Summary
אנו מציגים גישה חדשה כדי לאפיין תאים סרטניים. אנו משלבים immunofluorescence עם ה-DNA פלורסנט -מקומיים-הכלאה כדי להעריך את התאים שנתפסו על ידי חוט רפואי functionalized מסוגל ויוו מעשיר CTCs ישירות מדם החולה.
Abstract
מחזורי תאים סרטניים (CTCs) הקשורים המסכן ההישרדות מסרטן גרורתי. שלהם זיהוי, phenotyping, genotyping יכול להוביל להבנה טובה יותר של הגידול הטרוגניות, ובכך להקל על הבחירה של חולים לטיפול אישי. עם זאת, זה היא הקשו בגלל בנגישות של CTCs. אנו מציגים גישה חדשנית דגימה נפח גבוה של הדם המטופל וקבלת מידע אודות נוכחות, פנוטיפ, ג'ין טרנסלוקציה של CTCs. השיטה משלבת immunofluorescence מכתים ו- DNA פלורסנט -מקומיים-הכלאה (דנ א דגים) והוא מבוסס על חוט רפואי functionalized. החוט הזה הוא מכשיר חדשני המאפשר ויוו בידודו של CTCs של כמויות גדולות של דם היקפיים. נפח הדם הוקרן על ידי הממשל 30-מין של הכבל הוא כ 1.5-3 ל' כדי להדגים את הכדאיות של גישה זו, תאים אפיתל אדהזיה מולקולה (EpCAM) וביטוי של טרנסלוקציה כרומוזומלית של הגן ALK היו נחושים בקווים ריאות שאינם קטנים התא סרטן (NSCLC) תא שנתפסו על ידי החוט functionalized ו מוכתם בגישה דגים חיסונית-DNA. האתגר העיקרי שלנו היה לבצע את הבדיקה על מבנה תלת-ממדי, הכבל functionalized, וכדי לקבוע חיסונית-פנוטיפ ותמיכה דגים אותות על זה באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות קונבנציונלי. התוצאות המתקבלות מצביעים על כך מדבק CTCs וניתוח פנוטיפ שחלוף כרומוזומלית שלהם יכול באופן פוטנציאלי מייצגים גישה חדשה של אבחון לוויה לספק חדשנית אסטרטגיה לשיפור אישית טיפולים בסרטן.
Introduction
CTCs מייצגות צעד. מפתח של סרטן תאים הפצתו1. הנוכחות שלהם בדם ההיקפי של חולים היא משויכים (גרורתי) relapse ומחלות התקדמות2,3. CTC בידוד ואפיון ממחזור הדם של חולי סרטן היא סוג של ביופסיה נוזלי לא פולשנית. בשנים האחרונות זה הפך יותר ויותר ניכר כי ניטור של התקדמות, בתגובה של גידולים טיפולים שונים באמצעות ניתוח מסוג זה מספק מידע קליני חשוב4,5. ביופסיה נוזלי שימושית יותר כאשר הניתוח הוא לא ריאלי או כאשר רקמת הגידול העיקרי אינו זמין, קרי, לחבלות ללא biopsiable. ומכאן, גישה זו הוא מבטיח בהגדרות סרטן ספציפיים כגון NSCLC גרורתי, איפה הנוכחות של CTCs הוכח יש תפקיד שלילי prognostic6. NSCLC הוא גידול זה נהנה במיוחד ממוקד גישות טיפוליות7,8,9 תוכנן לפעול על מולקולות ספציפיות (מטרות מולקולריות) ידוע להיות מעורב הגידול, התקדמות, ו התפשטות המחלה. לפיכך, נדרש זיהוי מטרות מוגדרות במהלך התקדמות המחלה. CTC חקירה היא גישה אבחון מאוד מעניינת כדי לזהות ולנטר סמים מטרות ללא צורך רקמות ראשי או גרורתי. לדוגמה, זיהוי ALK translocations גנים בתאים NSCLC קשורה רגישות crizotinib, טיפול ממוקד ספציפי10. עם זאת, כיום, הגילוי של ALK translocations תבוצע רק על aspirates פיין-מחט או ביופסיות קטן; כתוצאה מכך, ללא גידול רקמות ALK ניתוח אינה אפשרית. CTCs אלטרנטיבה פוטנציאל הגידול חקירות מבוסס-רקמות, מייצגים גישה מאוד מבטיח של אבחון לוויה.
למרות חשיבותם פוטנציאליים, CTCs הן עדיין נושא הוויכוח הגדול בין מחקר, בעיקר בגלל נדירותם (1-10 תאים/מ"ל של דם היקפיים11). ביופסיה נוזלי שיטות להשתמש כמות מוגבלת של דם (קרי, 1-30 מ"ל)12,13, אבל זה יוצר מצב של רגישות שיוצרת איתור CTCs. לפיכך, המחקר היא מוצדקת כדי למצוא גישות והתקנים המתפתח לביצוע ביופסיות נוזלי CTC, ממוקדות על נפח גדול יותר של דם היקפיים.
