Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Enzymatisk Cascade reaksjoner for syntese av Chiral Amino alkoholer fra L-lysine

Published: February 16, 2018 doi: 10.3791/56926
Automatic Translation
1, 1, 1
1Génomique Métabolique, Genoscope, Institut François Jacob, CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay

Summary

Chiral amino alkoholer er allsidig molekyler for bruk som stillaser i Organisk syntese. Fra L-lysine, vi syntetisere amino alkoholer av en enzymatisk gjennomgripende reaksjon kombinerer diastereoselective C-H oksidasjon katalysert av dioxygenase etterfulgt av spalting av karboksylsyre moiety av tilsvarende hydroksyl aminosyren av en dekarboksylasehemmer.

Abstract

Amino alkoholer er allsidig forbindelser med et bredt utvalg av programmer. For eksempel, har de vært brukt som chiral stillaser i Organisk syntese. Deres syntese av konvensjonelle organisk kjemi krever ofte kjedelig flertrinns syntese prosesser, med vanskelige kontroll over stereokjemiske utfallet. Vi presenterer en protokoll til enzymatisk synthetize amino alkoholer fra de tilgjengelige L-lysin i 48 timer. Denne protokollen kombinerer to kjemiske reaksjoner som er svært vanskelig å gjennomføre av konvensjonelle Organisk syntese. I første trinn, regio- og diastereoselective oksidasjon av en unactivated C-H bånd av lysin er side-kjeden katalysert av en dioxygenase; en andre regio- og diastereoselective oksidasjon katalysert av et regiodivergent dioxygenase kan føre til dannelse av 1,2-diols. I det siste trinnet, er karbonoxylsyre gruppen av alpha aminosyren kløyvde av en pyridoxal-fosfat (PLP) dekarboksylasehemmer (DC). Dette decarboxylative trinnet bare påvirker alpha karbon av aminosyrer, beholder den hydroxy-substituert stereogenic center i beta/gamma posisjon. De resulterende amino alkoholer er derfor optisk beriket. Protokollen ble vellykket anvendt på semipreparative skala syntesen av fire amino alkoholer. Overvåking av reaksjonene ble utført av Væskekromatografi (HPLC) etter derivatization av 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Enkel rensing av solid-fase utvinning (SPE) gis amino alkoholer med utmerket avkastning (93% > 95%).

Introduction

Til tross for fordelene med biocatalysis, fortsatt integrering av biocatalytic trinnene i syntetisk veier eller totale biocatalytic ruter stort sett begrenset til enzymatisk kinetic oppløsninger. Disse rutene brukt mye som et første skritt i asymmetrisk chemo-enzymatisk syntese, men biocatalysis tilbyr mange flere muligheter i funksjonsgruppe interconversions med høy stereoselectivity1,2,3 . Videre som biocatalytic reaksjoner er gjennomført under like forhold, er det derfor mulig å utføre gjennomgripende reaksjoner i en en-potten mote4,5.

Chiral amino alkoholer er allsidig molekyler for bruk som hjelpeforetak eller stillaser i Organisk syntese6. Amino alkohol moiety er ofte funnet i sekundære metabolitter og aktive farmasøytiske råvarer (API). Primære β-amino alkoholer er lett tilgjengelig fra de tilsvarende α-aminosyrer konvensjonelle syntese, men tilgang til chiral γ-amino alkoholer eller sekundær amino alkoholer krever ofte kjedelig syntetiske veier med følsom kontroll av stereokjemi7,8,9,10. På grunn av sin høye stereoselectivity, kan biocatalysis tilby en førsteklasses syntetisk rute til disse chiral byggesteinene11,12,13,14.

Vi har tidligere rapportert syntesen av mono - og di-hydroxy-L-lysines av diastereoselective enzymatisk hydroksylering katalysert av dioxygenases av jern (II) / α-ketoacid-avhengige oxygenase familie (αKAO) (figur 1)15. Spesielt fra L-lysin, KDO1 dioxygenase gir dannelsen av (3S) - hydroxy derivat (1), mens (4R) - derivat (2) dannes ved reaksjon med KDO2 dioxygenase. Etterfølgende regiodivergent hydroxylations av KDO1 og KDO2 føre til dannelse av (3R, 4R) - dihydroxy - L-lysine (3) i optisk ren form. Imidlertid hindrer begrenset substrat rekke disse enzymene stor utnyttelse i syntese, spesielt i hydroksylering av enkel aminer, som en karboksylsyre moiety i α-posisjonen av amino-gruppen er avgjørende for aktivitet16.

