Summary
La reconstruction de la veine sus-hépatique (SHVC) reste une étape difficile dans une transplantation hépatique orthotopique rat. Dans cet article, nous montrons un protocole étape par étape pour la reconstruction de SHVC chez le rat en utilisant une technique nouvelle anastomose magnétique.
Abstract
Le modèle de rat de transplantation hépatique orthotopique (BTA) est essentiel pour la recherche de la transplantation. C’est un modèle animal très sophistiqué et nécessite une courbe d’apprentissage abrupte. L’introduction de la technique de Brassard pour l’abouchement de la veine porte (PV) et infrahepatic vena cava (IHVC) a considérablement simplifié la procédure de transplantation chez les rats. Toutefois, en raison de la courte paroi antérieure de la veine cave sus-hépatique bénéficiaires (SHVC), la technique du brassard est très difficile à utiliser pour la reconstruction de la SHVC. La plupart des chercheurs dans ce domaine toujours utilisent la technique de suture-main pour la reconstruction de SHVC, qui en fait l’étape de goulot d’étranglement en transplantation hépatique orthotopique de rat. La technique d’anastomose magnétique (c.-à-d., magnamosis) est une variante de raccordement de deux navires à l’aide de la force d’attraction entre deux aimants. Notre étude récente a montré que la technique d’anastomose magnétique est supérieure à la technique de suture-main pour la reconstruction de SHVC chez le rat. Dans cet article, nous montrons un protocole étape par étape pour la reconstruction de SHVC chez le rat en utilisant la technique d’anastomose magnétiques roman. Dans ce modèle, la reconstruction de la PV et IHVC a été réalisée par la technique de Brassard standard, tandis que la reconstruction de la voie biliaire principale (BD) a été réalisée par une technique de stent. re-L’arterialization hépatique n’a pas été effectuée. La technique d’anastomose magnétique reconstruction SHVC grandement facilitée et réduit considérablement la phase d’anphepatic. Après une courbe d’apprentissage raisonnable, même les chercheurs sans compétences avancées de microchirurgie peuvent produire des résultats fiables et reproductibles à l’aide de ce modèle de rat d’OLT.
Introduction
Le modèle de rat de transplantation hépatique orthotopique (BTA) est essentiel pour la transplantation recherche1,2. Le premier rat BTA a été décrit par Lee et al. , en 1973,3. Dans ce modèle, tous les navires ont été reconstruites par la technique de la main-suture. La technique de la main-suture nécessite des compétences microchirurgies avancées, qui limite considérablement son utilisation. Depuis lors, diverses modifications au protocole original de rat BTA ont été signalées. Parmi eux, la technique de Brassard pour l’abouchement de la veine porte (PV) et infrahepatic vena cava (IHVC) rapporté par Kamada et coll. en 1979 constitue une amélioration majeure de ce modèle, comme il a considérablement simplifié les procédures de reconstruction4 . Toutefois, en raison de la courte paroi antérieure de la veine cave sus-hépatique bénéficiaires (SHVC), la technique du brassard est très difficile à utiliser pour la reconstruction de la SHVC. La plupart des chercheurs dans ce domaine toujours utilisent la technique de suture-main pour la reconstruction de SHVC, qui en fait l’étape de goulot d’étranglement rat OLT5,6,7.
La technique d’anastomose magnétique (par exemple, magnamosis) est une variante de raccordement de deux navires ou autres structures tubulaires à l’aide de la force d’attraction entre deux aimants8,9,10,11. La force magnétique progressivement compresse et remodèle le tissu dans une anastomose fort, valvule12,13. Cette anastomose de compression s’est avérée pour être efficace pour les humains14,15. Nous avons conçu une paire d’anneaux magnétiques spécifiquement pour l’anastomose de la SHVC chez le rat. Notre étude récente a montré que la technique d’anastomose magnétique est supérieure à la technique de suture-main pour la reconstruction de SHVC au rat BTA16. Le but de cet article est de fournir un protocole détaillé, étape par étape pour la reconstruction de SHVC chez le rat en utilisant la technique d’anastomose magnétiques roman.
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Protocol
Le protocole a été réalisé conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et a été approuvé par le Comité sur l’éthique des animaux des expériences de Xi'an Jiaotong University, de Xi ' an, de la Province du Shaanxi en Chine.
Remarque : Aucune procédure de ce protocole ont été réalisé sous un microscope chirurgical.
1. préparation préopératoire
- La conception et la forme des anneaux magnétiques (Figure 1)
- Assembler l’appareil magnétique anastomose en faisant correspondre une paire d’anneaux magnétiques néodyme-fer-bore.
- Concevoir les anneaux selon les paramètres du rat SHVC avec diamètre de l’axe majeur, diamètre de l’axe mineur, épaisseur et poids de 8 mm, 5,5 mm, 1 mm, 0,5 g, respectivement.
- Les anneaux à la forme souhaitée de la courbe par une technique de découpage de fil-électrode, puis enduire les anneaux obtenus avec un aérographe d’oxyde de titane et stériliser 500 mg/L d’oxyde d’éthylène à 55-60 ° C pendant 6 h.
- Les poignets (Figure 2)
- Préparer le brassard pour anastomose des IHVC et des PV en coupant le tube de polyéthylène. S’assurer que le corps du brassard est 5 mm long avec une extension de Brassard de 2 mm.
Remarque : Les diamètres intérieurs et extérieurs de la manchette de PV sont 1,8 et 2,1 mm, tandis que ceux du brassard IHVC sont 2.6 et 2.8 mm, respectivement.
- Préparer le brassard pour anastomose des IHVC et des PV en coupant le tube de polyéthylène. S’assurer que le corps du brassard est 5 mm long avec une extension de Brassard de 2 mm.
- Le Stent (Figure 2)
- Préparer l’endoprothèse pour anastomose de la BD par canule intraveineuse de coupe 24-G avec une longueur de 5 mm pour produire le biseau aux deux extrémités.
- Animaux de laboratoire
- Utiliser des rats Sprague Dawley mâles pesant entre 250 et 280 g comme donneurs et receveurs. S’assurer que le destinataire est le même poids ou légèrement plus lourd (< 10 g) que le donneur.
- Garder les rats dans les chambres climatisé avec accès gratuit à la nourriture et l’eau avant la chirurgie.
2. donneur opération
- Injecter la buprénorphine (0,05 mg/kg) par voie sous-cutanée comme analgésique 1 heure avant l’opération.
- Anesthésier le rat donneur par inhalation isoflurane. Utilisation 5 vol % isoflurane à un débit de 1,5 L/min dans une boîte de Plexiglas pour l’induction de l’anesthésie et 2 vol % isoflurane à un débit de 0,6 à 0,8 L/min sur un cône de masque pour le maintien de l’anesthésie. Confirmer la profondeur de l’anesthésie en effectuant une pincée d’orteil et une pincée de peau.
- Raser la peau abdominale entière du rat à l’aide d’un rasoir électrique pour permettre une exposition plus propre. Désinfecter la peau correspondante avec une solution de polyvidone iodée.
- Ouvrir la cavité abdominale par une incision cruciforme à l’aide de ciseaux chirurgicaux de la racine du pénis jusqu'à 1 cm au-dessus de la xiphisternum le long linea alba, qui s’étend du point médian de l’incision longitudinale à la ligne médio axillaire. Extérioriser le tractus gastro-intestinal à gauche et le couvrir avec une gaze humide.
- Pince et tirer la xiphisternum vers la tête à l’aide d’une pince hémostatique. Disséquer le ligament falciforme et les tissus conjonctifs autour du foie. Isoler et ligaturer la veine phrénique inférieure gauche avec une suture de soie de 6-0.
- Insérez le stent dans le canal cholédoque.
- Fixer la BD juste au-dessus du point où la veine gastroduodenal rejoint la veine porte et tirez-le pour maintenir une tension un peu à l’aide d’un Micropinces. Ensuite, effectuer une incision en « V » de 1 mm de longueur sur la paroi antérieure environ 5 mm de proximal jusqu’au confluent biliaire par une paire de ciseaux micro.
- Insérez le stent dans la lumière de la voie biliaire principale à l’aide d’une courbe Micropinces. S’assurer au moins la moitié des stent se situe en dehors de la voie biliaire.
- Fixez le stent avec une suture de soie de 6-0. Couper une extrémité du fil de suture. Gardez l’autre se tenir au cours de l’anastomose plus tard. Transect biliaires au-dessous de l’endoprothèse et assurez-vous que la bile peut sortir de l’endoprothèse.
- Isoler la IHVC jusqu’au niveau de la veine rénale gauche. Libérer l’IHVC antérieure et latérale des tissus environnants en dissection du bourgeon coton jusqu'à ce que le IHVC est mouvement squelette. Séparez et ligaturer la veine surrénale droite et la veine rénale droite avec une suture de soie de 6-0.
- Hépariner le rat en injectant 50 U d’héparine dilué dans 2 mL d’une solution saline normale dans la veine dorsale de la verge.
- Perfuse le foie.
- Isoler l’aorte abdominale au-dessous de la veine rénale gauche. Insérer un cathéter 22-G dans l’aorte.
- Effectuer une thoracotomie, serrer l’aorte thoracique à l’aide d’un Micropinces.
- Perfuse le foie du donneur par le cathéter dans l’aorte avec 20 mL d’une solution saline normale contenant 25 U d’héparine (4 ° C) à raison de 3 mL/min avec une pompe à perfusion. Pendant ce temps, couper la veine cave inférieure de la veine rénale droite pour permettre à la solution de perfusion s’écouler hors du foie.
- Quand le foie du donneur est devenu pâle du transect le SHVC ainsi qu’une partie du diaphragme et la IHVC au niveau de la veine rénale gauche.
- Disséquer le tissu conjonctif entourant le PV par deux pinces micro. Ligaturer et diviser les veines du pylore avec une suture de prolène 8-0. Transect le PV au niveau de la veine splénique. Le foie du donneur de l’accise et rincez-la avec la solution saline normale froide. Placer dans un sérum physiologique froid bain-marie 4 ° C.
3. préparation
Remarque : Toutes les procédures pour la préparation de la greffe du foie sont effectuées dans un bain de solution saline froid à 4 ° C.
- Attacher un poignet à IHVC du donneur (Figure 3).
- Insérez le IHVC dans sa manchette avec l’extension brassard pointant vers le foie. Positionner l’extension de la manchette sur la paroi postérieure du IHVC. Fixer l’extension du poignet et la IHVC avec une courbe Micropinces lui-même attaché à l’aide d’une pince pour le conteneur de bain.
- Evert l’extrémité distale de la IHVC sur le corps de la manchette à l’aide de deux pinces micro.
- Fixez le bord avec une suture de soie de 6-0. Assurez-vous que le IHVC n’est pas tordue au cours du processus.
- Répétez l’étape 3.1 sur le PV pour attacher un poignet à Puerto Vallarta du donneur.
- Attacher un anneau magnétique à SHVC du donneur (Figure 4).
- Tirez sur le diaphragme par l’intermédiaire de la quatre pince et couper la SHVC.
- Passer le SHVC dans l’anneau magnétique à l’aide de la pince micro en alliage de titane.
- Evert l’extrémité distale de la SHVC sur l’anneau.
- Fixez l’anneau avec une suture de soie de 6-0. Assurez-vous que le SHVC n’est pas tordue au cours du processus.
- Retirer la membrane excès autour du foie.
- Plonger le foie du donneur dans un bain de solution saline normal froid et conserver à 4 ° C.
4. opération destinataire
Remarque : Le schéma de l’implantation du greffon chez le rat destinataire est montré dans la Figure 5.
- Injecter la buprénorphine (0,05 mg/kg) par voie sous-cutanée comme analgésique 1 heure avant l’opération. Anesthésier le rat donneur par inhalation isoflurane. Utilisation 5 vol % isoflurane à un débit de 1,5 L/min dans une boîte de Plexiglas pour l’induction de l’anesthésie et 2 vol % isoflurane à un débit de 0,6 à 0,8 L/min sur un cône de masque pour le maintien de l’anesthésie.
- Raser la peau abdominale entière du rat. Désinfecter la peau correspondante avec une solution de polyvidone iodée.
- Ouvrir la cavité abdominale par une incision médiane de 4 cm. Placez les rétracteurs abdominales. Tirez sur les côtes aussi éloignées que possible de la ligne médiane.
- Pince et tirer la xiphisternum vers la tête à l’aide d’une pince hémostatique. Disséquer les tissus conjonctifs et les ligaments autour du foie. Ligaturer et diviser le ligament hépato-oesophagien. Ligaturer et diviser l’artère hépatique avec une suture de prolène 8-0.
- Isoler le canal cholédoque à partir du premier portail hépatique. Placez une suture de soie de 6-0 dans le canal cholédoque juste en dessous de sa division et ligaturer le canal cholédoque.
- Disséquer la IHVC jusqu'à la veine rénale droite. Ligaturer et diviser la veine surrénalienne droite. Placez une courroie dans la SHVC du foie.
- Serrer le IHVC juste au-dessus de la veine rénale droite avec des microvaisseaux clips. Fixez le PV au niveau de la veine pylorique avec clips microvaisseaux.
- Pour vider le sang par le foie, injecter lentement 2 mL de sérum physiologique par le biais de la PV. Glisser vers le bas le foie en tirant sur la sangle précédemment mises. Serrez le SHVC et une partie du diaphragme avec un collier de Satinsky.
- La IHVC près le parenchyme et le PV à la porta hepatis du transect. Excise le foie en sectionnant le SHVC juste au-dessus du foie. Retirer le foie destinataire rapidement.
- Attacher un anneau magnétique à SHVC du destinataire.
- Insérer SHVC restants du destinataire dans un anneau magnétique.
- Fixer l’anneau magnétique sur une bride de Satinsky par attraction magnétique.
- Leonie le SHVC sur l’anneau magnétique jusqu'à ce que le navire recouvre le bord du ring.
- Placer le donneur greffe du foie orthotopically et la couvrir avec une gaze humide froide.
- Remplir la lumière du SHVCs du donneur et du receveur avec une solution saline normale. Enlever les bulles d’air pour éviter une embolie. Terminer la reconstruction SHVC en couplant les anneaux magnétiques incorporés dans du donneur et du receveur SHVC ensemble par la force magnétique.
- Reconstruire le PV.
- Tract la branche gauche et droite du PV du destinataire en tirant une suture de prolène 8-0 pour maintenir la tension de la PV.
- Déplacer la pince du PV du bénéficiaire vers le bas de la veine du pylore à la veine splénique afin d’exposer la veine entièrement.
- Inciser la paroi antérieure du destinataire. Remplir le lumen du PV avec une solution saline normale.
- Contenir l’extension de la manchette du PV du donneur avec une pince courbe.
- Insérer le corps de Brassard de PV du donneur dans le PV du destinataire tout en donjon rinçage le lumen de PV avec un soluté physiologique.
- Fixez-le avec un circonférentielle ligature soie de 6-0. Rétablir le flux sanguin vers le foie du greffon en libérant les pinces sur le PV et SHVC.
- Répétez l’étape 4.11 sur le IHVC de reconstruire l’IHVC.
- Reconstruire le canal cholédoque par une technique de stent.
- Inciser un « V » sur la paroi antérieure de la voie biliaire principale bénéficiaire.
- Insérez le stent de donateurs dans le lumen du destinataire BD et fixez-le avec une suture circonférentielle en soie de 6-0. Rassembler les sutures sur les deux voies biliaires et nouez les sutures pour amener la BD proches entre eux.
- Enroulez le tissu épiploon autour du site anastomotique pour empêcher la fuite de bile.
- Irriguer la cavité abdominale d’une solution saline normale. Refermer l’incision de l’abdomen en deux couches avec un continu pour sutures chirurgicales non résorbable 3-0.
- Administrer immédiatement cefuroxime 16 mg/kg (un antibiotique) et 0,05 mg/kg de buprénorphine (analgésique) par voie sous-cutanée après l’opération.
- Placez le rat dans une cage propre et nourriture et eau ad libitum.
- Injecter le céfuroxime (16 mg/kg) et la buprénorphine (0,05 mg/kg) dans la cavité abdominale toutes les 12 heures pendant 3 jours.
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Representative Results
Après environ 10 tentatives, la technique d’anastomose magnétique pour la reconstruction de SHVC a été avec succès maîtrisée par un chercheur qui n’avait aucune formation préalable de microchirurgie. La reconstruction de la SHVC a pris moins de 2 min. La phase anhépatique pour les rats bénéficiaires était environ 10 min. Pas de thrombose, hémorragie ou angiostegnosis a été observée sur le site anastomotique SHVC à 1, 5 et 30 jours après la reperfusion. Le cavography de la veine cave fut jouée à 2 semaines après la transplantation. Comme illustré à la Figure 6, les anneaux magnétiques étaient intacts, et le flux sanguin était brevet par l’intermédiaire de l’anastomose SHVC. Le taux de survie post-greffe était de 95 % au jour 1, jour 3, 90 % et 85 % à jours 7 à 30 (Figure 7).
Figure 1 : La conception (A) et photo (B) de la bague magnétique pour anastomose de la SHVC.
SHVC : veine cave sus-hépatique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les poignets et le stent pour anastomose de la IHVC (A), PV (B) et BD (C).
IHVC : infrahepatic vena cava ; PV : la veine porte ; BD : biliaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Schéma de l’anastomose de la manchette de la IHVC et le PV. Insérez les IHVC ou les PV dans un brassard (A) ; Evert l’extrémité distale du IHVC ou du PV sur le corps de la manchette à l’aide de deux Micropinces (B) ; Fixez le bord avec une suture de soie de 6-0 (C) ; Insérer le corps de la manchette du IHVC du donneur ou de la PV dans du destinataire IHVC ou PV (D).
IHVC : infrahepatic vena cava ; PV : la veine porte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Schéma de l’anastomose magnétique de la SHVC. Passer le SHVC à travers un anneau magnétique à l’aide des Micropinces en alliage de titane (A) ; Evert l’extrémité distale de la SHVC sur la bague (B) ; Fixez l’anneau avec une suture de soie de 6-0 (C). Couple les anneaux magnétiques incorporés dans du donneur et du receveur SHVC ensemble par force magnétique (D).
SHVC : veine cave sus-hépatique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Schéma de l’implantation du greffon chez le rat destinataire. Reconstruction de la SHVC : anastomose magnétique ; Reconstruction de la IHVC et PV : boutons de manchette anastomose ; Reconstruction de la BD : anastomose de l’endoprothèse. Reconstruction de l’AP : non effectué.
SHVC : veine cave sus-hépatique ; IHVC : infrahepatic vena cava ; PV : la veine porte ; BD : biliaires ; HA : l’artère hépatique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Veine cave cavography du rat à 2 semaines après la transplantation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Cure de survie représentant après la transplantation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Beaucoup progresse clinique en transplantation hépatique peut être attribuée aux études chez l’animal. Rat BTA est un modèle largement utilisé et reconnu dans la recherche de préservation d’organe, transplantation immunologie, physiologie et pathologie. Toutefois, il est également une procédure très complexe et requiert des compétences de microchirurgie avancée. Malgré de nombreuses améliorations dans la procédure du rat BTA, l’anastomose SHVC reste une étape difficile. Dans cet article, nous décrivons une technique nouvelle anastomose magnétique pour la reconstruction de SHVC au rat BTA. L’application de cette technique réduit le temps pour la reconstruction de SHVC à moins de 2 min et la phase anhépatique de rat OLT à environ 10 min. Nous pensons que cette technique a des implications beaucoup dans la recherche de la transplantation.
L’étape critique dans l’utilisation de cette technique d’anastomose magnétique pour la reconstruction de la SHVC est d’attacher les anneaux magnétiques à SHVC du donneur et du receveur. Toute prudence pour éviter de le tordre le SHVC. De plus, en reliant les deux anneaux magnétiques, bulles d’air dans le SHVC doivent êtres enlevés soigneusement.
Il existe certaines limitations dans l’utilisation de cette technique. Certaines souches de rats comme des rats Fischer 344 et les rats de Buffalo ont une SHVC extrêmement courte. Il est impossible de joindre l’anneau magnétique à leur SHVC. Ainsi, ils ne conviennent pas pour cette technique. Cependant, cette technique peut être facilement appliquée pour OLT dans la plupart des souches de rats dont les rats Sprague Dawley, rats Lewis et rats bruns norvégiens. Anneaux magnétiques peut interférer avec l’analyse de l’imagerie par résonance magnétique (IRM). Par conséquent, cette technique d’anastomose magnétique ne peut servir si un examen de MRI est nécessaire pour l’expérience.
En résumé, la technique d’anastomose magnétique permet la reconstruction SHVC facile et rapide chez les rats. Après une courbe d’apprentissage raisonnable, même les chercheurs sans compétences avancées de microchirurgie peuvent produire des résultats fiables et reproductibles à l’aide de ce modèle de rat d’OLT.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère de l’éducation l’Innovation équipe développement programme en Chine (no IRT16R57), Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (no 81470896) et une recherche Fonds pour jeunes talents recrutement Plans de Xi'an Jiaotong University (RW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Machine | Harvard | tabletop | Animal anaesthesia |
| PLX7000B HF Mobile Digital C-arm System | Perlong Medical | PLX7000B | It is mainly used for the angiography and photography of various operations |
| Syringe Pump | Mindray | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| iohexol | Shanghai General Pharmaceutical Co | intravascular contrast media | |
| heparin sodium injection | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| cefuroxime | Glaxo Operations UK Limited | an antibiotic | |
| buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| curved microforceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | W40350 | surgical tool |
| hemostatic forceps(straight) | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J31010 | surgical tool |
| hemostatic forceps(curved) | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J31020 | surgical tool |
| Satinsky clamp | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | XEC050 | surgical tool |
| needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32010 | surgical tool |
| microneedle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | WBA040 | surgical tool |
| notched forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J42010 | surgical tool |
| tissue forceps(with hook) | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J41010 | surgical tool |
| tissue scissor | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | Y00040 | surgical tool |
| surgical scissors | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | Y00030 | surgical tool |
| micro scissors | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | MR-S121T | surgical tool |
| microvessel clips | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | XEC240 | surgical tool |
| straight microforceps(titanium alloy) | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | WCC010 | surgical tool |
| curved microforceps (titanium alloy) | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | WCC020 | surgical tool |
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