מכשיר חלופי, חוט רפואי functionalized (ראה טבלה של חומרים), פותחה כדי להתגבר על מגבלות דגימה דם ולקבל ניתוח יותר נציג של CTCs. החוט הזה functionalized הוא מכשיר רפואי שאושרו על-ידי CE הלוכד את CTCs ישירות מן הדם של חולי סרטן1. הוא מורכב של חוט פלדה אל חלד 16-ס מארוך (איור 1 א') עם טיפ 2-ס מארוך functionalized מצופה בשכבה 0.2-מיקרומטר-עבה של זהב. השכבה בתורו מכוסה על ידי שכבה הידרוג 1 ל 5 מיקרומטר-עבה polycarboxylate covalently בשילוב עם נוגדנים נגד EpCAM, אחד של אנטיגנים ביטוי נרחב ביותר על פני השטח של CTCs14. Functionalized קצה החוט הוא הציג לתוך הווריד של הזרוע של החולה ונשאר בעמדה במשך לפחות 30 דקות. גישה זו מאפשרת בידוד של CTCs ויוו, ישירות בדם ההיקפי, וכדי מסך כ 1.5 – 3.0 L של דם (כ 300-fold יותר מאשר אמצעי האחסון המשמש גישות אלטרנטיביות)1.
Pantel et al. הראו את היעילות של גישה זו לבודד CTCs ישירות לתוך הורידים הזרוע של חולי סרטן ריאות15. הם ביצעו immunofluorescence תיל מכתים לזהות CTCs באמצעות נוגדנים קונבנציונאלי מכוונת נגד EpCAM פאן-cytokeratin, ואת CD45 לגילוי leucocyte. החוט נבחנה תחת מטוס מיקרוסקופ אופטי פלורסצנטיות15. המחברים הראו כי המכשיר הצליח לבודד את CTCs, אך הם לא לחקור כל מטרות הטיפול בנושא, כגון ALK translocations.
השיטה הציג שמטרתו לזהות בשם CTCs ב NSCLC שורות תאים על בסיס פרמטרים פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר, למשל, הגישה החיובית EpCAM, הנוכחות של סמנים מולקולריים, למשל מצב ALK (איור 1b). הליך זה 3-יום-ארוך משלב חוט functionalized immunofluorescence מכתים עם ה-DNA זריחה -מקומיים-הכלאה (דנ א דגים), בשם חיסונית-DNA-דגים. בהתחשב בכך CTCs הם ישויות נדיר, היתרון של פרוטוקול זה היא כי ניתן לאפיין CTCs על החבל זהה מבחינת תכונות immunophenotypic והן rearrangements דנ א.
Protocol
1. חיסונית-DNA דגים על Coverslip 2D
- Coverslip תא מחסידי והכנה זריעה
הערה: בצע את כל השלבים הבאים תחת ברדס זרימה בתנאים סטריליים.- לטבול את coverslip לתוך 100% אתנול לחטא אותם.
הערה: אנו משתמשים 12 מ"מ × 12 מ"מ הנתמכות על-ידי סיליקון בריבוע coverslips (ריאגנטים כל מופיעים בטבלה של חומרים). - מקם את coverslips צלחת פטרי (קוטר 100 מ מ). באמצעות יבש כפה זרימת האוויר במשך 5 דקות.
- לשטוף צלחת פטרי עם פוספט 15 מ"ל עקר 1 × Dulbecco buffered תמיסת מלח (PBS).
- לשטוף את צלחת פטרי עם 10 מ"ל של מדיום מלאה (ראה טבלה 1).
- זרע תאים חסיד (תאים 1,650,000 בערך 10 מ"ל של מדיום, נספר על-פי ניתוח FACS) על ידי הטלת בעדינות התליה תא אל הפטרי להשיג יופיצ תא אחיד (כ-30,000 תאים/cm2).
הערה: עבור ~ 70% הנהרות, מחסידי תאים צריך להיות תרבותי על coverslips לפחות 48 שעות.
- לטבול את coverslip לתוך 100% אתנול לחטא אותם.
- קיבוע ו- permeabilization
התראה: אצטון הוא דליק גירוי החומר הנדיף. השתמש פלסטיק עמיד רק אצטון או מיכלי זכוכית (לא PVC או PVDF).
הערה: בצע את הפעולות הבאות תחת ברדס fume כימי.- הסר את המדיום תרבות באמצעות של pipet שואבת חד פעמיות.
- לשטוף את צלחת פטרי עם 1 × PBS.
- באמצעות פינצטה, לשטוף את coverslips בטבילת אותם לתוך גביע זכוכית המכיל 5 מ של 1 × PBS.
- יבש את coverslips על נייר סופג.
- לתקן את התאים על coverslip במועט זה לתוך פתרון אצטון 100% 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- להסיר את coverslip על ידי פינצטה. יבש coverslip באמצעות זרם אוויר מאולץ במשך 5 דקות.
הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה. Coverslip צריך להיות מאוחסן ב-20 ° C.
- Immunofluorescence יום 1
הערה: בשלב זה כרוך של דגירה (O/N) לילה (~ ח 16).- לשטוף את coverslips ב 1 × PBS פעמיים.
