Summary
Quirais aminoácidos álcoois são moléculas versátil para uso como andaimes em síntese orgânica. A partir de L-lisina, sintetizar aminoácidos álcoois por uma reação em cascata enzimática combinando diastereoselective C-H oxidação catalisada por dioxigenase seguido por clivagem do moiety ácido carboxílico do aminoácido correspondente hidroxila por um descarboxilase.
Abstract
Aminoácidos álcoois são compostos versáteis com uma ampla gama de aplicações. Por exemplo, eles têm sido usados como quirais andaimes em síntese orgânica. Sua síntese por convencional de química orgânica, muitas vezes, requer processos de síntese de várias etapas tedioso, com difícil controle do resultado estereoquímica. Apresentamos um protocolo para enzimaticamente sintetizar amino álcoois a partir de L-lisina prontamente disponível em 48h. Este protocolo combina duas reações químicas que são muito difíceis de realizar por síntese orgânica convencional. Na primeiro passo, a regio - diastereoselective oxidação e de uma ligação C-H não ativada de lisina da cadeia lateral é catalisada por uma dioxigenase; uma segunda oxidação regio - e diastereoselective, catalisada por uma dioxigenase regiodivergent pode levar à formação da 1,2-dióis. Na última etapa, o grupo carboxílico do aminoácido alfa é clivado por uma descarboxilase piridoxal-fosfato (PLP) (DC). Esta etapa de dimerização afeta somente o carbono alfa de aminoácidos, mantendo o centro estereogênico hidroxi-substituídos na posição beta/gama. Aminoácidos álcoois resultantes são, portanto, opticamente enriquecidos. O protocolo foi aplicado com sucesso para a síntese de semipreparative-escala de quatro aminoácidos álcoois. Monitoramento das reações foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) após derivatização pelo 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno. Simples purificação pela extração de fase sólida (SPE) oferecidas os aminoácidos álcoois com excelente rendimento (93% de > 95%).
Introduction
Apesar dos benefícios oferecidos por biocatálise, a integração das etapas biocatalytic em vias sintéticas ou rotas biocatalytic totais permanece na sua maioria limitada a resoluções de cinéticas enzimáticas. Estas rotas têm sido amplamente utilizadas como um primeiro passo na síntese assimétrica de quimio-enzimático, mas biocatálise oferece muitas possibilidades mais no grupo funcional interconversões com elevada estereosseletividade1,2,3 . Além disso, como reações de biocatalytic são realizadas em condições similares, portanto, é viável para realizar reações em cascata em uma moda de um pot-4,5.
Quirais aminoácidos álcoois são moléculas versátil para uso como auxiliares ou andaimes em síntese orgânica6. O grupo amino álcool é frequentemente encontrado em metabólitos secundários e em ingredientes farmacêuticos ativos (API). Álcoois primários β-amino estão prontamente disponíveis a partir dos correspondentes ácidos α-amino por síntese química convencional, mas o acesso para álcoois quirais de γ-amino ou álcoois secundários aminoácidos requer muitas vezes tediosas vias sintéticas junto com sensível controle da estereoquímica7,8,9,10. Devido à sua elevada estereosseletividade, biocatálise pode fornecer uma rota sintética superior a esses blocos de construção quirais11,12,13,14.
Nós relatamos anteriormente a síntese de mono - e di-hidroxi-L-lisinas por diastereoselective hidroxilação enzimática catalisada por dioxygenases do ferro (II) / α-ketoacid-dependente família oxigenase (αKAO) (Figura 1)15. Em particular, a partir de L-lisina, a dioxigenase KDO1 catalisa a formação doS(3) - hidroxi derivado (1), enquanto o (R. 4) - derivado (2) é formado pela reação com dioxigenase KDO2. Sucessivas regiodivergent hydroxylations por KDO1 e KDO2 levam à formação doR, 4R(3) - dihidroxi - L-lisina (3) na forma opticamente pura. No entanto, a gama limitada de substrato destas enzimas impede sua grande utilização na síntese química, especialmente na hidroxilação de aminas simples, como um moiety ácido carboxílico em posição α do grupo amino é essencial para a atividade16.