Figure 1
Figur 1: Biocatalytic konverteringer av L-lysine. Konvertering til (3S) - hydroxy - L-lysine (1) katalysert av KDO1 dioxygenase; (4R) - hydroxy - L-lysine (2) katalysert av KDO2 dioxygenase; og (3R, 4R) - dihydroxy - L-lysine (3) av gjennomgripende reaksjon katalysert suksessivt av KDO1 og KDO2 dioxygenases. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dekarboksylering er en vanlig reaksjon i stoffskiftet17. Spesielt aminosyre DCs (EC 4.1.1) er kofaktor-fri (pyruvoyl-avhengige) eller PLP-avhengige enzymer, og katalysere dekarboksylering av aminosyrer i de tilsvarende polyaminer bakterier og høyere organismer18,19 , 20 , 21 , 22. mono- og dihydroxy forbindelser (Figur 3) 4-7, 10-11 tilsvarer hydroxylated cadaverine, diamine ved dekarboksylering av L-lysine. Cadaverine er en viktig byggekloss for kjemisk industri, spesielt det er en del av polyamid og polyuretan polymerer. Derfor bio-basert produksjon av denne diamine fra fornybare ressurser vakte oppmerksomhet som et alternativ til oljebaserte ruten, og ulike mikroorganismer har blitt utviklet for dette formålet. I disse metabolske veier er lysin DC (LDC) nøkkel enzymet. LDC er et PLP-avhengige enzym tilhører alanin racemase (AR) strukturelle familie23. PLP-avhengige DCs (PLP-DCs) er kjent for å være svært substrat-spesifikke. Men noen enzymer eier evnen til liten promiskuitet, å være aktiv mot både L-ornithine og L-lysine aminosyrer, som for eksempel LDC fra Selenomonas rumirantium (LDCSrum), som har lignende kinetic konstanter for lysin og ornithine dekarboksylering24,25. Dette utvidet underlaget spesifisitet gjør dette enzymet en god kandidat for dekarboksylering av mono - og di-hydroxy-L-lysine. I tillegg vil finne DCs aktive mot hydroksyl derivater av lysin, undersøkte vi genomisk sammenheng med genene som koder αKAO enzymer. Faktisk i prokaryote genomer er genene koding enzymer som er involvert i samme biosyntetiske veien generelt Co lokalisert i genet klynger. KDO2 (fra Chitinophaga pinensis) genet ble funnet Co lokalisert med et gen koding antatte PLP-DC (figur 2). Derimot har ingen genet koding for DC funnet når du analyserer genomisk sammenheng med KDO1 dioxygenase. PLP-DC protein fra C. pinensis (DCCpin) ble derfor valgt som en lovende kandidat å katalysere det dekarboksylering trinnet i cascade reaksjonen.

Figure 2
Figur 2: Genomic sammenheng med KDO2 gene i C. pinensis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Derfor designet vi enzymatisk gjennomgripende reaksjoner involverer dioxygenases og DCs å oppnå syntesen av alifatisk chiral β - og γ-amino alkoholer fra aminosyrer (Figur 3). Som tidligere rapportert introduserer C-H oksidasjon katalysert av αKAO AHA-substituert stereogenic sentrum med totalt diastereoselectivity; Cβ/γ chiralitet beholdes i decarboxylative trinn som påvirker bare Cα karbon aminosyre moiety16.

Figure 3
Figur 3: Retrosynthetic analyse. (A) Retrosynthesis av β - og γ-amino alkoholer (R) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (4) (5R) - hydroxy - L-lysin, og (S) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (5) og 1,5-diaminopentan-3-ol (6) fra L-lysine. (B) Retrosynthesis β, γ - og β, ses-amino diols (2S, 3S) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (10) og (2R, 4S) - 1,5 - diaminopentane-2,4-diol (11) starter fra (5R)- Aha-L-lysine og (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (7) starter fra L-lysine. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fra L-lysine og dens (5R)-hydroxy derivat, vi rapporterer her en to/tre trinn, en pott, enzymatisk prosedyren dioxygenases og PLP-DCs å få målet amino alkoholer. Før syntese på laboratoriet skalaen av målet molekyler, metoden ble utviklet i analytisk skala justere reaksjonen forhold, f.eks, enzym konsentrasjonen, må tillate full konvertering av Start; Vi presenterer denne prosedyren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. enzym forberedelse

  1. Express og rense proteiner som beskrevet tidligere26.
    Merk: Rekombinante proteinene ble oppnådd med følgende siste konsentrasjonen: αKAO fra Catenulispora acidiphila, UniProtKB-ID: C7QJ42 (KDO1), 1.35 mg/mL; ΑKAO fra C. pinensis, UniProtKB-ID: C7PLM6 (KDO2), 2,29 mg/mL; PLP-FM fra S. rumirantium, UniProtKB-ID: O50657 (LDCSrum), cellen gratis pakke med totalt enzym på 12.44 mg/mL; PLP-DC fra C. pinensis, UniProtKB-ID: C7PLM7 (DCCpin), 2.62 mg/mL.

2. forberedelse av løsninger

Merk: Alle løsningene nedenfor er forberedt deionisert vann.

  1. Forberede 1 M HEPES bufferen, pH 7.5; justere med 5 M NaOH.
    Merk: Under pH justering trinn, bruke vernehansker, verneklær, vernebriller og ansiktsskjerm (P280). Ved kontakt med øyne (P305, P351, P338), skyll forsiktig med vann til flere min. Fjern kontaktlinser hvis mulig. Fortsette skylling og umiddelbart kalle giften senter eller lege (P310). P-kode refererer til føre-var-setningen (fare klasse og kategori; se, f.eks, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).
  2. Forberede 100 mM L-lysin, 100 mM (5S) - hydroxy - L-lysin, 150 mM α-ketoglutaric syre, 100 mM natrium ascorbate, 10 mM ammonium iron(II) sulfate hexahydrate (Mohr salt), 100 mM pyridoxal 5-fosfat (PLP) og 100 mM dithiothreitol (DTT).
  3. Forberede 1 M, 2M, og 6M saltsyre (HCl) fra en 37% HCl løsning (approximatively 12 M løsning), etter samme sikkerhetsinstruksjonene som beskrevet i 2.1.
    Merk: Løsninger α-ketoglutaric syre, natrium ascorbate og ammonium iron(II) sulfate hexahydrate må gjøres frisk ved bruk. Lysin løsningen kan lagres i flere måneder ved romtemperatur. PLP løsningen kan lagres i en måned på 4 ° C. DTT løsningen kan lagres i en måned på 20 ° C.