- ירידה µL 100 נוגדן דילול מאגר (לפרטים, ראה טבלה 1 ) על גבי coverslip דגירה למשך 30 דקות ב- RT.
הערה: פתרון אחסון צריך להיות מותאם על בסיס השטח coverslip על מנת לכסות את coverslip כולו, למנוע את הסיכון של גלישה. - מכינים את תערובת נוגדנים (טבלה 1) באמצעות 1:20 דילול של נוגדן ראשוני monoclonal מצומדת באמצעות מאגר דילול fluorochrome, נוגדנים, כמפורט בגליון הנתונים המסופקים על ידי היצרן.
הערה: מומלץ בחום להשתמש נוגדנים חד-שבטיים מצומדת עם thermostable fluorochrome. אם fluorochrome thermostable משמש, הטמפרטורה מנוצל במהלך השלבים DNA-דג של הפרוטוקול עלול לגרום נזק fluorochrome את ולהעלים את פליטת פלורסנט. ב פרוטוקול זה, הסכמנו על נוגדן EpCAM-FITC (1:20 דילול), אשר לא הראה שום בעיות משמעותיות עם טמפרטורת שימוש. - יש לשטוף את coverslips פעמיים ב 1 × PBS.
- מקום coverslips התא בצד למעלה לח תא ושחרר 100 µL של המיקס נוגדן על coverslip.
הערה: פתרון אחסון צריך להיות מותאם על בסיס השטח coverslip כדי לכסות את כל coverslip ולהפחית את הסיכון של גלישה. - דגירה O/N (~ 16 h) בחושך ב 4 º C.
- Immunofluorescence יום שני
- לחסום נוגדן הדגירה ע י שטיפת על coverslips ב 1 × PBS פעמיים.
הערה: חנות coverslips שקוע 100 µL של 1 × PBS ב 4 ° C בתוך תא עם סביבה לחים קבוע בחושך עד וזמינותו דגים מבוצע.
- לחסום נוגדן הדגירה ע י שטיפת על coverslips ב 1 × PBS פעמיים.
- יום ה-DNA דו-מימדית-דגים 2
התראה: תשומת לב מיוחדת ישולם עד טמפרטורה גבוהה של כלי הנגינה ואת החדר לח.- להגדיר את הכלאה תנור, תנור חום יבש (~ h 3 לפני שמתחילים את פרוטוקול ה-DNA-דג). הגדר את התנור הכלאה ב 75 ° C, להגדיר את התנור חום יבש ב 37 מעלות צלזיוס, מגניב הפתרון האס 0.4 × (ה-pH = 7.0 ± 0.1) (למתכון האס ראה טבלה 1) עד 4 ° C.
הערה: מצב ה-pH של מאגרי דגים הוא קריטי: pH = 7.0 ± 0.1. - לשטוף את coverslip שלוש פעמים תוך קר כקרח × 0.4 האס פתרון.
- יבש את coverslip תחת ברדס fume כימי 10 דקות בחושך.
- מערבולת 10 s ולבצע סיבוב מהיר למטה (בקצב מרבי) של המכשיר מהקיר של בדיקה-הצינור.
- מניחים בצד התא coverslip למטה על ירידה של 5 µL של דגים בדיקה על שקופית בעלת חותם כל הקצוות של coverslip עם דבק גומי.
התראה: הבא שני השלבים לערב בטמפרטורות גבוהות. ללבוש כפפות מגן. - מכניסים את השקופית תא לח כהה בתנור הכלאה במשך 8 דקות ב 75 ° C עבור דנטורציה DNA מלאה.
- להזיז את החדר לח לתנור חום יבש ב 37 ° C O/ש
- להגדיר את הכלאה תנור, תנור חום יבש (~ h 3 לפני שמתחילים את פרוטוקול ה-DNA-דג). הגדר את התנור הכלאה ב 75 ° C, להגדיר את התנור חום יבש ב 37 מעלות צלזיוס, מגניב הפתרון האס 0.4 × (ה-pH = 7.0 ± 0.1) (למתכון האס ראה טבלה 1) עד 4 ° C.
- דנ א דו-מימדית-דג יום 3
- הגדר את המים הרותחים ב-72 מעלות ומניחים צנצנת מכתים שקופיות עם מאגר האס × 0.4 לתוכו (טבלה 1). לאחר 30 דקות, לבדוק את הטמפרטורה של המאגר האס 0.4 ×, אשר חייב להיות ב- 72 ± 1 ° C.
- להכין שני בקבוקונים זכוכית: אחת עם 2 × האס + 0.05% Tween מאגר (ה-pH = 7.0 ± 0.1) (טבלה 1) עוד אחת עם מים מזוקקים.
- להסיר את החדר לח מהתנור, בזהירות להסיר את הבטון גומי של השקופית, לנתק את coverslip עם פינצטה.
- לשטוף את coverslip בטבילת ב × 0.4 האס למשך 2 דקות ב- 72 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את coverslip על ידי שילוב של 2 × האס + 0.05% מאגר Tween ב-30 s.
- יש לשטוף את coverslip במים מזוקקים.
- יבש את coverslips ברדס fume כימי 10 דקות בחושך.