Figura 1: Biocatalytic conversões de L-lisina. Conversão em (3S) - hidroxi - L-lisina (1) catalisada por KDO1 dioxigenase; (4R) - hidroxi - L-lisina (2) catalisada por KDO2 dioxigenase; e 3R, 4R- dihidroxi - L-lisina (3) pela reação em cascata sucessivamente catalisada por dioxygenases KDO1 e KDO2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Descarboxilação é uma reação comum no metabolismo17. Em particular, aminoácido DCs (CE 4.1.1) está livre de cofator (pyruvoyl-dependente) ou enzimas PLP-dependentes e catalisar a descarboxilação de aminoácidos para as correspondentes poliaminas em bactérias e maior organismos18,19 , 20 , 21 , 22. o mono - e compostos (Figura 3) 4–7, 10–11 correspondem a cadaverina hidroxilada, a diamina obtida pela descarboxilação da L-lisina. Cadaverina é um bloco de construção fundamental para a indústria química, especificamente é um componente de polímeros de poliamida e poliuretano. Portanto, produção de base biológica desta diamina partir de recursos renováveis tem atraído a atenção como uma alternativa à rota do petróleo-baseados, e vários microorganismos têm foi projetados para essa finalidade. Estas vias metabólicas, lisina DC (PMD) é a enzima chave. LDC é uma enzima PLP-dependentes pertencentes ao alanina racemase (AR) estruturais família23. Os DCs PLP-dependentes (PLP-DCs) são conhecidas por serem altamente específicas do substrato. No entanto, algumas enzimas possuem a capacidade de promiscuidade ligeira, sendo ativo no sentido de aminoácidos L-ornitina e L-lisina, como por exemplo o LDC de Selenomonas rumirantium (LDCSrum), que tem similares constantes cinéticas para lisina e ornitina descarboxilação24,25. Este substrato estendido especificidade desta enzima faz com que um bom candidato para a descarboxilação de mono - e di-hidroxi-L-lisina. Além disso, para localizar DCs ativo para os derivados de hidroxila de lisina, examinamos o contexto genômico dos genes que codificam as enzimas αKAO. Com efeito, em genomas procariontes os genes que codificam enzimas envolvidas na via biossintética mesma são geralmente co localizados em clusters de gene. O gene KDO2 (de Chitinophaga pinensis) foi encontrado co localizados com um gene que codifica o putativo PLP-DC (Figura 2). Em contraste, nenhuma codificação de gene para DC foi encontrado quando se analisa o contexto genômico da dioxigenase KDO1. A proteína do PLP-DC de c. pinensis (DCnegras), portanto, foi selecionada como um candidato promissor para catalisar o passo de descarboxilação da reação em cascata.
Figura 2: contexto genômico do gene KDO2 em c. pinensis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Consequentemente, nós projetamos as reações enzimáticas da cascata envolvendo dioxygenases e DCs para atingir a síntese de álcoois alifáticos quiral β e γ-amino de aminoácidos (Figura 3). Como relatado anteriormente, a oxidação de C-H catalisada pela αKAO apresenta o centro estereogênico hidroxi-substituídos com diastereoseletividade total; a quiralidade Cβ/γ será preservada na etapa de dimerização, que afeta somente o carbono Cα do ácido aminado moiety16.
Figura 3: análise Retrosynthetic. (A) Retrosynthesis de β e γ-amino álcoois (R) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (4) (5R) - hidroxi - L-lisina e (S) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (5) e 1,5-diaminopentan-3-ol (6) de L-lisina. (B) Retrosynthesis de β, γ e β, δ-amino dióis (2S, 3S) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (10) e 2R, 4S- 1,5 - diaminopentane-2,4-diol (11) a partir de (R. 5)- hidroxi-L-lisina e 2R, 3R- 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (7) a partir de L-lisina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A partir de L-lisina e seus (5R)-hidroxi derivado, nós relatamos aqui um dois/três passo, um pote, procedimento enzimático combinando dioxygenases e PLP-DCs para obter o destino aminoácidos álcoois. Antes da síntese em escala de laboratório das moléculas do alvo, o método foi desenvolvido em escala analítica para ajustar as condições de reação, por exemplo, as concentrações de enzima, necessárias para permitir que a conversão completa das matérias-primas; apresentamos este procedimento também.
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Protocol
1. preparação enzimática
- Express e purificar as proteínas como descrito anteriormente,26.
Nota: Proteínas recombinantes foram obtidas com as seguintes concentrações finais: αKAO de Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL; ΑKAO de c. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM6 (KDO2), 2,29 mg/mL; PLP-DCs de S. rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (LDCSrum), extrato da célula livre com total enzima 12,44 mg/ml; PLP-DC de c. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (DCnegras), 2,62 mg/mL.
2. preparação de soluções
Nota: Todas as soluções abaixo são preparadas em água deionizada.
- Prepare-se 1 M de tampão HEPES, pH 7,5; ajuste com 5 M de NaOH.
Nota: Durante o passo de ajuste de pH, use luvas de proteção, roupas de proteção, proteção para os olhos e rosto proteção (P280). Em caso de contato com os olhos (P305, P351, P338), enxague cuidadosamente com água durante vários minutos remover lentes de contato se possível. Continue enxaguando e chame imediatamente um médico (P310) ou centro de veneno. O código de P refere-se à instrução da precaução (de perigo classe e categoria; Veja, por exemplo, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/). - Preparar 100 mM L-lisina, 100 mM (5S) - hidroxi - L-lisina, ácido alfa-cetoglutárico 150mm, ascorbato de sódio de 100 mM, 10 mM de amónio iron(II) hexaidrato de sulfato de sódio (sal de Mohr), 100 mM piridoxal 5-fosfato (PLP) e 100mm ditiotreitol (DTT).