3. analytisk skala reaksjoner

  1. Metodeutvikling for dekarboksylering reaksjon (5R) - hydroxy - L-lysin
    1. Legge til 11 µL av 1 M løsning av HEPES buffer pH 7.5 (siste konsentrasjon 50 mM) til en 2 mL microtube. Legg deretter til 22 µL av 100 mM (5S) - hydroxy - L-lysin (siste konsentrasjon 10 mM), 2.2 µL av 100 mM PLP (siste konsentrasjon 1 mM), og 2.2 µL av 100 mM DTT (siste konsentrasjon 1 mM).
      Merk: Ved reaksjon med LDCSrum, tillegg av DTT er ikke nødvendig.
    2. Legge til renset PLP-DC (siste konsentrasjon 0,1 mg/mL). Komplett med H2O til en endelig mengde 220 µL.
    3. Riste reaksjonsblandingen i romtemperatur, med en åpen lokk i friluft, på 300 rpm for 3t.
      Merk: Risting reaksjonsblandingen med en åpen lokk i friluft sikrer en god oksygenering av reaksjon media. Det er ikke derfor nødvendig å boble oksygen i reaksjon media.
    4. Samle 10 µL reaksjonsblandingen skal analyseres etter reaksjon overvåking fremgangsmåten som er beskrevet i trinn 6. Prøvene er fortrinnsvis derivatized og analyseres direkte etter prøvetaking.
  2. Metodeutvikling for enzymatisk gjennomgripende reaksjonen kombinerer en hydroksylering trinn katalysert av αKAO med dekarboksylering katalysert av PLP-DC
    1. Legge til 11 µL av 1 M HEPES buffer pH 7.5 (siste konsentrasjon 50 mM) til en 2 mL microtube. Legg deretter til 22 µL 150 mm α-ketoglutaric syre (siste konsentrasjon 15 mM), 5,5 µL 100 mm natrium ascorbate (siste konsentrasjon 2,5), 22 µL 10 mm Mohr's salt (siste konsentrasjon 1 mM), og 22 µL 100 mm L-lysine (siste konsentrasjon 10 mM).
    2. Komplett med H2O til en endelig mengde 220 µL, tar hensyn til volumet av enzymet løsningen skal legges i trinn 3.2.3.
    3. Legg det nødvendige renset αKAO enzymet i henhold til det målrettede regioselectivity: KDO1 for hydroksylering i posisjon C-3 eller KDO2 stillingen C-4 L-lysine. Siste konsentrasjonen av renset enzym (0,05-0,5 mg/mL) var fast bestemt på å aktivere en komplett konvertering i approximatively 3t.
    4. Riste reaksjonsblandingen i romtemperatur, med en åpen lokk i friluft, på 300 rpm for 3t.
    5. Legge til 2,2 µL 100 mm PLP (siste konsentrasjon ~ 1 mM) og 2.2 µL 100 mm DTT (siste konsentrasjon ~ 1 mM).
      Merk: Ved reaksjon med LDCSrum, tillegg av DTT er ikke nødvendig.
    6. Legge til renset PLP-fm i en konsentrasjon aktivere komplett konvertering i 18 h: LDCSrum på en omtrentlig endelige konsentrasjon av 0,1 mg/mL for gjennomgripende reaksjon med KDO1 og DCCpin på en omtrentlig endelige konsentrasjon på 0,5 mg/mL for den gjennomgripende reaksjon med KDO2.
    7. Riste reaksjonsblandingen i romtemperatur, med en åpen lokk i friluft på 300 rpm 18 h.
    8. Kjøre en overvåking fremgangsmåte som i trinn 3.1.4.
  3. Metodeutvikling for enzymatisk gjennomgripende reaksjonen kombinerer to hydroksylering trinn katalysert av αKAOs med dekarboksylering katalysert av PLP-DC
    1. Kjøre trinn 3.2.1-3.2.2.
    2. Legge til KDO1 i en endelig konsentrasjon av 0,05 mg/mL. Riste reaksjonsblandingen i romtemperatur, med en åpen lokk i friluft, på 300 rpm for 3t.
    3. Legge til KDO2 på en omtrentlig endelige konsentrasjon på 0,5 mg/mL, beregnet med første reaksjonen volumet. Riste reaksjonsblandingen i romtemperatur, med en åpen lokk i friluft, på 300 rpm 18 h.
    4. Kjøre trinn 3.2.5.
    5. Legge den renset PLP-DC DCCpin på en omtrentlig endelige konsentrasjon på 0,5 mg/mL, beregnet med første reaksjonen volumet. Riste reaksjonsblandingen i romtemperatur, med en åpen lokk i friluft, på 300 rpm 18 h.
    6. Kjøre overvåking prosedyren som i trinn 3.1.4.

