Summary
Хиральных спиртов аминокислоты являются универсальным молекулы для использования как строительные леса в органическом синтезе. Начиная с L-лизин, мы синтезировать амино спиртов реакцией ферментативные Каскад, сочетая окисления diastereoselective C-H, катализируемые dioxygenase следуют расщепления карбоновые кислоты группу соответствующего гидроксила аминокислоты, Декарбоксилаза.
Abstract
Амино спиртов являются универсальным соединений с широким спектром применения. Например они были использованы как хиральные леса в органическом синтезе. Их синтез по органической химии, обычных часто требует утомительной многоступенчатый синтез процессов, с сложным контролем стереохимические итогового документа. Мы представляем протокол для ферментативно synthetize амино спирты, начиная от доступной L-лизин в 48 ч. Этот протокол сочетает в себе два химических реакций, которые очень трудно проводить путем обычного органического синтеза. В первый шаг, regio - и diastereoselective окисление неактивированной C-H Бонд лизина боковой цепи катализируемые dioxygenase; второй regio - и diastereoselective окисления, катализируемые regiodivergent dioxygenase может привести к формированию 1,2-диолов. На последнем шаге карбоксильные группы Альфа-аминокислоты расщепляется, пиридоксальфосфат (ПЛП) Декарбоксилаза (DC). Это decarboxylative шаг влияет только на альфа-углерода аминокислоты, сохраняя гидрокси замещенных stereogenic центр в бета/гамма-положении. Поэтому оптически обогащены результате амино спиртов. Протокол был успешно применен к синтезу semipreparative шкала четырех амино спиртов. Мониторинг реакций проводили высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) после деривации, 1-фтор-2,4-динитробензол. Простая очистка твердофазный экстракцией (SPE) предоставлена амино спиртов с отличные урожаи (93% до > 95%).
Introduction
Несмотря на преимущества, предоставляемые биокатализ интеграция биокаталитической шаги в синтетических пути или всего биокаталитической маршруты основном остается ограниченным ферментативные кинетическая резолюций. Эти маршруты были широко используется в качестве первого шага в асимметричной химио ферментативного синтеза, но биокатализ предлагает много больше возможностей в функциональной группы превращения с высоким стереоселективность1,2,3 . Кроме того как биокаталитической реакций проводятся в аналогичных условиях, поэтому целесообразно выполнять Каскад реакций в один горшок моды4,5.
Хиральных спиртов аминокислоты являются универсальным молекулы как вспомогательное оборудование или подмости в органическом синтезе6для использования. Группу в составе аминокислот алкоголь часто встречается в вторичных метаболитов и активные фармацевтические ингредиенты (API). Первичные спирты β-аминокислоты легко доступны от соответствующего α-аминокислоты обычных химического синтеза, но доступ к хиральных спиртов γ-аминокислоты или вторичные спирты аминокислоты часто требует утомительной синтетических пути вместе с учетом контроль стереохимия7,8,9,10. Из-за его высокой стереоселективность биокатализ может предоставить улучшенный синтетических маршрут к эти хиральная строительные блоки11,12,13,14.
Мы ранее сообщали синтеза из моно - и ди гидрокси L-lysines diastereoselective ферментативные гидроксилирования, катализируемые dioxygenases железа (II) / α-ketoacid зависимой циклооксигеназы семьи (αKAO) (рис. 1)15. В частности, начиная с L-лизин, KDO1 dioxygenase катализирует образование (3S) - гидроксильные производные (1), время (4R) - производное (2) образуется в результате реакции с KDO2 dioxygenase. Hydroxylations последовательных regiodivergent KDO1 и KDO2 приводят к образованию (3R, 4R) - дигидрокси - L-лизин (3) в оптически чистом виде. Однако ограниченный субстрата спектр этих ферментов препятствует их большие использования химического синтеза, особенно в гидроксилирования простой амины, как остаток карбоновые кислоты в α-положении амино-группы имеет важнейшее значение для деятельности16.
Рисунок 1: биокаталитической преобразования L-лизин. Преобразование в (3S) - гидрокси - L-лизин (1), катализируемые KDO1 dioxygenase; (4R) - гидрокси - L-лизин (2), катализируемые KDO2 dioxygenase; и (3R, 4R) - дигидрокси - L-лизин (3) Каскад реакции катализированные последовательно, KDO1 и KDO2 dioxygenases. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Декарбоксилирования является общей реакцией метаболизма17. В частности, аминокислоты DCs (EC 4.1.1) кофактор бесплатно (pyruvoyl зависимых) или ПЛП зависимых ферментов и катализировать декарбоксилирования аминокислот в соответствующий полиаминов в бактериях и высших организмов18,19 , 20 , 21 , 22. моно - и дигидрокси соединений (рис. 3) 4–7, 10–11 соответствуют Гидроксилированные кадаверин, диамин, полученные декарбоксилирования L-лизин. Кадаверин ключевой строительный блок для химической промышленности, в частности это компонент из полиуретана и полиамидные полимеры. Таким образом био основе производства этого диамин из возобновляемых ресурсов привлекла внимание как альтернатива маршрут на нефтяной основе, и различные микроорганизмы были спроектированы для этой цели. В этих метаболических лизин DC (НРС) является ключевой фермент. НРС является ПЛП зависимых ферментов, принадлежащие аланина racemase (AR) структурные семьи23. PLP-зависимых DCs (ПЛП-DCs) известны как весьма специфичные для субстрата. Однако, несколько ферментов собственные возможности небольшой распущенность, будучи активной к L-орнитин и L-лизина, аминокислоты, как например НРС от Selenomonas rumirantium (НРСSrum), который имеет аналогичные кинетические константы для Лизин и орнитин декарбоксилирования24,-правовая25. Этот расширенный субстрат специфика делает этот фермент является хорошим кандидатом для декарбоксилирования из моно - и ди гидрокси L-лизин. Кроме того чтобы найти DCs активную сторону гидроксильные производные лизина, мы изучили геномной контексте генов, кодирующих ферменты αKAO. Действительно в геномах прокариот генов, кодирующих ферменты, участвующие в же биосинтетических пути обычно совместно локализованы в кластерах гена. Джин KDO2 (от Chitinophaga pinensis) был найден совместно локализованы с геном кодирования предполагаемого ПЛП-DC (рис. 2). В отличие от этого кодировка не гена для DC была обнаружена при анализе геномной контексте KDO1 dioxygenase. Поэтому белка ПЛП-DC от C. pinensis (DCCpin) был выбран в качестве перспективного кандидата чтобы катализировать декарбоксилирования шаг Каскад реакции.
Рисунок 2: геномной контексте гена KDO2 в C. pinensis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Следовательно мы разработали каскад ферментативных реакций с участием dioxygenases и DCs для достижения синтеза алифатических хиральная β - и γ-аминокислоты спиртов из аминокислот (рис. 3). Как сообщалось ранее C-H окисления, катализируемые αKAO вводит гидрокси замещенных stereogenic центр с общей diastereoselectivity; Cβ/γ хиральности будут сохранены в decarboxylative шаг, который влияет только на Cα углерода аминокислотный остаток16.
Рисунок 3: анализ Retrosynthetic. (A) Retrosynthesis β - и γ-аминокислоты спиртов (R) - 1,5 - diaminopentan-2-ол (4) (5R) - гидрокси - L-лизин и (S) - 1,5 - diaminopentan-2-ол (5) и 1,5-diaminopentan-3-ол (6) с L-лизин. (B) Retrosynthesis β, γ - и β, δ-аминокислоты диолов (2S, 3S) - 1,5 - diaminopentane-2,3-диол (10) и (2R, 4S) - 1,5 - diaminopentane-2,4-диол (11) начиная с (5R)- гидрокси L-лизин и (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentane-2,3-диол (7) начиная с L-лизин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Начиная с L-лизин и его (5R)-гидроксильные производные, мы приводим здесь два/три шага, один горшок, ферментативные процедуры объединения dioxygenases и ПЛП-DCs для получения целевого амино спиртов. Предварительное обобщение в лабораторном масштабе молекулы-мишени, метод был разработан в аналитической масштабе для настройки условий реакции, например, концентрации фермента, требуемых для полного преобразования исходных материалов; Мы представляем эту процедуру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ферментный препарат
- Экспресс и очистки белков как описано26.
Примечание: Рекомбинантных белков были получены следующие окончательные концентрации: αKAO из Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 мг/мл; ΑKAO от C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM6 (KDO2), 2,29 мг/мл; PLP-РС от S. rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (SrumНРС), Бесплатный сотовый экстракт с всего фермента в 12.44 мг/мл; PLP-DC от C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (CpinDC), 2,62 мг/мл.
2. Приготовление растворов
Примечание: Все решения ниже готовятся в деионизированной воде.
- Подготовка 1 М HEPES буфера, рН 7,5; Отрегулируйте с 5 M NaOH.
Примечание: Во время шага корректировки рН, носите защитные перчатки, Защитная Одежда, защита глаз и лица защиты (P280). В случае контакта с глазами (P305, P351, P338) Осторожно промойте водой для нескольких минут удалить контактные линзы, если это возможно. Продолжать полоскание и немедленно вызвать яд центр или к врачу (P310). P-код ссылается на предосторожности (опасности класса и категории; см., например, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/). - Подготовка 100 мм L-лизин, 100 мм (5S) - гидрокси - L-лизин, 150 мм α-кетоглутаровая кислота, натрия аскорбат 100 мм, 10 мм аммония железа сульфата гексагидрата (соль Мора), 100 мм 5-пиридоксальфосфат (ПЛП) и 100 мм Дитиотреитол (DTT).
- Подготовка 1 М, 2 М и 6 М соляной кислоты (HCl) от 37% HCl решение (приблизительно 12 М), после же инструкции по технике безопасности, которые описаны в пункте 2.1.
Примечание: Решения Альфа-кетоглутаровая кислота, натрия аскорбат и аммония железа сульфата гексагидрата должна производиться свежие в день использования. Лизин раствор может храниться несколько месяцев при комнатной температуре. ПЛП раствор может храниться в течение одного месяца при 4 ° C. DTT раствор может храниться в течение одного месяца при температуре-20 ° C.
3. Аналитическая масштаба реакции
- Метод развития реакции декарбоксилирования (5R) - гидрокси - L-лизин
- 11 мкл раствора 1 М HEPES буфер рН 7,5 (конечная концентрация 50 мм) до 2 мл микропробирок. Затем, добавьте 22 µL 100 мм (5S) - гидрокси - L-лизин (конечная концентрация 10 мм), 2,2 µL 100 мм ПЛП (конечная концентрация 1 мм) и 2,2 µL 100 мм DTT (конечная концентрация 1 мм).
Примечание: В случае реакции с НРСSrum, добавление ДТТ не является необходимым. - Добавить очищенный ПЛП-DC (конечной концентрации 0,1 мг/мл). Комплекте с H2O для окончательного объема 220 мкл.
- Встряхните смесь реакции при комнатной температуре, с открытой крышкой в открытом воздухе, на 300 об/мин за 3 ч.
Примечание: Пожимая реакционную смесь с открытой крышкой на открытом воздухе обеспечивает хорошее оксигенации реакция средств массовой информации. Не стоит таким образом для пузыря кислорода в реакции средств массовой информации. - Собирайте 10 мкл реакционной смеси для анализа реакции мониторинга процедуры, описанной в шаге 6. Образцы желательно дериватные и анализируется непосредственно после выборки.
- 11 мкл раствора 1 М HEPES буфер рН 7,5 (конечная концентрация 50 мм) до 2 мл микропробирок. Затем, добавьте 22 µL 100 мм (5S) - гидрокси - L-лизин (конечная концентрация 10 мм), 2,2 µL 100 мм ПЛП (конечная концентрация 1 мм) и 2,2 µL 100 мм DTT (конечная концентрация 1 мм).
- Разработка метода для каскада ферментативной реакции, сочетая один шаг гидроксилирования, катализируемые αKAO с декарбоксилирования, катализируемые ПЛП-DC
- 11 мкл 1 м HEPES буфер рН 7,5 (конечная концентрация 50 мм) до 2 мл микропробирок. Затем, 22 мкл 150 мм α-кетоглутаровая кислота (конечная концентрация 15 мм), 5.5 µL 100 мм Аскорбат натрия (конечная концентрация 2,5 мм), 22 мкл 10 мм Mohr соли (конечная концентрация 1 мм) и 22 µL 100 мм, L-лизина (конечная концентрация 10 мм).
- Комплекте с H2O для окончательного объема 220 мкл, принимая во внимание объем фермента решения будут добавлены в шаге 3.2.3.
- Добавьте необходимые очищенный αKAO фермента согласно целевой региоселективность: KDO1 для гидроксилирования в положения C-3 или KDO2 для C-4 L-лизина. Конечная концентрация очищенный фермента (0,05-0,5 мг/мл) был полон решимости включить полное преобразование в приблизительно 3 часа.
- Встряхните смесь реакции при комнатной температуре, с открытой крышкой в открытом воздухе, на 300 об/мин за 3 ч.
- 2.2 мкл 100 мм ПЛП (конечная концентрация ~ 1 мм) и 2.2 µL 100 мм DTT (конечная концентрация ~ 1 мм).
Примечание: В случае реакции с НРСSrum, добавление ДТТ не является необходимым. - Добавить очищенный ПЛП-DC на включение полного преобразования в 18 h: НРС концентрацииSrum в приблизительное конечной концентрации 0,1 мг/мл для Каскад реакции с KDO1 иCpin DC на приблизительное конечная концентрация 0,5 мг/мл для Каскад реакции с KDO2.
- Встряхните смесь реакции при комнатной температуре, с открытой крышкой в открытом воздухе при 300 об/мин для 18 h.
- Запуск процедуры мониторинга как шаг 3.1.4.
- Метод развития для каскада ферментативной реакции объединения двух шагов гидроксилирования, катализируемые αKAOs с декарбоксилирования, катализируемые ПЛП-DC
- Выполните шаги 3.2.1-3.2.2.
- Добавьте KDO1 в конечной концентрации 0,05 мг/мл. Встряхните смесь реакции при комнатной температуре, с открытой крышкой в открытом воздухе, на 300 об/мин за 3 ч.
- Добавьте KDO2 в приблизительное конечная концентрация 0,5 мг/мл, рассчитывается первоначальная реакция тома. Встряхните смесь реакции при комнатной температуре, с открытой крышкой в открытом воздухе, на 300 об/мин для 18 h.
- Выполните шаг 3.2.5.
- Добавьте очищенный ПЛП-DC DCCpin в приблизительное конечная концентрация 0,5 мг/мл, рассчитывается первоначальная реакция тома. Встряхните смесь реакции при комнатной температуре, с открытой крышкой в открытом воздухе, на 300 об/мин для 18 h.
- Запустите процедуру контроля как шаг 3.1.4.
4. полу-препаративный Однореакторный биокаталитической реакция
Примечание: Ферментативных реакций проводятся на 0,1 ммоль L-лизин в воздухе 250 мл стекла колбу Эрленмейера для общим объемом 10 мл.
- Синтез производных monohydroxylated
- Добавить 0,5 мл 1 М HEPES буфера, pH 7.5 (конечная концентрация 50 мм) в колбу. Затем, добавьте 1 mL 100 мм L-лизин (конечная концентрация 10 мм), 1 мл 150 мм α-кетоглутаровая кислота (конечная концентрация 15 мм), 0,25 мл 100 мм Аскорбат натрия (конечная концентрация 2,5 мм), и 1 мл 10 мм Mohr соли (конечная концентрация 1 мм).
- Комплекте с H2O для заключительного тома по 10 мл, принимая во внимание объем фермента решения будут добавлены в шаге 4.1.3.
- Добавьте необходимые очищенный αKAO фермента согласно целевой региоселективность: KDO1 в конечной концентрации 0,075 мг/мл для гидроксилирования в позиции C-3 или KDO2 в конечной концентрации 0.5 мг/мл для позиции C-4 L-лизин. Конечная концентрация очищенный фермента преисполнено решимости включить полное преобразование в приблизительно 3 часа.
- Shake реакционной смеси при комнатной температуре на 300 об/мин для соответствующей продолжительности. Когда реакция мониторинг указывает завершенных гидроксилирования реакции (выполнить все шаги подробно на шаге 6 для мониторинга протокол реакции), перейдите к шаг 4.1.5. Типичное время реакции составляет 3 часа.
- Добавить 100 µL 100 мм ПЛП в реакционную смесь αKAO (конечная концентрация ~ 1 мм). Затем, добавить 100 µL 100 мм DTT (конечная концентрация ~ 1 мм), за исключением случаев, когда с помощью НРСSrum.
- Добавить очищенный ПЛП-DC:Srum НРС на приблизительное конечной концентрации 0,05 мг/мл для Каскад реакции с KDO1 илиCpin DC на приблизительное конечная концентрация 0,5 мг/мл для Каскад реакции с KDO2.
- Встряхните смесь реакции при комнатной температуре, 300 об/мин, 18 h и непосредственно продолжать шаги, подробно описанные в шаге 4.3.
- Синтез производных dihydroxylated
- Добавить 0,5 мл 1 М HEPES буфера, pH 7.5 (конечная концентрация 50 мм), 1 мл 100 мм L-лизин (конечная концентрация 10 мм), 1 мл 150 мм α-кетоглутаровая кислота (конечная концентрация 15 мм), 0,25 мл 100 мм Аскорбат натрия (конечная концентрация 2,5 мм) , и 1 мл 10 мм Mohr соли (конечная концентрация 1 мм). Комплекте с H2O для заключительного тома по 10 мл, принимая во внимание объем фермента решения будут добавлены в шаге 4.2.2.
- Добавьте KDO1 в конечной концентрации 0,075 мг/мл. Встряхните смесь реакции при комнатной температуре, при 300 об/мин для соответствующей продолжительности.
- Когда реакция мониторинг указывает завершенных гидроксилирования реакции (см. шаг 6 для мониторинга протокол реакции), перейдите к пункт 4.2.5. Типичное время реакции составляет 3 часа.
- Добавьте 1 mL 150 мм α-кетоглутаровая кислота (конечная концентрация 15 мм), 0,25 мл 100 мм Аскорбат натрия (конечная концентрация 2,5 мм), и 1 мл 10 мм Mohr соли (конечная концентрация 1 мм).
- Добавьте KDO2 в приблизительное конечная концентрация 0,5 мг/мл, рассчитывается первоначальная реакция тома. Встряхните смесь реакции при комнатной температуре на 300 об/мин для 18 h.
- Когда реакция мониторинг указывает завершена dihydroxylation реакции (см. шаг 6 для мониторинга протокол реакции), переходите к шагу 4.2.7. Типичное время реакции составляет 18 h.
- Добавить 100 µL 100 мм DTT (конечная концентрация ~ 1 мм), за исключением случаев, когда использование НРСSrum.
- Добавьте очищенный DCCpin в приблизительное конечная концентрация 0,5 мг/мл, рассчитывается первоначальная реакция тома.
- Встряхните смесь реакции при комнатной температуре на 300 об/мин для 18 h.
- Закалка
- Охладить вниз реакционной смеси, поместив 250 mL стеклянная Колба Эрленмейера в ледяной бане.
- Добавьте тщательно, в течение приблизительно 1 мин, 0,25 мл 6 М HCl, вручную осторожно встряхивая охлаждением реакционной смеси. Следуйте инструкциям же безопасности, как описано в шаге 2.1.
- Передачи, кислая смесь в центрифугу коническое дно 50 мл трубки с использованием стекла, пипетку Pasteur оборудованы с лампой, затем центрифуги на 1680 x g и 4 ° C на 15 мин.
- Снять супернатант и держать в сторону в раунд нижней колбе 250 мл.
- 10мл деонизированной воды на конусном днище пластиковых пробирок, содержащие гранул. Вихревые вновь приостановить гранулы.
- Центрифуга на 1680 x g, 4 ° C, 15 мин.
- Снять супернатант и добавить его в колбу раунд дно 250 мл, содержащий первый супернатант (шаг 4.3.4).
- Заморозить собранные supernatants путем погружения колбу в жидком азоте с постоянным рукой закрученной и немедленно передать колбу benchtop коллектор замораживания сушилка для предотвращения материал от таяния.
- После Плаурайта процесс завершения (на ночь), удалите фляга из замораживания сушилки.
5. Очистка амино спиртов из смеси сырой ферментативной реакции
- Ионообменные смолы
- Распустить лиофилизированной продукт в минимальное количество водного раствора 0,1 М HCl (приблизительно 4 мл) до тех пор, пока твердые частицы больше не видны невооружённым глазом.
- Обусловливать сульфокислоты функциональной группы катионообменной смолы, 200-400 сетки в столбце стекла (20 x 250 мм) элюирующие при атмосферном давлении 1 М HCl (4 колонки томов) следуют 0,1 М HCl (4 столбца тома; столбца объем = 10 мл).
- Загрузите образец тщательно в верхней части смолы на стенах столбце стекла с помощью микропипеткой 1000 мкл. Затем промойте конусного днища пластиковых пробирок, который содержал сырой продукт три раза с 1 мл 0.1 М водный раствор HCl в мыть и загрузить результирующие полоскания томов на столбце таким же образом.
- Элюировать с нелинейного градиента: 4 столбца тома 0,1 м HCl, 4 столбца объемов воды, 4 тома колонка 5% NH4OH, 4 столбца тома 10% NH4OH, 4 тома колонки 15% NH4OH, 4 тома колонке 20% NH4OH , 4 тома столбец 25% NH4OH и наконец 4 столбца тома 28% NH4OH.
- Контролировать очистки, ВЭЖХ (см. шаг 6).
- Бассейн фракций, содержащих соединения (NH4OH 20-28%) и freeze-dry, как описано в шагах 4.3.8-4.3.9.
Примечание: Ионообменной колонке можно повторно использовать после элюирование с дейонизированной водой для нейтрализации элюции воды (приблизительно 50 мл) после ремонта, Новая с 50 мл 1 м HCl.
- SPE
- Солюбилизировать последнего лиофилизированной комплекса в приблизительно 2 мл H3PO4/water (20 мкл/мл).
- Место смешанного катионного обмена SPE 6 мл картридж на многообразии извлечения подключен к водяной насос. Условие картридж на основе через 4 мл метанола при пониженном давлении, предоставляемый коллектора. Сбалансировать картриджа, нарисовав через 4 мл H3PO4/water (20 мкл/мл).
- Загрузить образец на картридж, используя 1000 мкл микропипеткой в верхней части смолы на стенах столбце стекла и промойте флакон, содержащий продукт три раза с 0,75 мл H3PO4/water (20 мкл/мл) в мыть. Загрузите результирующий полоскания тома на столбце таким же образом.
- Промывочный картридж элюирующие под пониженным давлением, предоставляемой коллектором, 4 мл 2% HCOOH в воде, затем с 4 мл воды. Элюировать с градиентом NH4OH в воде (4 мл для каждого элюции, начиная от 4% NH4OH: 10%, 15%, 15%, 20% и 28%).
- Контролировать очистки, ВЭЖХ, анализируя каждую долю согласно реакции, мониторинг протокола, описанные в шаге 6. Держите все фракции, содержащие чисто желаемый производная согласно Хроматограмма ультрафиолетового (УФ) и перейдите к пункт 5.2.6.
- Бассейн фракций, содержащих нужную подворье в 100 мл вокруг нижней колбе, промыть пробирки, содержащие фракции с водой и добавить полоскания объем 100 мл вокруг нижней колбе.
- Удаление растворителя под пониженным давлением, с использованием роторный испаритель с кипятильником ванна воды термостат при температуре 40 ° C и подключен к вакуумный насос установлен на 10 мбар.
- Солюбилизировать последнего тела в минимальный объем воды и передача решения в весил 25 мл вокруг нижней колбе. Промойте колбу с минимальным объемом воды, добавить объем промывки 25 мл флакон и переходите к шагу 5.2.9.
- Весят очищенный продукт и рассчитать доходность.
- Распустить очищенный продукт в минимальный объем 2 М HCl, пока твердые частицы больше не видны невооружённым глазом и freeze-dry как описано в шагах 4.3.8-4.3.9.
Примечание: Амино спиртов чувствительных соединений и хранятся как их гидрохлорид соли.
6. реакция мониторинг и анализ продукции
- Деривации субстратов и продуктов до анализа ВЭЖХ
Примечание: Субстратов и продукты нужно дериватные как Ароматические производные увеличить их УФ хроматографического detectivity. Мы использовали 1-фтор-2,4-динитробензол (DNFB). Каждый образец было впрыснуто в ВЭЖХ сразу же после деривации.- Взять 10 мкл ферментативной реакции и передачи для 1.5 мл микропробирок. Добавьте 10 мкл 0,25 М NaHCO3 водный раствор, 100 мкл этанола и 30 мкл 2,5 мг/мл раствора DNFB в этиловом спирте.
- Закройте Микропробирка и встряхнуть полученный раствор для 1 h при 65 ° C, в 1000 об/мин. Утоляйте 10 мкл 1 М HCl.
- Фильтр над фильтр нестерильных шприцев диаметром 4 мм с 0,22 мкм поры размер гидрофильные винилидена фторида (PVDF) мембраны с помощью шприца 1 мл Luer.
- Выполняйте мониторинг с помощью любой системы, способной дериватные аминокислоты разделяющей реакции dioxygenase. Этот протокол включает обнаружение УФ аминокислот дериватные группы хромофора динитробензол (DNB)27.
- Подходят для ВЭЖХ с C18 триметил содержащих endcapping обратной фазы столбцом (5 мкм, 3 x 150 мм).
- Сбалансировать C18 столбец с элюента (30: 70) B (MeCN + 0.1% TFA) до элюента A (H2O + 0.1% TFA) со скоростью потока 1 мл/мин и 35 ° C в течение 15 мин (соответствует приблизительно 20 томов столбца).
- Придать 10 мкл дериватные реакционной смеси (см. шаг 6.1) на столбце ВЭЖХ C18. Используйте смесь MeCN, 0.1% TFA/H2O и 0,1% TFA как элюента с линейным градиентом (соотношение 30: 70 на 70: 30 мин, температура 35 ° C, поток 1 мл/мин).
- Используйте обнаружение УФ на 400 Нм для продукции этого eluted на столбце хроматографического анализа. DNB-лизин обычно elutes около 6.5 min, Гидроксилированные DNB-лизин около 5,5 мин, dihydroxylated DNB-лизин около 4,2 мин и DNB-aminodiol около 5,3 мин.
7. ЯМР анализ чистые аминокислоты спиртов
- Распустить чистые аминокислоты спиртов в D2O (700 мкл) и решение передать трубку ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
- Приобрести 1Ч и 13C NMR спектров согласно соответствующим ЯМР объекта протоколы28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы ранее сообщали синтеза из моно - и ди гидрокси L-lysines diastereoselective ферментативные гидроксилирования, катализируемые dioxygenases железа (II) / αKAO семьи (рис. 1)16. Для оптимизации протокола всей каскады, представленные здесь, которые сочетают в себе один или два шага гидроксилирования, катализируемые αKAO последовал шаг декарбоксилирования, катализируемые ПЛП-DC, условий реакции были скорректированы для удовлетворения требований обеих ферментативных реакций. Мы начали с расследованием деятельности двух DCs, НРСSrum и постоянного токаCpin, к коммерчески доступных (5R) - гидрокси - L-лизин. Затем мы assayed DC деятельность на моно производных, 3-гидрокси L-лизин (1) и 4-гидрокси L-лизин (2), в каскаде с шагом окисления, катализируемые соответствующие αKAO. В таблице 1 представлены результаты биокаталитической decarboxylations моно гидрокси L-lysines. Преобразования были измерены по HPLC после деривации реакционной смеси с DNFB дать соответствующие DNB дериватные субстратов и продуктов.
| Вход | Субстрат | PLP-DC | Продукта | Преобразование |
| 1 | (5R) - гидрокси - L-лизин | НРСSrumb) | 4 | 100% |
| 2 | (5R) - гидрокси - L-лизин | DCCpinb) | 4 | н.д. |
| 3 | 1 ) | НРСSrumb) | 5 | 100% |
| 4 | 1 ) | DCCpinb) | 5 | 29% |
| 5 | 2 ) | НРСSrumc) | 6 | 60% |
| 6 | 2 ) | DCCpinc) | 6 | 100% |
Таблица 1: биокаталитической декарбоксилирования monohydroxy-L-lysines. Условия реакции: субстрат (10 мм), ПЛП-DC (0,1-0,15 мг мл-1), HEPES буфера (50 мм, pH 7.5), ПЛП (1 мм), DTT (1 мм; не используется с НРСSrum), ночевка, RT, 300 об/мин. () синтезируется ферментативно в situ. (b) 0,1 мг/мл. (c) 0,15 мг/мл; н.д.: не обнаружено
DC от S. rumirantium (SrumНРС) выставлены деятельности на всех моно гидрокси lysines с лучшее преобразование 3 - и 5-производных для соответствующего хиральная гидрокси диамины (записи 1, 3 и 5). Как и ожидалось, DCCpin, DC αKAO геномной контекста, оказался наиболее подходящим для декарбоксилирования (4R) - гидрокси - L-лизин (2) (элемент 6). При стандартной реакции условиях преобразования (3S) - гидрокси - L-лизин (1) в ее коллегой декарбоксилировали (5) с DCCpin был низким (элемент 4) и никакой деятельности было отмечено к (5R)- гидрокси L-лизин (пункт 2).
Наконец, мы рассмотрели деятельность двух DCs к ди гидрокси L-лизин производные 3, 8и 9, синтезируется в situ один или два шага гидроксилирования, катализируемые KDO1, KDO2 или сочетание этих двух (Рисунок 2). в таблице 2резюмируются результаты биокаталитической декарбоксилирования ди гидрокси L-lysines.
| Вход | Субстрат | PLP-DC | Продукта | Преобразование |
| 1 | 3 | НРСSrumb) | 7 | н.д. |
| 2 | 3 | DCCpinb) | 7 | 100% |
| 3 | 8 ) | НРСSrumb) | 10 | 19% |
| 4 | 8 ) | DCCpinb) | 10 | 12% |
| 5 | 9 ) | НРСSrumc) | 11 | н.д. |
| 6 | 9 ) | DCCpinc) | 11 | н.д. |
Таблица 2: биокаталитической декарбоксилирования дигидрокси L-lysines. Условия реакции: субстрат (10 мм), ПЛП-DC (0,1-0,15 мг/мл), HEPES буфера (50 мм, pH 7.5), ПЛП (1 мм), DTT (1 мм; не используется с НРСSrum), ночевка, RT, 300 об/мин. () синтезируется ферментативно в situ. (b) 0,1 мг/мл. (c) 0,15 мг/мл; н.д.: не обнаружено.
Что касается декарбоксилирования дигидрокси L-lysines 3, 8и 9результаты не были полностью удовлетворительными. В условиях стандартного реакции, только (3R, 4R) - дигидрокси - L-лизин (3) количественно был преобразован в соответствующий дигидрокси диамин 7 (записи 1 - 2). Преобразование 4,5-дигидрокси L-лизин (8) был вмеру (записи 3-4), но это стоит отметить, что он может быть улучшена, значительно увеличивая фермента загрузки. Ни один из двух протестированных ПЛП-DCs были обнаружены активные к 3,5-дигидрокси L-лизин (9) (записи 5-6).
Каскад ферментативных реакций, экспонируется количественные преобразования как определяется ВЭЖХ мониторинга были успешно расширены (рис. 4).
Рисунок 4: представитель аналитические данные для каскад ферментативных трехступенчатой. (A) ВЭЖХ мониторинг биокаталитической преобразования L-лизин в (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentan-2,3-диол (7). RT = время удержания. (B) 1H ЯМР и (C) в 13C ЯМР амино алкоголя (7) после очистки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Протокол очистки, представленные здесь позволяет эффективного извлечения амино спиртов из смеси сложных ферментативной реакции. Амино спирты 4, 5, 6и 7 были получены отличные урожаи (рис. 5).
Рисунок 5: энзимный каскадов для синтеза аминокислот спиртов. Синтез (R) - 1,5 - diaminopentan-2-ол (4), (S) - 1,5 - diaminopentan-2-ол (5), 1,5-diaminopentan-3-ол (6), и (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentane-2,3-диол (7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хиральных спиртов аминокислот и производных имеют широкий спектр применения, от хиральная вспомогательное оборудование для органического синтеза фармацевтической терапии. Многоступенчатого синтеза для производства аминокислот спиртов путем обычного органического синтеза многочисленны, но не всегда может быть эффективным из-за утомительный защиты/deprotection шаги вместе с чувствительной контроля стереохимия16. Биокаталитической подход, который отменит меры защиты/deprotection и, как правило, весьма стереоселективный представляет собой хорошую альтернативу.
Предыдущие работы сообщили синтез различных β-аминокислоты спиртов с 2-phenylethan-1-Амин позвоночника преобразованием динамического кинетическая асимметричной (DYKAT). В этот маршрут гидрокси замещенных stereogenic центр был представлен aldolisation на бензальдегида и производные, катализируемые aldolase треонин. Низкая diastereoselectivity и умеренной доходности этого первого шага были преодолены путем последующего stereospecific декарбоксилирования, катализируемые DC L-тирозин, ведущие к enantioenriched ароматические спирты β-аминокислоты11,12.
Мы уже сообщали здесь простой протокол для синтеза различных аминокислот спиртов, начиная от доступной L-лизин. Хотя очень эффективный, этот протокол страдает от недостатков вследствие ограниченной субстрата диапазонов αKAO и ферментов ПЛП-DC. Тем не менее можно считать биокаталитической синтез различных аминокислот спиртов, используя различные комбинации других αKAO и аминокислоты DCs29,30,,3132. Стоит отметить, что двухэтапный порядок имеет решающее значение в каскад, как ПЛП-DCs также активны к L-лизин. Необходимо позаботиться о том, чтобы обеспечить, что все L-лизин потребляется на первом шаге окислительного перед запуском реакция декарбоксилирования, катализируемые ПЛП-DC. Это обеспечивается через тщательный мониторинг реакции ВЭЖХ после деривации реакция СМИ агентом хромофора. Низкая терпимость фермента концентрации высокой субстрата является ограничением для дальнейшего развития. Для решения этой проблемы, фермент эволюция стратегии могут быть использованы для оптимизации фермента свойства, такие как субстрат концентрации терпимости33. Кроме того чтобы обеспечить повторное использование фермента может рассматриваться иммобилизации фермента.
Этот протокол является легко осуществить, и одна из его самых привлекательных особенностей является эффективность очистки шагов. В нашей предыдущей работы прямого отжима полярных молекул из смеси сложных ферментативной реакции является проблемой, и деривации соединений гидрофобных групп было необходимо16. Очистки амино спиртов непосредственно от реакции без деривации требуется обширная работа. В этом протоколе, двухэтапная процедура очищения, сочетая ионообменные смолы и твердой фазы извлечения удаляет глицерина (содержится в решении фермента) и HEPES буфера, два полярных молекул с физико химическими свойствами недалеко от тех, которые целевые амино спирты и поэтому трудно отделить от этих соединений. Этот протокол очистки может быть адаптирован для извлечения различных полярных молекул из сложных реакция смеси такие, как те от ферментативных реакций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Véronique де Berardinis для плодотворного обсуждения и Ален Perret, Кристина Pellé и Пегги Sirvain для технической поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L-lysine hydrochloride | Sigma Aldrich | L5626 | |
| (5S)-hydroxy-L-lysine | Sigma Aldrich | GPS NONH | Out sourcing |
| α-ketoglutaric acid | Sigma Aldrich | 75892 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate | Acros | 201370250 | |
| Pyridoxal phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | 82870 | |
| 3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632 | |
| 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Sigma Aldrich | D1529 | |
| Ethanol | VWR | 20825.290 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 71631 | |
| HCl 37% | Sigma Aldrich | 435570 | |
| HCl 0.1M | Fluka | 35335 | |
| Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83640.320 | |
| 2,2,2-trifluoroacetic acid | VWR | 153112E | |
| Ammonia 28% | VWR | 21182.294 | |
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83638.32 | |
| Formic acid | Acros | 270480010 | |
| Phosphoric acid 85% | Acros | 201145000 | |
| Deuterium oxide | Acros | 320,710,075 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| C18 HPLC column | Phenomenex | 00F-4601-Y0 | |
| Accela UHPLC System | ThermoFisher Scientific | ||
| Accela PDA detector | ThermoFisher Scientific | ||
| 4mm syringe filters - 0,22µm - PVDF | Merck | SLGVR04NL | |
| Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip | VWR | HSWA5010.200V0 | |
| Cation exchange resin 100-200 mesh | Sigma Aldrich | 217506 | |
| Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL | Waters | 186000776 | |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | |
| Rotary evaporator | Büchi | 531-0103 | |
| Lyophilizer alpha 1-2 LDplus | Christ | L083302 | |
| Micropipette 20 µL | Eppendorf | 3121000031 | |
| Micropipette 100 µL | Eppendorf | 3121000074 | |
| Micropipette 500 µL | Eppendorf | 3121000112 | |
| Micropipette 1000 µL | Eppendorf | 3121000120 | |
| 300 MHz spectrometer | Bruker | ||
| 2 mL microtube | CLEARLine | CL20.002.0500 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tube | Fischer Scientific | 05-539-8 | |
| 25 mL round-bottom flask 14/23 | Fischer Scientific | 10353331 | |
| 100 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL erlenmeyer flask | Fischerbrand | 15496143 |
References
- Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
- Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
- Turner, N. J., O'Reilly, E. Biocatalytic retrosynthesis. Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).
- Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. Enzyme catalysed tandem reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).
- Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).
- Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. 1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis. Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).
- Abiko, A., Masamune, S. An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4. Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).
- McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).
- Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles. Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).
- Colomer, I., et al. Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries. Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).
- Steinreiber, J., et al. Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation. Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).
- Steinreiber, J., et al. Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations. Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).
- Kohls, H., et al. Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction. Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).
- Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114 (0), 65-71 (2015).
- Martinez, S., Hausinger, R. P. Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases. J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).
- Baud, D., et al. Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds. ChemCatChem. , (2014).
- Suzuki, H., Kurihara, S. Ch. 4. Polyamines. Kusano, T., Suzuki, H. 4, Springer Japan. 47-59 (2015).
- Kind, S., Wittmann, C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).
- Schneider, J., Wendisch, V. F. Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).
- Qian, Z. -G., Xia, X. -X., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).
- Shin, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives. Microb. Cell. Fact. 13, (2014).
- Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum. Metabolites. 5 (2), 211 (2015).
- Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies. Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).
- Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).
- Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).
- Baud, D., et al. Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation. Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).
- Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).
- JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy (2017).
- Hibi, M., Ogawa, J. Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).
- Hüttel, W. Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).
- Kourist, R., Guterl, J. -K., Miyamoto, K., Sieber, V. Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources. ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).
- Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases. J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).
- Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis. ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).
