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Chemistry

एल-lysine से चिराल अमीनो शराब के संश्लेषण के लिए एंजाइमी झरना प्रतिक्रियाओं

Published: February 16, 2018 doi: 10.3791/56926
Automatic Translation
1, 1, 1
1Génomique Métabolique, Genoscope, Institut François Jacob, CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay

Summary

चिराल अमीनो शराब कार्बनिक संश्लेषण में पाड़ के रूप में उपयोग के लिए बहुमुखी अणु हैं । एल से शुरू-lysine, हम एक एंजाइमी झरना diastereoselective सी-एच ऑक्सीकरण catalyzed के संयोजन dioxygenase द्वारा इसी carboxylic एमिनो एसिड की moiety एसिड हाइड्रॉक्सिल के बाद एक द्वारा एमिनो शराब संश्लेषण decarboxylase ।

Abstract

अमीनो शराब अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ बहुमुखी यौगिकों हैं । उदाहरण के लिए, वे कार्बनिक संश्लेषण में चिराल पाड़ के रूप में इस्तेमाल किया गया है । पारंपरिक कार्बनिक रसायन विज्ञान द्वारा उनके संश्लेषण अक्सर stereochemical परिणाम की मुश्किल नियंत्रण के साथ, थकाऊ बहु कदम संश्लेषण प्रक्रियाओं की आवश्यकता है. हम ४८ एच में आसानी से उपलब्ध एल-lysine से शुरू synthetize अमीनो शराब enzymatically करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल पारंपरिक कार्बनिक संश्लेषण द्वारा संचालित करने के लिए बहुत मुश्किल हैं कि दो रासायनिक प्रतिक्रियाओं को जोड़ती है. पहले चरण में, lysine पक्ष-शृंखला के एक अनक्रियाशील सी-एच बांड के regio-और diastereoselective ऑक्सीकरण रोधी का catalyzed एक dioxygenase द्वारा किया जाता है; एक दूसरे regio-और एक regiodivergent dioxygenase द्वारा diastereoselective ऑक्सीकरण catalyzed 1, 2-diols के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । अंतिम चरण में, अल्फा एमिनो एसिड के carboxylic समूह एक pyridoxal-फास्फेट (PLP) decarboxylase (डीसी) से सट गया है. इस decarboxylative कदम केवल एमिनो एसिड के अल्फा कार्बन को प्रभावित करता है, hydroxy को बनाए रखने-एक बीटा में stereogenic केंद्र प्रतिस्थापित/ परिणामस्वरूप अमीनो शराब इसलिए ऑप्टिकली समृद्ध कर रहे हैं । प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक चार एमिनो अल्कोहल के semipreparative पैमाने पर संश्लेषण के लिए लागू किया गया था । 1-fluoro-2, 4-dinitrobenzene द्वारा derivatization के बाद उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) द्वारा प्रतिक्रियाओं की निगरानी का आयोजन किया गया । ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) द्वारा सीधी शुद्धि उत्कृष्ट पैदावार के साथ अमीनो शराब afforded (९३% करने के लिए > 95%) ।

Introduction

biocatalysis द्वारा की पेशकश की लाभ के बावजूद, सिंथेटिक रास्ते या कुल में उत्प्रेरक कदम के एकीकरण मार्गों ज्यादातर एंजाइमी काइनेटिक संकल्प तक ही सीमित रहता है । इन मार्गों व्यापक रूप से असममित chemo-एंजाइमी संश्लेषण में एक पहला कदम के रूप में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन biocatalysis उच्च stereoselectivity के साथ कार्यात्मक समूह के रूपांतरणों में कई और अधिक संभावनाएं प्रदान करता है,2,3 . इसके अलावा, के रूप में एक समान स्थितियों में, यह एक एक पॉट फैशन4,5में झरना प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए व्यवहार्य है ।

चिराल अमीनो शराब कार्बनिक संश्लेषण में सहायक या पाड़ के रूप में उपयोग के लिए बहुमुखी अणुओं रहे है6। एमिनो अल्कोहल moiety अक्सर माध्यमिक चयापचयों में और सक्रिय दवा सामग्री (एपीआई) में पाया जाता है । प्राथमिक β-एमिनो अल्कोहल पारंपरिक रासायनिक संश्लेषण द्वारा इसी α-अमीनो एसिड से आसानी से उपलब्ध हैं, लेकिन चिराल γ के लिए उपयोग-अमीनो शराब या माध्यमिक अमीनो शराब अक्सर संवेदनशील के साथ एक साथ थकाऊ सिंथेटिक रास्ते की आवश्यकता है stereochemistry7,8,9,10का नियंत्रण । अपने उच्च stereoselectivity के कारण, biocatalysis इन चिराल बिल्डिंग ब्लॉकों के लिए एक बेहतर सिंथेटिक मार्ग11,12,13,14प्रदान कर सकता है ।

हम पहले के संश्लेषण की रिपोर्ट मोनो-और di-hydroxy-L-lysines द्वारा diastereoselective एंजाइमी hydroxylation catalyzed द्वारा dioxygenases आयरन (II)/α-ketoacid-निर्भर oxygenase परिवार (αKAO) (चित्रा 1)15. विशेष रूप से, एल से शुरू lysine, KDO1 dioxygenase (3एस) के गठन के catalyzes-hydroxy व्युत्पंन (1), जबकि (4आर)-व्युत्पंन (2) KDO2 dioxygenase के साथ प्रतिक्रिया द्वारा बनाई गई है । ऑप्टिकली रूप से शुद्ध रूप में (3आर, 4आर)-dihydroxy-एल-lysine (3) के गठन के लिए KDO1 और KDO2 नेतृत्व द्वारा उत्तराधिकारी regiodivergent hydroxylations । हालांकि, इन एंजाइमों की सीमित सब्सट्रेट रेंज रासायनिक संश्लेषण में उनके बड़े उपयोग, विशेष रूप से सरल अमीन के hydroxylation में, एमिनो समूह की α-स्थिति में एक carboxylic एसिड moiety के रूप में बाधा उत्पन्न होती है गतिविधि के लिए आवश्यक है16.