- Prepare 1 M, 2M e 6M de ácido clorídrico (HCl) de uma solução de HCl 37% (aproximadamente 12 M solução), seguindo as mesmas instruções de segurança, como as descritas no ponto 2.1.
Nota: As soluções de ácido alfa-cetoglutárico, ascorbato de sódio e de amônio hexaidrato de sulfato de iron(II) devem ser feitas frescas no dia do uso. A solução de lisina pode ser armazenada por vários meses à temperatura ambiente. A solução PLP pode ser armazenada durante um mês a 4 ° C. A solução de TDT pode ser armazenada durante um mês a-20 ° C.
3.-balança analítica reações
- Desenvolvimento de método para a reação de descarboxilação (5R) - hidroxi - L-lisina
- Adicionar 11 µ l de solução de 1m de HEPES buffer pH 7,5 (concentração final 50 milímetros) para um microtubo de 2 mL. Em seguida, adicione 22 µ l de 100 mM (5S) - hidroxi - L-lisina (concentração final 10 mM), 2,2 µ l de 100mm PLP (concentração final 1 mM) e 2,2 µ l de 100 mM DTT (concentração final 1 mM).
Nota: No caso de reação com LDCSrum, a adição de TDT não é necessária. - Adicionar o PLP-DC purificado (concentração final de 0,1 mg/mL). Complete com H2O para um volume final de 220 µ l.
- Agite a mistura de reação à temperatura ambiente, com uma tampa aberta ao ar livre, com 300 rpm para 3h.
Nota: Agitando a mistura de reação com uma tampa aberta ao ar livre garante uma boa oxigenação da mídia reação. Não é portanto necessário a bolha de oxigênio na mídia reação. - Colete 10 µ l da mistura de reação, para ser analisado de acordo com o procedimento de controlo de reação descrito na etapa 6. As amostras são preferencialmente derivatizadas e analisadas diretamente após a amostragem.
- Adicionar 11 µ l de solução de 1m de HEPES buffer pH 7,5 (concentração final 50 milímetros) para um microtubo de 2 mL. Em seguida, adicione 22 µ l de 100 mM (5S) - hidroxi - L-lisina (concentração final 10 mM), 2,2 µ l de 100mm PLP (concentração final 1 mM) e 2,2 µ l de 100 mM DTT (concentração final 1 mM).
- Desenvolvimento de método para a reação enzimática em cascata, combinando um passo de hidroxilação catalisado por αKAO com descarboxilação catalisada por PLP-DC
- Adicionar 11 µ l de 1 M de tampão com pH 7,5 HEPES (concentração final 50 milímetros) para um microtubo de 2 mL. Em seguida, adicione 22 µ l de 150 mM de ácido alfa-cetoglutárico (concentração final 15mm), 5,5 µ l de 100 mM de ascorbato de sódio (concentração final 2,5 mM), 22 µ l de 10mm de Mohr de sal (concentração final 1 mM) e 22 µ l de 100 mM de L-lisina (concentração final 10 mM).
- Complete com H2O para um volume final de 220 µ l, tendo em conta o volume da solução de enzima a ser adicionado na etapa 3.2.3.
- Adicionar a enzima αKAO purificada necessária de acordo com a alvo regioseletividade: KDO1 para hidroxilação em posição C-3 ou KDO2 para a posição C-4 de L-lisina. A concentração final da enzima purificada (0,05-0,5 mg/mL) foi determinada permitir uma conversão completa em cerca de 3 h.
- Agite a mistura de reação à temperatura ambiente, com uma tampa aberta ao ar livre, com 300 rpm para 3h.
- Adicionar 2,2 µ l de 100 mM do PLP (concentração final ~ 1 mM) e 2,2 µ l de 100 mM da televisão digital terrestre (concentração final ~ 1 mM).
Nota: No caso de reação com LDCSrum, a adição de TDT não é necessária. - Adicionar o PLP-DC purificado numa concentração permitindo a conversão completa em 18 h: LDCSrum uma concentração final aproximada de 0,1 mg/mL para a reação em cascata com KDO1 e DCnegras a uma concentração final aproximada de 0,5 mg/mL para o reação em cascata com KDO2.
- Agite a mistura de reação à temperatura ambiente, com uma tampa aberta ao ar livre com 300 rpm para 18 h.
- Execute um procedimento de controlo como no passo 3.1.4.
- Desenvolvimento de método para a reação enzimática em cascata, combinando duas etapas de hidroxilação catalisadas por αKAOs com descarboxilação catalisada por PLP-DC
- Execute etapas 3.2.1-3.2.2.
- Adicione KDO1 em uma concentração final de 0,05 mg/mL. Agite a mistura de reação à temperatura ambiente, com uma tampa aberta ao ar livre, com 300 rpm para 3h.
- Adicione KDO2 a uma concentração final aproximada de 0,5 mg/mL, calculado usando o volume de reação inicial. Agite a mistura de reação à temperatura ambiente, com uma tampa aberta ao ar livre, com 300 rpm para 18 h.
- Execute o passo 3.2.5.
- Adicione o PLP-DC DC purificadanegras a uma concentração final aproximada de 0,5 mg/mL, calculado usando o volume de reação inicial. Agite a mistura de reação à temperatura ambiente, com uma tampa aberta ao ar livre, com 300 rpm para 18 h.
- Execute o procedimento de controlo como no passo 3.1.4.
4. semipreparativa um pot-Biocatalytic reação
Nota: Reações enzimáticas são realizadas em 0,1 mmol de L-lisina em um frasco de Erlenmeyer para um volume total de 10 mL de vidro 250ml ao ar livre.
- Síntese de derivados da monohydroxylated
- Adicionar 0,5 mL de tampão HEPES de 1 M, pH 7,5 (concentração final 50 mM) ao balão. Em seguida, adicione 1 mL de 100 mM L-lisina (concentração final 10 mM), 1 mL de ácido alfa-cetoglutárico 150mm (concentração final 15mm), 0,25 mL de ascorbato de sódio de 100 mM (concentração final 2,5 mM), e 1 mL de 10mm Mohr de sal (concentração final 1 mM).
- Complete com H2O para um volume final de 10 mL, tendo em conta o volume da solução de enzima a ser adicionado na etapa 4.1.3.
- Adicionar a enzima αKAO purificada necessária de acordo com a alvo regioseletividade: KDO1 em uma concentração final de 0,075 mg/mL para a hidroxilação na posição C-3 ou KDO2 em uma concentração final de 0,5 mg/mL para a posição C-4 de L-lisina. Determinou-se a concentração final da enzima purificada para permitir uma conversão completa em cerca de 3 h.
- Agite a mistura de reação na temperatura de quarto a 300 rpm para a duração apropriada. Quando o monitoramento da reação indica uma reação de hidroxilação concluído (executar todas as etapas detalhadas no passo 6 para a reação de protocolo de monitorização), vá para a etapa 4.1.5. Um tempo de reação típico é de 3h.
- Adicionar 100 µ l de 100mm PLP a mistura de reacção αKAO (concentração final ~ 1 mM). Em seguida, adicionar 100 µ l de 100 mM DTT (concentração final ~ 1 mM), exceto quando usando o LDCSrum.
- Adicionar purificada PLP-DC: LDCSrum uma concentração final aproximado de 0,05 mg/mL para a reação em cascata com KDO1 ou DCnegras a uma concentração final aproximada de 0,5 mg/mL para a reação em cascata com KDO2.
- Agitar a mistura de reação à temperatura ambiente, 300 rpm, para 18 h e continuar diretamente para as etapas detalhadas no passo 4.3.
- Síntese do derivado dihydroxylated
- Adicionar 0,5 mL de tampão HEPES de 1 M, pH 7,5 (concentração final 50 mM), 1 mL de 100 mM L-lisina (concentração final 10 mM), 1 mL de ácido alfa-cetoglutárico 150mm (concentração final 15mm), 0,25 mL de ascorbato de sódio de 100 mM (concentração final 2,5 mM) , e 1 mL de 10mm Mohr de sal (concentração final 1 mM). Complete com H2O para um volume final de 10 mL, tendo em conta o volume da solução de enzima a ser adicionado na etapa 4.2.2.
- Adicione KDO1 para uma concentração final de 0,075 mg/mL. Agite a mistura de reação à temperatura ambiente, a 300 rpm para a duração apropriada.
- Quando o monitoramento da reação indica uma reação de hidroxilação concluído (consulte a etapa 6 para a reação de protocolo de monitorização), prossiga para a etapa 4.2.5. Um tempo de reação típico é de 3h.
- Adicionar 1 mL de ácido alfa-cetoglutárico 150mm (concentração final 15mm), 0,25 mL de ascorbato de sódio de 100 mM (concentração final 2,5 mM), e 1 mL de 10mm Mohr de sal (concentração final 1 mM).
- Adicione KDO2 para uma concentração final aproximada de 0,5 mg/mL, calculado usando o volume de reação inicial. Agite a mistura de reação na temperatura de quarto a 300 rpm para 18 h.
- Quando o monitoramento da reação indica uma reação dihydroxylation concluído (consulte a etapa 6 para a reação de protocolo de monitorização), prossiga para a etapa 4.2.7. Um tempo de reação típico é 18 h.
- Adicione 100 µ l de 100 mM da televisão digital terrestre (concentração final ~ 1 mM), exceto quando usando o LDCSrum.
- Adicione o DC purificadanegras a uma concentração final aproximada de 0,5 mg/mL, calculado usando o volume de reação inicial.
- Agite a mistura de reação na temperatura de quarto a 300 rpm para 18 h.
- Têmpera
- Arrefecer a mistura de reação, colocando o copo de 250 mL frasco Erlenmeyer num banho de gelo.
