Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Enzymatisk Cascade reaktioner til syntese af Chiral Amino alkoholer fra L-lysin

Published: February 16, 2018 doi: 10.3791/56926
Automatic Translation
1, 1, 1
1Génomique Métabolique, Genoscope, Institut François Jacob, CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay

Summary

Chiral amino alkoholer er alsidige molekyler til brug som stilladser i organisk syntese. Startende fra L-lysin, vi syntetisere amino alkoholer ved en enzymatisk cascade reaktion over kombinerer diastereoselective C-H oxidation katalyseret af dioxygenase efterfulgt af spaltning af carboxylsyre gruppe af tilsvarende hydroxyl amino syre af en decarboxylase.

Abstract

Amino alkoholer er alsidige forbindelser med en bred vifte af applikationer. For eksempel, har de været brugt som chiral stilladser i organisk syntese. Deres syntese af konventionelle organisk kemi kræver ofte trættende multi-step syntese processer, med vanskelige kontrol af stereokemiske resultatet. Vi præsenterer en protokol til enzymatisk synthetize amino alkoholer, startende fra den let tilgængelige L-lysin i 48 timer. Denne protokol kombinerer to kemiske reaktioner, der er meget vanskelige at gennemføre af konventionelle organisk syntese. I den første skridt, den regio- og diastereoselective oxidering af en unactivated C-H bond af lysin er side-kæden katalyseret af et dioxygenase; en anden regio- og diastereoselective oxidering katalyseret af et regiodivergent dioxygenase kan føre til dannelsen af 1,2-dioler. I det sidste trin, er den carboxylic gruppe af alpha aminosyre kløvet af en pyridoxal-fosfat (PLP) decarboxylase (DC). Dette decarboxylative trin påvirker kun den alpha carbon af aminosyre, bevarer den hydroxy-substituerede stereogenic center i en beta/gamma position. De resulterende amino alkoholer er derfor optisk beriget. Protokollen blev anvendt til semipreparative-skala syntesen af fire amino alkoholer. Overvågning af reaktionerne, der blev gennemført ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) efter forædling af 1-fluoro-2,4-dinitrobenzen. Ligetil rensning af fast-fase ekstraktion (SPE) ydes de amino alkoholer med fremragende udbytter (93% > 95%).

Introduction

Trods de fordele, der tilbydes af biocatalysis, stadig integration af biocatalytic trin i syntetisk veje eller samlede biocatalytic ruter for det meste begrænset til enzymatisk kinetic resolutioner. Disse ruter er blevet bredt anvendt som et første skridt i asymmetriske kemo-enzymatisk syntese, men biocatalysis tilbyder mange flere muligheder i den funktionelle gruppe interconversions med høj stereoselectivity1,2,3 . Desuden som biocatalytic reaktioner er gennemført under lignende forhold, er det derfor muligt at udføre cascade reaktioner i et en-pot mode4,5.

Chiral amino alkoholer er alsidige molekyler til brug som medhjælpere eller stilladser i organisk syntese6. Amino alkohol-gruppe er ofte fundet i sekundære metabolitter og aktive farmaceutiske ingredienser (API). Primære β-amino alkoholer er let tilgængelige fra de tilsvarende α-aminosyrer af konventionelle kemisk syntese, men adgang til chiral γ-amino alkoholer eller sekundære amino alkoholer kræver ofte trættende syntetiske veje samt følsomme kontrol af stereokemi7,8,9,10. På grund af sin høje stereoselectivity, kan biocatalysis give en overlegen syntesevejen til disse chiral byggesten11,12,13,14.

Vi har tidligere rapporteret syntese af mono - og di-hydroxy-L-lysines af diastereoselective enzymatisk hydroxylering katalyseret af dioxygenases af jern (II) / α-ketosyre-afhængige oxygenase familie (αKAO) (figur 1)15. Navnlig, startende fra L-lysin, KDO1 dioxygenase katalyserer dannelsen af (3S) - hydroxy afledte (1), mens (4R) - derivat (2) er dannet ved reaktion med KDO2 dioxygenase. Successive regiodivergent hydroxylations af KDO1 og KDO2 føre til dannelsen af (3R, 4R) - dihydroxy - L-lysin (3) i optisk ren form. Dog hindrer begrænset substrat vifte af disse enzymer deres store udnyttelse i kemisk syntese, især i hydroxylering af simple aminer, som en carboxylsyre gruppe i α-stilling aminogruppen er afgørende for aktivitet16.