Figure 1
चित्र 1: L-lysine का उत्प्रेरक रूपांतरण । (3एस) में रूपांतरण-hydroxy-L-lysine (1) catalyzed द्वारा KDO1 dioxygenase; (4R)-hydroxy-L-lysine (2) catalyzed by KDO2 dioxygenase; तथा (३आर, ४आर)-dihydroxy-एल-lysine (३) द्वारा झरना अभिक्रिया catalyzed क्रमिक द्वारा KDO1 तथा KDO2 dioxygenases. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Decarboxylation चयापचय17में एक आम प्रतिक्रिया है । विशेष रूप से, अमीनो अम्ल dc (ईसी शुू) cofactor-रहित (pyruvoyl-आश्रित) या PLP-आश्रित एंजाइम होते हैं, और उत्प्रेरित अमीनो अम्ल की decarboxylation में इसी polyamines में बैक्टीरिया और उच्चतर जीवों में18,19 , 20 , 21 , 22. मोनो और dihydroxy यौगिकों (चित्रा 3) 4-7, 10-11 hydroxylated cadaverine के अनुरूप, एल decarboxylation के lysine द्वारा प्राप्त डायमाइन. Cadaverine रासायनिक उद्योग के लिए एक महत्वपूर्ण इमारत ब्लॉक है, विशेष रूप से यह पॉलियामाइड और टुकड़े पॉलिमर का एक घटक है । इसलिए, नवीकरणीय संसाधनों से इस डायमाइन के जैव आधारित उत्पादन ने पेट्रोलियम-आधारित मार्ग के विकल्प के रूप में ध्यान आकर्षित किया है, और इस प्रयोजन के लिए विभिन्न सूक्ष्मजीवों को इंजीनियर किया गया है । इन चयापचय मार्ग में, lysine डीसी (एलडीसी) कुंजी एंजाइम है । एलडीसी एक PLP-निर्भर एंजाइम alanine racemase (एआर) संरचनात्मक परिवार23से संबंधित है । PLP-निर्भर dc (PLP-dc) अत्यधिक सब्सट्रेट-विशिष्ट होने के लिए जाने जाते हैं । तथापि, कुछ एंजाइमों मामूली संकीर्णता की क्षमता ही, दोनों एल ornithine और एल-lysine अमीनो एसिड की ओर सक्रिय किया जा रहा है, उदाहरण के लिए के रूप में Selenomonas rumirantium (एलडीसीSrum) से एलडीसी, जो समान काइनेटिक स्थिरांक के लिए है lysine व ornithine decarboxylation२४,२५. इस विस्तारित सब्सट्रेट विशिष्टता इस एंजाइम मोनो के decarboxylation के लिए एक अच्छा उम्मीदवार बनाता है-और di-hydroxy-L-lysine. इसके अलावा, lysine के हाइड्रॉक्सिल डेरिवेटिव की ओर सक्रिय dc खोजने के लिए, हम αKAO एंजाइमों एंकोडिंग जीन के जीनोमिक संदर्भ की जांच की । दरअसल, prokaryotic जीनोम में जीन एक ही सिंथेटिक मार्ग में शामिल एंजाइमों कूटबंधन आम तौर पर सह जीन समूहों में स्थानीयकृत रहे हैं । KDO2 ( Chitinophaga pinensisसे) जीन एक जीन एंकोडिंग ख्यात PLP डीसी (चित्रा 2) के साथ सह-स्थानीयकृत पाया गया । इसके विपरीत, KDO1 dioxygenase के जीनोमिक प्रसंग का विश्लेषण करते समय डीसी के लिए कोई जीन एंकोडिंग नहीं मिली है । C. pinensis (dcCpin) से PLP-dc प्रोटीन इसलिए एक होनहार उंमीदवार के रूप में चुना गया था झरना प्रतिक्रिया के decarboxylation कदम उत्प्रेरित ।

Figure 2
चित्रा 2: सी. pinensisमें KDO2 जीन के जीनोमिक प्रसंग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नतीजतन, हम एंजाइमी झरना dioxygenases और dc को शामिल प्रतिक्रियाओं aliphatic चिराल β के संश्लेषण को प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन-और γ अमीनो एसिड से एमिनो अल्कोहल (चित्रा 3) । जैसा कि पहले की रिपोर्ट, सी एच αKAO द्वारा catalyzed ऑक्सीकरण कुल diastereoselectivity के साथ hydroxy-प्रतिस्थापित stereogenic केंद्र का परिचय; Cβ/γ chirality decarboxylative चरण में संरक्षित किया जाएगा, जो केवल एमिनो एसिड Cα के moiety कार्बन को प्रभावित करता है16.

Figure 3
चित्र 3: Retrosynthetic विश्लेषण. (क) Retrosynthesis β-व γ-अमीनों मद्य (नि)-1, 5-diaminopentan-2-राजभाषा (4) से (5R)-hydroxy-L-Lysine, और (स)-1, 5-diaminopentan-2-राजभाषा (5) और 1, 5-diaminopentan-3-राजभाषा (6) से L-lysine. (ख) Retrosynthesis β, γ-व β, δ-अमीनो diols (2s, 3s)-1, 5-diaminopentane-2, 3-दिओल (10) और (2आर, 4एस)-1, 5-diaminopentane-2, 4-दिओल (11) से शुरू (5आर)- hydroxy-एल-lysine, और (2आर, 3आर)-1, 5-diaminopentane-2, 3-दिओल (7) से शुरू एल-lysine । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एल से शुरू-lysine और उसके (5R)-hydroxy व्युत्पंन, हम इस के साथ साथ एक दो/तीन कदम, एक पॉट, एंजाइमी प्रक्रिया dioxygenases और PLP के संयोजन-dc लक्ष्य अमीनो शराब प्राप्त करने के लिए रिपोर्ट । लक्ष्य अणुओं की प्रयोगशाला पैमाने पर संश्लेषण से पहले, विधि विश्लेषणात्मक पैमाने पर विकसित किया गया था प्रतिक्रिया की स्थिति को समायोजित करने के लिए, उदा, एंजाइम सांद्रता, प्रारंभिक सामग्री के पूर्ण रूपांतरण की अनुमति के लिए आवश्यक; हम इस प्रक्रिया को भी प्रस्तुत करते हैं ।

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Protocol

1. एंजाइम तैयारी

  1. एक्सप्रेस और शुद्ध प्रोटीन के रूप में पहले वर्णित26।
    नोट: रिकॉमबिनेंट प्रोटीन निंनलिखित अंतिम सांद्रता के साथ प्राप्त किया गया: αKAO से Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), १.३५ mg/एमएल; αKAO से C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM6 (KDO2), २.२९ mg/एमएल; PLP-dc से एस rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (एलडीसीSrum), सेल मुफ्त निकालने पर कुल एंजाइम के साथ १२.४४ मिलीग्राम/ PLP-dc से C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (dcCpin), २.६२ मिलीग्राम/

2. समाधान की तैयारी

नोट: नीचे दिए गए सभी समाधानों को पानी में तैयार किया जाता है ।

  1. तैयार HEPES बफर के 1 मीटर, पीएच ७.५; NaOH के 5 मीटर के साथ समायोजित करें ।
    नोट: पीएच समायोजन कदम के दौरान, सुरक्षात्मक दस्ताने, सुरक्षात्मक कपड़े, नेत्र संरक्षण, और चेहरा संरक्षण (P280) पहनते हैं । आँखों के साथ संपर्क के मामले में (P305, P351, P338), कई मिनट के लिए पानी के साथ सावधानी से कुल्ला. यदि संभव हो तो संपर्क लेंस निकालें । कुल्ला जारी रखें और तुरंत एक ज़हर केंद्र या डॉक्टर (P310) को बुलाओ । P कोड एहतियाती बयान (जोखिम वर्ग और श्रेणी; देखें, उदा, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/) को संदर्भित करता है ।
  2. तैयार १०० mM L-lysine, १०० मिमी (5एस)-hydroxy-एल-lysine, १५० एमएम α-ketoglutaric एसिड, १०० एमएम सोडियम ascorbate, 10 एमएम अमोनियम आयरन (II) सल्फेट hexahydrate (Mohr साल्ट), १०० एमएम pyridoxal 5-फास्फेट (PLP), और १०० एमएम dithiothreitol (डीटीटी) ।
  3. २.१ में वर्णित के रूप में एक ही सुरक्षा निर्देशों का पालन, 1 मीटर, 2 एम, और 6M हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के एक ३७% एचसीएल समाधान (approximatively 12 मीटर समाधान) से तैयार करें ।
    नोट: α-ketoglutaric एसिड, सोडियम ascorbate, और अमोनियम आयरन (II) सल्फेट hexahydrate के समाधान को उपयोग के दिन ताजा बनाया जाना चाहिए । lysine समाधान कमरे के तापमान पर कई महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । PLP समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है । डीटीटी समाधान-20 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।

3. विश्लेषणात्मक पैमाने प्रतिक्रियाओं

  1. (5R)-hydroxy-L-lysine की decarboxylation प्रतिक्रिया के लिए विधि विकास
    1. एक 2 मिलीलीटर microtube के लिए HEPES बफर पीएच ७.५ (अंतिम एकाग्रता ५० मिमी) के 1 मीटर समाधान के 11 µ एल जोड़ें । फिर, १०० मिमी (5एस) के 22 µ एल जोड़ें-hydroxy-l-lysine (अंतिम एकाग्रता 10 मिमी), १०० मिमी PLP (अंतिम एकाग्रता 1 मिमी) के २.२ µ एल, और २.२ µ एल के १०० मिमी डीटीटी (अंतिम एकाग्रता 1 मिमी).
      नोट: एलडीसीSrumके साथ प्रतिक्रिया के मामले में, डीटीटी के अलावा आवश्यक नहीं है ।
    2. शुद्ध PLP-डीसी जोड़ें (अंतिम एकाग्रता ०.१ मिलीग्राम/एमएल) । २२० µ एल के एक अंतिम मात्रा के लिए एच2O के साथ पूरा करें
    3. कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण शेक, खुली हवा में एक खुले ढक्कन के साथ, 3 एच के लिए ३०० rpm पर ।
      नोट: खुली हवा में एक खुले ढक्कन के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण मिलाते हुए प्रतिक्रिया मीडिया का एक अच्छा ऑक्सीजन सुनिश्चित करता है । इसलिए यह प्रतिक्रिया मीडिया में ऑक्सीजन बुलबुला करने के लिए आवश्यक नहीं है ।
    4. प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 µ एल लीजिए 6 चरण में वर्णित प्रतिक्रिया निगरानी प्रक्रिया के अनुसार विश्लेषण किया जाएगा. नमूने अधिमानतः derivatized और नमूने के बाद सीधे विश्लेषण कर रहे हैं ।
  2. एंजाइमी झरना प्रतिक्रिया के लिए विधि विकास decarboxylation द्वारा catalyzed PLP के साथ αKAO द्वारा एक hydroxylation कदम catalyzed संयोजन-डीसी
    1. एक 2 मिलीलीटर microtube के लिए HEPES बफर पीएच ७.५ (अंतिम एकाग्रता ५० मिमी) के 1 मीटर के 11 µ एल जोड़ें । फिर, α-ketoglutaric एसिड (अंतिम एकाग्रता 15 मिमी) के १५० मिमी के 22 µ एल जोड़ें, ५.५ सोडियम ascorbate के १०० मिमी के µ एल (अंतिम एकाग्रता २.५ मिमी), Mohr के नमक के 22 µ एल के 10 मिमी (अंतिम एकाग्रता 1 मिमी), और एल के १०० मिमी के 22 µ एल-lysine (अंतिम एकाग्रता 10 मिमी).
    2. २२० µ एल की एक अंतिम मात्रा के लिए एच2O के साथ पूरा, खाते में कदम 3.2.3 में जोड़ा जा करने के लिए एंजाइम समाधान की मात्रा ले रही है ।
    3. लक्षित regioselectivity के अनुसार आवश्यक शुद्धि αKAO एंजाइम जोड़ें: KDO1 के लिए स्थिति सी-3 या KDO2 में hydroxylation के लिए एल-lysine की स्थिति सी-4. अंतिम एकाग्रता के शुद्ध एंजाइम (0.05-0.5 मिलीग्राम/एमएल) approximatively 3 एच में एक पूर्ण रूपांतरण सक्षम करने के लिए निर्धारित किया गया था ।
    4. कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण शेक, खुली हवा में एक खुले ढक्कन के साथ, 3 एच के लिए ३०० rpm पर ।
    5. PLP के १०० मिमी (अंतिम एकाग्रता ~ 1 मिमी) और २.२ µ एल के १०० मिमी के डीटीटी (अंतिम एकाग्रता ~ 1 मिमी) के २.२ µ एल जोड़ें ।
      नोट: एलडीसीSrumके साथ प्रतिक्रिया के मामले में, डीटीटी के अलावा आवश्यक नहीं है ।
    6. एक एकाग्रता में पूर्ण रूपांतरण को सक्षम करने में एक सांद्रता पर शुद्ध PLP-डीसी जोड़ें: एलडीसीSrum KDO1 के साथ झरना प्रतिक्रिया के लिए ०.१ मिलीग्राम/एमएल के एक लगभग अंतिम एकाग्रता पर, और डीसीCpin ०.५ मिलीग्राम/एमएल के लिए एक लगभग अंतिम एकाग्रता पर झरना KDO2 के साथ प्रतिक्रिया ।
    7. शेक कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण, खुली हवा में एक खुले ढक्कन के साथ ३०० rpm पर 18 घंटे के लिए
    8. चरण 3.1.4 के रूप में एक मॉनिटरिंग प्रक्रिया चलाएँ ।
  3. एंजाइमी झरना प्रतिक्रिया के लिए विधि विकास decarboxylation द्वारा catalyzed PLP के साथ αKAOs द्वारा दो hydroxylation कदम catalyzed के संयोजन-डीसी
    1. रन कदम 3.2.1-3.2.2 ।
    2. ०.०५ मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता में KDO1 जोड़ें । कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण शेक, खुली हवा में एक खुले ढक्कन के साथ, 3h के लिए ३०० rpm पर ।
    3. ०.५ मिलीग्राम/एमएल, प्रारंभिक प्रतिक्रिया मात्रा का उपयोग कर की गणना की एक लगभग अंतिम एकाग्रता पर KDO2 जोड़ें । कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण शेक, खुली हवा में एक खुले ढक्कन के साथ, ३०० rpm पर 18 घंटे के लिए
    4. चला चरण 3.2.5 ।
    5. ०.५ मिलीग्राम/एमएल, प्रारंभिक प्रतिक्रिया मात्रा का उपयोग कर की गणना की एक लगभग अंतिम एकाग्रता पर शुद्ध PLP-डीसी डीसीCpin जोड़ें । कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण शेक, खुली हवा में एक खुले ढक्कन के साथ, ३०० rpm पर 18 घंटे के लिए
    6. चरण 3.1.4 के रूप में मॉनिटरिंग प्रक्रिया चलाएँ ।

4. अर्द्ध preparative एक पॉट उत्प्रेरक प्रतिक्रिया

नोट: एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के ०.१ mmol पर किया जाता है L-lysine एक खुली हवा में २५० मिलीलीटर ग्लास Erlenmeyer कुप्पी की कुल मात्रा के लिए 10 मिलीलीटर.

  1. monohydroxylated डेरिवेटिव का संश्लेषण
    1. 1 मीटर HEPES बफर, पीएच ७.५ (अंतिम एकाग्रता ५० मिमी) की कुप्पी के लिए ०.५ मिलीलीटर जोड़ें । फिर, १०० mm L-lysine (अंतिम एकाग्रता 10 मिमी) की 1 मिलीलीटर जोड़ें, १५० मिमी α-ketoglutaric एसिड की 1 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता 15 मिमी), १०० मिमी सोडियम ascorbate की ०.२५ मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता २.५ मिमी), और 10 मिमी Mohr के नमक की 1 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता 1 मिमी).
    2. 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए एच2O के साथ पूरा, खाते में कदम 4.1.3 में जोड़ा जा करने के लिए एंजाइम समाधान की मात्रा ले ।
    3. लक्षित regioselectivity के अनुसार आवश्यक शुद्ध αKAO एंजाइम जोड़ें: KDO1 की एक अंतिम एकाग्रता में ०.०७५ मिलीग्राम/एमएल की स्थिति सी-3 या KDO2 के अंतिम एकाग्रता में ०.५ मिलीग्राम/एमएल की स्थिति सी-4 के लिए एल-lysine । शुद्ध एंजाइम के अंतिम एकाग्रता approximatively में एक पूर्ण रूपांतरण सक्षम करने के लिए निर्धारित किया गया था 3 एच.
    4. उपयुक्त अवधि के लिए ३०० rpm पर कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण शेक । प्रतिक्रिया निगरानी एक पूर्ण hydroxylation प्रतिक्रिया को इंगित करता है (प्रतिक्रिया निगरानी प्रोटोकॉल के लिए चरण 6 में विस्तृत सभी चरणों को चलाने), 4.1.5 चरण के लिए आगे बढ़ें । एक ठेठ प्रतिक्रिया समय 3 एच है ।
    5. αKAO प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए १०० mM PLP के १०० µ एल जोड़ें (अंतिम एकाग्रता ~ 1 मिमी) । फिर, १०० µ l जोड़ें १०० mm डीटीटी (अंतिम एकाग्रता ~ 1 मिमी), सिवाय जब एलडीसीSrumका उपयोग कर रहा है ।
    6. जोड़ें शुद्ध PLP-डीसी: एक लगभग अंतिम एकाग्रता पर एलडीसीSrum ०.०५ मिलीग्राम/एक लगभग अंतिम एकाग्रता में KDO1 या डीसीCpin के साथ झरना प्रतिक्रिया के लिए ०.५ मिलीग्राम/एमएल के साथ झरना प्रतिक्रिया के लिए KDO2 ।
    7. , 18 घंटे के लिए कमरे के तापमान, ३०० rpm पर प्रतिक्रिया मिश्रण हिला और ४.३ कदम में विस्तृत कदम के लिए सीधे जारी है ।
  2. dihydroxylated व्युत्पंन का संश्लेषण
    1. 1 मीटर HEPES बफर की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें, पीएच ७.५ (अंतिम एकाग्रता ५० मिमी), १०० मिमी एल-lysine की 1 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता 10 मिमी), १५० मिमी α-ketoglutaric एसिड की 1 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता 15 मिमी), ०.२५ मिमी सोडियम की ascorbate (अंतिम एकाग्रता १०० मिमी) , और 10 मिमी है Mohr नमक की 1 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता 1 मिमी) । 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए एच2O के साथ पूरा, खाते में कदम 4.2.2 में जोड़ा जा करने के लिए एंजाइम समाधान की मात्रा ले ।
    2. ०.०७५ मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए KDO1 जोड़ें । उपयुक्त अवधि के लिए ३०० rpm पर कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण हिला ।
    3. प्रतिक्रिया निगरानी एक पूर्ण hydroxylation प्रतिक्रिया (प्रतिक्रिया निगरानी प्रोटोकॉल के लिए चरण 6 देखें) इंगित करता है, जब 4.2.5 चरण के लिए आगे बढ़ें । एक ठेठ प्रतिक्रिया समय 3 एच है ।
    4. १५० मिमी α-ketoglutaric एसिड की 1 मिलीलीटर जोड़ें (अंतिम एकाग्रता 15 मिमी), १०० मिमी सोडियम ascorbate की ०.२५ मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता २.५ मिमी), और 10 मिमी Mohr के नमक की 1 मिलीलीटर (अंतिम एकाग्रता 1 मिमी).
    5. ०.५ मिलीग्राम/एमएल, प्रारंभिक प्रतिक्रिया मात्रा का उपयोग कर की गणना की एक अनुमानित अंतिम एकाग्रता के लिए KDO2 जोड़ें । 18 एच के लिए ३०० rpm पर कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण शेक
    6. प्रतिक्रिया निगरानी एक पूर्ण dihydroxylation प्रतिक्रिया (प्रतिक्रिया निगरानी प्रोटोकॉल के लिए चरण 6 देखें) इंगित करता है, जब 4.2.7 चरण के लिए आगे बढ़ें । एक ठेठ प्रतिक्रिया समय 18 एच है ।
    7. डीटीटी (अंतिम एकाग्रता ~ 1 मिमी) के १०० mM के १०० µ एल जोड़ें, सिवाय जब एलडीसीSrumका उपयोग कर ।
    8. ०.५ मिलीग्राम/एमएल, प्रारंभिक प्रतिक्रिया मात्रा का उपयोग कर की गणना की एक लगभग अंतिम एकाग्रता पर शुद्ध डीसीCpin जोड़ें ।
    9. 18 एच के लिए ३०० rpm पर कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण शेक
  3. शमन
    1. एक बर्फ स्नान में २५० मिलीलीटर गिलास Erlenmeyer कुप्पी रखकर प्रतिक्रिया मिश्रण शांत हो जाओ ।
    2. सावधानी से, approximatively पर 1 मिनट, 6 एम एचसीएल के ०.२५ मिलीलीटर मैंयुअल रूप से धीरे से ठंडा प्रतिक्रिया मिश्रण मिलाते हुए जोड़ें । चरण २.१ में वर्णित के रूप में समान सुरक्षा निर्देशों का पालन करें ।
    3. एक ५० मिलीलीटर शंकु में अंलीय मिश्रण हस्तांतरण-नीचे केंद्रापसारक एक गिलास पाश्चर पिपेट एक बल्ब से सुसज्जित का उपयोग कर ट्यूब, तो १,६८० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    4. supernatant को वापस लें और एक २५० मिलीलीटर गोल-नीचे कुप्पी में अलग रखें ।
    5. शंकु-नीचे केंद्रापसारक ट्यूब गोली युक्त करने के लिए जल के 10 मिलीलीटर जोड़ें । भंवर को फिर से गोली से सस्पेंड ।
    6. 15 मिनट के लिए १,६८० x g, 4 ° c, पर केंद्रापसारक ।
    7. supernatant को वापस लें और इसे २५० मिलीलीटर गोल-नीचे कुप्पी में डालें जिसमें पहला supernatant (step 4.3.4) होता है ।
    8. स्थिर हाथ घूमता के साथ तरल नाइट्रोजन में कुप्पी के विसर्जन द्वारा एकत्र supernatants फ्रीज, और एक benchtop कई गुना फ्रीज करने के लिए तुरंत कुप्पी हस्तांतरण-गल से सामग्री को रोकने के लिए ड्रायर.
    9. फ्रीज-सुखाने की प्रक्रिया पूरी (रातोंरात) हो जाने के बाद, फ्रीज से कुप्पी-ड्रायर निकाल दें.

5. क्रूड एंजाइमी रिएक्शन मिक्सचर से अमीनो शराब का शुद्धिकरण

  1. आयन एक्सचेंज राल
    1. फ्रीज-सूखे उत्पाद को जलीय की न्यूनतम मात्रा में भंग करें एचसीएल का ०.१ मीटर (approximatively 4 एमएल) तक ठोस कण अब नंगी-आंख तक दिखाई नहीं दे रहे हैं ।
    2. हालत एक sulfonic एसिड कार्यात्मक समूह कटियन विनिमय राल, 200-400 मेष, एक गिलास कॉलम (20 x २५० mm) में eluting द्वारा वायुमंडलीय दबाव 1m एचसीएल (4 कॉलम मात्रा) द्वारा पीछा किया ०.१ M hcl (4 कॉलम मात्रा; कॉलम मात्रा = 10 मिलीलीटर) ।
    3. नमूना ग्लास स्तंभ की दीवारों पर राल के शीर्ष पर ध्यान से लोड एक १,००० µ l micropipette का उपयोग कर. फिर, शंकु नीचे केंद्रापसारक ट्यूब है कि कच्चे उत्पाद 1 मिलीलीटर ०.१ मीटर के साथ तीन बार शामिल कुल्ला प्रति धोने के लिए जलीय समाधान, और एक ही रास्ते में कॉलम पर जिसके परिणामस्वरूप कुल्ला मात्रा लोड ।
    4. Elute एक गैर रेखीय ढाल के साथ: ०.१ एम एचसीएल के 4 कॉलम संस्करणों, 4 पानी की कॉलम मात्रा, 5% के 4 कॉलम खंड4ओह, 4 कॉलम संस्करणों के 10% nh4ओह, 4 कॉलम संस्करणों के 15% nh4ओह, 4 कॉलम खंड के 20% एनएच4ओह , 25% एनएच4के 4 कॉलम संस्करणों ओह, और अंतिम रूप से 4 28% एनएच4के कॉलम संस्करणों ओह ।
    5. HPLC द्वारा शुद्धि की निगरानी (चरण 6 देखें) ।
    6. पूल यौगिक युक्त अंशों (एनएच4ओह 20-28%) और फ्रीज-शुष्क के रूप में कदम 4.3.8-4.3.9 में वर्णित है ।
      नोट: (approximatively ५० एमएल) एचसीएल के 1 मीटर के ५० मिलीलीटर के साथ eluting द्वारा जीर्णोद्वार के बाद आयन एक्सचेंज कॉलम को रेफरेंस वॉटर के बेअसर करने के लिए पानी के साथ रेफरेंस के बाद फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. एसपीई
    1. Solubilize के approximatively 2 एमएल के एच3पीओ4/water (20 µ एल/एमएल) में फ्रीज-सूखे यौगिक ।
    2. एक मिश्रित मोड कटियन-विनिमय एसपीई 6 मिलीलीटर एक निकासी कई गुना एक पानी पंप से जुड़े पर कारतूस प्लेस । हालत कई गुना द्वारा प्रदान की कम दबाव के तहत मेथनॉल के 4 मिलीलीटर के माध्यम से ड्राइंग द्वारा कारतूस । Equilibrate एच3पीओ4/water (20 µ एल/एमएल) के 4 मिलीलीटर के माध्यम से ड्राइंग द्वारा कारतूस ।
    3. ग्लास कॉलम की दीवारों पर राल के शीर्ष पर एक १,००० µ एल micropipette का उपयोग कर कारतूस पर नमूना लोड, और कुल्ला के उत्पाद के साथ तीन बार ०.७५ मिलीलीटर की एच3पीओ4/water (20 µ एल/एमएल) प्रति धो । एक ही रास्ते में कॉलम पर जिसके परिणामस्वरूप कुल्ला मात्रा लोड ।
    4. कम दबाव के तहत eluting द्वारा कारतूस धो, कई गुना द्वारा प्रदान की, पानी में 2% HCOOH के 4 मिलीलीटर, तो पानी की 4 मिलीलीटर के साथ । Elute के एक ढाल के साथ एनएच4ओह पानी में (प्रत्येक रेफरेंस के लिए 4 मिलीलीटर, 4% से शुरू एनएच4ओह: 10%, 15%, 15%, 20%, और 28%) ।
    5. कदम 6 में वर्णित प्रतिक्रिया निगरानी प्रोटोकॉल के अनुसार प्रत्येक अंश का विश्लेषण करके HPLC द्वारा शुद्धि की निगरानी । सभी भागों पराबैंगनी (यूवी) वर्णलेख के अनुसार शुद्ध वांछित व्युत्पंन युक्त रखें और कदम 5.2.6 के लिए आगे बढ़ना ।
    6. पूल एक १०० मिलीलीटर दौर नीचे कुप्पी में वांछित यौगिक युक्त अंश, पानी के साथ भागों युक्त ट्यूबों कुल्ला, और १०० मिलीलीटर गोल नीचे कुप्पी करने के लिए कुल्ला मात्रा जोड़ें ।
    7. कम दबाव के तहत विलायक निकालें एक रोटरी वाष्पीकरण ४० डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मोस्टेट पानी स्नान केतली के साथ सुसज्जित और 10 mbar पर सेट एक वैक्यूम पंप से जुड़ा का उपयोग कर ।
    8. Solubilize पानी की एक ंयूनतम मात्रा में ठोस और एक तौला 25 मिलीलीटर गोल नीचे कुप्पी में समाधान हस्तांतरण । पानी की एक ंयूनतम मात्रा के साथ कुप्पी कुल्ला, 25 मिलीलीटर कुप्पी के लिए कुल्ला मात्रा जोड़ने, और कदम 5.2.9 के लिए आगे बढ़ना ।
    9. शुद्ध उत्पाद तौलना और उपज की गणना ।
    10. 4.3.8-4.3.9 चरणों में वर्णित के रूप में ठोस कणों अब नग्न आंख और फ्रीज-शुष्क करने के लिए दिखाई दे रहे हैं जब तक कि एचसीएल के 2 एम की न्यूनतम मात्रा में शुद्ध उत्पाद भंग.
      नोट: एमिनो अल्कोहल संवेदनशील यौगिकों रहे है और उनके हाइडरोक्लॉराइड लवण के रूप में रखा जाता है ।

6. प्रतिक्रिया निगरानी और उत्पाद विश्लेषण

  1. HPLC विश्लेषण से पहले सब्सट्रेट और उत्पादों की Derivatization
    नोट: सब्सट्रेट और उत्पादों को खुशबूदार डेरिवेटिव के रूप में derivatized करने के लिए उनके यूवी क्रोमेटोग्राफिक detectivity बढ़ाने की जरूरत है । हमने 1-fluoro-2, 4-dinitrobenzene (DNFB) का उपयोग किया । प्रत्येक नमूना derivatization के तुरंत बाद HPLC में इंजेक्ट किया गया था ।
    1. एंजाइमी प्रतिक्रिया के 10 µ l ले और एक १.५ मिलीलीटर microtube के लिए स्थानांतरण । NaHCO के ०.२५ मीटर के 10 µ एल जोड़ें3 जलीय समाधान, इथेनॉल के १०० µ एल, और 30 µ एल के २.५ मिलीग्राम/DNFB समाधान की इथेनॉल में ।
    2. microtube बंद करो और 1 के लिए परिणामी समाधान शेक ६५ डिग्री सेल्सियस पर, १,००० rpm पर । एचसीएल के 10 µ एल 1 मीटर के साथ बुझाएं ।
    3. एक 1 मिलीलीटर Luer सिरिंज का उपयोग कर एक ०.२२ µm ताकना आकार हाइड्रोफिलिक polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली के साथ एक 4 मिमी व्यास गैर बाँझ सिरिंज फिल्टर पर फ़िल्टर.
  2. derivatized अमीनो एसिड को अलग करने में सक्षम किसी भी प्रणाली का उपयोग कर dioxygenase प्रतिक्रिया की निगरानी करते हैं । इस प्रोटोकॉल dinitrobenzene (डी एन बी) chromophore समूह27द्वारा derivatized अमीनो एसिड की यूवी का पता लगाने शामिल है ।
    1. एक trimethyl silyl endcapping के साथ C18 के साथ HPLC फिट चरण कॉलम (5 µm, 3 x १५० mm) उलट ।
    2. Equilibrate (30:70) eluent B (MeCN + ०.१% TFA) के साथ C18 स्तंभ को eluent a (H2O + ०.१% TFA) से 15 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर/min और ३५ ° c की प्रवाह दर पर (approximatively 20 स्तंभ वॉल्यूंस के संगत) ।
    3. derivatized प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 µ एल इंजेक्षन (६.१ कदम देखें) HPLC C18 स्तंभ पर. MeCN के मिश्रण का उपयोग करें, ०.१% TFA/एच2O और ०.१% TFA के साथ eluent के रूप में एक रैखिक ढाल (अनुपात 30:70 में 70:30 करने के लिए 9 मिनट, तापमान ३५ ° c, प्रवाह 1 मिलीलीटर/
    4. क्रोमेटोग्राफिक कॉलम पर eluted उत्पादों का विश्लेषण करने के लिए ४०० एनएम पर यूवी डिटेक्शन सेट का उपयोग करें । डी एन बी-lysine आमतौर पर लगभग ६.५ मिनट elutes, hydroxylated डी एन बी-lysine लगभग ५.५ मिनट के आसपास, dihydroxylated डी एन बी-४.२ मिनट के आसपास lysine, और डी एन बी-५.३ मिनट के आसपास aminodiol ।

7. शुद्ध एमिनो अल्कोहल का एनएमआर विश्लेषण

  1. D2O (७०० µ l) में शुद्ध अमीनो शराब को भंग और एक परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) ट्यूब के समाधान हस्तांतरण ।
  2. मोल 1ज र १३ग एनएमआर स्पेक्ट्रा अनुसार उपयुक्त एनएमआर सुविधा चलत२८।

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Representative Results

हम पहले के संश्लेषण की सूचना दी है मोनो-और di-hydroxy-L-lysines द्वारा diastereoselective एंजाइमी hydroxylation catalyzed द्वारा dioxygenases आयरन (II)/αKAO परिवार (चित्रा 1)16. यहां प्रस्तुत संपूर्ण कैस्केडिंग के प्रोटोकॉल को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए, जो एक catalyzed द्वारा एक decarboxylation चरण PLP द्वारा फ़ॉलो किए गए एक या दो hydroxylation चरणों को catalyzed-DC द्वारा संयोजित करने के लिए, प्रतिक्रिया शर्तों दोनों की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए समायोजित किए गए थे एंजाइमी प्रतिक्रियाओं । हमने दो dc, एलडीसीSrum और dcCpinकी गतिविधियों की जांच व्यावसायिक रूप से उपलब्ध (5R)-hydroxy-L-lysine की ओर से शुरू की । तो हम मोनो डेरिवेटिव, 3-hydroxy-l-lysine (1) और 4-hydroxy-l-lysine (2), झरना में उपयुक्त catalyzed द्वारा αKAO कदम के साथ की दिशा में डीसी गतिविधियों परख । तालिका 1 मोनो-hydroxy-L-lysines के decarboxylations उत्प्रेरक के परिणाम प्रस्तुत करता है । रूपांतरण DNFB के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण के derivatization के बाद HPLC द्वारा मापा गया इसी डी एन बी derivatized सब्सट्रेट और उत्पादों दे ।

प्रविष्टि सब्सट्रेट PLP-डीसी उत्पाद रूपांतरण
1 (5R)-hydroxy-L-lysine एलडीसीSrumबी) 4 १००%
2 (5R)-hydroxy-L-lysine डीसीCpinबी) 4 जवाबतलब
3 1 क) एलडीसीSrumबी) 5 १००%
4 1 क) डीसीCpinबी) 5 29%
5 2 क) एलडीसीSrumसी) 6 ६०%
6 2 क) डीसीCpinसी) 6 १००%

तालिका 1: monohydroxy-L-lysines के decarboxylation उत्प्रेरक । प्रतिक्रिया की स्थिति: सब्सट्रेट (10 मिमी), PLP-डीसी (०.१ से ०.१५ मिलीग्राम मिलीलीटर-1), HEPES बफर (५० मिमी, पीएच ७.५), PLP (1 मिमी), डीटीटी (1 मिमी; एलडीसीSrumके साथ उपयोग नहीं), रातोंरात, आरटी, ३०० rpm । (क) सीटू मेंसंश्लेषित enzymatically. (b) ०.१ मिलीग्राम/ (c) ०.१५ मिलीग्राम/एमएल; जवाबतलब: पता नहीं

एस rumirantium (एलडीसीSrum) से डीसी ने इसी चिराल hydroxy diamines (प्रविष्टियां 1, 3, और 5) के लिए 3-और 5 डेरिवेटिव के सर्वश्रेष्ठ रूपांतरण के साथ सभी मोनो hydroxy lysines की दिशा में गतिविधि का प्रदर्शन किया । उम्मीद के अनुसार, डीसीCpin, αKAO जीनोमिक संदर्भ के डीसी, (4आर) के decarboxylation के लिए सबसे उपयुक्त हो गया-hydroxy-एल-lysine (2) (प्रविष्टि 6) । मानक प्रतिक्रिया शर्तों के तहत (3एस) के रूपांतरण-hydroxy-L-lysine (1) अपने decarboxylated समकक्ष (5) डीसीCpin के साथ में कम था (प्रविष्टि 4), और कोई गतिविधि (5आर) की ओर देखा गया था- hydroxy-L-lysine (प्रविष्टि 2).

अन्त में, हम di-hydroxy-L-lysine डेरिवेटिव 3, 8, और 9की ओर दो dc की गतिविधियों की जांच की, एक या दो hydroxylation कदम द्वारा सीटू में संश्लेषित KDO1, KDO2, या दो का एक संयोजन द्वारा catalyzed (चित्रा 2). di-hydroxy-L-lysines के उत्प्रेरक decarboxylation के परिणाम तालिका 2में संक्षेप हैं ।

प्रविष्टि सब्सट्रेट PLP-डीसी उत्पाद रूपांतरण
1 3 एलडीसीSrumबी) 7 जवाबतलब
2 3 डीसीCpinबी) 7 १००%
3 8 क) एलडीसीSrumबी) 10 19%
4 8 क) डीसीCpinबी) 10 12%
5 9 क) एलडीसीSrumसी) 11 जवाबतलब
6 9 क) डीसीCpinसी) 11 जवाबतलब

तालिका 2: dihydroxy-L-lysines के decarboxylation उत्प्रेरक । प्रतिक्रिया की स्थिति: सब्सट्रेट (10 मिमी), PLP-डीसी (०.१ करने के लिए ०.१५ मिलीग्राम/एमएल), HEPES बफर (५० मिमी, पीएच ७.५), PLP (1 मिमी), डीटीटी (1 मिमी; एलडीसी के साथ इस्तेमाल नहीं कियाSrum), रातोंरात, आरटी, ३०० rpm । (क) सीटू मेंसंश्लेषित enzymatically. (b) ०.१ मिलीग्राम/ (c) ०.१५ मिलीग्राम/एमएल; जवाबतलब: पता नहीं ।

dihydroxy-L-lysines 3, 8, और 9के decarboxylation के संबंध में, परिणाम पूरी तरह से संतोषजनक नहीं थे । मानक प्रतिक्रिया स्थितियों में, केवल (3r, 4r)-dihydroxy-L-lysine (3) को मात्रात्मक रूप से इसी dihydroxy डायमाइन 7 (प्रविष्टियां 1-2) में रूपांतरित किया गया था । 4 का रूपांतरण, 5-dihydroxy-L-lysine (8) मध्यम था (प्रविष्टियां 3-4) लेकिन यह ध्यान देने योग्य बात है कि यह बहुत एंजाइम लदान में वृद्धि से सुधार किया जा सकता है लायक है । दो परीक्षण PLP-dc में से कोई भी 3, 5-dihydroxy-L-lysine (9) (प्रविष्टियां 5-6) की ओर सक्रिय पाए गए ।

HPLC निगरानी द्वारा निर्धारित मात्रात्मक रूपांतरण के रूप में प्रदर्शित एंजाइमी झरना प्रतिक्रियाओं को सफलतापूर्वक बढ़ाया गया था (चित्रा 4).

Figure 4
चित्रा 4: तीन कदम एंजाइमी झरना के लिए प्रतिनिधि विश्लेषणात्मक डेटा. (क) एल-lysine में (२आर, ३आर)-१, ५-diaminopentan-२, ३-दिओल (७) के HPLC की निगरानी की जा रही है. RT = अवधारण समय. (ख) १एच एनएमआर और (ग) १३सी एनएमआर के बाद एमिनो अल्कोहल (७) के शुद्धिकरण के बाद. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

शुद्धि प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत परिसर एंजाइमी प्रतिक्रिया मिश्रण से अमीनो शराब के कुशल निष्कर्षण की अनुमति देता है । एमिनो अल्कोहल 4, 5, 6, और 7 उत्कृष्ट पैदावार (चित्रा 5) में प्राप्त किया गया ।

Figure 5
चित्र 5: अमीनो अल्कोहल के संश्लेषण के लिए एंजाइमी कैस्केडिंग. (नि.) का संश्लेषण-1, 5-diaminopentan-2-राजभाषा (4), (S)-1, 5-diaminopentan-2-राजभाषा (5), 1, 5-diaminopentan-3-राजभाषा (6), और (2R, 3आर)-1, 5-diaminopentane-2, 3-दिओल (7) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

चिराल अमीनो शराब और डेरिवेटिव अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है, चिराल सहायक से दवा चिकित्सा के लिए कार्बनिक संश्लेषण के लिए । पारंपरिक कार्बनिक संश्लेषण द्वारा अमीनो शराब के उत्पादन के लिए Multistep संश्लेषण कई हैं, लेकिन stereochemistry16के एक संवेदनशील नियंत्रण के साथ थकाऊ सुरक्षा/संरक्षण कदम के कारण हमेशा कुशल नहीं हो सकता है. एक उत्प्रेरक दृष्टिकोण है कि सुरक्षा के साथ तिरस्कृत/संरक्षण कदम और आम तौर पर अत्यधिक stereoselective एक अच्छा विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है ।

पिछले काम गतिशील काइनेटिक असममित परिवर्तन (DYKAT) द्वारा एक 2-phenylethan-1-अमीन रीढ़ के साथ विभिन्न β-अमीनो शराब के संश्लेषण की सूचना दी । इस मार्ग में, hydroxy-स्थानापन्न stereogenic केंद्र aldolisation द्वारा benzaldehyde और डेरिवेटिव पर, catalyzed द्वारा एक threonine aldolase की शुरुआत की गई थी. कम diastereoselectivity और इस पहले कदम के उदारवादी उपज L-tyrosine डीसी द्वारा बाद में stereospecific decarboxylation catalyzed द्वारा दूर किया गया, enantioenriched खुशबूदार β-अमीनो शराब11,12के लिए अग्रणी ।

हम विभिंन अमीनो आसानी से उपलब्ध एल-lysine से शुरू शराब के संश्लेषण के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल की सूचना दी । हालांकि बहुत कुशल, इस प्रोटोकॉल αKAO और PLP-डीसी एंजाइमों की सीमित सब्सट्रेट पर्वतमाला के कारण कमियां से ग्रस्त है । फिर भी, विभिंन एमिनो अल्कोहल के विभिंन संयोजनों का उपयोग करके विचार किया जा सकता है अंय αKAO और एमिनो एसिड dc29,30,31,३२। यह ध्यान देने योग्य है कि दो कदम क्रम झरना में महत्वपूर्ण है के रूप में PLP-dc भी एल lysine की ओर सक्रिय कर रहे है लायक है । देखभाल यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए कि सभी एल-lysine पहले ऑक्सीडेटिव कदम में PLP डीसी द्वारा catalyzed decarboxylation प्रतिक्रिया चलाने से पहले भस्म हो जाता है । यह एक chromophore एजेंट द्वारा प्रतिक्रिया मीडिया के derivatization के बाद HPLC द्वारा प्रतिक्रिया की एक सावधान निगरानी के माध्यम से सुनिश्चित किया जाता है । उच्च सब्सट्रेट एकाग्रता के लिए एंजाइम की कम सहिष्णुता आगे के विकास के लिए एक सीमा है । इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए, एंजाइम विकास रणनीतियों ऐसे सब्सट्रेट एकाग्रता सहिष्णुता३३के रूप में एंजाइम गुण, अनुकूलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, एंजाइम स्थिरीकरण एंजाइम का पुनः प्रयोग सुनिश्चित करने के लिए विचार किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल को बाहर ले जाने के लिए आसान है, और इसकी सबसे आकर्षक सुविधाओं में से एक शुद्धि कदम की क्षमता है । हमारे पूर्ववर्ती काम में, जटिल एंजाइमी प्रतिक्रिया मिश्रण से ध्रुवीय अणुओं के प्रत्यक्ष निष्कर्षण एक मुद्दा था, और hydrophobic समूहों द्वारा यौगिकों के derivatization16आवश्यक था । derivatization बिना प्रतिक्रिया से सीधे अमीनों के अल्कोहल की शुद्धि आवश्यक व्यापक कार्य करते हैं. इस प्रोटोकॉल में, दो कदम शुद्धि प्रक्रिया आयन विनिमय राल और ठोस चरण निष्कर्षण के संयोजन ग्लिसरॉल निकालता है (एंजाइम समाधान में समाहित) और HEPES बफर, दो भौतिक रासायनिक गुणों के साथ ध्रुवीय अणुओं के लोगों के पास लक्षित अमीनो शराब और इसलिए इन यौगिकों से अलग करना मुश्किल है । इस शुद्धि प्रोटोकॉल ऐसे एंजाइम प्रतिक्रियाओं से उन के रूप में जटिल प्रतिक्रिया मिश्रण से विभिंन ध्रुवीय अणुओं की निकासी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों Véronique de Berardinis के लिए उपयोगी चर्चा और Alain पेर्रेट, क्रिस्टीन Pellé, और तकनीकी सहायता के लिए पैगी Sirvain धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Sigma Aldrich H3375
L-lysine hydrochloride Sigma Aldrich L5626
(5S)-hydroxy-L-lysine Sigma Aldrich GPS NONH Out sourcing
α-ketoglutaric acid Sigma Aldrich 75892
Sodium ascorbate Sigma Aldrich A7631
Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate Acros 201370250
Pyridoxal phosphate (PLP) Sigma Aldrich 82870
3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) Sigma Aldrich D0632
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) Sigma Aldrich D1529
Ethanol VWR 20825.290
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 71631
HCl 37% Sigma Aldrich 435570
HCl 0.1M Fluka 35335
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS VWR 83640.320
2,2,2-trifluoroacetic acid VWR 153112E
Ammonia 28% VWR 21182.294
Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS VWR 83638.32
Formic acid Acros 270480010
Phosphoric acid 85% Acros 201145000
Deuterium oxide Acros 320,710,075
NaOH Sigma Aldrich S5881
C18 HPLC column Phenomenex 00F-4601-Y0
Accela UHPLC System ThermoFisher Scientific
Accela PDA detector ThermoFisher Scientific
4mm syringe filters - 0,22µm - PVDF Merck SLGVR04NL
Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip VWR HSWA5010.200V0
Cation exchange resin 100-200 mesh Sigma Aldrich 217506
Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL Waters 186000776
Extraction manifold Waters WAT200609
Rotary evaporator Büchi 531-0103
Lyophilizer alpha 1-2 LDplus Christ L083302
Micropipette 20 µL Eppendorf 3121000031
Micropipette 100 µL Eppendorf 3121000074
Micropipette 500 µL Eppendorf 3121000112
Micropipette 1000 µL Eppendorf 3121000120
300 MHz spectrometer Bruker
2 mL microtube CLEARLine CL20.002.0500
50 mL conical-bottom centrifuge tube Fischer Scientific 05-539-8
25 mL round-bottom flask 14/23 Fischer Scientific 10353331
100 mL round-bottom flask 29/32 Fischer Scientific 11786183
250 mL round-bottom flask 29/32 Fischer Scientific 11786183
250 mL erlenmeyer flask Fischerbrand 15496143

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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रसायन विज्ञान अंक १३२ चिराल अमीनो शराब झरना प्रतिक्रिया एंजाइमों dioxygenases decarboxylases biocatalysis
एल-lysine से चिराल अमीनो शराब के संश्लेषण के लिए एंजाइमी झरना प्रतिक्रियाओं
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Fossey-Jouenne, A.,… More

Fossey-Jouenne, A., Vergne-Vaxelaire, C., Zaparucha, A. Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine. J. Vis. Exp. (132), e56926, doi:10.3791/56926 (2018).

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