4. semi-preparative One-pot Biocatalytic reaksjon

Merk: Enzymatiske reaksjoner er utført på 0,1 mmol av L-lysine i en åpen 250 mL glass Erlenmeyer kolbe for et totalt volum på 10 mL.

  1. Syntese av monohydroxylated derivater
    1. Legge til 0,5 mL 1 M HEPES buffer, pH 7.5 (siste konsentrasjon 50 mM) til kolbe. Legg deretter til 1 mL av 100 mM L-lysine (siste konsentrasjon 10 mM), 1 mL av 150 mM α-ketoglutaric syre (siste konsentrasjon 15 mM), 0,25 mL av 100 mM natrium askorbat (siste konsentrasjon 2,5), og 1 mL av 10 mM Mohr's salt (siste konsentrasjon 1 mM).
    2. Komplett med H2O til en endelig mengde 10 mL, tar hensyn til volumet av enzymet løsningen skal legges i trinn 4.1.3.
    3. Legg det nødvendige renset αKAO enzymet i henhold til det målrettede regioselectivity: KDO1 i en endelig konsentrasjon av 0.075 mg/mL for hydroksylering i posisjon C-3 eller KDO2 i en endelig konsentrasjon på 0,5 mg/mL stillingen C-4 L-lysine. Siste konsentrasjonen av renset enzymet var fast bestemt på å aktivere en komplett konvertering i approximatively 3t.
    4. Riste reaksjonsblandingen ved romtemperatur på 300 rpm for aktuelle varigheten. Når reaksjon overvåking angir en fullført hydroksylering reaksjon (kjøre alle trinnene i trinn 6 for reaksjonen overvåking protokollen), går du til trinn 4.1.5. En typisk reaksjonstid er 3 h.
    5. Legge til 100 µL av 100 mM PLP αKAO reaksjonsblandingen (siste konsentrasjon ~ 1 mM). Deretter legge til 100 µL av 100 mM DTT (siste konsentrasjon ~ 1 mM), bortsett fra når du bruker LDCSrum.
    6. Legge til renset PLP-DC: LDCSrum på en omtrentlig endelige konsentrasjon av 0,05 mg/mL for gjennomgripende reaksjon med KDO1 eller DCCpin på en omtrentlig endelige konsentrasjon på 0,5 mg/mL for gjennomgripende reaksjonen med KDO2.
    7. Riste reaksjonsblandingen i romtemperatur, 300 rpm, 18 h og fortsette direkte til fremgangsmåten i trinn 4.3.
  2. Syntese av dihydroxylated derivater
    1. Legge til 0,5 mL 1 M HEPES buffer, pH 7.5 (siste konsentrasjon 50 mM), 1 mL av 100 mM L-lysine (siste konsentrasjon 10 mM), 1 mL av 150 mM α-ketoglutaric syre (siste konsentrasjon 15 mM), 0,25 mL av 100 mM natrium askorbat (siste konsentrasjon 2,5) , og 1 mL av 10 mM Mohr's salt (siste konsentrasjon 1 mM). Komplett med H2O til en endelig mengde 10 mL, tar hensyn til volumet av enzymet løsningen skal legges i trinn 4.2.2.
    2. Legge til KDO1 en siste konsentrasjon av 0.075 mg/mL. Riste reaksjonsblandingen i romtemperatur, på 300 rpm for aktuelle varigheten.
    3. Når reaksjon overvåking angir en fullført hydroksylering reaksjon (se trinn 6 for reaksjonen overvåking protokollen), gå til trinn 4.2.5. En typisk reaksjonstid er 3 h.
    4. Legge 1 mL av 150 mM α-ketoglutaric syre (siste konsentrasjon 15 mM), 0,25 mL av 100 mM natrium askorbat (siste konsentrasjon 2,5), og 1 mL av 10 mM Mohr's salt (siste konsentrasjon 1 mM).
    5. Legge til KDO2 i en omtrentlig endelige konsentrasjon på 0,5 mg/mL, beregnet med første reaksjonen volumet. Riste reaksjonsblandingen ved romtemperatur på 300 rpm 18 h.
    6. Når reaksjon overvåking angir en fullført dihydroxylation reaksjon (se trinn 6 for reaksjonen overvåking protokollen), fortsetter å gå 4.2.7. En typisk reaksjonstid er 18 t.
    7. Legge til 100 µL 100 mm DTT (siste konsentrasjon ~ 1 mM), bortsett fra når du bruker LDCSrum.
    8. Legge den renset DCCpin på en omtrentlig endelige konsentrasjon på 0,5 mg/mL, beregnet med første reaksjonen volumet.
    9. Riste reaksjonsblandingen ved romtemperatur på 300 rpm 18 h.
  3. Slukke
    1. Avkjøl reaksjonsblandingen ved å plassere 250 mL glasset Erlenmeyer kolbe i en isbadet.
    2. Legg nøye, over approximatively 1 min, 0,25 mL av 6 M HCl av manuelt forsiktig risting avkjølt reaksjonsblandingen. Følg samme sikkerhetsinstruksjonene som beskrevet i trinn 2.1.
    3. Overføringen syrlig blandingen i en 50 mL konisk bunn sentrifuge rør med et glass Pasteur pipette utstyrt med en pære, deretter virvel i 1680 x g og 4 ° C i 15 min.
    4. Trekke nedbryting og holde til side i en 250 mL runde bunn kolbe.
    5. Legge til 10 mL deionisert vann til konisk bunn sentrifuge røret som inneholder pellet. Vortex å suspendere pellet.
    6. Sentrifuger 1680 x g, 4 ° C, i 15 min.
    7. Trekke nedbryting og legge den til 250 mL runde bunn kolbe som inneholder første nedbryting (trinn 4.3.4).
    8. Fryse de innsamlede supernatants ved nedsenkning av flasken i flytende nitrogen med konstant hånd virvlende, og overføre kolbe umiddelbart til en Borstemmaskin manifold fryse-tørker å hindre materialet tining.
    9. Når fryse-tørking prosessen er fullført (overnatting), Fjern flasken fra fryse-tørketrommelen.

5. rensing av Amino alkoholer fra råolje enzymatisk reaksjonsblandingen

  1. Ionebytte harpiks
    1. Oppløse frysetørket produktet i minimum av vandig 0.1 M av HCl (approximatively 4 mL) til faste partikler er ikke lenger synlig for naken-øye.
    2. Tilstand en sulfonsyre funksjonsgruppe cation exchange harpiks, 200-400 mesh, i en glass kolonne (20 x 250 mm) av eluting med lufttrykk 1 M HCl (4 kolonne volumer) etterfulgt av 0.1 M HCl (4 kolonne volumer; kolonne volum = 10 mL).
    3. Laste inn prøven forsiktig på toppen av harpiks på veggene i kolonnen glass med 1000 µL brønnene. Skyll konisk bunn sentrifuge røret som inneholdt råolje produktet tre ganger med 1 mL 0.1 M til HCl vandig løsning per vask, og laste de resulterende skyll volumene til kolonnen på samme måte.
    4. Elute med en ikke-lineær gradient: 4 kolonne mengder 0.1 M HCl, 4 kolonne mengder vann, 4 kolonne mengder 5% NH4OH, 4 kolonne mengder 10% NH4OH, 4 kolonne mengder 15% NH4OH, 4 kolonne mengder 20% NH4OH , 4 kolonne mengder 25% NH4OH og til slutt 4 kolonne mengder 28% NH4OH.
    5. Overvåke rensing av HPLC (se trinn 6).
    6. Basseng fraksjoner som inneholder sammensatte (NH4OH 20-28%) og freeze-dry som beskrevet i trinn 4.3.8-4.3.9.
      Merk: Kolonnen ionebytte kan gjenbrukes etter elueringsrør med deionisert vann til nøytralisering elueringsrør vann (approximatively 50 mL) etterfulgt av reparasjon av eluting med 50 mL 1 M av HCl.
  2. SPE
    1. Solubilize frysetørket sammensatte i approximatively 2 mL H3PO4/water (20 µL/mL).
    2. Sted en blandet modus cation exchange SPE 6 mL-patronen på en utvinning manifold koblet til en vannpumpe. Tilstand patronen ved å tegne gjennom 4 mL av metanol under redusert trykk av manifold. Equilibrate patronen ved å tegne gjennom 4 mL H3PO4/water (20 µL/mL).
    3. Laste inn prøven på kassetten med 1000 µL brønnene på toppen av harpiks på veggene i kolonnen glass og skyll ampullen inneholder produktet tre ganger med 0,75 mL H3PO4/water (20 µL/mL) per vask. Laste det skyll volumet på kolonnen på samme måte.
    4. Vask kassetten av eluting under redusert trykk, levert av manifolden, 4 mL 2% HCOOH i vann, deretter med 4 mL vann. Elute med en gradient NH4OH i vann (4 mL for hver elueringsrør, fra 4% NH4OH: 10%, 15%, 15%, 20% og 28%).
    5. Overvåke rensing av HPLC ved å analysere hver fraksjon etter reaksjonen overvåking protokoll beskrevet i trinn 6. Holde alle fraksjoner som inneholder ren ønsket derivat ifølge ultrafiolett (UV) chromatogram og Fortsett å gå 5.2.6.
    6. Bassenget fraksjoner som inneholder ønsket sammensatte i en 100 mL rundt bunnen kolbe, skyll rør som inneholder fraksjoner med vann og legge skyll volumet til 100 mL rundt bunnen kolbe.
    7. Fjerne løsemiddelet under redusert trykk bruker en roterende fordamperen utstyrt med en termostat bad vannkoker på 40 ° C og koblet til en vakuumpumpe satt til 10 mbar.
    8. Solubilize solid i et minimum volum av vann og overføre løsningen i en vektet 25 mL rundt bunnen kolbe. Skyll flasken et minimum volum av vann, Legg skyll volumet til 25 mL kolbe og fortsetter å gå 5.2.9.
    9. Veie renset produktet og beregne avkastningen.
    10. Oppløse renset produktet i minste mengde 2M av HCl til faste partikler er ikke lenger synlig for naken-øye og freeze-dry som beskrevet i trinn 4.3.8-4.3.9.
      Merk: Amino alkoholer er følsom forbindelser og beholdes som deres hydrochloride salter.

6. reaksjon overvåking og produkt analyse

  1. Derivatization av underlag og produkter før såkalt HPLC-analyse
    Merk: Underlag og produkter må være derivatized som aromatiske derivater å øke deres UV brukt kromatografiske detectivity. Vi brukte 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB). Hvert utvalg ble sprøytet inn i HPLC umiddelbart etter derivatization.
    1. Ta 10 µL av den enzymatiske reaksjonen og overføre til en 1,5 mL microtube. Legge til 10 µL 0,25 m til NaHCO3 vandig løsning, 100 µL av etanol og 30 µL av 2,5 mg/mL DNFB løsning i etanol.
    2. Lukk microtube og riste den resulterende løsningen for 1t ved 65 ° C, 1000 RPM. Slukke med 10 µL 1 M av HCl.
    3. Filtrere over filtere 4 mm diameter ikke-sterilt sprøyte med en 0.22 µm pore størrelse hydrofile polyvinylidene fluor (PVDF) membran bruker en 1 mL Luer sprøyte.
  2. Utføre overvåking av dioxygenase reaksjonen bruker ethvert system som kan skille derivatized aminosyrer. Denne protokollen innebærer UV påvisning av aminosyrer som er derivatized av de dinitrobenzene (DNB) chromophore gruppe27.
    1. Passe HPLC med C18 trimethyl silyl endcapping motsatt fase kolonnen (5 µm, 3 x 150 mm).
    2. Equilibrate C18 kolonnen med (30:70) eluent B (MeCN + 0,1% TFA) til eluent A (H2O + 0,1% TFA) på en strømningshastighet på 1 mL/min og 35 ° C i 15 min (tilsvarende approximatively 20 kolonnen volumer).
    3. Injisere 10 µL derivatized reaksjonsblandingen (se trinn 6.1) på kolonnen HPLC C18. Bruke en blanding av MeCN, 0,1% TFA/T2O og 0,1% TFA som eluent med en lineær gradient (forholdet 30:70 til 70:30 i 9 min, temperatur 35 ° C, flow 1 mL/min).
    4. Bruke UV oppdagelsen satt på 400 nm å analysere produktene elut på kolonnen brukt kromatografiske. DNB-lysine elutes vanligvis rundt 6,5 min, hydroxylated DNB-lysine rundt 5,5 min, dihydroxylated DNB-lysine rundt 4,2 min og DNB-aminodiol rundt 5,3 min.

7. NMR analyse av renset Amino alkoholer

  1. Oppløse renset amino alkoholer i D2O (700 µL) og overføre løsningen slik kjernefysiske magnetisk resonans (NRM).
  2. Få 1H og 13C NMR spekter etter passende NMR anlegget protokoller28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har tidligere rapportert syntesen av mono - og di-hydroxy-L-lysines av diastereoselective enzymatisk hydroksylering katalysert av dioxygenases av jern (II) / αKAO familie (figur 1)16. For å optimalisere protokollen for hele kaskader presenteres her, som kombinerer ett eller to hydroksylering trinn katalysert av et αKAO etterfulgt av et dekarboksylering skritt katalysert av en PLP-DC, ble reaksjonen forhold justert for å tilfredsstille kravene til både enzymatiske reaksjoner. Vi startet ved å undersøke aktiviteter av to DCs, LDCSrum og DCCpin, mot de kommersielt tilgjengelige (5R) - hydroxy - L-lysine. Så assayed vi DC aktiviteter mot mono derivater, 3-hydroxy-L-lysine (1) og 4-hydroxy-L-lysine (2), i cascade med oksidering trinn katalysert av den aktuelle αKAO. Tabell 1 presenterer resultatene av de biocatalytic decarboxylations av de mono-hydroxy-L-lysines. Konverteringer ble målt ved HPLC etter derivatization reaksjonsblandingen med DNFB å gi tilsvarende DNB derivatized underlag og produkter.

Oppføring Substrat PLP-DC Produkt Konvertering
1 (5R) - hydroxy - L-lysin MULSrumb) 4 100%
2 (5R) - hydroxy - L-lysin DCCpinb) 4 nd
3 1 en) MULSrumb) 5 100%
4 1 en) DCCpinb) 5 29%
5 2 en) MULSrumc) 6 60%
6 2 en) DCCpinc) 6 100%

Tabell 1: Biocatalytic dekarboksylering av monohydroxy-L-lysines. Reaksjonen forhold: substrat (10 mM), PLP-DC (0,1 til 0,15 mg mL-1), HEPES buffer (50 mM, pH 7.5), PLP (1 mM), DTT (1 mM, ikke brukes med LDCSrum), overnatting, RT, 300 rpm. (en) syntetisert enzymatisk i situ. (b) 0,1 mg/mL. (c) 0,15 mg/mL; nd: ikke oppdaget

FM fra S. rumirantium (LDCSrum) utstilt aktivitet mot alle mono hydroxy lysines med best konvertering av 3 - og 5-derivater til de tilsvarende chiral AHA-diamines (innlegg 1, 3 og 5). Som forventet, DCCpin, DC av αKAO genomisk sammenheng, viste seg for å være de mest passende for dekarboksylering av (4R) - hydroxy - L-lysine (2) (oppføring 6). Under standard reaksjonen forhold konvertering av (3S) - hydroxy - L-lysine (1) i dekarboksyleres motparten (5) med DCCpin var lav (post 4), og ingen aktivitet ble observert mot (5R)- Aha-L-lysine (inngang 2).

Til slutt, vi undersøkte aktiviteter av to domenekontrollere mot den di-hydroxy-L-lysine derivater 3, 8og 9, syntetisert i situ av ett eller to hydroksylering trinn katalysert av KDO1, KDO2 eller en kombinasjon av de to (figur 2). resultatene av den biocatalytic dekarboksylering av de di-hydroxy-L-lysines oppsummeres i tabell 2.

Oppføring Substrat PLP-DC Produkt Konvertering
1 3 MULSrumb) 7 nd
2 3 DCCpinb) 7 100%
3 8 en) MULSrumb) 10 19%
4 8 en) DCCpinb) 10 12%
5 9 en) MULSrumc) 11 nd
6 9 en) DCCpinc) 11 nd

Tabell 2: Biocatalytic dekarboksylering av dihydroxy-L-lysines. Reaksjonen forhold: substrat (10 mM), PLP-DC (0,1 til 0,15 mg/mL), HEPES buffer (50 mM, pH 7.5), PLP (1 mM), DTT (1 mM, ikke brukes med LDCSrum), overnatting, RT, 300 rpm. (en) syntetisert enzymatisk i situ. (b) 0,1 mg/mL. (c) 0,15 mg/mL; nd: ikke oppdaget.

Vedrørende dekarboksylering av dihydroxy-L-lysines 3, 8og 9var resultatene ikke helt tilfredsstillende. I standard reaksjonen forhold, bare (3R, 4R) - dihydroxy - L-lysine (3) ble kvantitativt konvertert til tilsvarende dihydroxy diamine 7 (oppføringer 1 - 2). Konvertering av 4,5-dihydroxy-L-lysine (8) var moderat (oppføringer 3-4), men det er verdt å merke seg at det kan bli forbedret av sterkt økende enzym lasting. Ingen av to testet PLP-domenekontrollere ble funnet aktive mot 3,5-dihydroxy-L-lysine (9) (oppføringer 5-6).

Enzymatisk gjennomgripende reaksjonene viser kvantitative konvertering som bestemmes av HPLC overvåking var vellykket skalert opp (Figur 4).

Figure 4
Figur 4: representant analysedata for tretrinns enzymatisk kaskade. (A) HPLC overvåking av biocatalytic konvertering av L-lysine i (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentan-2,3-diol (7). RT = tiden. (B) 1H-NMR og (C) 13C NMR amino alkohol (7) etter rensing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Rensing protokollen presenteres her kan effektiv utvinning av amino alkoholer fra komplekse enzymatisk reaksjonsblandingen. Den aminosyre alkoholer 4, 5, 6og 7 ble innhentet utmerket gir (figur 5).

Figure 5
Figur 5: enzymatisk cascades for syntese av amino alkoholer. Syntese av (R) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (4), (S) - 1,5 - diaminopentan-2-ol (5), 1,5-diaminopentan-3-ol (6), og (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentane-2,3-diol (7). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Chiral amino alkoholer og derivater har et bredt spekter av applikasjoner fra chiral hjelpestoffer til Organisk syntese til farmasøytiske terapi. Må syntese for å produsere amino alkoholer av konvensjonelle Organisk syntese er mange, men kan ikke alltid være effektive på grunn av kjedelig beskyttelse/deprotection trinn med en følsom kontroll av stereokjemi16. En biocatalytic tilnærming som dispenses med beskyttelse/deprotection trinnene og er vanligvis svært stereoselektiv representerer et godt alternativ.

Tidligere arbeid rapportert syntesen av ulike β-amino alkoholer med en 2-phenylethan-1-Amin ryggrad av dynamisk kinetic asymmetrisk transformasjon (DYKAT). I denne ruten, ble AHA-substituert stereogenic center introdusert av aldolisation på benzaldehyde og derivater, katalysert av en threonin aldolase. Den lave diastereoselectivity og moderat avkastningen av dette første trinnet ble overvunnet av påfølgende stereospecific dekarboksylering katalysert av L-Tyrosin DC, fører til enantioenriched aromatiske β-amino alkoholer11,12.

Vi rapporterte her en enkel protokoll for syntese av ulike aminosyre alkoholer fra de tilgjengelige L-lysin. Selv om det er veldig effektivt, lider denne protokollen ulemper på grunn av begrenset substrat områder av αKAO og PLP-DC enzymer. Likevel kan biocatalytic syntese av ulike aminosyre alkoholer bli vurdert ved hjelp av forskjellige kombinasjoner av andre αKAO og aminosyre DCs29,30,31,32. Det er verdt å merke seg at i two-step rekkefølge er kritisk i kaskade som PLP-domenekontrollere er også aktiv mot L-lysine. Hensyn må tas for å sikre at alle L-lysine er konsumert i første oksidativt trinn før du kjører dekarboksylering reaksjonen katalysert av PLP-DC. Dette er sikret gjennom en nøye overvåking av reaksjonen av HPLC etter derivatization av reaksjon media av en chromophore agent. Lav toleranse av enzymet til høy substrat konsentrasjonen er en begrensning for videre utvikling. For å løse dette problemet, enzym utviklingen strategier kan brukes for å optimalisere enzym egenskaper, for eksempel substrat konsentrasjon toleranse33. Enzym immobilisering kan også anses å sikre gjenbruk av enzymet.

Denne protokollen er enkle å gjennomføre en av de mest attraktive funksjonene er effektiviteten av rensingen trinnene. I vårt forrige arbeid, direkte utvinning av polare molekyler fra komplekse enzymatisk reaksjonsblandingen var et problem, og derivatization av forbindelser av hydrofobe grupper var nødvendig16. Rensing av amino alkoholer direkte krevde reaksjonen uten derivatization omfattende arbeid. I denne protokollen, totrinns rensing prosedyren ionebytte harpiks og solid fase utvinning fjerner glyserol (som finnes i enzym løsningen) og HEPES buffer, to polare molekyler med fysisk-kjemiske egenskaper nær de av den målrettet amino alkoholer og derfor vanskelig å skille fra disse forbindelsene. Denne rensing protokollen kan tilpasses for utvinning av ulike polare molekyler fra komplekse reaksjon blandinger som de fra enzymreaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Véronique de Berardinis til fruktbar diskusjon og Alain Perret, Christine Pellé og Peggy Sirvain for kundestøtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Sigma Aldrich H3375
L-lysine hydrochloride Sigma Aldrich L5626
(5S)-hydroxy-L-lysine Sigma Aldrich GPS NONH Out sourcing
α-ketoglutaric acid Sigma Aldrich 75892
Sodium ascorbate Sigma Aldrich A7631
Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate Acros 201370250
Pyridoxal phosphate (PLP) Sigma Aldrich 82870
3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) Sigma Aldrich D0632
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) Sigma Aldrich D1529
Ethanol VWR 20825.290
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 71631
HCl 37% Sigma Aldrich 435570
HCl 0.1M Fluka 35335
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS VWR 83640.320
2,2,2-trifluoroacetic acid VWR 153112E
Ammonia 28% VWR 21182.294
Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS VWR 83638.32
Formic acid Acros 270480010
Phosphoric acid 85% Acros 201145000
Deuterium oxide Acros 320,710,075
NaOH Sigma Aldrich S5881
C18 HPLC column Phenomenex 00F-4601-Y0
Accela UHPLC System ThermoFisher Scientific
Accela PDA detector ThermoFisher Scientific
4mm syringe filters - 0,22µm - PVDF Merck SLGVR04NL
Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip VWR HSWA5010.200V0
Cation exchange resin 100-200 mesh Sigma Aldrich 217506
Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL Waters 186000776
Extraction manifold Waters WAT200609
Rotary evaporator Büchi 531-0103
Lyophilizer alpha 1-2 LDplus Christ L083302
Micropipette 20 µL Eppendorf 3121000031
Micropipette 100 µL Eppendorf 3121000074
Micropipette 500 µL Eppendorf 3121000112
Micropipette 1000 µL Eppendorf 3121000120
300 MHz spectrometer Bruker
2 mL microtube CLEARLine CL20.002.0500
50 mL conical-bottom centrifuge tube Fischer Scientific 05-539-8
25 mL round-bottom flask 14/23 Fischer Scientific 10353331
100 mL round-bottom flask 29/32 Fischer Scientific 11786183
250 mL round-bottom flask 29/32 Fischer Scientific 11786183
250 mL erlenmeyer flask Fischerbrand 15496143

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
  2. Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  3. Turner, N. J., O'Reilly, E. Biocatalytic retrosynthesis. Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).
  4. Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. Enzyme catalysed tandem reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).
  5. Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).
  6. Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. 1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis. Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).
  7. Abiko, A., Masamune, S. An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4. Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).
  8. McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).
  9. Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles. Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).
  10. Colomer, I., et al. Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries. Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).
  11. Steinreiber, J., et al. Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation. Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).
  12. Steinreiber, J., et al. Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations. Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).
  13. Kohls, H., et al. Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction. Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).
  14. Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114 (0), 65-71 (2015).
  15. Martinez, S., Hausinger, R. P. Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases. J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).
  16. Baud, D., et al. Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds. ChemCatChem. , (2014).
  17. Suzuki, H., Kurihara, S. Ch. 4. Polyamines. Kusano, T., Suzuki, H. 4, Springer Japan. 47-59 (2015).
  18. Kind, S., Wittmann, C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).
  19. Schneider, J., Wendisch, V. F. Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).
  20. Qian, Z. -G., Xia, X. -X., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).
  21. Shin, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives. Microb. Cell. Fact. 13, (2014).
  22. Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum. Metabolites. 5 (2), 211 (2015).
  23. Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies. Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).
  24. Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).
  25. Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).
  26. Baud, D., et al. Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation. Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).
  27. Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).
  28. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy (2017).
  29. Hibi, M., Ogawa, J. Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).
  30. Hüttel, W. Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).
  31. Kourist, R., Guterl, J. -K., Miyamoto, K., Sieber, V. Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources. ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).
  32. Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases. J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).
  33. Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis. ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).

Tags

Kjemi problemet 132 Chiral amino alkoholer gjennomgripende reaksjon enzymer dioxygenases decarboxylases biocatalysis
Enzymatisk Cascade reaksjoner for syntese av Chiral Amino alkoholer fra L-lysine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fossey-Jouenne, A.,… More

Fossey-Jouenne, A., Vergne-Vaxelaire, C., Zaparucha, A. Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine. J. Vis. Exp. (132), e56926, doi:10.3791/56926 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter