Summary
Aminoalcoholes quirales son moléculas versátiles para el uso como andamios en síntesis orgánica. A partir de L-lisina, sintetizar alcoholes aminos por una reacción de cascada enzimática combinando diastereoselectiva H C oxidación catalizada por dioxygenase seguido por clivaje de la molécula de ácido carboxílico del aminoácido del hidróxido correspondiente por un decarboxilasa.
Abstract
Amino alcoholes son compuestos versátiles con una amplia gama de aplicaciones. Por ejemplo, se han utilizado como andamios quirales en síntesis orgánica. Su síntesis de química orgánica convencional a menudo requiere procesos de síntesis de múltiples pasos tediosos, con difícil control sobre el resultado stereochemical. Presentamos un protocolo enzimáticamente sintetizar amino alcoholes a partir de la L-lisina disponible en 48 h. Este protocolo combina dos reacciones químicas que son muy difíciles de llevar a cabo por síntesis orgánica convencional. En la primera oxidación de paso, el regio - y diastereoselectiva de un enlace C-H sin activar de la lisina cadena lateral es catalizada por una dioxigenasa; una segundo regio - y diastereoselectiva de la oxidación catalizada por una dioxigenasa regiodivergent puede conducir a la formación de 1, 2-dioles. En el último paso, el grupo carboxílico del ácido alfa amino es dividido por un decarboxylase del fosfato de piridoxal (PLP) (DC). Este paso decarboxylative afecta sólo el carbono alfa del aminoácido, conservando el centro stereogenic hidroxi sustituido en posición beta y gamma. Los alcoholes aminos resultantes son ópticamente enriquecidos. El protocolo fue aplicado con éxito a la síntesis de semipreparative-escala de cuatro amino alcoholes. Seguimiento de las reacciones se realizó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) después de la derivatización de 1-fluoro-2, 4-dinitrobenceno. Simple purificación por extracción en fase sólida (SPE) que brinda el amino alcoholes con excelentes rendimientos (93% a > 95%).
Introduction
A pesar de los beneficios ofrecidos por Biocatálisis, la integración de biocatalizadores pasos de vías sintéticas o rutas biocatalíticas total sigue siendo en su mayoría limitada resolución cinética enzimática. Estas rutas han sido ampliamente utilizadas como un primer paso en la síntesis asimétrica de chemo-enzimática y Biocatálisis ofrece muchas más posibilidades de interconversions de grupo funcional con alta estereoselectividad1,2,3 . Por otra parte, como reacciones biocatalíticas se realizan en condiciones similares, por lo tanto es factible llevar a cabo reacciones de cascada en un pote de una manera4,5.
Aminoalcoholes quirales, son moléculas versátiles para el uso como auxiliares o andamios en síntesis orgánica6. La molécula de alcohol amino se encuentra con frecuencia en metabolitos secundarios y en ingredientes farmacéuticos activos (API). Β-amino alcoholes primarios están disponibles de los correspondientes ácidos α-amino por síntesis química convencional, sino acceso a γ-amino alcoholes quirales o alcoholes aminos secundarios requiere a menudo tediosas vías sintéticas junto con sensibles control de la estereoquímica7,8,9,10. Debido a su alta estereoselectividad, Biocatálisis pueden proporcionar una ruta sintética superior a estos bloques de construcción quirales11,12,13,14.
Previamente Reportamos la síntesis de mono - y di-hidroxi-L-lisinas por diastereoselectiva hidroxilación enzimática catalizada por dioxygenases de hierro (II) / α-ketoacid-dependiente de la familia de la ciclooxigenasa (αKAO) (figura 1)15. En particular, a partir de L-lisina, la KDO1 dioxigenasa cataliza la formación de los (3S) - hidroxi derivado (1), mientras que laR(4) - derivado (2) se forma por la reacción con KDO2 dioxigenasa. Hydroxylations regiodivergent sucesivos KDO1 y KDO2 conducen a la formación de los (3R4R) - dihidroxi - L-lisina (3) en forma ópticamente pura. Sin embargo, la gama limitada del sustrato de estas enzimas impide su gran utilización en la síntesis química, especialmente en la hidroxilación de aminas simples, como una molécula de ácido carboxílico en la α-posición del grupo amino es esencial para la actividad16.
Figura 1: conversiones biocatalíticas de L-lisina. Conversión en (3S) - hidroxi - L-lisina (1) catalizada por KDO1 dioxigenasa; (4R) - hidroxi - L-lisina (2) catalizada por dioxygenase KDO2; y 3R4R- dihidroxi - L-lisina (3) por la reacción en cascada sucesivamente catalizada por KDO1 y KDO2 dioxygenases. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Descarboxilación es una reacción común en el metabolismo17. En particular, aminoácidos DCs (EC 4.1.1) libre de cofactor (pyruvoyl-dependiente) o enzimas dependientes de PLP y catalizar la descarboxilación de los aminoácidos en las poliaminas correspondientes en las bacterias y los más altos organismos18,19 , 20 , 21 , 22. el mono - y dihidroxi compuestos (figura 3) 4–7, 10–11 corresponden a cadaverina hidroxilado, la diamina obtenida por descarboxilación de la L-lisina. Cadaverina es un bloque de construcción clave para la industria química, específicamente es un componente de polímeros de poliuretano y poliamida. Por lo tanto, bio-basado en la producción de esta diamina de recursos renovables ha atraído la atención como alternativa a la ruta de base de petróleo y varios microorganismos han sido diseñados para este propósito. En estas rutas metabólicas, lisina DC (PMA) es la enzima clave. LDC es una enzima dependiente de PLP pertenecientes a la alanina evaluacion (AR) familia estructural23. El DCs de PLP-dependientes (PLP-DCs) son conocidos por ser altamente específicos de sustrato. Sin embargo, algunas enzimas poseen la capacidad de la promiscuidad leve, siendo activa a los aminoácidos L-ornitina y L-lisina, como por ejemplo el LDC de Selenomonas rumirantium (LDCSrum), que tiene constantes cinéticas similares para lisina y ornitina descarboxilación24,25. Este sustrato extendido especificidad hace que esta enzima un buen candidato para la descarboxilación de mono - y di-hidroxi-L-lisina. Además, para DCs activa hacia los derivados hidroxilos de la lisina, se examinó el contexto genomic de los genes que codifican las enzimas αKAO. De hecho, en genomas procariotas los genes que codifican las enzimas implicadas en la vía biosintética de la misma son generalmente co localizados en racimos del gene. El gene KDO2 (de Chitinophaga pinensis) fue encontrado Co localizada con un gen que codifica la supuesta PLP-DC (figura 2). En cambio, ninguna codificación del gene para DC se ha encontrado al analizar el contexto genómico de la KDO1 dioxigenasa. La proteína PLP-DC de C. pinensis (DCCpin) por lo tanto, fue seleccionada como un candidato prometedor para catalizar el paso de la descarboxilación de la reacción en cascada.
Figura 2: contexto Genomic del gene KDO2 en C. pinensis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Por lo tanto, hemos diseñado las reacciones de la cascada enzimática que dioxygenases y DCs para lograr la síntesis de alcoholes alifáticos quirales β - y γ-amino de los aminoácidos (figura 3). Como se informó anteriormente, la oxidación de H de C catalizada por la αKAO presenta el centro stereogenic hidroxi sustituidas con diastereoselectividad total; la quiralidad Cβ/γ se conservarán en el paso decarboxylative, que sólo afecta el carbono Cα de la molécula del aminoácido del16.
Figura 3: Análisis retrosintético. Retrosynthesis (A) de β - y γ-amino alcoholes (R) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (4) (5R) - hidroxi - L-lisina y (S) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (5) y 1, 5-diaminopentan-3-ol (6) de L-lisina. Retrosynthesis (B) β, γ y β, δ-aminoácidos dioles (2S, 3S) - 1, 5 - diaminopentane-2, 3-diol (10) y (2R, 4S) - 1,5 - diaminopentane-2, 4-diol (11) a partir de (5R)- hidroxi-L-lisina y (2R, 3R) - 1,5 - diaminopentane-2, 3-diol (7) a partir de L-lisina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
A partir de L-lisina y su (5R)-hidroxi derivado, Adjunto divulgamos una dos o tres paso, un pote, procedimiento enzimático combina dioxygenases y PLP-DCs para obtener el objetivo de amino alcoholes. Antes de la síntesis a escala de laboratorio de las moléculas de la blanco, el método fue desarrollado en la balanza analítica para ajustar las condiciones de reacción, por ejemplo, las concentraciones de enzima, necesarias para permitir la conversión total de las materias primas; Presentamos este procedimiento así.
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Protocol
1. preparación de enzimas
- Expresar y purificar las proteínas como se describió anteriormente26.
Nota: Proteínas recombinantes se obtuvieron con las siguientes concentraciones finales: αKAO de Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID: C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL; ΑKAO de C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM6 (KDO2) 2,29 mg/mL; PLP-DCs de S. rumirantium, UniProtKB ID: O50657 (LDCSrum), extracto de célula libre con enzima total 12,44 mg/ml; PLP-DC de C. pinensis, UniProtKB ID: C7PLM7 (CCCpin), 2,62 mg/mL.
2. preparación de soluciones
Nota: Todas las soluciones que a continuación se preparan en agua desionizada.
- Preparar 1 M de tampón HEPES, pH 7,5; ajuste con 5 M de NaOH.
Nota: Durante la etapa de ajuste de pH, use guantes protectores, ropa protectora, protección para los ojos y cara protección (P280). En caso de contacto con los ojos (P305, P351, P338), enjuague cuidadosamente con agua durante varios minutos quitar lentes de contacto si es posible. Continúe enjuagando y llame de inmediato a un centro de envenenamiento o al médico (P310). El código P se refiere a la intervención cautelar (peligro clase y categoría; véase, por ejemplo, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/). - Preparar 100 mM de L-lisina, 100 (5S) - hidroxi - L-lisina, 150 mM α-ketoglutaric ácido, ascorbato de sodio 100 mM, 10 mM amonio hierro (II) sulfato hexahidrato (sal de Mohr), piridoxal 5-fosfato (PLP) de 100 mM y 100 mM Ditiotreitol (DTT).
- Preparar 1 M, 2M y 6M de ácido clorhídrico (HCl) de una solución de HCl 37% (aproximadamente 12 M solución), siguiendo las mismas instrucciones de seguridad descritas en el punto 2.1.
Nota: Las soluciones de ácido α-ketoglutaric, ascorbato de sodio y amonio hierro (II) sulfato hexahidrato se realizará recién en el día de uso. La solución de lisina puede almacenarse durante varios meses a temperatura ambiente. La solución PLP puede guardarse durante un mes a 4 ° C. La solución DTT puede guardarse durante un mes a-20 ° C.
3. balanza analítica reacciones
- Desarrollo de métodos para la reacción de descarboxilación de (5R) - hidroxi - L-lisina
- Añadir 11 μl de 1 M solución de HEPES buffer pH 7,5 (concentración final 50 m m) a un microtubo 2 mL. Luego agregue 22 μL de 100 mM (5S) - hidroxi - L-lisina (concentración final 10 mM), 2,2 μl 100 mm PLP (concentración final 1 mM) y 2,2 μl de 100 mM DTT (concentración final 1 mM).
Nota: En el caso de la reacción con LDCSrum, la incorporación de la TDT no es necesaria. - Añadir el PLP-DC purificado (concentración final 0,1 mg/mL). Completo con H2O para un volumen final de 220 μl.
- Agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente, con una tapa abierta al aire libre, en 300 rpm durante 3 horas.
Nota: Agitación de la mezcla de reacción con una tapa abierta aire libre garantiza una buena oxigenación de los medios de reacción. Por lo tanto no es necesario a la burbuja de oxígeno en el medio de reacción. - Recoger 10 μl de la mezcla de reacción para ser analizados según el procedimiento de control de la reacción se describe en el paso 6. Las muestras son preferentemente derivatizadas y analizadas directamente después del muestreo.
- Añadir 11 μl de 1 M solución de HEPES buffer pH 7,5 (concentración final 50 m m) a un microtubo 2 mL. Luego agregue 22 μL de 100 mM (5S) - hidroxi - L-lisina (concentración final 10 mM), 2,2 μl 100 mm PLP (concentración final 1 mM) y 2,2 μl de 100 mM DTT (concentración final 1 mM).
- Desarrollo de métodos para la reacción de la cascada enzimática combina un paso de hidroxilación catalizado por αKAO con descarboxilación catalizada por PLP-DC
- Añadir 11 μl de 1 M de pH de buffer HEPES 7.5 (concentración final 50 m m) a un microtubo 2 mL. Luego, añade 22 μL de 150 mM de α-ketoglutaric ácido (concentración final 15 mM), 5.5 μl de 100 mM de ascorbato de sodio (concentración final 2,5 mM), 22 μL de 10 mM de Mohr de sal (concentración final 1 mM) y 22 μL de 100 mM de L-lisina (concentración final 10 mM).
- Completo con H2O para un volumen final de 220 μl, tomando en cuenta el volumen de la solución de enzima a ser agregado en el paso 3.2.3.
- Agregue la enzima αKAO purificada requerido según la regioselectividad específica: KDO1 para la hidroxilación en posición C-3 o KDO2 posición C-4 de L-lisina. La concentración final de la enzima purificada (0.05-0.5 mg/mL) fue determinado permitir una conversión completa en aproximadamente 3 h.
- Agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente, con una tapa abierta al aire libre, en 300 rpm durante 3 horas.
- Añadir 2,2 μl de 100 mM de PLP (concentración final ~ 1 mM) y 2,2 μl de 100 mM de DTT (concentración final ~ 1 mM).
Nota: En el caso de la reacción con LDCSrum, la incorporación de la TDT no es necesaria. - Añadir el PLP-DC purificado en una concentración que permite la conversión completa en 18 h: LDCSrum en una concentración final aproximada de 0,1 mg/mL para la reacción en cascada con KDO1 y DCCpin en una concentración final aproximada de 0,5 mg/mL para la reacción en cascada con KDO2.
- Agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente, con una tapa abierta al aire libre a 300 rpm durante 18 h.
- Ejecutar un procedimiento de control como en el paso 3.1.4.
- Desarrollo de métodos para la reacción de cascada enzimática que combina dos pasos de hidroxilación catalizadas por αKAOs con descarboxilación catalizada por PLP-DC
- Ejecutar pasos 3.2.1-3.2.2.
- Añadir a KDO1 a una concentración final de 0.05 mg/mL. Agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente, con una tapa abierta al aire libre, en 300 rpm durante 3 horas.
- Añadir KDO2 en una concentración final aproximada de 0,5 mg/mL, calculada el volumen inicial de reacción. Agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente, con una tapa abierta al aire libre, a 300 rpm durante 18 h.
- Ejecute paso 3.2.5.
- Añadir el PLP-DC DC purificadoCpin en una concentración final aproximada de 0,5 mg/mL, calculada el volumen inicial de reacción. Agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente, con una tapa abierta al aire libre, a 300 rpm durante 18 h.
- Ejecute el procedimiento de control como en el paso 3.1.4.
4. semi-preparativa reacción biocatalítica de One-pot
Nota: Las reacciones enzimáticas se llevan a cabo en 0.1 mmol de L-lisina en un matraz Erlenmeyer un volumen total de 10 mL de vidrio 250 mL al aire libre.
- Síntesis de los derivados de monohydroxylated
- Agregar 0,5 mL de tampón HEPES de 1 M pH 7,5 (concentración final 50 mM) en el matraz. Luego, añadir 1 mL de 100 mM de L-lisina (concentración final 10 mM), 1 mL de 150 mM α-ketoglutaric ácido (concentración final 15 mM), 0.25 mL de ascorbato de sodio 100 mM (concentración final de 2,5 mM), y 1 mL de 10 mM Mohr sal (concentración final 1 mM).
- Completo con H2O para un volumen final de 10 mL, teniendo en cuenta el volumen de la solución de enzima a ser agregado en el paso 4.1.3.
- Agregue la enzima αKAO purificada requerido según la regioselectividad objetivo: KDO1 a una concentración final de 0,075 mg/mL para la hidroxilación en posición C-3 o KDO2 a una concentración final de 0,5 mg/mL para la posición C-4 de L-lisina. La concentración final de la enzima purificada fue determinada para permitir una conversión completa en aproximadamente 3 h.
- Agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente a 300 rpm para la duración apropiada. Cuando la supervisión de reacción indica una reacción de hidroxilación terminado (ejecute todos los pasos detallados en el paso 6 para la reacción control protocolo), proceda al paso 4.1.5. Un tiempo de reacción típico es 3 h.
- Añada 100 μl de 100 mM PLP a la mezcla de reacción αKAO (concentración final ~ 1 mM). Luego, añada 100 μl del 100 mM DTT (concentración final ~ 1 mM), excepto cuando se utiliza LDCSrum.
- Añadir purificada PLP-DC: LDCSrum en una concentración final aproximada de 0,05 mg/mL para la reacción en cascada con KDO1 o DCCpin en una concentración final aproximada de 0,5 mg/mL para la reacción en cascada con KDO2.
- Agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente, 300 rpm, durante 18 h y continuar directamente a los pasos detallados en el paso 4.3.
- Síntesis del derivado dihydroxylated
- Agregar 0,5 mL de tampón HEPES de 1 M pH 7,5 (concentración final 50 mM), 1 mL de 100 mM de L-lisina (concentración final 10 mM), 1 mL de 150 mM α-ketoglutaric ácido (concentración final 15 mM), 0.25 mL de ascorbato de sodio 100 mM (concentración final 2, 5 mM) , y 1 mL de 10 mM Mohr sal (concentración final 1 mM). Completo con H2O para un volumen final de 10 mL, teniendo en cuenta el volumen de la solución de enzima a ser agregado en el paso 4.2.2.
- Añadir a KDO1 a una concentración final de 0,075 mg/mL. Agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente, 300 rpm durante el tiempo apropiado.
- Cuando la supervisión de reacción indica una reacción de hidroxilación completa (vea el paso 6 para la reacción control protocolo), proceda al paso 4.2.5. Un tiempo de reacción típico es 3 h.
- Añadir 1 mL de 150 mM α-ketoglutaric ácido (concentración final 15 mM), 0.25 mL de ascorbato de sodio 100 mM (concentración final de 2,5 mM), y 1 mL de 10 mM Mohr sal (concentración final 1 mM).
- Añadir KDO2 a una concentración final aproximada de 0,5 mg/mL, calculada el volumen inicial de reacción. Agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente a 300 rpm durante 18 h.
- Cuando la supervisión de reacción indica una reacción de hidroxilación completa (vea el paso 6 para la reacción control protocolo), proceda al paso 4.2.7. Un tiempo de reacción típico es 18 h.
- Añada 100 μl de 100 mM de DTT (concentración final ~ 1 mM), excepto cuando se utiliza el LDCSrum.
- Añadir el purificado DCCpin en una concentración final aproximada de 0,5 mg/mL, calculada el volumen inicial de reacción.
- Agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente a 300 rpm durante 18 h.
- Amortiguamiento de
- Enfríe la mezcla de reacción colocando el vaso de 250 mL matraz Erlenmeyer en un baño de hielo.
- Añadir cuidadosamente, durante aproximadamente 1 minuto, 0.25 mL de 6 M de HCl agitando manualmente con cuidado la mezcla de reacción refrigerada. Siga las mismas instrucciones de seguridad descritas en el paso 2.1.
- Transferencia de la mezcla ácida en una centrífuga de fondo cónico de 50 mL del tubo utilizando un vidrio pipeta Pasteur equipada con una bombilla, luego centrifugar a 1.680 x g y 4 ° C por 15 minutos.
- Retirar el sobrenadante y mantener a un lado en un matraz de fondo redondo de 250 mL.
- Añadir 10 mL de agua desionizada para el tubo de centrífuga de fondo cónico que contiene el precipitado. Vortex para Resuspender el pellet.
- Centrífuga x 1.680 g, 4 º C, durante 15 minutos.
- Retirar el sobrenadante y añadir al matraz de fondo redondo de 250 mL que contiene el primer sobrenadante (paso 4.3.4).
- Congelar los sobrenadantes recogidos por inmersión del matraz en nitrógeno líquido con mano constante remolino y transferir inmediatamente el matraz a un colector de benchtop congelar-secador para evitar que el material descongelado.
- Una vez finalizado el proceso de liofilización (noche), retire el matraz del congelar-secador.
5. purificación de Amino Alcoholes de mezcla de crudo de reacción enzimática
- Resina de intercambio iónico
- Disolver el producto liofilizado en la cantidad mínima de acuosa 0,1 M de HCl (aproximadamente 4 mL) hasta que las partículas sólidas no son visibles para el ojo desnudo.
- Condición de una resina de intercambio catiónico del grupo funcional ácido sulfónico, malla de 200-400, en una columna de vidrio (20 x 250 mm) por liberador a presión atmosférica 1 M HCl (volúmenes de columna 4) seguido de 0.1 M HCl (4 volúmenes de columna, volumen de la columna = 10 mL).
- Carga de la muestra cuidadosamente en la parte superior de la resina en las paredes de la columna de vidrio utilizando una micropipeta de 1000 μl. Luego, enjuague el tubo de centrífuga de fondo cónico que contenía el producto crudo tres veces con 1 mL 0.1 M de ácido clorhídrico solución acuosa por lavar y cargar los volúmenes de enjuague resultante en la columna de la misma manera.
- Eluir con una no-lineal gradiente: 4 volúmenes de columna de 0.1 M HCl, 4 volúmenes de columna de agua, 4 volúmenes de columna de 5% de NH4OH, 4 volúmenes de columna de 10% de NH4OH, 4 volúmenes de columna de 15% NH4OH, 4 volúmenes de columna de 20% NH4OH , 4 volúmenes de columna de 25% de NH4OH y por último 4 volúmenes de columna de 28% NH4OH.
- Supervisar la purificación por HPLC (ver paso 6).
- Las fracciones que contiene el compuesto (NH4OH 20-28%) de la piscina y como se describe en pasos 4.3.8-4.3.9 por congelación.
Nota: La columna de intercambio iónico se puede reutilizar después de la elución con agua desionizada para neutralización de agua de elución (aproximadamente 50 mL) seguido de reacondicionamiento por liberador con 50 mL de 1 M de HCl.
- SPE
- Solubilizar el compuesto liofilizado en aproximadamente 2 mL de H3PO4diesel (20 μl/mL).
- Lugar un modo mixto intercambio catiónico SPE 6 mL cartucho en un colector de extracción conectada a una bomba de agua. Estado del cartucho de dibujo con 4 mL de metanol a presión reducida, suministrada por el distribuidor. Equilibrar el cartucho por el dibujo a través de 4 mL de H3PO4diesel (20 μl/mL).
- Cargar la muestra en el cartucho utilizando una micropipeta μL 1.000 en la parte superior de la resina en las paredes de la columna de vidrio y enjuague el frasco que contiene el producto tres veces con 0,75 mL de H3PO4diesel (20 μl/mL) por lavado. El volumen de enjuague resultante en la columna de la carga de la misma manera.
- Lavar el cartucho por liberador de presión reducida, suministrado por el colector, 4 mL 2% HCOOH, en agua, luego con 4 mL de agua. Procederá a la elución con un gradiente de NH4OH en agua (4 mL para cada elución, a partir de 4% de NH4OH: 10%, 15%, 15%, 20% y 28%).
- Supervisar la purificación por HPLC mediante el análisis de cada fracción según la reacción seguimiento protocolo descrito en el paso 6. Mantenga todas las fracciones que contienen puro derivado deseado según cromatograma (UV) ULTRAVIOLETA y proceda al paso 5.2.6.
- Piscina las fracciones que contiene el deseado compuesto en un 100 mL redondo matraz de fondo, enjuague los tubos que contienen las fracciones con agua y añadir el volumen de enjuague 100 ml redondo matraz de fondo.
- Eliminar el disolvente a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio, equipado con termostato agua baño hervidor de agua a 40 ° C y conectado a una bomba de vacío de 10 mbar.
- Solubilizar el sólido en un volumen mínimo de agua y transfiera la solución a un pesado 25 mL redondo matraz de fondo. Enjuagar el matraz con un volumen mínimo de agua, añadir el volumen de enjuague al matraz de 25 mL y proceda al paso 5.2.9.
- Pesar el producto purificado y calcular el rendimiento.
- El producto purificado en el volumen mínimo de 2M de HCl se disuelven hasta que las partículas sólidas no son visibles para el ojo desnudo y como se describe en pasos 4.3.8-4.3.9 por congelación.
Nota: El amino alcoholes son compuestos sensibles y se mantienen como sus sales de clorhidrato.
6. reacción de monitoreo y análisis de productos
- Derivatización de sustratos y productos antes de análisis de HPLC
Nota: Los substratos y productos necesitan derivatizada como derivados aromáticos para aumentar su detectivity cromatográfico de UV. Utilizamos 1-fluoro-2, 4-dinitrobenceno (DNFB). Cada muestra fue inyectada en el HPLC inmediatamente después de la derivatización.- Tomar 10 μl de la reacción enzimática y la transferencia a un microtubo de 1.5 mL. Añadir 10 μl de 0,25 M de solución acuosa de NaHCO3 , 100 μl de etanol y 30 μl de 2.5 mg/mL de solución DNFB en etanol.
- Cierre el microtubo y agitar la solución resultante por 1 h a 65 ° C, a 1.000 rpm. Saciar con 10 μl de 1 M de HCl.
- Filtrar sobre un filtro de jeringas no estériles de 4 mm de diámetro con un 0,22 μm poro tamaño del polivinilideno hidrofílico fluoruro (PVDF) la membrana utilizando una jeringa de 1 mL Luer.
- Realizar seguimiento de la reacción del dioxygenase utilizando cualquier sistema capaz de separar los aminoácidos derivatizados. Este protocolo implica la detección UV de aminoácidos derivatizada en el dinitrobenceno (DNB) del cromóforo grupo27.
- Ajuste el HPLC con C18 con trimetil sililo endcapping fase reversa columna (5 μm, 3 x 150 mm).
- Equilibrar la columna C18 con (30:70) eluyente B (MeCN + 0.1% TFA) al eluyente A (H2O + 0.1% TFA) a un flujo de 1 mL/min y 35 ° C por 15 min (correspondiente a aproximadamente 20 volúmenes de columna).
- Inyectar 10 μl de la mezcla de reacción derivatizados (ver paso 6.1) en la columna HPLC C18. Use una mezcla de MeCN, 0.1% TFA/H2O y 0.1% TFA como eluyente con un degradado lineal (relación 30:70 a 70: 30 en 9 min., temperatura de 35 ° C, flujo 1 mL/min).
- Utilizar la detección de UV de 400 nm a analizar los productos que eluyen en la columna cromatográfica. DNB-lisina elutes típicamente alrededor 6,5 min hidroxilado DNB-lisina alrededor de 5,5 min, dihydroxylated DNB-lisina alrededor de 4,2 min y DNB-aminodiol alrededor de 5,3 minutos.
7. RMN análisis de Amino Alcoholes purificadas
- Disolver purificadas amino alcoholes en D2O (700 μL) y transfiera la solución a un tubo de resonancia magnética Nuclear (RMN).
- Adquirir 1H y 13C NMR espectros según apropiado NMR facility protocolos28.
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Representative Results
Hemos divulgado previamente la síntesis de mono - y di-hidroxi-L-lisinas por diastereoselectiva hidroxilación enzimática catalizada por dioxygenases de hierro (II) / αKAO familia (figura 1)16. Para optimizar el protocolo de las cascadas todos presentado aquí, que combinan uno o dos pasos de hidroxilación catalizadas por una αKAO seguida por un paso de descarboxilación catalizado por un PLP-DC, las condiciones de reacción fueron ajustadas para satisfacer los requerimientos de ambos reacciones enzimáticas. Comenzamos por investigar las actividades de los dos DCs, LDCSrum y DCCpin, hacia el comercialmente disponible (5R) - hidroxi - L-lisina. Luego analizan las actividades DC hacia los derivados mono, 3-hidroxi-L-lisina (1) y 4-hidroxi-L-lisina (2), en cascada con el paso de oxidación catalizado por la αKAO apropiada. Tabla 1 presenta los resultados de los biocatalizadores decarboxilaciones de las mono-hidroxi-L-lisinas. Las conversiones fueron medidas por HPLC después de derivatización de la mezcla de reacción con DNFB para dar el correspondiente DNB derivatizada sustratos y productos.
| Entrada | Sustrato | PLP-DC | Producto | Conversión |
| 1 | (5R) - hidroxi - L-lisina | Los PMASrumb) | 4 | 100% |
| 2 | (5R) - hidroxi - L-lisina | C.C.Cpinb) | 4 | n.d. |
| 3 | 1 un) | Los PMASrumb) | 5 | 100% |
| 4 | 1 un) | C.C.Cpinb) | 5 | 29% |
| 5 | 2 un) | Los PMASrumc) | 6 | 60% |
| 6 | 2 un) | C.C.Cpinc) | 6 | 100% |
Tabla 1: descarboxilación biocatalítica de monohidroxilados-L-lisinas. Condiciones de reacción: sustrato (10 mM), PLP-DC (0,1 a 0,15 mg mL-1), HEPES buffer (50 mM, pH 7.5), PLP (1 mM), TDT (1 mM; no utilizado con LDCSrum), durante la noche, RT, 300 rpm. (un) sintetizados enzimáticamente en situ. (b) 0,1 mg/mL. (c) 0,15 mg/mL; n.d.: no detectado
El C.C. de S. rumirantium (LDCSrum) mostraron actividad hacia el mono lisinas hidroxis con mejor conversión de derivados 3 - y 5-a los correspondientes diaminas quirales hidroxis (entradas 1, 3 y 5). Como era de esperar, DCCpin, el DC del contexto genómico αKAO, resultó para ser el más adecuado para la descarboxilación de (4R) - hidroxi - L-lisina (2) (entrada 6). En la reacción estándar condiciones la conversión de (3S) - hidroxi - L-lisina (1) a su homólogo descarboxila (5) con DCCpin fue baja (entrada 4) y ninguna actividad se observó hacia (5R)- hidroxi-L-lisina (entrada 2).
Por último, examinó las actividades de los dos controladores de dominio hacia los derivados di-hidroxi-L-lisina 3, 8y 9, sintetizado en situ por uno o dos pasos de hidroxilación catalizadas por KDO1, KDO2 o una combinación de los dos (figura 2). los resultados de la descarboxilación biocatalítica de los di-hidroxi-L-lisinas son resumidos en la tabla 2.
| Entrada | Sustrato | PLP-DC | Producto | Conversión |
| 1 | 3 | Los PMASrumb) | 7 | n.d. |
| 2 | 3 | C.C.Cpinb) | 7 | 100% |
| 3 | 8 un) | Los PMASrumb) | 10 | 19% |
| 4 | 8 un) | C.C.Cpinb) | 10 | 12% |
| 5 | 9 un) | Los PMASrumc) | 11 | n.d. |
| 6 | 9 un) | C.C.Cpinc) | 11 | n.d. |
Tabla 2: biocatalizadores descarboxilación de la L-dihidroxi-lisinas. Condiciones de reacción: sustrato (10 mM), PLP-DC (0,1 a 0,15 mg/mL), HEPES buffer (50 mM, pH 7.5), PLP (1 mM), TDT (1 mM; no utilizado con LDCSrum), durante la noche, RT, 300 rpm. (un) sintetizados enzimáticamente en situ. (b) 0,1 mg/mL. (c) 0,15 mg/mL; n.d.: no detectado.
Con respecto a la descarboxilación de la L-dihidroxi-lisinas 3, 8y 9, los resultados no fueron completamente satisfactorios. En las condiciones de reacción estándar, sólo (3R4R) - dihidroxi - L-lisina (3) cuantitativo fue convertido en el dihydroxy correspondiente diamina 7 (entradas 1 - 2). La conversión de 4, 5-dihidroxi-L-lisina (8) fue moderado (entradas 3-4) pero merece la pena señalar que podría mejorarse incrementando grandemente la carga de la enzima. Ninguno de los dos probados PLP-DCs se encontraron activo hacia 3, 5-dihidroxi-L-lisina (9) (entradas 5-6).
Las reacciones de la cascada enzimática exhibiendo conversión cuantitativa determinada por HPLC de monitoreo fueron aumentadas con éxito (figura 4).
Figura 4: datos analíticos representativos para la cascada enzimática de tres paso. (A) HPLC monitoreo de biocatalizadores conversión de L-lisina (2R, 3R) - 1, 5 - diaminopentan-2, 3-diol (7). RT = tiempo de retención. (B) 1H NMR yC 13C NMR del amino alcohol (7) después de la purificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El protocolo de purificación aquí presentado permite la extracción eficiente de amino alcoholes de la mezcla de reacción enzimática complejo. El amino alcoholes 4, 5, 6y 7 se obtuvieron excelentes rendimientos (figura 5).
Figura 5: cascada enzimática para la síntesis de aminoalcoholes. Síntesis de (R) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (4), (S) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (5), 1.5-diaminopentan-3-ol (6), y 2R, 3R- 1,5 - diaminopentane-2, 3-diol (7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Derivados y aminoalcoholes quirales tienen una amplia gama de aplicaciones, desde auxiliares quirales para la síntesis orgánica a la terapia farmacéutica. Síntesis multietapa para producir alcoholes aminos por síntesis orgánica convencional son numerosos, pero no siempre es eficiente debido a medidas de protección/desprotección tedioso junto con un control sensible de la estereoquímica16. Un enfoque de biocatalizadores que prescinde de las medidas de protección/desprotección y es generalmente altamente estereoselectiva representa una buena alternativa.
Trabajo previo había reportado la síntesis de varios β-amino alcoholes con un esqueleto de 2-phenylethan-1-Amina por transformación asimétrica cinética dinámica (DYKAT). En esta ruta, el hidroxi sustituidas stereogenic centro fue introducido por aldolisation benzaldehído y derivados, catalizadas por una aldolasa treonina. La diastereoselectividad baja y el rendimiento moderado de este primer paso fueron superados por el estereoespecífica posterior descarboxilación catalizada por la L-tirosina C.C., llevando a enantioenriched β-amino alcoholes aromáticos11,12.
Aquí divulgamos un protocolo sencillo para la síntesis de varios amino alcoholes a partir de la L-lisina disponible. Aunque muy eficiente, este protocolo adolece de inconvenientes debido a gamas de sustrato limitado de la αKAO y enzimas PLP-DC. Sin embargo, pueden considerarse síntesis biocatalítica de diversos aminoalcoholes utilizando diferentes combinaciones de αKAO y aminoácido DCs29,30,31,32. Cabe destacar que el orden de dos pasos es fundamental en la cascada como el PLP-DCs también es activo hacia la L-lisina. Debe tenerse cuidado para asegurarse de que la L-lisina se consume en el primer paso oxidativo antes de ejecutar la reacción de descarboxilación catalizada por el PLP-DC. Esto se logra a través de un monitoreo cuidadoso de la reacción por HPLC después de la derivatización de los medios de reacción por un agente cromóforo. La baja tolerancia de la enzima a la concentración de sustrato alta es una limitación para el desarrollo. Para abordar esta cuestión, enzima evolución estrategias podría utilizarse para optimizar las propiedades de la enzima, como substrato concentración tolerancia33. También, inmovilización de la enzima puede considerarse para garantizar la reutilización de la enzima.
Este protocolo es fácil de realizar, y una de sus características más atractivas es la eficiencia de los pasos de purificación. En nuestro trabajo anterior, la extracción directa de las moléculas polares de la mezcla de reacción enzimática compleja era un problema, y derivatización de los compuestos por grupos hidrofóbicos fue necesario16. La purificación de los alcoholes aminos directamente de la reacción sin derivatización requiere trabajo extenso. En el presente Protocolo, el procedimiento de purificación de dos etapas combina la resina de intercambio iónico y extracción en fase sólida elimina el glicerol (contenido en la solución de enzima) y tampón HEPES, dos moléculas polares con propiedades fisico-químicas cerca de la objetivo de amino alcoholes y por lo tanto, difícil de separar estos compuestos. Este protocolo de purificación puede ser adaptado para la extracción de moléculas polares diferentes de mezclas de reacción complejos tales como reacciones enzimáticas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen Véronique de Berardinis de debate fructífero y Alain Perret, Christine Pellé y Peggy Sirvain para soporte técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L-lysine hydrochloride | Sigma Aldrich | L5626 | |
| (5S)-hydroxy-L-lysine | Sigma Aldrich | GPS NONH | Out sourcing |
| α-ketoglutaric acid | Sigma Aldrich | 75892 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate | Acros | 201370250 | |
| Pyridoxal phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | 82870 | |
| 3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632 | |
| 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Sigma Aldrich | D1529 | |
| Ethanol | VWR | 20825.290 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 71631 | |
| HCl 37% | Sigma Aldrich | 435570 | |
| HCl 0.1M | Fluka | 35335 | |
| Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83640.320 | |
| 2,2,2-trifluoroacetic acid | VWR | 153112E | |
| Ammonia 28% | VWR | 21182.294 | |
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83638.32 | |
| Formic acid | Acros | 270480010 | |
| Phosphoric acid 85% | Acros | 201145000 | |
| Deuterium oxide | Acros | 320,710,075 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| C18 HPLC column | Phenomenex | 00F-4601-Y0 | |
| Accela UHPLC System | ThermoFisher Scientific | ||
| Accela PDA detector | ThermoFisher Scientific | ||
| 4mm syringe filters - 0,22µm - PVDF | Merck | SLGVR04NL | |
| Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip | VWR | HSWA5010.200V0 | |
| Cation exchange resin 100-200 mesh | Sigma Aldrich | 217506 | |
| Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL | Waters | 186000776 | |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | |
| Rotary evaporator | Büchi | 531-0103 | |
| Lyophilizer alpha 1-2 LDplus | Christ | L083302 | |
| Micropipette 20 µL | Eppendorf | 3121000031 | |
| Micropipette 100 µL | Eppendorf | 3121000074 | |
| Micropipette 500 µL | Eppendorf | 3121000112 | |
| Micropipette 1000 µL | Eppendorf | 3121000120 | |
| 300 MHz spectrometer | Bruker | ||
| 2 mL microtube | CLEARLine | CL20.002.0500 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tube | Fischer Scientific | 05-539-8 | |
| 25 mL round-bottom flask 14/23 | Fischer Scientific | 10353331 | |
| 100 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL erlenmeyer flask | Fischerbrand | 15496143 |
References
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