- הר של coverslip נוזלי הרכבה בינוני עם µg/mL 1.5 של 4´, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי counterstain DNA הכולל. למקם את הצד התא coverslip למטה על ירידה של 5 µL של הרכבה בינונית בשקופית, הקש את הפינצטה-coverslip כדי לקבל את האוויר החוצה, לאטום עם לק.
הערה: טעינת אמצעי אחסון בינוני צריך להיות מותאם על בסיס גודל השטח coverslip.
- מיקרוסקופ דו-מימדית התבוננות וניתוח
הערה: ניתן לרכוש תמונות עם מערכות שונות מיקרוסקופ.
- לרכוש תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית 12 סיביות ו × 20/נה 0.50 ויעד 40 × / 0.65 נה עם המסננים המתאימים עבור אדום (עירור: 599 ננומטר, פליטת: 588 nm) וירוק (עירור: 509, פליטת: 524), וכחול (עירור: 367 ננומטר, פליטת: 452 nm) רגשים.
- ניתוח תמונות בעזרת כלי תוכנה של בחירה.
הערה: כדי להעריך את ההכתמה immunofluorescence ולוקליזציה ALK-בדיקה, השתמשנו ImageJ. ניתן לאחסן שקופיות ב-20 ° C בחושך לתקופה מקסימלית של 3 שבועות. לאחסון ממושך, אנחנו מציעים באמצעות הרכבה ספציפיים בינוני לאחסון לטווח ארוך.
2. חיסונית-DNA דגים על חוט
- תא ספייק סנכנ על חוט (תמיכה ב 3D)
הערה: הגדרת ראשוני כרוך מדויקת מבחר מחסידי תאי שורות בהתבסס על EpCAM-חיוביות. החוט הוא functionalized עם נוגדנים anti-EpCAM כך רק תאים EpCAM-חיוביות מוכתמים.
הערה: אל תיגע החלק functionalized של הכבל כדי למנוע נזק.
הערה: כל השלבים צריך להתבצע תחת תא למינארי בתנאים סטריליים.- Resuspend את כל התוכן של בקבוקון T75 (80% הנהרות) בבקבוקון מ ל באמצעות 4 מיליליטר בינוני מלא; עבור יישום ספייק-in יחיד, תאים כ 2,000,000 מומלץ להגדיל את הידבקות תאים לכבל.
- להסיר את החוט מאריזתו זכוכית.
- טובלים את החלק זהב functionalized של החוט לתוך המבחנה, המבטיח כי החוט-בסימפטומים ולא במחלה עצמה הוא אטומה למים מתאים המבחנה. חותם עם סרט מעבדה.
הערה: השימוש של שפופרת 5 מ ל מומלץ כדי לאפשר התאמה נכונה בין את החוט ממגר את המבחנה. - תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT ב rotator הרכבת התחתית (0-120 זווית).
- יש לשטוף את החוט שלוש פעמים בפתרון 1 × PBS באמצעות 3 צלוחיות נקי שונים.
- קיבוע ו- permeabilization
התראה: אצטון הוא חומר דליק. זה יכול לגרום לגירוי דרכי הנשימה. השתמש רק פלסטיק עמידים אצטון או מיכלי זכוכית (לא PVC או PVDF).
הערה: בצע את הפעולות הבאות תחת ברדס fume כימי.- מילה נהדרת את החוט.
- לתקן התאים בטבילת החוט בפתרון אצטון 100% 10 דקות RT. בשימוש שפופרת 5 מ.
הערה: החוט-בסימפטומים ולא במחלה עצמה אל תבוא במגע עם מקבע - מילה נהדרת את החוט למשך 5 דקות ב- RT.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. החוט להיות מאוחסן ב-20 ° C. כאשר לארוז את החוט לאחסון לטווח ארוך, למקם את החוט-הפקק ליד הקצה functionalized והכנס בקפידה את החוט לתוך הצינורית זכוכית אחסון, דואגת שלא יגרמו נזק הטיפ functionalized. לסגור את הזכוכית לאחסון ולאחסן (אנכי או אופקי) ב-20 ° C.
- Immunofluorescence יום 1
הערה: בשלב זה כרוך של דגירה O/N (~ ח 16).- לשטוף פעמיים בפתרון 1 × PBS באמצעות שפופרת 5 מ.
- דגירה החוט במאגר דילול נוגדן למשך 30 דקות ב- RT באמצעות שפופרת 5 מ.
- להכין µL 150 של נוגדן לערבב לדילול monoclonal נוגדן ראשוני מצומדת עם fluorochrome במאגר דילול נוגדן, כמפורט בגליון הנתונים. כך למשל, נוגדן EpCAM-FITC היה בשימוש של 1:20 דילול.
- להשתמש טיפ p200 לביצוע דגירה, כדלקמן: לחלץ את החוט החוט-בסימפטומים ולא במחלה עצמה ולהוסיף בעדינות את החוט דרך החור גדול יותר של הקצה. הכנס את הסוף unfunctionalized ראשון, לאט משוך את החוט דרך החור קטן יותר עד החלק זהב נמצא מעבר לבור גדול יותר.
- זרוק בעדינות µL 150 של המיקס נוגדנים (לדוגמה אנטי EpCAM_FITC נוגדנים 1:20 מדולל) לתוך הקצה. כדי למנוע את סיכון היווצרות בועה, בעדינות מסובבת את החוט עד החלק functionalized הוא צלל לחלוטין.
- תנעל את החור של הקצה. עטיפה בסרט מעבדה סביב החור יכול לעזור.
- דגירה אנכית O/N (~ 16 h) בחושך ב 4 º C.
- Immunofluorescence יום שני
- לחסום נוגדן הדגירה ע י שטיפת את החוט פעמיים ב 1 × PBS.
- הכנס מחדש את חוט התיל-בסימפטומים שלה.
הערה: חנות 1 X PBS ב 4 ° C ב- 5 מ"ל בקבוקון עד וזמינותו דגים מבוצע.
- יום ה-DNA 3D-דגים 2
התראה: תשומת לב מיוחדת ישולם עד לטמפרטורה גבוהה של כלי נגינה, הקאמרית לח.- להגדיר את הכלאה תנור, תנור חום יבש (~ h 3 לפני שמתחילים את פרוטוקול ה-DNA-דג). להגדיר את התנור הכלאה ב 75 ° C, להגדיר את התנור חום יבש ב 37 מעלות צלזיוס, מגניב הפתרון האס 0.4 × (ה-pH = 7.0 ± 0.1) עד 4 ° C.
הערה: מצב ה-pH של מאגרי דגים הוא קריטי והוא חייב להיות 7.0 ± 0.1. - לשטוף את החוט 3 פעמים תוך קר כקרח × 0.4 האס פתרון.
הערה: להחזיק את החוט בחשכה למנוע fluorochrome photobleaching במהלך ההליכים הבאים. - יבש למשך 10 דקות בחושך מתחת לארון fume.
- מערבולת ולסחוט המכשיר עבור 5 s.
- ירידה µL 10 של המכשיר לתוך theglass microtubes. מכסים עם סרט מעבדה.
- לסובב את microtubes כדלקמן: עוטף את microtube שם, נייר סופג יבש לתוך צינור 50-mL, ומתפתלים בקצרה.
- בזהירות מניחים את החוט מיובשים לתוך microtube והכנס את החוט-בסימפטומים ולא במחלה עצמה. חותם עם דבק גומי.
התראה: הבא שני השלבים לערב בטמפרטורות גבוהות.
- להגדיר את הכלאה תנור, תנור חום יבש (~ h 3 לפני שמתחילים את פרוטוקול ה-DNA-דג). להגדיר את התנור הכלאה ב 75 ° C, להגדיר את התנור חום יבש ב 37 מעלות צלזיוס, מגניב הפתרון האס 0.4 × (ה-pH = 7.0 ± 0.1) עד 4 ° C.
- לשים שקופית מכתימה את הצנצנת עם פתרון האס × 0.4 לתוך אמבט מים ולהגדיר -72 מעלות צלזיוס.
- לבדוק את הטמפרטורה הפתרון האס 0.4 × עד שהוא מגיע 72 ± 1 ° C.
- להכין שני ספלים מזכוכית, עם 2 × האס + 0.05% Tween (ה-pH = 7.0 ± 0.1) פתרון והשני עם מים מזוקקים.
- להסיר את החדר לח מהתנור חום יבש, בזהירות להסיר את הבטון גומי החוט-בסימפטומים ולא במחלה עצמה באמצעות פינצטה, ולהוציא את החוט.
הערה: משוך בזהירות בסוף החוט דרך בבסימפטומים ולא במחלה עצמה, נזהר שלא לפגוע הטיפ functionalized ללא ציפוי. - טובלים את החוט בתוך תמיסת האס 0.4 × למשך 2 דקות ב- 72 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את החוט 2 × האס + 0.05% פתרון Tween ב-30 s-RT.
- לשטוף את החוט במים מזוקקים-RT.
- יבש את החוט מתחת למכסה המנוע fume 10 דקות בחושך.
- להכין פתרון דאפי מניות של 1.43 מיקרומטר ב 2 מ ל 1 × PBS.
- דגירה קצה החוט עם דאפי פתרון בבקבוקון 2 מ"ל לשעה בחושך-RT. functionalized
- לשטוף את החוט פעמיים ב 1 × PBS, מילה נהדרת...
- מקם את החוט למחזיק חוט. בזהירות להוסיף את הטיפ functionalized דרך נקודת הכניסה של בעל מיוחד, עד הקצה תואם את נקודת צימוד. להיזהר לא לפגוע functionalized העצה (איור 1 א').
- המקום בעל מיוחד על הבמה מיקרוסקופ. להתאים את המוקד של המיקרוסקופ משתמשים בעדשה 20 ×. תחילה גס להתמקד תמיכה מיוחדת ולאחר מכן התאם דק על התאים נראים בהירים דאפי-ערוץ.
- רק מכניסים המוקד התאים המרכזית על העדשה.
הערה: ניתן לרכוש תמונות עם מערכות שונות מיקרוסקופ. בהגדרה זו, אנו משתמשים במיקרוסקופ פלורסנט קונבנציונלי ניחן תוכנה מסחרית רגילה עבור רכישת התמונה. - לרכוש תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית 12 סיביות ו × 20/נה 0.50 ויעד 40 × / 0.65 נה עם המסננים המתאימים עבור אדום (עירור: 599 ננומטר, פליטת: 588 nm) וירוק (עירור: 509, פליטת: 524), וכחול (עירור: 367 ננומטר, פליטת: 452 nm) רגשים.
הערה: תמונות, ניתן לאבחן באמצעות כלים שונים ותוכנות. אנו משתמשים ImageJ כדי להעריך immunofluorescence מכתים ולוקליזציה ALK-בדיקה.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. החוט להיות מאוחסן ב-20 ° C. כאשר לארוז את החוט לאחסון לטווח ארוך, למקם את החוט-הפקק ליד הקצה functionalized והכנס בקפידה את החוט לתוך הצינורית זכוכית אחסון, דואגת שלא יגרמו נזק הטיפ functionalized. לסגור את הזכוכית לאחסון ולאחסן (אנכי או אופקי) ב-20 ° C.
Representative Results
שימוש בהליך המתואר לעיל אפשרי לבצע assay דגים חיסונית-DNA של CTCs (או תאים שווי ערך אחרים) מועשר על ידי החוט functionalized. לפני הגדרת פרוטוקול זה, התאימות של שני טכניקות היה נחוש (חיסונית-זריחה עם דגים) על תקן תומך 2D. נבחרו שני NSCLC תא קווים שונים לבטא EpCAM (חובה לדבוק החוט יחד עם נוגדנים נגד EpCAM). יש להם מצב ALK אחר, אשר שימושי לבדוק את תנאי התחלה שונה. הראשון, NCI-H1975, יש גנים ALK פראי סוג (WT), ואילו השנייה, NCI-H3122, מאופיין על-ידי ALK translocations.
מערכת זיהוי הפסקה-apart ALK ג'ין וזמינותו דגים היה בשימוש. המערכת כוללת שני רגשים, אחד (כתום) hybridizing לאזור proximal בתוך ALK 2p 23, אחד (ירוק) hybridizing דיסטלי כדי ALK. ב- 2D תומך, דגים חיסונית-DNA מסופקים אותות מוגדרים היטב גם נוגדנים וגם בדיקה (איור 2). בפרט, שניהם תא קווים הראה לוקליזציה ממברנה EpCAM מוגדרים היטב. יתר על כן, בדיקה אותות הופיע בהיר וחד: NCI-H1975 תאים הראה חופפים הגששים כתום וירוק, המאשרת את המצב wildtype של ג'ין ALK (איור 2 א, ב'). לעומת זאת, NCI-H3122 תאים הראה אותות חופפים יחיד נקודות ירוקות, המשקף מחיקה של ג'ין ALK (איור 2 c, d). כאשר וזמינותו חיסונית-DNA דגים בוצעה ב- 3D תמיכה functionalized תיל, נוגדנים, בדיקה אותות היו בדרך כלל פחות מוגדר יותר על התמיכה 2D. EpCAM מכתים היה גלוי. אותות לווין ALK היו פחות המוגדר אך עדיין לידי ביטוי את מצב ALK הצפוי (איור 3). תוצאות המחקר הראו כי immunofluorescence מכתים לא התערבו עם אותות ה-DNA דגים. הגששים hybridized במיוחד עם המטרות שלהם. שורת התאים NCI-H3122 הראה מצב גנטי ALK סוטה (איור 3b), בניגוד NCI-H1975, עם גן ALK פראי סוג (איור 3 א).
איור 1 : Functionalized תיל, סידור סכמטי של הגששים הפסקה-apart ALK, ערכה של דפוסי הצפוי ALK שחלוף, מחזיק מיוחד. תיבות () אדום לסמן את שלושת החלקים העיקריים של הכבל: functionalized קצה חוט ממגר, עצה functionalized האו ם. הטיפ functionalized הוא החלק הכי עדינה הסמויה, והוא לא חייב להיות נגע במהלך הטיפול כדי למנוע ניתוק התא או נזק. (b) ירוק ו אדום רגשים כל בהתאמה לאגד רצפים ויוצאת של מנחלת ALK ג'ין (בצד השמאל). בצד הימין, מוצגים exemplificative דפוסי ALK הסדרים. לוקליזציה שיתוף אדום וירוק אותות על תאים נורמליים; אותות נפרדים ירוק ואדום עולה של ALK ג'ין כרומוזום הפסקה (טרנסלוקציה של ג'ין ALK) אות אחת colocalization כתום ירוק (סוטה תא-1). אות אדומה אחת שני אותות ירוק עולה על אובדן אות אדום אחד, רומז על טרנסלוקציה כרומוזומלית, מחיקה (סוטה תא-2). (ג) כבל בעל; התיבות האדומות לסמן אזורים שבהם טיפול נחוץ בעת טיפול החוט במהלך ניתוח מיקרוסקופ. הכבל יכול לעבור ניתוח 360 מעלות על-ידי הפעלת מסובב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : דגים חיסונית-DNA assay על תמיכה דו-ממדית (coverslip). (, b) NCI-H1975 תאים חיובי חלש עבור EpCAM. אותות EpCAM FITC היו ניכר. הגששים הכתום והירוק של ALK ההפסקה-apart. לא, המאשרת את המצב WT של ג'ין ALK בתור תא NCIH1975. הצגת אותות לזווג יותר משני תאים נכחו עקב אנאפלואידיה שלהם. (c, d) בשורה תא NCIH3122 EpCAM-ביטוי גבוהה, immunofluorescence אותות היו בהירים, אשר היה הדגישה ב צמתי תא-תא. דגים מחיקות מאושרות ניתוחים של הגן ALK, טיפוסי של הקו הסלולרי. חצים אדומים מציינים יחיד הגששים ירוקה (ללא המקביל כתום הגששים), המשקף ALK ג'ין מחיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Assay חיסונית-DNA דגים באמצעות הכבל functionalized כמו תמיכה ב 3D. תמונה () נציג של NCI-H1975 תאים על החבל. למרות הצורה התלת-ממדית של התאים על החבל להקשות לרכוש תמונות באופן מלא בפוקוס, אות EpCAM הוא טוב לעין בכל התאים. תמונה (b) נציג של NCI-H3122 תאים על החבל. ALK הגששים הראה ג'ין מחיקה (חצים אדומים), ראיתי כאמור על התמיכה 2D. האותות רקע גלוי היו ככל הנראה עקב הנוכחות של השכבה פולימר. עם זאת, היא לא משמעותית השפיעה ניתוח זיהוי או קרינה פלואורסצנטית התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מאגר | קומפוזיציה | הערה | מניות |
| תא בינוני תרבות שלמה | RPMI 1640 + 2 מ מ גלוטמין + 5-10% בהריונות סרום שור (FBS). | RPMI: 4 ° C; גלוטמין, FBS:-20 ° C | |
| מאגר Diluition נוגדן | 1% BSA, 0.3% X-100 Triton ב- PBS 1 x | RT. חותם עם סרט מעבדה. | |
| 20 x פתרון האס | 3 מ' נתרן כלורי, ציטראט trisodium 300 מ"מ מומס ddH20 | לסנן פתרון ו- pH = 7.0 + /-0.1 עם HCl | RT. חותם עם סרט מעבדה. |
| 0.4 x פתרון האס | לדלל המניה 20 x SSC ב מזוקקים H2O | לסנן פתרון ו- pH = 7.0 + /-0.1 עם HCl | RT. |
טבלה 1: פתרונות מתכונים.
Discussion
בנייר זה, בפעם הראשונה, שיטה המשלבת immunofluorescence מכתים ודגים דנ א, לשימוש עם החוט functionalized הוצע. השיטה נקראה חיסונית-DNA דגים. שיטה זו פותחה כדי לאפשר זיהוי בשם CTCs בו זמנית על חוט 3D על בסיס פרמטרים פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר, כגון חיוביות כדי EpCAM (אירוע 1), וכדי להקל על זיהוי שינויים מולקולריים, כגון ALK ג'ין מצב ( אירוע 2). זיהוי שני האירועים בו זמנית מאפשרת הגילוי של לוקליזציה משותפת שלהם. לפיכך, גישה זו ניתן להתאימו לזהות ולאפיין CTCs שאוחזר מהדם של חולי סרטן. ההשפעות פוטנציאלי של haemo-רכיבים של לויקוציטים על ההליך מכתימים אינם מפריעים כלל עם ההליך. בפרט, הנתונים המדווחים בספרות ציינו כי haemo-רכיבים של לויקוציטים לא להשפיע על ההכתמה immunofluorescence של התאים מחובר הכבל, השלב הקריטי כדי לזהות CTCs בפועל1,15.
קרינה פלואורסצנטית הבהירות של דגים חיסונית-DNA הוא מסומן מעט פחות מאשר זו של immunophototyping המסורתי assay היא התוצאה של טמפרטורה גבוהה לצורך וזמינותו דגים. אולם, immunofluorescence מכתים הוא עדיין ניכר. לדוגמה, אות חלש הוא עדיין לזיהוי בשורה נמוכה לבטא EpCAM תא, NCIH1975. הטמפרטורה הגבוהה הדרושה וזמינותו דגים היא הגורם המגביל המרכזי בבחירת את fluorochrome נכון מקושר הנוגדן. ב פרוטוקול זה, נוגדנים חייב להיות מקושר אל fluorochrome thermostable כדי לסבול את הטמפרטורה דנטורציה של ה-DNA. לדוגמה, phycoerythrin, fluorochrome thermosensitive, לא מומלץ בהגדרה זו בגלל fluorochrome פגם שנגרם ע י בטמפרטורה גבוהה. Fluorescein isothiocyanate היא בחירה טובה fluorochrome נפוצים לעתים קרובות המועסקים על דגים הגששים. האות autofluorescence חיסונית-DNA דגים הוא עני מאוד על סטנדרטי תומך 2D. על התמיכה תיל, השכבה פולימר עלול לגרום אות autofluorescence קלה, בעיקר על ערוץ הצבע האדום. בניגוד הרקע דו-ממדי, אות רקע aspecific ניכר על החבל אך אינה משפיעה באופן משמעותי אפיון זיהוי או תא גרעינים.
הערכה מיקרוסקופים של הגדר היא מעייפת הרבה יותר מאשר על תמיכה דו-ממדית כתוצאה ממגבלות במיקרוסקופ אופטי קריאה השטח של מבנה תלת-ממדי בצורת גליל. עם זאת, הקושי הזה ניתן להתגבר על ידי סיבוב למחזיק חוט ורכישת תמונות מותאמים בעיקר לאורך הקו האמצעי של החוט. בעל חוט מאפשר סיבוב 360 מעלות של החוט. ברגע ממוקדת הגרעינים, שינוי ערוצי פלורסצנטיות לא בהכרח נתמקד על אזור היעד. מסיבה זו, זה חיוני כדי לשמור על המוקד על האזור הפנימי-תא היעד.
טכניקה זו ניתן להתאים לזהות ולאפיין לתאים מסוגים שונים תומך 3D. ייתכן גם שתהיה אפשרות להשתמש נוגדנים שונים, דגים רגשים. כאשר בוחרים להשתמש נוגדנים שונים, fluorochrome thermostability ואת רמת ביטוי של אנטיגן מטרה על קרום התא הם גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון. גם יכול להיות מוכתם אנטיגנים אינטרה-cytoplasmatic. כאשר באמצעות דגים שונים probes, חשוב לבדוק מפרטי גליון נתונים עבור ההליך דנטורציה וכדי להכין תאים שהדגים assay בהתאם.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Carlo Erba | # 414605 | |
| Tween 20 | BIO RAD | # 1706531 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Medicago | # 09-9400-100 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | # 534064-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | # A7906 | |
| Triton X-100 Detergent | BIO RAD | # 1610407 | |
| RUBBERCEMENT | Royal Talens | # 95306500 | |
| Vysis 20X SSC (66g) | Abbott Molecular Inc. | # 30-804850 | powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended |
| RPMI 1640 | Gibco | # 31870-025 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | # 10270-098 | |
| L-Glutamine (200mM) | Gibco | # 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | # 15140-122 | |
| H20 | MilliPore | ||
| XT ALK BA | MetaSystems Probes | # D-6001-100-OG | |
| DAPI, FluoroPure grade | Invitrogen | # D21490 | |
| SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI | Life Technologies | # S36973 | |
| EpCAM-FITC (clone: HEA-125) | Mitenyi | # 130-080-301 | |
| Micro tubes M-Tube18 | Gilupi Nanomedizin | ||
| Detektor CANCER01 EpCAM | Gilupi Nanomedizin | Functionalized wire | |
| STAR FROST Microscope Slides | Knittel GLÄSER | VS1117# 076FKB | |
| SecureSlip Silicone Supported Coverglass | GRACE BIO-LABS | # 104112 | |
| ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop | ZEISS | ||
| Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software | Nikon | BR 4.11.00 | |
| Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera | Nikon | DS-QiMc |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int. J. Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Xu, W., et al. Comparison of three different methods for the detection of circulating tumor cells in mice with lung metastasis. Oncol. Rep. , 1-8 (2017).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci. Rep. 7 (February), 43424 (2017).
- Masuda, T., Hayashi, N., Iguchi, T., Ito, S., Eguchi, H., Mimori, K. Clinical and biological significance of circulating tumor cells in cancer. Mol. Oncol. 10 (3), 408-417 (2016).
- Toss, A., Mu, Z., Fernandez, S., Cristofanilli, M. CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine. Ann. Transl. Med. 2 (11), 108 (2014).
- Wang, J., Huang, J., Wang, K., Xu, J., Huang, J., Zhang, T. Prognostic significance of circulating tumor cells in non-small-cell lung cancer patients: a meta-analysis. PLoS One. 8 (11), e78070 (2013).
- Maemondo, M., et al. Gefitinib or Chemotherapy for Non?Small-Cell Lung Cancer with Mutated EGFR. N. Engl. J. Med. 362 (25), 2380-2388 (2010).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK -Positive Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 368 (25), 2385-2394 (2013).
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Costa, D. B., et al. Clinical Experience With Crizotinib in Patients With Advanced ALK -Rearranged Non-Small-Cell Lung Cancer and Brain Metastases. J. Clin. Oncol. 33 (17), 1881-1888 (2015).
- Fischer, J. C., et al. Diagnostic leukapheresis enables reliable detection of circulating tumor cells of nonmetastatic cancer patients. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (41), 16580-16585 (2013).
- Coumans, F. A. W., Ligthart, S. T., Uhr, J. W., Terstappen, L. W. M. M. Challenges in the enumeration and phenotyping of CTC. Clin. Cancer Res. 18 (20), 5711-5718 (2012).
- Allard, W. J., Terstappen, L. W. M. M. CCR 20th Anniversary Commentary: Paving the Way for Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 21 (13), 2883-2885 (2015).
- Theil, G., et al. The use of a new CellCollector to isolate circulating tumor cells from the blood of patients with different stages of prostate cancer and clinical outcomes - A proof-of-concept study. PLoS One. 11 (8), 1-14 (2016).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