- Adicione cuidadosamente, ao longo de aproximadamente 1 min, 0,25 mL de 6 M HCl, agitando manualmente delicadamente a mistura de reação de refrigeração. Siga as mesmas instruções de segurança, como os descritos no passo 2.1.
- Transferência a mistura ácida em uma centrífuga de fundo cónico de 50 mL do tubo usando um pipeta Pasteur equipada de vidro com um bulbo, então centrifugar a 1.680 x g e 4 ° C por 15 min.
- Retirar o sobrenadante e reserve em um balão de fundo redondo de 250 mL.
- Adicione 10 mL de água desionizada para o tubo de centrifuga fundo cónico contendo a pelota. Vórtice para Ressuspender o sedimento.
- Centrífuga a 1.680 x g, 4 ° C, por 15 min.
- Retirar o sobrenadante e adicioná-lo para o balão de fundo redondo de 250 mL contendo o primeiro sobrenadante (passo 4.3.4).
- Congelar os sobrenadantes coletados pela imersão do balão no nitrogênio líquido com mão constante agitação e transferir o frasco imediatamente para um colector de bancada Liofilizador para impedir que o material de descongelamento.
- Após o processo de liofilização é completo (overnight), retire o balão o liofilizador.
5. purificação de Amino álcoois bruto reacção enzimática
- Resina de troca iônica
- Dissolver o produto liofilizado no montante mínimo de aquosa 0,1 M de HCl (cerca de 4 mL) até partículas sólidas já não são visíveis o olho nu.
- Condição de uma resina de troca de cátion do grupo funcional ácido sulfônico, malha de 200-400, em uma coluna de vidro (20 x 250 mm) por eluição à pressão atmosférica de 1 M HCl (volumes de coluna 4) seguido de 0.1 M HCl (4 volumes de coluna; volume de coluna = 10 mL).
- Carrega a amostra cuidadosamente na parte superior da resina nas paredes da coluna de vidro usando uma micropipeta de 1.000 µ l. Em seguida, enxaguar o tubo cónico-parte inferior que continha o produto bruto três vezes com 1 mL 0,1 M de HCl solução aquosa por lavar e carregar os volumes de enxaguamento resultante para a coluna da mesma forma.
- Eluir com um não-linear gradiente: 4 volumes de coluna de 0.1 M HCl, 4 volumes de coluna de água, 4 volumes de coluna de 5% NH4OH, 4 volumes de coluna de 10% NH4OH, 4 volumes de coluna de 15% NH4OH, 4 volumes de coluna de 20% NH4OH , 4 volumes de coluna de 25% de NH4OH e por último 4 volumes de coluna de 28% NH4OH.
- Monitorar a purificação por HPLC (consulte a etapa 6).
- As frações contendo o composto (NH4OH 20-28%) do pool e congela, conforme descrito em etapas 4.3.8-4.3.9.
Nota: A coluna de troca iônica pode ser reutilizada após eluição com água desionizada para neutralização de água de eluição (aproximadamente 50 mL) seguida de recondicionamento por eluição com 50 mL de 1 M de HCl.
- SPE
- Solubilize o composto liofilizado em cerca de 2 mL de H3PO4/water (20 µ l/mL).
- Lugar um modo misto permutadora de catiões SPE 6 mL-cartucho sobre um colector de extração ligado a uma bomba de água. Condição do cartucho pelo desenho através de 4 mL de metanol sob pressão reduzida fornecida pelo colector de. Equilibrar o cartucho pelo desenho através de 4 mL de H3PO4/water (20 µ l/mL).
- Carregar a amostra para o cartucho usando uma micropipeta µ l 1.000 no topo da resina nas paredes da coluna de vidro e enxaguar o frasco que contém o produto três vezes com 0,75 mL de H3PO4/water (20 µ l/mL), por lavagem. Carrega o volume resultante de enxaguamento para a coluna da mesma forma.
- Lavar o cartucho por eluição sob pressão reduzida, fornecida pelo colector de, 4 mL de 2% HCOOH na água e, em seguida, com 4 mL de água. Eluir com um gradiente de NH4OH em água (4 mL para cada eluição, a partir de 4% NH4OH: 10%, 15%, 15%, 20% e 28%).
- Monitore a purificação por HPLC, analisando cada fração de acordo com a reação de monitoramento protocolo descrito na etapa 6. Mantenha todas as frações que contêm puro derivado desejado de acordo com o cromatograma de (UV) ultravioleta e prossiga para a etapa 5.2.6.
- Piscina as frações contendo o desejado composto para uma 100 mL redonda balão de fundo, lave os tubos contendo as frações com água e adicionem o volume de lavagem para os 100 mL redonda balão de fundo.
- Remova o solvente sob pressão reduzida usando um evaporador rotativo equipado com um termostato banho jarro eléctrico a 40 ° C e ligado a uma bomba de vácuo de 10 mbar.
- Solubilizar o sólido em um volume mínimo de água e transferir a solução para uma pesada 25 mL redonda balão de fundo. Lavar o balão com um volume mínimo de água, adicionar o volume de lavagem para o balão de 25 mL e prossiga para a etapa 5.2.9.
- Pesar o produto purificado e calcular o rendimento.
- Dissolver o produto purificado no volume mínimo de 2M de HCl até partículas sólidas não são mais visíveis para o olho nu e congela, conforme descrito em etapas 4.3.8-4.3.9.
Nota: Os aminoácidos álcoois são compostos sensíveis e são mantidos como seus sais de cloridrato.
6. reação de monitoramento e análises de produtos
- Derivatização de substratos e produtos antes da análise por HPLC
Nota: Os substratos e produtos precisam ser derivatizado como derivados aromáticos para aumentar sua detectivity cromatográfica de UV. Nós usamos 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno (DNFB). Cada amostra foi injetada a HPLC imediatamente após derivatização.- Leve 10 µ l da reação enzimática e transferência para um microtubo de 1,5 mL. Adicione 10 µ l de 0,25 M de solução aquosa de NaHCO3 , 100 µ l de etanol e 30 µ l de 2,5 mg/mL de solução DNFB em etanol.
- Feche o microtubo e agite a solução resultante por 1h a 65 ° C, a 1.000 rpm. Saciar com 10 µ l 1 M de HCl.
- Filtrar com um filtro de seringa não estéreis de diâmetro de 4 mm com uma 0,22 µm poro tamanho hidrofílico polivinilideno fluoreto (PVDF) membrana usando uma seringa de 1 mL Luer.
- Realize monitoramento da reação da dioxigenase usando qualquer sistema capaz de separar pyrazole de aminoácidos. Este protocolo envolve detecção no ultravioleta de aminoácidos derivatizado pelo grupo cromóforo dinitrobenzeno (DNB)27.
- Encaixe a HPLC com C18 com uma trimetil silil endcapping fase reversa coluna (5 µm, 3 x 150 mm).
- Equilibrar a coluna C18 com o eluente (30:70) B (MeCN + 0,1% TFA) de eluente A (H2O + 0,1% TFA) a uma taxa de fluxo de 1 mL/min e 35 ° C por 15 min (correspondente a cerca de 20 volumes de coluna).
- Injectar 10 µ l da mistura de reação pyrazole (consulte a etapa 6.1) na coluna C18 de HPLC. Usar uma mistura de MeCN, 0,1% TFA/H2O e 0,1% TFA como eluente com um gradiente linear (ratio 30:70 para 70:30 em 9 min, temperatura de 35 ° C, fluxo de 1ml/min).
- Usar a detecção de UV de 400 nm para analisar os produtos eluídos na coluna cromatográfica. DNB-lisina elutes normalmente cerca 6,5 min, hidroxilado DNB-lisina em torno de 5,5 min, dihydroxylated DNB-lisina em torno de 4,2 min e DNB-aminodiol em torno de 5,3 min.
7. NMR análise de purificado Amino álcoois
- Dissolver purificadas aminoácidos álcoois em D2O (700 µ l) e transferir a solução para um tubo de ressonância magnética Nuclear (RMN).
- Aquisição de 1H e espectro de RMN de C 13de acordo com o apropriado NMR facilidade protocolos28.
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Representative Results
Temos relatado anteriormente a síntese de mono - e di-hidroxi-L-lisinas por diastereoselective hidroxilação enzimática catalisada por dioxygenases do ferro (II) / αKAO família (Figura 1)16. Para otimizar o protocolo das cascatas toda apresentada aqui, que combinam um ou dois passos de hidroxilação catalisados por uma αKAO, seguido por uma etapa de descarboxilação catalisada por um Pip-DC, as condições de reação foram ajustadas para satisfazer os requisitos de ambos reações enzimáticas. Começamos por investigar as atividades dos dois DCs, LDCSrum e DCnegras, em direção a comercialmente disponíveis (5R) - hidroxi - L-lisina. Então nós analisada as atividades de DC para os derivados mono, 3-hidroxi-L-lisina (1) e 4-hidroxi-L-lisina (2), em cascata com a etapa de oxidação catalisada pelo αKAO apropriado. A tabela 1 apresenta os resultados das decarboxylations biocatalytic dos mono-hidroxi-L-lisinas. As conversões foram medidas por HPLC após derivatização da mistura de reação com DNFB para dar o correspondente DNB derivatizado substratos e produtos.
| Entrada | Substrato | PLP-DC | Produto | Conversão |
| 1 | (5R) - hidroxi - L-lisina | LDCSrumb) | 4 | 100% |
| 2 | (5R) - hidroxi - L-lisina | DCnegrasb) | 4 | n.d. |
| 3 | 1 um) | LDCSrumb) | 5 | 100% |
| 4 | 1 um) | DCnegrasb) | 5 | 29% |
| 5 | 2 um) | LDCSrumc) | 6 | 60% |
| 6 | 2 um) | DCnegrasc) | 6 | 100% |
Tabela 1: descarboxilação Biocatalytic de monohidroxílico-L-lisinas. Condições da reação: substrato (10 mM), Pip-DC (0,1 a 0,15 mg mL-1), HEPES buffer (50 mM, pH 7,5), Pip (1 mM), TDT (1 mM; não usado com LDCSrum), durante a noite, RT, 300 rpm. (um) sintetizados enzimaticamente em situ. (b) 0,1 mg/mL. (c) 0,15 mg/mL; n.d.: não detectado
O DC de S. rumirantium (LDCSrum) exibiu atividade para todas as lisinas hidroxi mono com melhor conversão de 3 - 5-derivados e para as correspondentes diaminas hidroxi quirais (ítens 1, 3 e 5). Como esperado, DCnegras, o DC do contexto genômico αKAO, acabou por ser o mais adequado para a descarboxilação do (4R) - hidroxi - L-lisina (2) (entrada 6). Em reação padrão condições a conversão de (3S) - hidroxi - L-lisina (1) em sua contraparte sintetizado (5) com DCnegras foi baixa (entrada 4) e nenhuma atividade observou-se no sentido de (R. 5)- hidroxi-L-lisina (entrada 2).
Por último, podemos examinar as atividades de dois DCs em direção a di-hidroxi-L-lisina derivados 3, 8e 9, sintetizado em situ por um ou dois passos de hidroxilação catalisados por KDO1, KDO2 ou uma combinação dos dois (Figura 2). os resultados da descarboxilação biocatalytic dos di-hidroxi-L-lisinas estão resumidos na tabela 2.
| Entrada | Substrato | PLP-DC | Produto | Conversão |
| 1 | 3 | LDCSrumb) | 7 | n.d. |
| 2 | 3 | DCnegrasb) | 7 | 100% |
| 3 | 8 um) | LDCSrumb) | 10 | 19% |
| 4 | 8 um) | DCnegrasb) | 10 | 12% |
| 5 | 9 um) | LDCSrumc) | 11 | n.d. |
| 6 | 9 um) | DCnegrasc) | 11 | n.d. |
Tabela 2: Biocatalytic descarboxilação do dihidroxi-L-lisinas. Condições da reação: substrato (10 mM), Pip-DC (0,1 a 0,15 mg/mL), HEPES buffer (50 mM, pH 7,5), Pip (1 mM), TDT (1 mM; não usado com LDCSrum), durante a noite, RT, 300 rpm. (um) sintetizados enzimaticamente em situ. (b) 0,1 mg/mL. (c) 0,15 mg/mL; n.d.: não detectado.
Em relação a descarboxilação do lisinas-dihidroxi-L 3, 8e 9, os resultados não foram plenamente satisfatórios. As condições de reação padrão, apenas (R, 4R. 3) - dihidroxi - L-lisina (3) foi convertida quantitativamente o correspondente dihidroxi diamina 7 (entradas 1 - 2). A conversão de 4,5-dihidroxi-L-lisina (8) foi moderado (entradas 3-4), mas é importante notar que poderia ser melhorada, aumentando a carga de enzima. Nenhum dos dois testados PLP-DCs foram encontrados ativo para 3,5-dihidroxi-L-lisina (9) (entradas de 5-6).
As reações da cascata enzimática exibindo quantitativa conversão conforme determinado por HPLC de monitoramento foram ampliadas com sucesso (Figura 4).
Figura 4: dados analíticos representativos para a cascata enzimática de três passos. (A), HPLC, monitoramento de biocatalytic conversão de L-lisina em (2R,3R) - 1,5 - diaminopentan-2,3-diol (7). RT = tempo de retenção. (B) 1H NMR e (C) 13C NMR de amino álcool (7) após a purificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O protocolo de purificação apresentado permite a extração eficiente de aminoácidos álcoois da mistura complexa reação enzimática. A amino álcoois 4, 5, 6e 7 foram obtidos do excelente rendimento (Figura 5).
Figura 5: cascatas enzimáticas para a síntese de aminoácidos-álcoois. Síntese de (R) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (4), diaminopentan (S) - 1,5--2-ol (5), 1,5-diaminopentan-3-ol (6),, e 2R, 3R- 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (7). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Derivados e álcoois quirais de aminoácidos têm uma ampla gama de aplicações, desde auxiliares quirais para a síntese orgânica para terapia farmacêutica. Síntese de várias etapas para a produção de aminoácidos álcoois por síntese orgânica convencional são numerosos, mas nem sempre é eficiente porque passos de proteção/desproteção tedioso juntamente com um controle sensível do estereoquímica16. Uma abordagem biocatalytic que dispensa as medidas de proteção/desproteção e é geralmente altamente stereoselective representa uma boa alternativa.
Trabalhos anteriores relataram a síntese de vários β-amino álcoois com um backbone de 2-phenylethan-1-amina por transformação assimétrica cinética dinâmica (DYKAT). Nesta rota, o centro estereogênico hidroxi-substituídos foi introduzido por aldolisation no benzaldeído e derivados, catalisados por uma aldolase treonina. A baixa diastereoseletividade e o rendimento moderado desta primeira etapa foram superados pela estereoespecífico subsequentes de descarboxilação catalisada por DC L-tirosina, levando a enantioenriched aromáticos β-amino álcoois11,12.
Nós relatamos aqui um protocolo simples para a síntese de vários aminoácidos álcoois a partir de L-lisina prontamente disponível. Apesar de muito eficiente, este protocolo sofre inconvenientes devido a intervalos de substrato limitada dos αKAO e enzimas PLP-DC. No entanto, biocatalytic síntese de vários aminoácidos álcoois pode ser considerado usando diferentes combinações de outras αKAO e ácido aminado DCs29,30,31,32. É interessante notar que a ordem de duas etapas é crítica em cascata como os PLP-DCs também são ativos no sentido do L-lisina. Deve ter cuidado para garantir que todas o L-lisina é consumido na etapa oxidativa primeira antes de executar a reação de descarboxilação catalisada pela PLP-DC. Isto é assegurado através de um acompanhamento atento da reação por HPLC após derivatização da mídia por um agente cromóforo reação. A baixa tolerância da enzima a concentração de substrato alta é uma limitação para o desenvolvimento. Para resolver este problema, estratégias de evolução de enzima pode ser usado para otimizar as propriedades da enzima, tais como a concentração de substrato tolerância33. Também, a imobilização da enzima pode ser considerada para garantir a reutilização da enzima.
Este protocolo é fácil de realizar, e uma das suas características mais atraentes é a eficiência das etapas de purificação. Em nosso trabalho anterior, a extração direta de moléculas polares de mistura de reacção enzimática complexo foi um problema, e derivatização dos compostos por grupos hidrofóbicos foi necessário16. A purificação dos aminoácidos álcoois diretamente da reação sem derivatização exigiu trabalho extenso. Neste protocolo, as fases de purificação, combinação de resina de troca iônica e extração de fase sólida remove glicerol (contido na solução enzimática) e tampão HEPES, duas moléculas polares com propriedades físico-químicas perto do aminoácidos álcoois como alvo e, portanto, difícil separar estes compostos. Este protocolo de purificação pode ser adaptado para a extração de várias moléculas polares de misturas de reação complexa, tais como aqueles de reacções enzimáticas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores graças a Véronique de Berardinis para discussão proveitosa e Alain Perret, Christine Pellé e Peggy Sirvain para suporte técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L-lysine hydrochloride | Sigma Aldrich | L5626 | |
| (5S)-hydroxy-L-lysine | Sigma Aldrich | GPS NONH | Out sourcing |
| α-ketoglutaric acid | Sigma Aldrich | 75892 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate | Acros | 201370250 | |
| Pyridoxal phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | 82870 | |
| 3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632 | |
| 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Sigma Aldrich | D1529 | |
| Ethanol | VWR | 20825.290 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 71631 | |
| HCl 37% | Sigma Aldrich | 435570 | |
| HCl 0.1M | Fluka | 35335 | |
| Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83640.320 | |
| 2,2,2-trifluoroacetic acid | VWR | 153112E | |
| Ammonia 28% | VWR | 21182.294 | |
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83638.32 | |
| Formic acid | Acros | 270480010 | |
| Phosphoric acid 85% | Acros | 201145000 | |
| Deuterium oxide | Acros | 320,710,075 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| C18 HPLC column | Phenomenex | 00F-4601-Y0 | |
| Accela UHPLC System | ThermoFisher Scientific | ||
| Accela PDA detector | ThermoFisher Scientific | ||
| 4mm syringe filters - 0,22µm - PVDF | Merck | SLGVR04NL | |
| Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip | VWR | HSWA5010.200V0 | |
| Cation exchange resin 100-200 mesh | Sigma Aldrich | 217506 | |
| Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL | Waters | 186000776 | |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | |
| Rotary evaporator | Büchi | 531-0103 | |
| Lyophilizer alpha 1-2 LDplus | Christ | L083302 | |
| Micropipette 20 µL | Eppendorf | 3121000031 | |
| Micropipette 100 µL | Eppendorf | 3121000074 | |
| Micropipette 500 µL | Eppendorf | 3121000112 | |
| Micropipette 1000 µL | Eppendorf | 3121000120 | |
| 300 MHz spectrometer | Bruker | ||
| 2 mL microtube | CLEARLine | CL20.002.0500 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tube | Fischer Scientific | 05-539-8 | |
| 25 mL round-bottom flask 14/23 | Fischer Scientific | 10353331 | |
| 100 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL erlenmeyer flask | Fischerbrand | 15496143 |
References
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