Summary
肝臓の傷害および齧歯動物の再生の手術モデルとして部分胆管結紮を紹介します。
Abstract
総胆管の完全な胆管結紮 (cBDL) は、齧歯動物、閉塞性胆汁うっ滞、肝内胆管の増殖を研究するための確立された手術方法です。ただし、長期的な実験は増加罹患率と死亡率につながることができます。選択マウス系統基礎疾患、単一動物の損失および費用を減らすことができます肝葉の結紮とも有意義な比較を可能です。ここで、説明部分胆管結紮 (pBDL) にのみ左肝内胆管を結紮は、マウスの左葉ですがない、残りの葉の胆管閉塞の原因します。同じ動物で同じ条件に服従するときに unligated の葉は、結紮葉に内部統制として役割を果たすため注意して顕微鏡手術と pBDL 実験が費用対効果をすることができます。CBDL とは異なり、別の偽手術群は必要ではありません。pBDL、胆汁うっ滞及び他の保有胆汁成分の全身影響とローカライズされた直接の比較に非常に役立ちます。pBDL は薬や細胞遊走に関連するメカニズムを調査する手法として用途に使用することができます。
Introduction
急性肝障害・肝部分切除や胆管結紮 (cBDL) などの修復手術のモデルは、肝再生と病理学1,2を研究する齧歯動物で何十年も使用されています。CBDL で (これは肝臓で生成されるすべての胆汁を排出) 胆管結紮は、肝硬変3に最終的な進行すると術後最初の 2 〜 3 週間で閉塞性胆汁うっ滞、炎症および線維化の結果します。胆管の増殖、分化転換、および居住者の肝前駆細胞の誘導 cBDL4、5の機能があります。CBDL は、再現可能な成果野生型マウスと正常な肝臓6,7,8でこれらの系統の特徴である閉塞性 cholangiopathy の特定のメカニズムを解明し、プロシージャは、肝疾患、高い罹患率と死亡率は時間の経過とともに胆道閉塞のため予想よりもより多くの動物を必要とするいくつかの遺伝子導入マウスモデルで技術的に厳しいことができます。この手法も長時間コース実験 cBDL のストレスをそれ以外の場合は許せないかもしれないトランスジェニック マウスの基になると肝疾患の勉強のために有益です。
pBDL は、いくつかのこれらの課題を克服するために合理的な選択肢を提供できます。野生型マウスの初期 pBDL 研究は、炎症9の演技のローカルおよび全身の仲介人を区別するために目指しています。PBDL、総胆管の上左右の肝胆汁管の主な胆道合流は慎重に、門で可視化し、ローカライズされた閉塞性胆汁うっ滞を生成するのみ、左肝内胆管を結紮します。pBDL では、cBDL にいくつかの利点を提供しています。PBDL、unligated の右葉は栄養状態や要因を循環など、同じ全身作用を受ける結紮の左葉の同じ牌内部統制として機能します。全身性炎症性メディエーターを調べたところ、大沢ら以下の線維化および unligated の葉の壊死が観察が、炎症細胞と変形の成長因子 β 式結紮葉9に増加します。
最近では、pBDL が保持されて胆汁10の肝実質の効果を研究する再定義されました。(Unligated「シャム」) 内部統制群と実験群の同じ動物を使用して、pBDL は効果的により費用対効果は実験ごとに必要な動物の数を半減します。マウスは、コース実験理想的な時間 (≥2 週) 結紮葉で達成することができますので、はるかに良い、pBDL の影響を容認します。最も重要なは、pBDL は閉塞性胆汁うっ滞の直接的な肝内効果を区別することができます、unligated コントロール葉に比べて、結紮葉の胆汁構成成分を保持します。全体的に、pBDL は肝臓でローカライズされた胆汁うっ滞の葉固有の効果を研究する魅力的な方法です。
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Protocol
動物介護制度とピッツバーグ大学の利用委員会の倫理的なガイドラインに従ってすべてのプロシージャを行った。
1. 基本的なテクニックと一般的な手順
- オートクレーブ使用する前にすべての顕微鏡装置。
- 麻酔によりマウスを殺すことを避けるため、慎重にその呼吸パターンを確認します。
- 臓器や器官を損傷し、出血を引き起こしているを避けるために可能な限り少し腸をタップします。湿式の綿棒やガーゼで出血点を押してください。
- 臓器の穏やかな操作にウェット綿棒を使用します。2 つのサイズでウェット、非織ガーゼを使用、3.5 × 3.5 cm と 6.0 × 6.0 cm。 は全肝を撤回する小さいものを使用します。大きい 1 つを使用して、小規模および大規模な腸をラップします。
2. 術前準備
- 男性の c57/b6 マウス部分胆管結紮用 (体重が約 20 35 g) 時代の 8 〜 12 週間を使用します。
- 麻酔導入までマウス水や食料への無料アクセスを許可します。
3. 部分胆管結紮操作
- 1.5 から 2.0 パーセントのイソフルランと 1 L/分の酸素を混ぜた誘導の商工会議所に動物を置くことによってマウスを麻酔します。呼吸を観察することによって動物を注意深く監視します。動物の呼吸速度は 1 秒あたり 1 つの息をマウスがよく麻酔です。以来、前肢逃避反射はより急速に消え、逃避反射の完全な不在を確認する同様に後肢の足をピンチします。目は、角膜潰瘍を防ぐために眼科用潤滑剤と潤滑する必要があります。メモその鎮痛剤の投与は痛みの受容体の刺激を防ぐために手術前に与えることができます。
- シェイブ バリカン、腹壁、手術用顕微鏡下で手術のテーブルの上にマウスを置きます。テーブルにすべての手足をテープで固定します。イソフルラン吸入を全身麻酔下でマウスを維持するために使用します。
- イソフルラン気化器を調整し、誘導 2.0 3.0% イソフルランを使用します。
- 腹部壁の消毒滅菌綿棒を使用して、最初 0.3 0.5 mL ポビドン ヨードの局所的に適用は 70% のエタノールが続きます。動物は、滅菌ドレープで覆われるべきであります。
- はさみとアドソン鑷子を使用して恥骨に、剣から正中腹部切開を確認します。0.8 1.0 にイソフルランを減らす腹部切開をしたら、メンテナンスのため %。
- マイクロ リトラクターを使用して腹腔内を公開します。モスキート鉗子で、剣を押し、マウスの頭に向かって撤回します。ソフト粘土を使用して場所のモスキート鉗子を修正します。
- 温めた (37 ° C) の 1-2 の mL を植え付ける滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 腹部臓器が負傷を避けるために腹腔内に。濡れた綿棒で小腸を押し軽くマウスの頭に向かってそれらを撤回します。小腸、小腸 (図 1 a) を負傷を避けるために後腹膜間靭帯をカットします。
- ウェット、不織布-ガーゼ スポンジでの小規模および大規模な腸をラップします。腹腔内の尾側に配置します。滅菌ガーゼに包まれた腸は、汚染を避けるため無菌ドレープ フィールドを配置できます。
- 優しく肝門部、肝十二指腸靭帯 (図 1 b) を公開する小型湿式不織布-ガーゼ スポンジを使用して、剣に向かって全体の肝臓を撤回します。
- 肝門部の解剖を確認を確認します。総胆管は門脈の腹側にあります。肝門部の主な胆道合流地点に流出する右および左の肝の胆管の位置を確認します。
- 左葉を排水左胆管を識別し、縫合針 (図 2 a) の鈍側を使用して 10-0 ナイロン縫合糸とそれを取り囲みます。避けるために門脈、肝動脈、肝表面を負傷します。
- 10-0 ナイロン左胆管を結紮します。(図 2 b)。
- 湿式の綿棒を使用して、操作の前と同じ位置で小腸・大腸を配置します。
- 腸管の捻転と腹腔内出血がないことを確認し、筋肉と 4-0 vicryl の二層で皮膚を閉じます。皮膚縫合用編組縫合 (Vicryl) が使用されたが、感染の可能性を減らすためにモノフィラメントを優先します。
注: は、恥骨に剣から継続的な縫合糸で筋膜を閉じて剣に恥骨から継続的な縫合で皮膚を閉じます。 - 切開部を閉じる後麻酔を停止します。
4. 術後の治療とフォロー アップ
- ちょうど手術後がマウスの背側の皮をつまむし、注入 Buprenex (0.1 mg/kg) とセファゾリン (100 mg/kg 皮下、それぞれ Buprenex 注入による 12 時間間隔 3 日、セファゾリンのすべての 24 h 3 日間続いた11,12 ,13。メモその鎮痛剤の投与は痛みの受容体の刺激を防ぐために手術前に与えることができます。セファゾリンと他の周術期の抗生物質だけ移植実験で使われたもののような免疫抑制動物に必要なです。
注: 場合手術を正常に実行すると、マウス通常回復 30 分以内、マウスの活動は術前の状態とほぼ同じになります。 - 毎日苦痛の兆候のマウスを確認してください。
- PBDL 後肝臓と (すなわち7、14、21 日) 定義された時点で他の組織サンプルを調達する全身麻酔下頚部転位によってマウスを犠牲に。
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Representative Results
この典型的な実験のため pBDL は、α 1 アンチトリプシン (A1AT) 欠乏は、人間の肝臓病を要約する帳票のピッツ ・ トランスジェニック マウスで行われました。PiZ マウス染色遺伝子の DNA の突然変異人間 A1AT 遺伝子、プロモーター、イントロンと上流と下流地域14の側面の ~ 2 kilobases のコーディング領域を含む複数のゲノム断片から成る 15。通常 A1AT 肝臓で生成分泌血清蛋白質であります。A1AT の変異形は、肝臓毒性ストレスを原因に自発的に蓄積される不溶性タンパク質凝集体を生成します。実験利用 3 ヶ雄 PiZ マウス蛋白質の集合のピーク16時、この病気の最も深刻な表現型を表現します。
肝の生化学は、pBDL と cBDL のピッツ ・ マウス (表 1)10で比較しました。肝酵素アラニントランスアミナーゼ (ALT) とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) は、胆汁うっ滞の程度を測定する血清総ビリルビン (TSB) 肝障害のバイオ マーカーです。全体的に、pBDL を受けるマウスの血清値基準計画10に類似していた、重篤な肝障害や胆汁うっ滞、兆しは見られません。(胆管や血管損傷などの技術的な問題) のために失敗した pBDL マウス大幅上昇肝臓酵素と TSB の cBDL マウスに類似した血清値が表示されます注意してくださいすることが重要です。臨床的に、失敗した pBDL マウスより黄疸、胆汁漏れ、腹水、腹膜炎、または血腫の所見、苦しめられたが表示され、最終的に犠牲にする必要があります。
マウスの pBDL を受ける葉固有閉塞性胆汁うっ滞を開発、以来、cBDL で見られる膨張した、暗い、胆汁で満たされた胆嚢は取得しません。Unligated の葉は通常、暗い、赤褐色着色 (図 3) を維持しながら結紮葉だけが淡い色で表示されます。増加胆管増殖と結紮葉 (図 4) の線維化と肝組織学、同様に重要な違いがあります。10
表 1:部分的な肝内胆管結紮 (pBDL) からの代表的な血清肝生化学に比べて胆管結紮術 (cBDL) を完了10.時間の各ポイントは、3-4 マウスを表します。PiZ トランスジェニック マウスは c57/bl6 の背景には注意してください。ラボの参照範囲はまた括弧内に与えられます。(WT、野生型;TSB は、血清総ビリルビン;ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ;アルカリフォスファターゼ ALP)。
図 1:腹部キャビティと肝・胆道系の露出します。(A) 小腸の腸の損傷を避けるために収縮されていますゆっくりと接続する靭帯は後腹膜から無料でカットされます。(B) 肝が優しく肝門部 (矢印) で胆道ツリーの最大可視化の許可を取り消されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 部分胆管結紮します。(A) 手術針の鈍い端は慎重に左肝内胆管、胆管 (元倍率 40 倍) への合流の上の周りナイロン縫合糸を取り囲むように使用されます。(B) 肝左葉を通常排水左肝胆汁管の成功した合字。残りの胆管は、unligated (元倍率 40 倍) です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:総重量 (c57/b6) マウス肝臓の外観 pBDL 後 14 日。Unligated の葉は、通常、暗い、赤茶色の着色を保持しながら結紮の左葉が淡い色 (矢印) で表示されることに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 葉固有の WT (c57/b6) マウスの左 (L) 葉を結紮する unligated 右 (R) 葉を比較すると 14 日目 pBDL から代表的な肝組織のセクションで変更します。(A) ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色増加示す胆管増殖 (矢印) で結紮葉。(B) シリウス赤い汚れ示すブリッジ線維症胆管結紮葉増殖を伴います。マウスは以前にされている PiZ の組織は、10を報告しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
CBDL は閉塞性胆汁うっ滞のため最も一般的な実験的手法が、齧歯動物の複数の課題が発生することができます。術後日のエンドポイントを達成するために必要な数、に応じて、動物は重要な罹患率と時間が進むにつれて死亡率を体験できます。肝臓病の異常肝実質とベースラインで関数を示すいくつかのトランスジェニック マウス モデルを操作するとき、組織の損傷および胆管壊死の程度がさらに悪化します。CBDL と比較して、pBDL のレポートが限られているが、否定的な結果や動物の損失を軽減する選択実験の代替としてこの技術を適用することができます。
PBDL 法の変化も報告されています。ハインリッヒらのメソッド、外部湾曲した針を胆管、総胆管周辺針17合字の順に隣接して配置します。針が腹壁閉鎖、17胆管の狭窄ルーメン (すなわち、小計閉塞) を通じて限られた胆汁の流れの結果の前に削除されます。この中に、胆嚢は胆嚢炎17を防ぐためにも削除されます。著者らは、この方法は慢性の変更17ではなく急性胆汁うっ滞を勉強するより有益な結論。対照的に、我々 はここで説明されている pBDL メソッドは厳重、同じ動物の結紮と unligated (「偽の」) 葉の少ない動物実験ごとに必要ですので。重篤な基礎疾患を持つもトランスジェニック マウスは、長い端ポイント (2-3 週間) を維持できます。完全に公開し、胆道ツリー レーザーマイクロダイ セクション法を用いた血管および胆管損傷を防ぐための限られた操作を識別するには、注意が必要です。
理想的な実験組織学的および分子技術を使用して、胆汁分泌、トランスポーターの直接比較を行うことができますので、同時に結紮 (左) unligated (右) の葉から組織が収穫できる予定します。肝の生化学は重度の胆汁うっ滞を反映されません、結紮葉が閉塞性胆汁うっ滞10に伴う組織学的変化を示しています。このモデルは、肝臓内で保持された胆汁成分 (例えば胆汁酸、脂質、コレステロール) の直接アイソレータケージ効果の研究に有用です。今後の研究として pBDL は、シャント、場所特定の胆汁酸と薬は肝細胞18,19に胆管から直接再吸収 cholehepatic を調査する考慮されるかもしれない。内因性の胆汁酸が肝細胞で非効率的共役受動的、cholehepatic 同様に入れ換え、増加の重炭酸分泌20hypercholeresis と胆汁の alkanlinization につながるを受ける胆道上皮で吸収されます。PBDL 技術の応用は、肝疾患の調査の下で新規胆汁酸治療の薬理学的メカニズムを識別することによって創を促進できます。
PBDL のための追加のアプリケーションは、胆道ツリーを超えて拡張することができます。CBDL とその関連する影響の可逆性は記述され、これはまた内部統制21への直接比較を pBDL に適用することがあります。同様に、蛍光レポーター マウスの肝臓における表現の縦断的生体内イメージングは、cBDL22, pBDL の実験のための強力な意味を持つ後検討されています。さらに、トレースする血統や肝障害、追跡する生体内でより多くのそれらを許可するサイトに、骨髄由来の間葉系細胞などの細胞のホーミングを組み込む可能性があります pBDL を用いたげっ歯類を用いた研究精度23,24,25。
明らかに、肝障害や胆道の生理機能と薬物代謝と共に修理を研究する内部制御で再現可能な手法として単独で pBDL の広範なアプリケーションがあります。進行し慢性胆汁うっ滞の全身の効果を評価することを目指して実験、cBDL はまだ最も好ましいメソッドです。ただし、pBDL はまだこのような結果をサポートする補完データに追加します。
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Disclosures
著者の開示があります。
Acknowledgments
カーン博士は、NIH/NICHD K12HD052892、アルファ 1 の基礎、ヒルマン財団およびピッツバーグ肝臓研究センターから助成を認めています。博士 Michalopoulos は、NIH/NIDDK P01DK096990 から助成を認めています。アン ・ オアの優秀で、寛大な技術的な支援お願い申し上げます。マイクロサージャリー移植または齧歯動物ラボへのアクセスを提供するためも博士デビッド A. ゲラーに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope-Leica Wild M650, 6–40× magnification | Leica Microsystems | n/a | |
| Tec 3 isoflurane funnel fill vaporizer | General Anesthetic Services | n/a | |
| Stevens Tenotomy Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation | ASSI.9193 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | |
| Mosquito classic delicate hemostatic forceps | Codman | 30-4472 | |
| Micro-retractor | Murdock; Roboz Surgical Instrument | RS-6550 | |
| Nonwoven gauze sponges | Fisherband | 870-PC-DBL | |
| Puritan 6” Small Cotton Swab w/Wooden Handle | Puritan Medical Products Company | 868-WCS | |
| Dumont SS Forceps - Standard Tips/Straight/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-23 | |
| Dumont SS Forceps - Standard Tips/Angled 45°/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-25 | |
| Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge | Fine science tools | 15000-00 | |
| Microneedle holder | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | |
| Micro AROSuture, sterile 10-0 nylon suture, 70 µm, TAP points | AROSurgical Instruments Corporation | T4A10N07 | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J662H | |
| 5-ml Syringe | BD | 309646 | |
| Falcon tissue culture dish, 60 × 15 mm | Corning | 353002 | |
| Isoflurane, United States Pharmacopeia (USP) liquid for inhalation, 250 ml | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | |
| Buprenex injectable (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496-0757-1 | |
| Cefazolin for injection , USP | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-238-61 | |
| PVP scrub solution (povidone–iodine 7.5%) | Medline | NDC 12496-0757-1 | |
| 70% Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| Phosphate Buffered Saline Without Calcium or Magnesium | LONZA | 17-516F | |
| Sirius Red | Sigma | 365548 | |
| Hematolxylin | Fisher (Richard-Allan Scientific) | 22-050-111 (7211) | |
| Eosin | Anatech (Fisher) | 832 (NC9686037) | |
| Formalin | Fisher | SF100-20 |
References
- Higgins, G. M., Anderson, R. Experimental pathology of the liver - Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. The Journal of Pathology and Bacteriology. 35 (5), 769-798 (1932).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Michalopoulos, G. K., Barua, L., Bowen, W. C. Transdifferentiation of rat hepatocytes into biliary cells after bile duct ligation and toxic biliary injury. Hepatology. 41 (3), 535-544 (2005).
- Dipaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Guyot, C., Combe, C., Desmouliere, A. The common bile duct ligation in rat: A relevant in vivo model to study the role of mechanical stress on cell and matrix behaviour. Histochem Cell Biol. 126 (4), 517-523 (2006).
- Zhang, Y., et al. Effect of bile duct ligation on bile acid composition in mouse serum and liver. Liver Int. 32 (1), 58-69 (2012).
- Tag, C. G., et al. Bile duct ligation in mice: induction of inflammatory liver injury and fibrosis by obstructive cholestasis. J Vis Exp. (96), e52438 (2015).
- Osawa, Y., et al. Systemic mediators induce fibrogenic effects in normal liver after partial bile duct ligation. Liver Int. 26 (9), 1138-1147 (2006).
- Khan, Z., et al. Bile Duct Ligation Induces ATZ Globule Clearance in a Mouse Model of alpha-1 Antitrypsin Deficiency. Gene Expr. 17 (2), 115-127 (2017).
- Birkhead, H. A., Briggs, G. B., Saunders, L. Z. Toxicology of cefazolin in animals. J Infect Dis. 128, 378 (1973).
- Kunst, M. W., Mattie, H., van Furth, R. Antibacterial efficacy of cefazolin and cephradine in neutropenic mice. Infection. 7 (1), 30-34 (1979).
- Traul, K. A., et al. Safety studies of post-surgical buprenorphine therapy for mice. Lab Anim. 49 (2), 100-110 (2015).
- Carlson, J. A., et al. Accumulation of PiZ alpha 1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J Clin Invest. 83 (4), 1183-1190 (1989).
- Sifers, R. N., Finegold, M. J., Woo, S. L. Alpha-1-antitrypsin deficiency: accumulation or degradation of mutant variants within the hepatic endoplasmic reticulum. Am J Respir Cell Mol Biol. 1 (5), 341-345 (1989).
- Rudnick, D. A., Shikapwashya, O., Blomenkamp, K., Teckman, J. H. Indomethacin increases liver damage in a murine model of liver injury from alpha-1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 44 (4), 976-982 (2006).
- Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
- Glaser, S. S., Alpini, G. Activation of the cholehepatic shunt as a potential therapy for primary sclerosing cholangitis. Hepatology. 49 (6), 1795-1797 (2009).
- Gurpinar, E., et al. A novel sulindac derivative inhibits lung adenocarcinoma cell growth through suppression of Akt/mTOR signaling and induction of autophagy. Mol Cancer Ther. 12 (5), 663-674 (2013).
- Alpini, G. G., Francis, H., Marzioni, M., Venter, J., Phinizy, J., LeSage, G. Madame Curie Bioscience Database. , Landes Bioscience. Austin, TX. (2013).
- Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J Surg Res. 164 (2), 221-227 (2010).
- Delhove, J. M., et al. Longitudinal in vivo bioimaging of hepatocyte transcription factor activity following cholestatic liver injury in mice. Sci Rep. 7, 41874 (2017).
- Li, C., et al. Homing of bone marrow mesenchymal stem cells mediated by sphingosine 1-phosphate contributes to liver fibrosis. J Hepatol. 50 (6), 1174-1183 (2009).
- Xu, J., et al. Factors released from cholestatic rat livers possibly involved in inducing bone marrow hepatic stem cell priming. Stem Cells Dev. 17 (1), 143-155 (2008).
- Sharma, S., et al. Propitious role of bone marrow-derived mononuclear cells in an experimental bile duct ligation model: potential clinical implications in obstructive cholangiopathy. Pediatr Surg Int. 29 (6), 623-632 (2013).