Figure 1
Figur 1: Biocatalytic konverteringer af L-lysin. Omregning til (3S) - hydroxy - L-lysin (1) katalyseret af KDO1 dioxygenase; (4R) - hydroxy - L-lysin (2) katalyseret af KDO2 dioxygenase; og (3R, 4R) - dihydroxy - L-lysin (3) af cascade reaktion katalyseret successivt ved KDO1 og KDO2 dioxygenases. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Decarboxylation er en fælles reaktion i metabolisme17. Især aminosyren DCs (EC 4.1.1) er fri for cofaktor (pyruvoyl-afhængige) eller PLP-afhængige enzymer, og katalyserer decarboxylation af aminosyrer i de tilsvarende polyaminer i bakterier og højere organismer18,19 , 20 , 21 , 22. mono- og dihydroxy forbindelser (figur 3) 4-7, 10-11 svarer til hydroxyleret cadaverine, diamin fremstillet ved decarboxylation af L-lysin. Cadaverine er en vigtig byggesten i den kemiske industri, specielt det er en komponent af polyamid og polyurethan polymerer. Derfor biobaseret produktion af denne diamin fra vedvarende ressourcer har tiltrukket sig opmærksomhed som et alternativ til ruten oliebaserede, og forskellige mikroorganismer har været udviklet til dette formål. I disse metaboliseringsveje er lysin DC (LDC) det vigtigste enzym. LDC er en PLP-afhængige enzym tilhører den alanin racemase (AR) strukturelle familie23. PLP-afhængige DCs (PLP-DCs) er kendt for at være meget substrat-specifikke. Men et par enzymer egen evne til lille promiskuitet, være aktiv mod både L-ornithin og L-lysin aminosyrer, som for eksempel LDC fra Selenomonas rumirantium (LDCSrum), som har lignende kinetiske konstanter for Lysin og ornithin decarboxylation24,25. Denne udvidede substrat specificitet gør dette enzym en god kandidat til decarboxylation af mono - og di-hydroxy-L-lysin. Derudover for at finde DCs aktive mod hydroxyl derivater af lysin, undersøgte vi genomisk forbindelse med generne kodning αKAO enzymer. Faktisk, i prokaryote genomer gener kodning enzymer involveret i den samme biosyntetiske pathway er generelt Co er lokaliseret i gen klynger. KDO2 (fra Chitinophaga pinensis) genet blev fundet Co lokaliseret med et gen, der koder formodede PLP-DC (figur 2). Derimod er ingen gen kodning for DC blevet fundet når analyserer genomisk forbindelse med KDO1 dioxygenase. PLP-DC protein fra C. pinensis (DCCpin) blev derfor udvalgt som lovende kandidat til at katalysere decarboxylation skridt af cascade reaktion.

Figure 2
Figur 2: genomisk kontekst af KDO2 gen i C. pinensis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Derfor, vi designet enzymatisk cascade reaktion, der involverer dioxygenases og DCs at opnå syntesen af alifatiske chiral β - og γ-amino alkoholer fra aminosyrer (figur 3). Som tidligere rapporteret introducerer C-H oxidation katalyseret af αKAO hydroxy-substituerede stereogenic center med total diastereoselectivity; Cβ/γ chiralitet vil blive bevaret i decarboxylative trin, som kun påvirker Cα carbon aminosyre gruppe16.

Figure 3
Figur 3: retrosyntetiske analyse. (A) Retrosynthesis af β - og γ-amino alkoholer (R) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (4) (5R) - hydroxy - L-lysin, og (S) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (5) og 1,5-diaminopentan-3-ol (6) fra L-lysin. (B) Retrosynthesis af β-, γ- og β, δ-amino dioler (2S, 3S) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (10) og (2R, 4S) - 1,5 - diaminopentane-2,4-diol (11) startende fra (5R)- hydroxy-L-lysin, og (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (7) med udgangspunkt i L-lysin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Start fra L-lysin og dens (5R)-hydroxy derivat, vi heri rapport en to/tre trin, en pot, enzymatisk procedure kombinerer dioxygenases og PLP-DCs at opnå målet amino alkoholer. Forudgående syntese på laboratoriet omfanget af målmolekyler, metoden er udviklet af den analytiske skala til at justere reaktionsbetingelser, fx, enzym koncentrationer, forpligtet til at tillade fuld konvertering af udgangsmaterialer; Vi præsenterer denne procedure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. enzympræparat

  1. Express og rense proteiner som tidligere beskrevet26.
    Bemærk: Rekombinante proteiner er fremstillet med den følgende endelige koncentration: αKAO fra Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL; ΑKAO fra C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM6 (KDO2), 2,29 mg/mL; PLP-DCs fra S. rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (LDCSrum), celle gratis uddrag med samlede enzym på 12.44 mg/mL; PLP-DC fra C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (DCCpin), 2.62 mg/mL.

2. udarbejdelsen af løsninger

Bemærk: Alle løsningerne nedenfor er udarbejdet i ionbyttet vand.

  1. Forberede 1 M af HEPES buffer, pH 7,5; justere med 5 M NaOH.
    Bemærk: Under trinnet pH justering bære beskyttende handsker, beskyttelsesdragt, øjenbeskyttelse og ansigtsbeskyttelse (P280). I tilfælde af kontakt med øjnene (P305, P351, P338), skyl forsigtigt med vand i flere min. Fjern kontaktlinser, hvis muligt. Fortsæt skylning og straks ringe til en gift center eller læge (P310). P-kode henviser til forsigtighedsprincippet redegørelse (hazard klasse og kategori; jf., fx, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).
  2. Forberede 100 mM L-lysin, 100 mM (5S) - hydroxy - L-lysin, 150 mM α-ketoglutaric acid, 100 mM natrium Ascorbat, 10 mM ammonium Aluminiumacetat sulfat hexahydrat (Mohr salt), 100 mM pyridoxal 5-fosfat (PLP) og 100 mM dithiothreitol (DTT).
  3. Forberede 1 M, 2M og 6M saltsyre (HCl) fra en 37% HCl løsning (ca 12 M opløsning), efter de samme sikkerhedsinstruktioner som beskrevet i punkt 2.1.
    Bemærk: Løsninger af α-ketoglutaric syre, natrium Ascorbat og ammonium Aluminiumacetat sulfat hexahydrat skal være lavet frisk på dagen for brug. Lysin løsning kan opbevares i flere måneder ved stuetemperatur. PLP løsning kan opbevares i en måned ved 4 ° C. DTT-løsning kan opbevares i en måned ved-20 ° C.

3. analytisk-skala reaktioner

  1. Metodeudvikling for decarboxylation reaktionen (5R) - hydroxy - L-lysin
    1. Tilføje 11 µL 1 M opløsning af HEPES buffer pH 7,5 (slutkoncentration 50 mM) til en 2 mL microtube. Derefter tilsættes 22 µL af 100 mM (5S) - hydroxy - L-lysin (slutkoncentration 10 mM), 2.2 µL af 100 mM PLP (slutkoncentration 1 mM), og 2,2 µL af 100 mM DTT (slutkoncentration 1 mM).
      Bemærk: Ved reaktion med LDCSrum, tilsætning af DTT er ikke nødvendige.
    2. Tilføj den renset PLP-DC (endelig koncentration 0,1 mg/mL). Komplet med H2O for en endelige mængden af 220 µL.
    3. Ryste reaktionsblandingen ved stuetemperatur, med en åben låget i åben luft på 300 rpm i 3 timer.
      Bemærk: Ryster reaktionsblandingen med en åben låget i åben luft sikrer en god iltning af reaktion medier. Det er således ikke nødvendigt at boble ilt i reaktion medier.
    4. Indsamle 10 µL af reaktionsblandingen analyseres efter reaktion overvågning proceduren beskrevet i trin 6. Prøverne er fortrinsvis derivatized og analyseres umiddelbart efter prøveudtagning.
  2. Metodeudvikling for den enzymatiske cascade reaktion kombinerer en hydroxylering trin katalyseret af αKAO med decarboxylation katalyseret af PLP-DC
    1. Tilføje 11 µL 1 m af HEPES buffer pH 7,5 (slutkoncentration 50 mM) til en 2 mL microtube. Derefter tilsættes 22 µL af 150 mM af α-ketoglutaric syre (slutkoncentration 15 mM), 5,5 µL af 100 mM af natrium Ascorbat (slutkoncentration 2,5 mM), 22 µL af 10 mM af Mohr's salt (slutkoncentration 1 mM), og 22 µL af 100 mM af L-lysin (slutkoncentration 10 mM).
    2. Komplet med H2O for en endelige mængden af 220 µL, under hensyntagen til omfanget af enzymet løsningen føjes taktfast 3.2.3.
    3. Tilføj den påkrævede renset αKAO enzym ifølge den målrettede regioselektivitet: KDO1 for hydroxylering i position C-3 eller KDO2 til position C-4 af L-lysin. Den endelige koncentration af renset enzym (0,05-0,5 mg/mL) var fast besluttet på at give en komplet konvertering i ca 3 timer.
    4. Ryste reaktionsblandingen ved stuetemperatur, med en åben låget i åben luft på 300 rpm i 3 timer.
    5. Tilføje 2,2 µL af 100 mM af PLP (slutkoncentration ~ 1 mM) og 2,2 µL af 100 mM DTT (slutkoncentration ~ 1 mM).
      Bemærk: Ved reaktion med LDCSrum, tilsætning af DTT er ikke nødvendige.
    6. Tilføj den renset PLP-DC på en koncentration, der muliggør komplet konvertering i 18 h: LDCSrum i en omtrentlig endelig koncentration 0,1 mg/ml for cascade reaktionen med KDO1, og DCCpin i en omtrentlig endelig koncentration på 0,5 mg/mL for den Cascade reaktion med KDO2.
    7. Ryste reaktionsblandingen ved stuetemperatur, med en åben låget i åben luft på 300 rpm til 18 h.
    8. Køre en kontrolprocedure i trin 3.1.4.
  3. Metodeudvikling for den enzymatiske cascade reaktion kombinerer to hydroxylering trin katalyseret af αKAOs med decarboxylation katalyseret af PLP-DC
    1. Kør trin 3.2.1-3.2.2.
    2. Tilføje KDO1 i en endelig koncentration på 0,05 mg/mL. Ryste reaktionsblandingen ved stuetemperatur, med en åben låget i åben luft på 300 rpm i 3 timer.
    3. Tilføje KDO2 i en omtrentlig endelig koncentration på 0,5 mg/mL, beregnes den første reaktion volumen. Ryste reaktionsblandingen ved stuetemperatur, med en åben låget i åben luft på 300 rpm til 18 h.
    4. Kør trin 3.2.5.
    5. Tilføj den renset PLP-DC-DCCpin i en omtrentlig endelig koncentration på 0,5 mg/mL, beregnes den første reaktion volumen. Ryste reaktionsblandingen ved stuetemperatur, med en åben låget i åben luft på 300 rpm til 18 h.
    6. Køre kontrolprocedure som i trin 3.1.4.

4. semi-forberedende One-pot Biocatalytic reaktion

Bemærk: Enzymatiske reaktioner er udført på 0,1 mmol af L-lysin i en open-air 250 mL glas Erlenmeyerkolben for en samlet maengde paa 10 mL.

  1. Syntese af monohydroxylated derivater
    1. Der tilsættes 0,5 mL 1 M HEPES buffer, pH 7,5 (slutkoncentration 50 mM) til kolben. Derefter tilsættes 1 mL 100 mM L-lysin (slutkoncentration 10 mM), 1 mL af 150 mM α-ketoglutaric syre (slutkoncentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM natrium Ascorbat (slutkoncentration 2,5 mM), og 1 mL af 10 mM Mohr's salt (slutkoncentration 1 mM).
    2. Komplet med H2O for en endelige mængden af 10 mL, under hensyntagen til omfanget af enzymet løsningen føjes taktfast 4.1.3.
    3. Tilføj den påkrævede renset αKAO enzym ifølge den målrettede regioselektivitet: KDO1 i en endelig koncentration på 0.075 mg/mL for hydroxylering i position C-3 eller KDO2 i en endelig koncentration på 0,5 mg/mL til position C-4 af L-lysin. Den endelige koncentration af renset enzymet var fast besluttet på at aktiverer en komplet konvertering i ca 3 timer.
    4. Ryste reaktionsblandingen ved stuetemperatur på 300 rpm for passende varighed. Når reaktionen overvågning angiver en udfyldt hydroxylering reaktion (Kør alle trin beskrevet i trin 6 for reaktionen kontrol protokol), Fortsæt til trin 4.1.5. En typisk reaktionstid er 3 h.
    5. Tilsæt 100 µL af 100 mM PLP til αKAO reaktionsblandingen (slutkoncentration ~ 1 mM). Derefter tilsættes 100 µL af 100 mM DTT (slutkoncentration ~ 1 mM), undtagen når du bruger LDCSrum.
    6. Tilføje renset PLP-DC: LDCSrum i en omtrentlig endelig koncentration på 0,05 mg/mL for cascade reaktion med KDO1 eller DCCpin i en omtrentlig endelig koncentration på 0,5 mg/mL for cascade reaktion med KDO2.
    7. Ryste reaktionsblandingen ved stuetemperatur, 300 rpm, til 18 h og fortsætte direkte til trinene beskrevet taktfast 4.3.
  2. Syntese af dihydroxylated derivat
    1. Der tilsættes 0,5 mL 1 M HEPES buffer, pH 7,5 (slutkoncentration 50 mM), 1 mL 100 mm L-lysin (slutkoncentration 10 mM), 1 mL af 150 mM α-ketoglutaric syre (slutkoncentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM natrium Ascorbat (slutkoncentration 2,5 mM) , og 1 mL af 10 mM Mohr's salt (slutkoncentration 1 mM). Komplet med H2O for en endelige mængden af 10 mL, under hensyntagen til omfanget af enzymet løsningen føjes taktfast 4.2.2.
    2. Føje KDO1 til en endelig koncentration på 0.075 mg/mL. Ryste reaktionsblandingen ved stuetemperatur på 300 rpm for passende varighed.
    3. Når reaktionen overvågning angiver en udfyldt hydroxylering reaktion (Se trin 6 for reaktionen kontrol protokol), Fortsæt til trin 4.2.5. En typisk reaktionstid er 3 h.
    4. Der tilsættes 1 mL af 150 mM α-ketoglutaric syre (slutkoncentration 15 mM), 0,25 mL 100 mM natrium Ascorbat (slutkoncentration 2,5 mM), og 1 mL af 10 mM Mohr's salt (slutkoncentration 1 mM).
    5. Føje KDO2 til en omtrentlig endelig koncentration på 0,5 mg/mL, beregnes den første reaktion volumen. Ryste reaktionsblandingen ved stuetemperatur på 300 rpm til 18 h.
    6. Når reaktionen overvågning angiver en udfyldt dihydroxylation reaktion (Se trin 6 for reaktionen kontrol protokol), Fortsæt til trin 4.2.7. En typisk reaktionstid er 18 h.
    7. Tilsæt 100 µL af 100 mM DTT (slutkoncentration ~ 1 mM), undtagen når du bruger LDCSrum.
    8. Tilføj den renset DCCpin i en omtrentlig endelig koncentration på 0,5 mg/mL, beregnes den første reaktion volumen.
    9. Ryste reaktionsblandingen ved stuetemperatur på 300 rpm til 18 h.
  3. Dæmper
    1. Køle ned reaktionsblandingen ved at placere 250 mL glas Erlenmeyerkolben i isbad.
    2. Tilføj forsigtigt, over ca 1 min, 0,25 mL 6 M HCL ved manuelt forsigtigt ryste den afkølede reaktionsblandingen. Følg sikkerhedsinstruktionerne samme som beskrevet i trin 2.1.
    3. Overførsel sure blandingen i en 50 mL konisk bund centrifuge rør ved hjælp af et glas Pasteur pipette udstyret med en pære, derefter centrifugeres ved 1.680 x g og 4 ° C i 15 min.
    4. Trække supernatanten og holde udtaget i en 250 mL runde-bunden kolbe.
    5. Der tilsættes 10 mL deioniseret vand til konisk bund centrifugeglasset indeholdende pelleten. Vortex til genopslæmmes pellet.
    6. Der centrifugeres ved 1,680 x g, 4 ° C i 15 min.
    7. Trække supernatanten og føje den til 250 mL runde-bunden kolbe indeholdende den første supernatanten (trin 4.3.4).
    8. Fryse de indsamlede analysere ved nedsænkning af kolben til flydende kvælstof med konstant hånd hvirvlende, og overføre kolben straks til en benchtop manifold fryse-tørretumbler til at forhindre, at materialet optøning.
    9. Efter den freeze-drying proces er færdig (natten), fjernes kolben fra freeze-tørretumbler.

5. rensning af Amino alkoholer fra rå enzymatisk reaktionsblanding

  1. Ionbytteren
    1. Opløse den frysetørret produkt i det mindste beløb af vandige 0,1 M HCL (ca 4 mL) indtil faste partikler er ikke længere synlige for nøgen-øjet.
    2. Tilstand en ethylbenzthiazolinsulfonsyre syre funktionsgruppe kationbytter harpiks, 200-400 mesh, i en glaskolonne (20 x 250 mm) af eluerer ved atmosfærisk tryk 1 M HCl (4 kolonne diskenheder) efterfulgt af 0,1 M HCl (4 kolonne diskenheder; kolonne volumen = 10 mL).
    3. Indlæse prøve omhyggeligt på toppen af harpiks på væggene i kolonnen glas ved hjælp af en 1.000 µL mikropipette. Skyl derefter, konisk bund centrifugeglasset, der indeholdt den rå vare tre gange med 1 mL 0,1 M HCl vandig opløsning pr. vask, og indlæse de resulterende skyl systemdiskenhederne til kolonnen på samme måde.
    4. Elueres med en ikke-lineær gradient: 4 kolonne mængder af 0,1 M HCl, 4 kolonne mængder vand, 4 kolonne bind 5% NH4OH, 4 kolonne bind 10% NH4OH, 4 kolonne mængder af 15% NH4OH, 4 kolonne mængder af 20% NH4OH , 4 kolonne mængder af 25% NH4OH og endelig 4 kolonne bind 28% NH4OH.
    5. Overvåge rensning af HPLC (Se trin 6).
    6. Pool fraktioner der indeholder sammensatte (NH4OH 20-28%) og frysetørre som beskrevet i trin 4.3.8-4.3.9.
      Bemærk: Ionbyttersøjlen kan genbruges efter eluering med deioniseret vand til neutralisering af eluering vand (ca. 50 mL) efterfulgt af istandsættelse ved eluering med 50 mL af 1 M HCL.
  2. SPE
    1. Solubilize den frysetørrede sammensatte i ca 2 mL H3PO4/water (20 µL/mL).
    2. Sted en blandet tilstand kationbytter SPE 6 mL-patron på en udvinding manifold forbundet til en vandpumpe. Betingelse patron af tegning gennem 4 mL methanol under reduceret tryk leveres af manifolden. Reagensglasset patronen ved at trække gennem 4 mL H3PO4/water (20 µL/mL).
    3. Læg prøven på patronen ved hjælp af en 1.000 µL mikropipette på toppen af harpiks på væggene af glaskolonne, og skyl hætteglasset indeholdende vare tre gange med 0,75 mL H3PO4/water (20 µL/mL) pr. vask. Indlæse den resulterende skyl diskenhed til kolonnen på samme måde.
    4. Vaske patronen ved eluering under reduceret tryk, leveret af manifold, 4 mL 2% HCOOH i vand, derefter med 4 mL vand. Elueres med en gradient af NH4OH i vand (4 mL for hver eluering, startende fra 4% NH4OH: 10%, 15%, 15%, 20% og 28%).
    5. Overvåge rensning af HPLC ved at analysere hver fraktion efter reaktionen overvågning protokollen beskrevet i trin 6. Holde alle fraktioner der indeholder ren ønskede derivat ifølge ultraviolet (UV) kromatogrammet og gå videre til trin 5.2.6.
    6. Pool de fraktioner, der indeholder den ønskede sammensatte i en 100 mL rund bund kolbe, skyl rør indeholdende fraktioner med vand og tilføje skyl volumen til 100 mL rund bund kolbe.
    7. Fjerne opløsningsmiddel under reduceret tryk ved hjælp af en rotationsfordamper udstyret med en termostat bad kedel ved 40 ° C og tilsluttet en vacuum pumpen indstillet på 10 mbar.
    8. Solubilize fast i en mindstemængde af vand og opløsningen overføres til en tareret 25 mL rund bund kolbe. Skyl kolben med en mindstemængde af vand, tilføje skyl volumen til 25 mL kolbe, og Fortsæt til trin 5.2.9.
    9. Vejer det rensede produkt og beregne udbytte.
    10. Opløse den rensede vare i minimumsvolumen af 2M HCL indtil faste partikler er ikke længere synlige for nøgen-øjet og frysetørre som beskrevet i trin 4.3.8-4.3.9.
      Bemærk: De amino alkoholer er følsomme forbindelser og holdes som salte hydrochlorid.

6. reaktion overvågning og produkt analyse

  1. Forædling af substrater og produkter før HPLC-analysen
    Bemærk: Substrater og produkter skal være derivatized som aromatiske derivater til at øge deres UV gaskromatografisk detectivity. Vi brugt 1-fluoro-2,4-dinitrobenzen (DNFB). Hver prøve blev tilført HPLC umiddelbart efter forædling.
    1. Tage 10 µL af enzymatisk reaktion og overførsel til en 1,5 mL microtube. Tilsæt 10 µL af 0,25 M af NaHCO3 vandig opløsning, 100 µL af ethanol og 30 µL af 2,5 mg/mL af DNFB opløsning i ethanol.
    2. Luk microtube og ryst den resulterende løsning for 1 h ved 65 ° C, ved 1000 rpm. Dæmpning med 10 µL 1 M HCL.
    3. Filtrer over en 4 mm diameter ikke-steril sprøjte filter med en 0,22 µm pore størrelse hydrofile polyvinylidene fluorid (PVDF) membran ved hjælp af en 1 mL Luer sprøjte.
  2. Udføre overvågning af dioxygenase reaktion med ethvert system i stand til at adskille derivatized aminosyrer. Denne protokol omfatter UV detektion af aminosyrer derivatized af dinitrobenzen (DNB) farvelegeme gruppe27.
    1. Passe HPLC med C18 med en trimethyl silyl endcapping med omvendt fase kolonne (5 µm, 3 x 150 mm).
    2. Reagensglasset C18 kolonne med (30:70) elueringsvæsken B (MeCN + 0,1% TFA) at elueringsvæskens A (H2O + 0,1% TFA) med en væskehastighed på 1 mL/min og 35 ° C i 15 min. (svarende til ca 20 kolonne diskenheder).
    3. Injicér 10 µL af derivatized reaktionsblandingen (Se trin 6.1) HPLC C18 kolonne. Brug en blanding af MeCN, 0,1% TFA/H2O og 0,1% TFA som elueringsvæsken med en lineær gradient (ratio 30:70 til 70:30 i 9 min, temperatur 35 ° C, flow 1 mL/min).
    4. Bruge UV detektion indstillet på 400 nm til at analysere de produkter, der er elueret på kolonnen kromatografiske. DNB-lysin eluerer typisk omkring 6,5 min, hydroxyleret DNB-lysin omkring 5,5 min, dihydroxylated DNB-lysin omkring 4,2 min og DNB-aminodiol omkring 5,3 min.

7. NMR analyse af renset Amino alkoholer

  1. Opløse renset amino alkoholer i D2O (700 µL) og opløsningen overføres til en Kernemagnetisk resonans (NMR) tube.
  2. Erhverve 1H og 13C NMR spektre efter passende NMR facilitet protokoller28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har tidligere rapporteret syntese af mono - og di-hydroxy-L-lysines af diastereoselective enzymatisk hydroxylering katalyseret af dioxygenases af jern (II) / αKAO familie (figur 1)16. For at optimere protokollen af de hele cascades præsenteres her, som kombinerer en eller to hydroxylering trinene, katalyseret af et αKAO efterfulgt af en decarboxylation trin katalyseret af et PLP-DC, blev reaktionsbetingelser justeret for at opfylde kravene i begge enzymatiske reaktioner. Vi startede ved at undersøge to DCs, LDCSrum og DCCpin, til kommercielt tilgængelige (5R) aktiviteter - hydroxy - L-lysin. Derefter analyseres vi DC aktiviteter over mono derivater, 3-hydroxy-L-lysin (1) og 4-hydroxy-L-lysin (2), i cascade med oxidation skridt katalyseret af den relevante αKAO. Tabel 1 præsenterer resultaterne af de biocatalytic decarboxylations af mono-hydroxy-L-lysines. Konverteringer blev målt ved HPLC efter forædling af reaktionsblandingen med DNFB at give tilsvarende DNB derivatized substrater og produkter.

Indrejse Substrat PLP-DC Produkt Konvertering
1 (5R) - hydroxy - L-lysin LDCSrumb) 4 100%
2 (5R) - hydroxy - L-lysin DCCpinb) 4 n.d.
3 1 en) LDCSrumb) 5 100%
4 1 en) DCCpinb) 5 29%
5 2 en) LDCSrumc) 6 60%
6 2 en) DCCpinc) 6 100%

Tabel 1: Biocatalytic decarboxylation af monohydroxy-L-lysines. Reaktionsbetingelser: substrat (10 mM), PLP-DC (0,1 til 0,15 mg mL-1), HEPES buffer (50 mM, pH 7,5), PLP (1 mM), DTT (1 mM; ikke brugt med LDCSrum), overnatning, RT, 300 rpm. (en) syntetiseret enzymatisk in situ. (b) 0,1 mg/mL. (c) 0,15 mg/mL; n.d.: ikke fundet

DC fra S. rumirantium (LDCSrum) udstillet aktivitet mod alle de mono hydroxy lysines med bedste konvertering af 3 - og 5-derivater til de tilsvarende chiral hydroxy diamines (posterne 1, 3 og 5). Som forventet, DCCpin, DC αKAO genomisk kontekst, viste sig for at være den mest egnede til decarboxylation (4R) - hydroxy - L-lysin (2) (post 6). Under standard reaktion betingelser konvertering (3S) - hydroxy - L-lysin (1) i sin decarboxylated modpart (5) med DCCpin var lav (indgang 4) og ingen aktivitet blev observeret mod (5R)- hydroxy-L-lysin (post 2).

Endelig, vi undersøgte aktiviteter af de to DCs mod di-hydroxy-L-lysin derivater 3, 8og 9, syntetiseret i situ af én eller to hydroxylering trinene, katalyseret af KDO1, KDO2 eller en kombination af disse to (figur 2). resultaterne af den biocatalytic decarboxylation af di-hydroxy-L-lysines er opsummeret i tabel 2.

Indrejse Substrat PLP-DC Produkt Konvertering
1 3 LDCSrumb) 7 n.d.
2 3 DCCpinb) 7 100%
3 8 en) LDCSrumb) 10 19%
4 8 en) DCCpinb) 10 12%
5 9 en) LDCSrumc) 11 n.d.
6 9 en) DCCpinc) 11 n.d.

Tabel 2: Biocatalytic decarboxylation af dihydroxy-L-lysines. Reaktionsbetingelser: substrat (10 mM), PLP-DC (0,1 til 0,15 mg/mL), HEPES buffer (50 mM, pH 7,5), PLP (1 mM), DTT (1 mM; ikke brugt med LDCSrum), overnatning, RT, 300 rpm. (en) syntetiseret enzymatisk in situ. (b) 0,1 mg/mL. (c) 0,15 mg/mL; n.d.: ikke fundet.

Med hensyn til decarboxylation af dihydroxy-Larsen-lysines 3, 8og 9var resultaterne ikke fuldt tilfredsstillende. I standard reaktionsbetingelser, kun (3R, 4R) - dihydroxy - L-lysin (3) blev kvantitativt konverteres til den tilsvarende dihydroxy diamin 7 (posterne 1 - 2). Konvertering af 4,5-dihydroxy-L-lysin (8) var moderat (poster 3-4), men det er værd at bemærke, at det kunne forbedres ved at øge enzym lastning. Ingen af de to testede PLP-DCs blev fundet aktive mod 3,5-dihydroxy-L-lysin (9) (poster 5-6).

De enzymatiske cascade reaktioner udstiller kvantitative konvertering som bestemt ved HPLC overvågning blev med held skaleret op (figur 4).

Figure 4
Figur 4: repræsentative analytiske data for de tre-trins enzymatisk kaskade. (A) HPLC overvågning af biocatalytic omdannelse af L-lysin til (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentan-2,3-diol (7). RT = retentionstid. (B) 1H NMR og (C) 13C NMR amino alkohol (7) efter rensning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Rensning protokollen præsenteres heri giver mulighed for effektiv udvinding af amino alkoholer fra komplekse enzymatisk reaktionsblanding. Amino alkoholer 4, 5, 6og 7 blev fremstillet i fremragende udbytter (figur 5).

Figure 5
Figur 5: enzymatisk cascades til syntese af amino alkoholer. Syntese af (R) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (4), (S) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (5), 1,5-diaminopentan-3-ol (6), og (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (7). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Chiral amino alkoholer og derivater har en bred vifte af applikationer, fra chiral medhjælpere for organisk syntese til farmaceutiske terapi. Omstændelig syntese for at producere amino alkoholer af konventionelle organisk syntese er talrige, men kan ikke altid være effektiv på grund af kedelige beskyttelse/deprotection trin følsomme kontrol af stereokemi16. En biocatalytic tilgang, der giver afkald på de beskyttelse/deprotection trin og er normalt meget stereoselective repræsenterer et godt alternativ.

Tidligere arbejde rapporteret syntese af forskellige β-amino alkoholer med et 2-phenylethan-1-Amin rygraden af dynamiske kinetic asymmetriske transformation (DYKAT). I denne rute, blev byens hydroxy-substituerede stereogenic indført af aldolisation på benzaldehyd og derivater, katalyseret af et Threonin aldolase. Den lave diastereoselectivity og moderat udbyttet af dette første skridt blev overvundet af den efterfølgende stereospecific decarboxylation katalyseres af L-tyrosin DC, fører til enantioenriched aromatiske β-amino alkoholer11,12.

Vi rapporterede heri en enkel protokol til syntese af forskellige amino alkoholer startende fra den let tilgængelige L-lysin. Selvom meget effektiv, lider under denne protokol ulemper på grund af begrænset substrat intervaller af αKAO og PLP-DC enzymer. Biocatalytic syntese af forskellige amino alkoholer kan dog tages i betragtning ved hjælp af forskellige kombinationer af andre αKAO og aminosyre DCs29,30,31,32. Det er værd at bemærke, at to-trins ordren er kritisk i kaskade som PLP-DCs er også aktive mod L-lysin. Pleje skal træffes for at sikre, at alle L-lysin forbruges i det første oxidative skridt før du kører den decarboxylation reaktion katalyseret af PLP-DC. Dette sikres gennem en omhyggelig overvågning af reaktionen ved HPLC efter forædling af reaktion medierne af en farvelegeme agent. Lav tolerance over for enzymet til høj substratkoncentrationen er en begrænsning for yderligere udvikling. For at løse dette problem, enzym evolution strategier kan anvendes til optimering af egenskaberne enzym som substrat koncentration tolerance33. Enzym immobilisering kan også anses for at sikre genbrug af enzymet.

Denne protokol er nemme at udføre, og en af dens mest attraktive funktioner er effektiviteten af rensning trin. I vores foregående arbejde, direkte udvinding af polære molekyler fra komplekse enzymatisk reaktionsblandingen var et problem og forædling af forbindelser af hydrofobe grupper var nødvendige16. Rensning af amino alkoholer direkte krævede fra reaktion uden forædling omfattende arbejde. I denne protokol, rensning totrinsprocedure kombinerer ionbytter og faste fase udvinding fjerner glycerol (indeholdt i opløsningen enzym) og HEPES buffer, to polære molekyler med fysisk-kemiske egenskaber tæt på dem, af den målrettet amino alkoholer og derfor vanskelige at adskille fra disse forbindelser. Denne rensning protokol kan tilpasses til udvinding af forskellige polære molekyler fra komplekse reaktion blandinger som dem fra enzymet reaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Véronique de Berardinis nemlig givtig diskussion og Alain Perret, Christine Pellé og Peggy Sirvain for teknisk support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Sigma Aldrich H3375
L-lysine hydrochloride Sigma Aldrich L5626
(5S)-hydroxy-L-lysine Sigma Aldrich GPS NONH Out sourcing
α-ketoglutaric acid Sigma Aldrich 75892
Sodium ascorbate Sigma Aldrich A7631
Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate Acros 201370250
Pyridoxal phosphate (PLP) Sigma Aldrich 82870
3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) Sigma Aldrich D0632
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) Sigma Aldrich D1529
Ethanol VWR 20825.290
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 71631
HCl 37% Sigma Aldrich 435570
HCl 0.1M Fluka 35335
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS VWR 83640.320
2,2,2-trifluoroacetic acid VWR 153112E
Ammonia 28% VWR 21182.294
Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS VWR 83638.32
Formic acid Acros 270480010
Phosphoric acid 85% Acros 201145000
Deuterium oxide Acros 320,710,075
NaOH Sigma Aldrich S5881
C18 HPLC column Phenomenex 00F-4601-Y0
Accela UHPLC System ThermoFisher Scientific
Accela PDA detector ThermoFisher Scientific
4mm syringe filters - 0,22µm - PVDF Merck SLGVR04NL
Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip VWR HSWA5010.200V0
Cation exchange resin 100-200 mesh Sigma Aldrich 217506
Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL Waters 186000776
Extraction manifold Waters WAT200609
Rotary evaporator Büchi 531-0103
Lyophilizer alpha 1-2 LDplus Christ L083302
Micropipette 20 µL Eppendorf 3121000031
Micropipette 100 µL Eppendorf 3121000074
Micropipette 500 µL Eppendorf 3121000112
Micropipette 1000 µL Eppendorf 3121000120
300 MHz spectrometer Bruker
2 mL microtube CLEARLine CL20.002.0500
50 mL conical-bottom centrifuge tube Fischer Scientific 05-539-8
25 mL round-bottom flask 14/23 Fischer Scientific 10353331
100 mL round-bottom flask 29/32 Fischer Scientific 11786183
250 mL round-bottom flask 29/32 Fischer Scientific 11786183
250 mL erlenmeyer flask Fischerbrand 15496143

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
  2. Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  3. Turner, N. J., O'Reilly, E. Biocatalytic retrosynthesis. Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).
  4. Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. Enzyme catalysed tandem reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).
  5. Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).
  6. Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. 1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis. Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).
  7. Abiko, A., Masamune, S. An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4. Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).
  8. McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).
  9. Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles. Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).
  10. Colomer, I., et al. Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries. Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).
  11. Steinreiber, J., et al. Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation. Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).
  12. Steinreiber, J., et al. Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations. Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).
  13. Kohls, H., et al. Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction. Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).
  14. Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114 (0), 65-71 (2015).
  15. Martinez, S., Hausinger, R. P. Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases. J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).
  16. Baud, D., et al. Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds. ChemCatChem. , (2014).
  17. Suzuki, H., Kurihara, S. Ch. 4. Polyamines. Kusano, T., Suzuki, H. 4, Springer Japan. 47-59 (2015).
  18. Kind, S., Wittmann, C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).
  19. Schneider, J., Wendisch, V. F. Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).
  20. Qian, Z. -G., Xia, X. -X., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).
  21. Shin, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives. Microb. Cell. Fact. 13, (2014).
  22. Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum. Metabolites. 5 (2), 211 (2015).
  23. Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies. Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).
  24. Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).
  25. Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).
  26. Baud, D., et al. Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation. Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).
  27. Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).
  28. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy (2017).
  29. Hibi, M., Ogawa, J. Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).
  30. Hüttel, W. Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).
  31. Kourist, R., Guterl, J. -K., Miyamoto, K., Sieber, V. Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources. ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).
  32. Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases. J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).
  33. Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis. ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).

Tags

Kemi sag 132 Chiral amino alkoholer kaskade reaktion enzymer dioxygenases decarboxylaser biocatalysis
Enzymatisk Cascade reaktioner til syntese af Chiral Amino alkoholer fra L-lysin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fossey-Jouenne, A.,… More

Fossey-Jouenne, A., Vergne-Vaxelaire, C., Zaparucha, A. Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine. J. Vis. Exp. (132), e56926, doi:10.3791/56926 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter