerat tryck som tillhandahålls av grenröret. Temperera patronen genom att dra igenom 4 mL H3PO4/water (20 µL/mL).
    3. Fyll provet på patronen med en 1000 µL mikropipett längst av kådan på väggarna i glaskolonnen och skölj injektionsflaskan med produkten tre gånger med 0,75 mL H3PO4/water (20 µL/mL) per tvätt. Ladda den resulterande skölj volymen till kolumnen på samma sätt.
    4. Tvätta patronen genom eluering under reducerat tryck, som tillhandahålls av grenröret, 4 mL 2% HCOOH i vatten, sedan med 4 mL vatten. Eluera med en gradient av NH4OH i vatten (4 mL för varje eluering, start från 4% NH4OH: 10%, 15%, 15%, 20% och 28%).
    5. Övervaka rening genom HPLC genom att analysera varje fraktion enligt reaktionen övervakning protokoll som beskrivs i steg 6. Hålla alla de fraktioner som innehåller ren önskad derivat enligt ultraviolett (UV) kromatogrammet och fortsätt till steg 5.2.6.
    6. Pool fraktioner som innehåller önskad sammansatta till en 100 mL rund botten kolven, skölj rören som innehåller bråk med vatten och tillsätt skölj volym 100 ml rund botten kolven.
    7. Ta bort lösningsmedlet under reducerat tryck med en rotationsindunstare utrustad med en termostat vattenkokaren bad vid 40 ° C och ansluten till en vakuumpump som fastställts till 10 mbar.
    8. Solubilize fast i en minsta volym vatten och överför lösningen till en vägd 25 mL rund botten kolven. Skölj kolven med en minsta volym på vatten, tillsätt skölj volym till 25 mL kolven och fortsätt till steg 5.2.9.
    9. Väger den rena produkten och beräkna avkastningen.
    10. Lös den rena produkten i den minsta mängden 2M HCL tills fasta partiklar är inte längre naken-ögat och kaseinbanden som beskrivs i steg 4.3.8-4.3.9.
      Obs: De amino alkoholerna är känsliga föreningar och hålls som salter hydroklorid.

6. reaktionsövervakning och produktanalys

  1. Derivatisering av substrat och produkter innan HPLC-analysen
    Obs: De substrat och produkter måste vara derivatized som aromatiska derivat att öka deras UV kromatografiska detectivity. Vi använde 1-fluoro-2,4-dinitrobensen (DNFB). Varje prov injicerades i HPLC omedelbart efter derivatisering.
    1. Ta 10 µL av enzymatisk reaktion och överföring till ett 1,5 mL mikrorör. Lägg till 10 µL av 0,25 M NaHCO3 vattenlösning, 100 µL etanol och 30 µL av 2,5 mg/mL DNFB lösning i etanol.
    2. Stäng mikroröret och skaka den resulterande lösningen för 1 h vid 65 ° C, vid 1000 rpm. Släcka med 10 µL 1 M HCl.
    3. Filtrera över ett 4 mm diameter icke-steril spruta filter med 0,22 µm porstorlek storlek hydrophilic polyvinylidene fluor (PVDF) membran med en 1 mL Luer spruta.
  2. Utföra övervakning av dioxygenas reaktionen med alla system som kan separera derivatized aminosyror. Detta protokoll innebär UV-detektion av aminosyror som derivatized av de dinitrobensen (DNB) kromofor grupp27.
    1. Passa HPLC med C18 med en trimetyl silyl endcapping reversed phase-kolonn (5 µm, 3 x 150 mm).
    2. Temperera C18 kolonnen med (30: 70) elueringslösning B (MeCN + 0,1% TFA) till Elueringslösning A (H2O + 0,1% TFA) med en flödeshastighet av 1 mL/min och 35 ° C i 15 min (motsvarande approximativt 20 kolumn volymer).
    3. Injicera 10 µL derivatized reaktionsblandningen (se steg 6.1) på HPLC C18 kolonnen. Använd en blandning av MeCN, 0,1% TFA/H2O och 0,1% transfettsyror som eluent med en linjär övertoning (baserat på 30: 70 till 70:30 i 9 min, temperatur 35 ° C, flöde 1 mL/min).
    4. Använda UV-detektion på 400 nm till analysera produkterna elueras på kolumnen kromatografiska. DNB-lysin eluerar vanligtvis omkring 6,5 min, hydroxylerade DNB-lysin runt 5,5 min, dihydroxylated DNB-lysin runt 4,2 min och DNB-aminodiol runt 5,3 min.

7. NMR analys av renat Amino alkoholer

  1. Upplösa renat amino alkoholer i D2O (700 µL) och överför lösningen till en kärnmagnetisk resonans (NMR) röret.
  2. Förvärva 1H och 13C NMR spectra enligt lämpliga NMR anläggning protokoll28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har tidigare rapporterat syntesen av mono - och di-hydroxy-L-lysines genom diastereoselective enzymatisk hydroxylering katalyseras av dioxygenases av järn (II) / αKAO familj (figur 1)16. För att optimera protokollet av hela kaskader presenteras här, som kombinerar ett eller två hydroxylering steg katalyseras av en αKAO följt av ett decarboxylation steg katalyseras av en PLP-DC, justerades reaktionsbetingelser för att uppfylla kraven i både enzymatiska reaktioner. Vi började genom att undersöka de två DCs, LDCSrum och DCCpin, mot den kommersiellt tillgängliga (5R) verksamhet - hydroxy - L-lysin. Sedan analyseras vi DC verksamhet mot den mono derivaten, 3-hydroxi-L-lysin (1) och 4-hydroxi-L-lysin (2), i kaskad med oxidation steg katalyseras av den lämpliga αKAO. I tabell 1 redovisas resultatet av de biokatalytiska dekarboxylering av de mono-hydroxy-L-lysines. Konverteringar mättes genom HPLC efter derivatisering av reaktionsblandningen med DNFB att ge motsvarande DNB derivatized substrat och produkter.

Inträde Substrat PLP-DC Produkt Konvertering
1 (5R) - hydroxy - L-lysin LDCSrumb) 4 100%
2 (5R) - hydroxy - L-lysin DCCpinb) 4 n.d.
3 1 en) LDCSrumb) 5 100%
4 1 en) DCCpinb) 5 29%
5 2 en) LDCSrumc) 6 60%
6 2 en) DCCpinc) 6 100%

Tabell 1: biokatalytiska decarboxylation av monohydroxy-L-lysines. Reaktionsbetingelser: substrat (10 mM), PLP-DC (0,1 till 0,15 mg mL-1), HEPES buffert (50 mM, pH 7.5), PLP (1 mM), DTT (1 mM; inte används med LDCSrum), övernattning, RT, 300 rpm. (en) syntetiseras enzymatiskt i situ. (b) 0,1 mg/mL. (c) 0.15 mg/mL; nd: inte upptäckt

DC från S. rumirantium (LDCSrum) uppvisade aktivitet mot alla de mono hydroxi lysines med bästa konvertering av 3 - och 5-derivat till de motsvarande kirala hydroxy diaminer (posterna 1, 3 och 5). Som förväntat, DCCpin, DC av αKAO genomisk ramen, visade sig vara den mest lämpliga för decarboxylation av (4R) - hydroxy - L-lysin (2), (punkt 6). På standard reaktion villkor omvandlingen av (S3) - hydroxy - L-lysin (1) i dess dekarboxylering motsvarighet (5) med DCCpin var låg (post 4), och ingen aktivitet observerades mot (5R)- hydroxy-L-lysin (post 2).

Slutligen, vi granskat verksamheten inom de två DCs mot di-hydroxy-L-lysin derivat 3, 8och 9, syntetiseras i situ av en eller två hydroxylering steg katalyseras av KDO1, KDO2 eller en kombination av båda (figur 2). resultaten av den biokatalytiska decarboxylation av de di-hydroxy-L-lysines sammanfattas i tabell 2.

Inträde Substrat PLP-DC Produkt Konvertering
1 3 LDCSrumb) 7 n.d.
2 3 DCCpinb) 7 100%
3 8 en) LDCSrumb) 10 19%
4 8 en) DCCpinb) 10 12%
5 9 en) LDCSrumc) 11 n.d.
6 9 en) DCCpinc) 11 n.d.

Tabell 2: biokatalytiska decarboxylation av dihydroxi-L-lysines. Reaktionsbetingelser: substrat (10 mM), PLP-DC (0,1 till 0,15 mg/mL), HEPES buffert (50 mM, pH 7.5), PLP (1 mM), DTT (1 mM; inte används med LDCSrum), övernattning, RT, 300 rpm. (en) syntetiseras enzymatiskt i situ. (b) 0,1 mg/mL. (c) 0.15 mg/mL; nd: inte upptäcks.

Angående decarboxylation av dihydroxi-L-lysines 3, 8, och 9var resultaten inte helt tillfredsställande. I de standard reaktion villkor, endast (3R, 4R) - dihydroxi - L-lysin (3) omvandlades kvantitativt till den motsvarande dihydroxi diamine 7 (poster 1 - 2). Omvandlingen av 4,5-dihydroxi-L-lysin (8) var måttlig (poster 3-4) men det är värt att notera att det skulle kunna förbättras genom att kraftigt öka enzym lastning. Ingen av de två testade PLP-DCs hittades aktiva mot 3,5-dihydroxi-L-lysin (9), (5-6 poster).

De enzymatiska cascade reaktioner uppvisar kvantitativa konvertering som bestäms genom HPLC övervakning var framgångsrikt skalas upp (figur 4).

Figure 4
Figur 4: representativa analysdata för tre steg enzymatisk kaskaden. (A), HPLC övervakning av biokatalytiska omvandling av L-lysin till (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentan-2,3-diol (7). RT = retentionstiden. (B) 1H NMR och (C) 13C NMR amino alkohol (7) efter rening. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Rening protokollet presenteras häri tillåter effektiv utvinning av de amino alkoholerna från komplexa enzymatisk reaktionsblandningen. Den amino alkoholer 4, 5, 6och 7 erhölls i utmärkt avkastning (figur 5).

Figure 5
Figur 5: enzymatisk kaskader för syntesen av amino alkoholer. Syntes av (R) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (4), (S) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (5), 1,5-diaminopentan-3-ol (6),, och (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (7). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kirala amino alkoholer och derivat har ett brett utbud av applikationer, från kirala extraanställda för organisk syntes till farmaceutisk behandling. Flerstegssyntes för att producera amino alkoholer av konventionella organisk syntes är många, men kanske inte alltid är effektiv på grund av tråkiga skydd/deprotection steg tillsammans med en känslig kontroll av stereokemi16. En biokatalytiska tillvägagångssätt som doserar med skydd/deprotection steg och är oftast mycket stereoselektiv representerar ett bra alternativ.

Tidigare arbete rapporteras syntesen av olika β-amino alkoholer med en 2-phenylethan-1-Amin ryggrad av dynamiska kinetiska asymmetrisk omvandling (DYKAT). I denna väg introducerades stadens hydroxi-substituerade stereogenic av aldolisation på bensaldehyd och derivat, katalyseras av en treonin aldolase. Den låga diastereoselectivity och måttlig avkastningen av detta första steg var betagna av den efterföljande stereospecific decarboxylation katalyseras av L-tyrosin DC, leder till enantioenriched aromatiska β-amino alkoholer11,12.

Vi rapporterade häri ett enkelt protokoll för syntes av olika amino alkoholer start från den lättillgängliga L-lysin. Även om det är mycket effektiv, lider detta protokoll nackdelar på grund av begränsad substrat spänner av αKAO och PLP-DC enzymer. Biokatalytiska syntes av olika amino alkoholer kan dock anses med hjälp av olika kombinationer av andra αKAO och aminosyra DCs29,30,31,32. Det är värt att notera att två steg är kritisk i kaskad som PLP-DCs är också aktiva mot den L-lysin. Var noga med att säkerställa att alla de L-lysin konsumeras i första oxidativ steg innan du kör decarboxylation reaktionen katalyseras av PLP-DC. Detta säkerställs genom en noggrann kontroll av reaktionen genom HPLC efter derivatisering av reaktion media en kromofor agent. Den låg toleransen av enzymet hög substrat koncentrationen är en begränsning för vidare utveckling. För att åtgärda detta problem, enzym evolution strategier kan användas för att optimera enzym egenskaper, såsom substrat koncentrationen tolerans33. Enzymet immobilisering kan dessutom anses säkerställa återanvändning av enzymet.

Detta protokoll är lätt att genomföra, och en av dess mest attraktiva funktioner är effektiviteten i reningssteg. I vårt föregående arbete, direkt utvinning av polära molekyler från komplexa enzymatisk reaktionsblandningen var ett problem, och derivatisering av föreningar av hydrofoba grupper var nödvändiga16. Rening av de amino alkoholerna direkt krävs från reaktionen utan derivatisering omfattande arbete. I detta protokoll, rening tvåstegsförfarandet kombinerar jonbytare och fasta fasen extraktion tar bort glycerol (finns i enzymet lösningen) och HEPES buffert, två polära molekyler med fysikalisk-kemiska egenskaper nära dem av den riktade amino alkoholer och därför svåra att skilja från dessa föreningar. Denna rening protokoll kan anpassas för utvinning av olika polära molekyler från komplexa blandningar såsom de från enzymreaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Véronique de Berardinis för fruktbar diskussion och Alain Perret, Christine Pellé och Peggy Sirvain för teknisk support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Sigma Aldrich H3375
L-lysine hydrochloride Sigma Aldrich L5626
(5S)-hydroxy-L-lysine Sigma Aldrich GPS NONH Out sourcing
α-ketoglutaric acid Sigma Aldrich 75892
Sodium ascorbate Sigma Aldrich A7631
Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate Acros 201370250
Pyridoxal phosphate (PLP) Sigma Aldrich 82870
3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) Sigma Aldrich D0632
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) Sigma Aldrich D1529
Ethanol VWR 20825.290
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 71631
HCl 37% Sigma Aldrich 435570
HCl 0.1M Fluka 35335
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS VWR 83640.320
2,2,2-trifluoroacetic acid VWR 153112E
Ammonia 28% VWR 21182.294
Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS VWR 83638.32
Formic acid Acros 270480010
Phosphoric acid 85% Acros 201145000
Deuterium oxide Acros 320,710,075
NaOH Sigma Aldrich S5881
C18 HPLC column Phenomenex 00F-4601-Y0
Accela UHPLC System ThermoFisher Scientific
Accela PDA detector ThermoFisher Scientific
4mm syringe filters - 0,22µm - PVDF Merck SLGVR04NL
Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip VWR HSWA5010.200V0
Cation exchange resin 100-200 mesh Sigma Aldrich 217506
Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL Waters 186000776
Extraction manifold Waters WAT200609
Rotary evaporator Büchi 531-0103
Lyophilizer alpha 1-2 LDplus Christ L083302
Micropipette 20 µL Eppendorf 3121000031
Micropipette 100 µL Eppendorf 3121000074
Micropipette 500 µL Eppendorf 3121000112
Micropipette 1000 µL Eppendorf 3121000120
300 MHz spectrometer Bruker
2 mL microtube CLEARLine CL20.002.0500
50 mL conical-bottom centrifuge tube Fischer Scientific 05-539-8
25 mL round-bottom flask 14/23 Fischer Scientific 10353331
100 mL round-bottom flask 29/32 Fischer Scientific 11786183
250 mL round-bottom flask 29/32 Fischer Scientific 11786183
250 mL erlenmeyer flask Fischerbrand 15496143

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
  2. Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  3. Turner, N. J., O'Reilly, E. Biocatalytic retrosynthesis. Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).
  4. Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. Enzyme catalysed tandem reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).
  5. Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).
  6. Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. 1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis. Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).
  7. Abiko, A., Masamune, S. An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4. Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).
  8. McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).
  9. Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles. Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).
  10. Colomer, I., et al. Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries. Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).
  11. Steinreiber, J., et al. Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation. Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).
  12. Steinreiber, J., et al. Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations. Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).
  13. Kohls, H., et al. Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction. Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).
  14. Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114 (0), 65-71 (2015).
  15. Martinez, S., Hausinger, R. P. Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases. J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).
  16. Baud, D., et al. Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds. ChemCatChem. , (2014).
  17. Suzuki, H., Kurihara, S. Ch. 4. Polyamines. Kusano, T., Suzuki, H. 4, Springer Japan. 47-59 (2015).
  18. Kind, S., Wittmann, C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).
  19. Schneider, J., Wendisch, V. F. Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).
  20. Qian, Z. -G., Xia, X. -X., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).
  21. Shin, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives. Microb. Cell. Fact. 13, (2014).
  22. Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum. Metabolites. 5 (2), 211 (2015).
  23. Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies. Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).
  24. Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).
  25. Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).
  26. Baud, D., et al. Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation. Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).
  27. Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).
  28. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy (2017).
  29. Hibi, M., Ogawa, J. Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).
  30. Hüttel, W. Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).
  31. Kourist, R., Guterl, J. -K., Miyamoto, K., Sieber, V. Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources. ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).
  32. Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases. J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).
  33. Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis. ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).

Tags

Kemi fråga 132 kirala amino alkoholer kaskad reaktion enzymer dioxygenases decarboxylases biocatalysis
Enzymatisk Cascade reaktioner för syntesen av kirala Amino alkoholer från L-lysin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fossey-Jouenne, A.,… More

Fossey-Jouenne, A., Vergne-Vaxelaire, C., Zaparucha, A. Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine. J. Vis. Exp. (132), e56926, doi:10.3791/56926 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter