Summary
Vi presenterar en ny metod för att karakterisera tumörceller. Vi kombinerade immunofluorescens med DNA fluorescerandein situ-hybridisering att utvärdera celler fångas av en functionalized medicinsk tråd kan i vivo berikande CTCs direkt från patientens blod.
Abstract
Cirkulerande tumörceller är (CTCs) associerade med dålig överlevnad i metastaserande cancer. Deras identifiering, fenotypning och genotypning kunde leda till en bättre förståelse av tumör heterogenitet och därmed underlätta urvalet av patienter för individualiserad behandling. Detta hämmas dock på grund av sällsynthet av CTCs. Vi presenterar en innovativ metod för provtagning en hög volym av patientens blod och att erhålla information om närvaro, fenotyp och gen flyttning av CTCs. Metoden kombinerar immunofluorescens färgning och DNA fluorescerandein situ-hybridisering (DNA fisk) och bygger på en functionalized medicinsk tråd. Denna wire är en innovativ produkt som tillåter i vivo isolering av CTCs från en stor volym av perifert blod. Blodvolymen säkerhetskontrolleras med en 30-min administration av tråd är cirka 1,5-3 L. För att demonstrera genomförbarheten av denna strategi, epitelial cell adhesion molekyl (EpCAM) uttryck och det kromosomala translokationen av ALK-genen bestämdes i icke-småcellig lungcancer (NSCLC) cancer cellinjer fångas av functionalized tråd och målat med ett immuno-DNA fisk förhållningssätt. Vår största utmaning var att utföra analysen på en 3D-strukturen, functionalized tråd, och att fastställa immuno-fenotyp och fisk signaler på detta stöd med konventionella fluorescens Mikroskop. Resultaten tyder på att fånga CTCs och analysera sin fenotyp och kromosomala rearrangering potentiellt kunde representera en ny följeslagare diagnostisk metod och ge en innovativ strategi för att förbättra personlig cancerbehandlingar.
Introduction
CTCs utgör ett viktigt steg för cancer cell spridning1. Deras närvaro i perifert blod av patienter är associerade med (metastaserad) återfall och sjukdom progression2,3. CTC isolering och karakterisering från blodet av cancerpatienter är en typ av icke-invasiva flytande biopsi. Under de senaste åren har det blivit alltmer uppenbart att övervakning av sjukdomsprogression och respons av tumörer på olika behandlingar med denna slags analys ger viktig klinisk information4,5. Flytande biopsi är ännu mer användbara när kirurgi inte är möjlig eller när primärtumör vävnad inte är tillgänglig, dvsför icke-biopsiable lesioner. Detta tillvägagångssätt är därför lovande i specifika cancer inställningar såsom metastaserande NSCLC, där förekomsten av CTCs har visat sig ha en negativ prognostisk roll6. NSCLC är en tumör som gynnar särskilt från riktade behandlingsmetoder7,8,9 konstruerad för att fungera på specifika molekyler (molekylära mål) kända för att vara inblandade i tillväxten, progression, och spridningen av sjukdomen. Därför krävs påvisande av specifika mål under sjukdomsförloppet. CTC undersökning är en extremt intressant diagnostiska metod att upptäcka och övervaka läkemedelsmål utan behov av primär eller metastaserad vävnader. Till exempel är upptäckt av ALK-genen flyttningar i NSCLC celler associerad med känslighet för crizotinib, en särskild riktad terapi10. Dock för närvarande utförs detektion av ALK flyttningar endast på fin nål aspirerade eller små biopsier; som ett resultat, utan en tumör är vävnad ALK analys inte möjligt. CTCs är en potentiella alternativ till tumör tissue-baserade utredningar och representerar ett mycket lovande följeslagare diagnostiska tillvägagångssätt.
Trots deras potentiella betydelse är CTCs fortfarande föremål för stor debatt bland forskning, främst på grund av deras raritet (1-10 celler/mL i perifert blod11). Nuvarande flytande biopsi metoder använder en begränsad mängd blod (dvs, 1-30 mL)12,13, men detta skapar en situation av suboptimal känslighet för detektion av CTCs. därav, forskning är motiverad till att hitta metoder och utveckla enheter utföra CTC-riktade flytande biopsier på en större volym av perifert blod.
En alternativ enhet, en functionalized medicinsk tråd (se Tabell för material), har utvecklats för att övervinna blod provtagning begränsningar och få en mer representativ analys av CTCs. Detta functionalized wire är en CE-godkänd medicinteknisk produkt som fångar CTCs direkt från blodet av cancer patienter1. Den består av en 16 cm lång rostfri tråd (figur 1a) med 2 cm långa functionalized spets belagd med ett 0,2 µm-tjocka lager av guld. Lagret är i sin tur omfattas av en 1-5 µm tjock polykarboxylat hydrogel stratum kovalent tillsammans med antikroppar riktade mot EpCAM, en av de mest uttryckt antigenerna på ytan av CTCs14. Functionalized spetsen av tråd introduceras i en ven i armen av patienten och förblir i position i minst 30 min. Detta synsätt gör isolering av CTCs in vivo direkt i perifert blod och till skärmen ca 1,5-3,0 L blod (cirka 300-fold mer än volymen används för alternativa metoder)1.
Pantel et al. visade effekten av detta tillvägagångssätt isolera CTCs direkt i arm venerna i lung cancer patienter15. De utförde tråd immunofluorescens färgning för att identifiera CTCs använder konventionella antikroppar riktade mot EpCAM och pan-cytokeratin, och CD45 för leukocytbefriade upptäckt. Tråden undersöktes under en optisk fluorescens Mikroskop15. Författarna visade att enheten var kunna isolera CTCs, men de inte undersöka alla terapi-relaterade mål, såsom ALK flyttningar.
Den presenterade metoden syftar till att identifiera förmodad CTCs i NSCLC cellinjer utifrån fenotypiska parametrar, t.ex., EpCAM positivitet och förekomsten av molekylära markörer, exempelvis ALK status (figur 1b). Proceduren 3-dag-långa kombinerar en functionalized tråd och immunofluorescens färgning med DNA fluorescensin situ-hybridisering (DNA fisk), heter Immuno-DNA-fisk. CTCs är sällsynta enheter, är fördelen med detta protokoll att CTCs kan karaktäriseras på samma tråd när det gäller både immunophenotypic funktioner och DNA omflyttningar.
Protocol
1. Immuno-DNA fisk på ett 2D täckglas
- Täckglas förberedelse och anhängare cell sådd
Obs: Utför alla de följande stegen under huv laminar-flow i sterila förhållanden.- Fördjupa täckglaset i 100% etanol att desinficera dem.
Obs: Vi använder 12 mm × 12 mm silikon-stödda kvadrerade coverslips (alla reagenser som listas i Tabell för material). - Placera coverslips i en petriskål (100 mm diameter). Torr med tvingade luftflöde för 5 min.
- Tvätta petriskål med 15 mL steril 1 × Dulbeccos fosfat buffrad saltlösning (PBS).
- Tvätta petriskål med 10 mL komplett medium (se tabell 1).
- Utsäde vidhäftande celler (ca 1,650,000 celler i 10 mL medium, räknas av FACS analys) genom att försiktigt släppa cellsuspension på petriskål att få enhetliga cell plätering (omkring 30 000 celler/cm2).
Obs: För ~ 70% confluence, anhängare celler bör vara odlade på coverslips för minst 48 h.
- Fördjupa täckglaset i 100% etanol att desinficera dem.
- Fixering och permeabilisering
Varning: Aceton är en brandfarlig och irriterande flyktigt ämne. Använd endast aceton-resistent plast eller glasbehållare (ingen PVC eller PVDF).
Obs: Utföra stegen under kemiska spiskåpa.- Ta bort odlingssubstratet med en disponibel utvärderingsenheten Pipettera.
- Tvätta petriskål med 1 × PBS.
- Med pincett, tvätta coverslips genom att doppa dem i en glasbägare innehållande 5 mL 1 × PBS.
- Torka av coverslips på läskpapper.
- Fastställa cellerna på täckglaset av nedsänkning till en 100% aceton lösning för 10 min i rumstemperatur (RT).
- Ta bort täckglaset av pincett. Torra täckglas med ett påtvingat luftflöde för 5 min.
Obs: Protokollet kan pausas vid denna punkt. Täckglaset ska förvaras vid-20 ° C.
- Immunofluorescens dag 1
Obs: Detta skede innebär en övernattning (O/N) inkubation (~ 16 h).- Tvätta coverslips i 1 × PBS två gånger.
- Släppa 100 µL förtunningsbuffert antikropp (se tabell 1 för detaljer) på täckglaset och inkubera i 30 min på RT.
Obs: Lösningsvolym bör justeras på grundval av täckglas ytan för att täcka det hela täckglaset och undvika risken för spill. - Förbereda den antikropp mix (tabell 1) med en 1:20 utspädning av monoklonala primär antikropp konjugerat med fluorokrom och antikropp förtunningsbuffert, som anges i databladet som tillhandahålls av tillverkaren.
Obs: Det rekommenderas starkt att använda monoklonala antikroppar konjugerat med termostabila fluorokrom. Om en icke-termostabila fluorokrom används, kan temperaturen utnyttjas under DNA-fisk stegen i protokollet skada fluorokrom och släcka de fluorescerande utsläppen. I detta protokoll, valde vi en EpCAM-FITC-antikropp (1:20 utspädning), som inte visade några betydande problem med utnyttjad temperaturen. - Skölj coverslips två gånger i 1 × PBS.
- Placera coverslips cell-sidan upp i en fuktig kammare och släpp 100 µL av antikropp mixen på täckglaset.
Obs: Lösningsvolym bör justeras på grundval av täckglas yta att täcka det hela täckglaset och minska risken för spill. - Inkubera O/N (~ 16 h) i mörker vid 4 ° C.
- Immunofluorescens dag 2
- Blockera antikropp inkubation av handtvättar coverslips i 1 × PBS.
Obs: Butik coverslips nedsänkt i 100 µL av 1 × PBS vid 4 ° C i en kammare med konstant fuktig miljö i mörkret tills fisken analysen utförs.
- Blockera antikropp inkubation av handtvättar coverslips i 1 × PBS.
- 2D DNA-fisk dag 2
FÖRSIKTIGHET: Särskild uppmärksamhet måste betalas till den höga temperaturen och den fuktig kammaren.- Ställ in hybridisering ugn och torr värme ugn (~ 3 h innan protokollet DNA-fisk). Ange hybridisering ugnen på 75 ° C, ange torr värme ugnen vid 37 ° C och cool 0,4 × SSC lösningen (pH = 7,0 ± 0,1) (se tabell 1för SSC recept) till 4 ° C.
Obs: pH status för fisk buffertar är kritisk: pH = 7,0 ± 0,1. - Tvätta täckglaset tre gånger i iskall 0,4 × SSC lösning.
- Torka täckglaset under kemiska spiskåpa i 10 min i mörker.
- Virvel för 10 s och utföra en snabb spinn ner (med högsta hastighet) av sonden från väggen av sonden-röret.
- Placera täckglas cell-sidan neråt på en droppe av 5 µL fisk sonden på en bild och försegla alla kanterna på täckglaset med gummi cement.
Varning: Följande två steg innebära höga temperaturer. Använd skyddshandskar. - Placera bilden i en mörk fuktig kammare i hybridisering ugnen i 8 min vid 75 ° C för komplett DNA denaturering.
- Flytta den fuktig kammaren in i torr värme ugnen vid 37 ° C O/N.
- Ställ in hybridisering ugn och torr värme ugn (~ 3 h innan protokollet DNA-fisk). Ange hybridisering ugnen på 75 ° C, ange torr värme ugnen vid 37 ° C och cool 0,4 × SSC lösningen (pH = 7,0 ± 0,1) (se tabell 1för SSC recept) till 4 ° C.
- 2D DNA-fisk dag 3
- Vattenbadet vid 72 ° C och placera en slide-färgning burk med 0,4 × SSC buffert till det (tabell 1). Efter 30 min, kontrollera temperaturen på 0,4 × SSC bufferten, vilket måste vara 72 ± 1 ° C.
- Förbered två glasbägare: en med 2 × SSC + 0,05% Tween buffert (pH = 7,0 ± 0,1) (tabell 1) och en andra med destillerat vatten.
- Ta bort den fuktig kammaren från ugnen, försiktigt bort gummi cement från bilden och lossa täckglaset med pincett.
- Tvätta täckglaset genom doppning i 0,4 × SSC under 2 minuter vid 72 ° C.
- Tvätta täckglaset genom att doppa i 2 × SSC + 0,05% Tween buffert för 30 s.
- Skölj täckglaset i destillerat vatten.
- Torka av coverslips under kemiska spiskåpa i 10 min i mörker.
- Montera täckglaset i flytande monteringsmedium med 1,5 µg/mL 4´, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) till motfärg totala DNA. Placera täckglas cell-sidan ner på en droppe av 5 µL monteringsmedium på en bild, tryck på pincetten på täckglas att få ut luften, och försegla med nagellack.
Obs: Montering medium volym bör justeras på grundval av storleken på täckglas ytan.
- 2D Mikroskop observation och analys
Obs: Bilder kan förvärvas med olika Mikroskop system.
- Hämta bilder med en 12-bitars digital kamera och 20 × / 0,50 NA och 40 × / 0,65 NA objektiv med lämpliga filter för rött (excitation: 599 nm, emission: 588 nm), grön (excitation: 509, utsläpp: 524), och blå (excitation: 367 nm, emission: 452 nm) sonder.
- Analysera bilder med hjälp av programvaruverktyg för val.
Obs: För att utvärdera immunofluorescens färgningen och ALK-probe lokaliseringen, vi använde ImageJ. Bilder kan lagras vid-20 ° C i mörker för högst 3 veckor. För långvarig lagring, skulle vi föreslå att använda specifika monteringsmedium för långsiktig lagring.
2. Immuno-DNA fisk på tråd
- Cell spike linjeingång på tråd (3D-stöd)
Obs: Preliminära set-up innebär ett korrekt urval av anhängare celler rader utifrån EpCAM-positivitet. Tråden är functionalized med anti-EpCAM-antikroppar så att endast EpCAM-positiva celler färgas.
Obs: Rör inte den functionalized delen av kabeln för att undvika skada.
Obs: Alla åtgärder bör utföras under en LAF i sterila förhållanden.- Återsuspendera hela innehållet i en T75 kolv (80% confluence) i en 5 mL injektionsflaska med 4 mL komplett medium; för en enda spike-i rekommenderas cirka 2.000.000 celler att maximera celler vidhäftning till tråd.
- Ta bort kabeln från dess glasförpackningar.
- Doppa den functionalized guldiga delen av tråden i flaskan, säkerställa att wire-proppen är en vattentät passform för injektionsflaskan. Försegla med laboratorium film.
Obs: Användning av 5 mL tub rekommenderas att möjliggöra en korrekt matchning mellan tråd-proppen och injektionsflaskan. - Inkubera i 30 min på RT i en tube rotator (0-120 vinkel).
- Skölj tråd tre gånger i 1 × PBS lösningen med 3 olika rena injektionsflaskor.
- Fixering och permeabilisering
Varning: Aceton är ett brandfarligt ämne som kan irritera luftvägarna. Endast använda aceton-resistent plast eller glasbehållare (ingen PVC eller PVDF).
Obs: Utföra stegen under kemiska spiskåpa.- Lufttorka tråd.
- Fixa cellerna genom att doppa kabeln i aceton 100% lösning för 10 min vid RT. användning en 5 mL tub.
Obs: Wire-proppen får inte komma i kontakt med fixativ. - Lufttorka tråd för 5 min på RT.
Obs: Protokollet kan pausas här. Tråden måste förvaras vid-20 ° C. När du packar tråd för långsiktig lagring, placera tråd-proppen bredvid functionalized spetsen och försiktigt in kabeln i lagring glasröret, noga med att inte skada functionalized spetsen. Stäng lagring glaset och lagra (vertikalt eller horisontellt) vid-20 ° C.
- Immunofluorescens dag 1
Obs: Detta skede innebär en O/N inkubation (~ 16 h).- Tvätta två gånger i 1 × PBS lösning med 5 mL tub.
- Inkubera kabeln i antikropp förtunningsbuffert i 30 min på RT med 5 mL tub.
- Förbereda 150 µL av antikropp mix med en utspädning av monoklonala primär antikropp konjugerat med fluorokrom i antikropp förtunningsbuffert, som anges i databladet. Till exempel EpCAM-FITC antikropp användes med en 1:20 utspädning.
- Använda ett p200 tips för att utföra inkubation, enligt följande: extrahera tråd från wire-proppen och försiktigt in tråden genom det större hålet av spetsen. Infoga unfunctionalized slutet först och långsamt dra tråden genom mindre hålet tills det guld är strax bortom det större hålet.
- Försiktigt släppa 150 µL av antikropp mixen (till exempel anti EpCAM_FITC antikropp 1:20 utspädd) i spetsen. För att undvika risk för bubbla bildandet, försiktigt snurra tråden tills den functionalized delen är helt störtade.
- Försegla hålet i spetsen. Inslagning laboratorium film runt hålet kan hjälpa.
- Inkubera vertikalt O/N (~ 16 h) i mörker vid 4 ° C.
- Immunofluorescens dag 2
- Blockera antikropp inkubation genom att tvätta tråden två gånger i 1 × PBS.
- Sätt tillbaka kabeln i sin tråd-propp.
Observera: Store i 1 X PBS vid 4 ° C i en 5 mL injektionsflaska tills fisken analysen utförs.
- 3D DNA-fisk dag 2
FÖRSIKTIGHET: Särskild uppmärksamhet måste betalas till hög temperatur av instrument och fuktig kammare.- Ställ in hybridisering ugn och torr värme ugn (~ 3 h innan protokollet DNA-fisk). Ange hybridisering ugnen på 75 ° C, ange torr värme ugnen vid 37 ° C och cool 0,4 × SSC lösningen (pH = 7,0 ± 0,1) till 4 ° C.
Obs: pH status för fisk buffertar är kritisk och måste vara 7,0 ± 0,1. - Tvätta tråd 3 gånger i iskall 0,4 × SSC lösning.
Obs: Hålla tråden i mörker för att undvika fluorokrom fotoblekning under följande procedurer. - Torr i 10 min i mörker under dragskåpet.
- Vortex och spin proben för 5 s.
- Släpp 10 µL av sonden i theglass mikrorör. Täck med laboratorium film.
- Snurra mikrorör enligt följande: Linda mikroröret i torrt absorberande, papper sätts in i en 50 mL tub, och snurra kort.
- Noggrant placera torkade tråd in i mikrorör och sätt i tråd-proppen. Försegla med gummi cement.
Varning: Följande två steg innebära höga temperaturer.
- Ställ in hybridisering ugn och torr värme ugn (~ 3 h innan protokollet DNA-fisk). Ange hybridisering ugnen på 75 ° C, ange torr värme ugnen vid 37 ° C och cool 0,4 × SSC lösningen (pH = 7,0 ± 0,1) till 4 ° C.
- Sätta en bild färgning burk med 0,4 × SSC lösning i ett vattenbad och Ställ in på 72 ° C.
- Kontrollera 0,4 × SSC lösningen temperaturen tills den når 72 ± 1 ° C.
- Förbered två glasbägare, en med 2 × SSC + 0,05% Tween (pH = 7,0 ± 0,1) lösning och den andra med destillerat vatten.
- Ta bort den fuktig kammaren från torr värme ugnen, ta försiktigt bort gummi cement från wire-proppen med pincett, och ta ut kabeln.
Anmärkning: Dra försiktigt obestruket slutet av tråden genom IN-proppen, vara noga med att inte skada functionalized spetsen. - Doppa tråd i 0,4 × SSC lösningen under 2 minuter vid 72 ° C.
- Tvätta kabeln i 2 × SSC + 0,05% Tween lösning för 30 s vid RT.
- Tvätta kabeln i destillerat vatten på RT.
- Torr tråd under spiskåpa i 10 min i mörker.
- Förbereda en DAPI stamlösning av 1,43 µM i 2 mL 1 × PBS.
- Inkubera functionalized spetsen av tråd med DAPI lösning i en 2 mL injektionsflaska för 1 h i mörker vid RT.
- Skölj tråden två gånger i 1 × PBS och lufttorka.
- Placera tråden i tråd innehavaren. Sätt försiktigt functionalized spetsen genom startpunkten av innehavaren av särskilda, tills spetsen matchar kopplingspunkten. Var noga med att inte skada functionalized spetsen (figur 1a).
- Placera den speciell hållaren på Mikroskop scenen. Justera fokus för mikroskopet med en 20 × objektiv. Först grovt fokusera på särskilda stöd och justera sedan fint på celler som visas ljusa i DAPI-kanalen.
- Bara sätta i fokus cellerna central för linsen.
Obs: Bilder kan förvärvas med olika Mikroskop system. I denna inställning använder vi konventionella fluorescerande Mikroskop begåvad med en vanlig kommersiell programvara för bild förvärv. - Hämta bilder med en 12-bitars digital kamera och 20 × / 0,50 NA och 40 × / 0,65 NA objektiv med lämpliga filter för rött (excitation: 599 nm, emission: 588 nm), grön (excitation: 509, utsläpp: 524), och blå (excitation: 367 nm, emission: 452 nm) sonder.
Obs: Bilder kan visualiseras med hjälp av olika verktyg och programvara. Vi använder ImageJ för att utvärdera immunofluorescens färgning och ALK-probe lokalisering.
Obs: Protokollet kan pausas här. Tråden måste förvaras vid-20 ° C. När du packar tråd för långsiktig lagring, placera tråd-proppen bredvid functionalized spetsen och försiktigt in kabeln i lagring glasröret, noga med att inte skada functionalized spetsen. Stäng lagring glaset och lagra (vertikalt eller horisontellt) vid-20 ° C.
Representative Results
Använda proceduren ovan det är möjligt att utföra ett Immuno-DNA fisk test på CTCs (eller andra motsvarande celler) berikas av functionalized tråd. Innan du konfigurerar detta protokoll, var förenligheten av de två teknikerna beslutsam (immuno-fluorescens med fisk) på standard 2D stöd. Två olika cellinjer för NSCLC uttrycker EpCAM (krävs att följa tråden tillsammans med antikroppar mot EpCAM) valdes. De har en annan ALK-status, vilket är användbart för att testa olika start villkor. Först, NCI-H1975, har vildtyp (WT) ALK gener, medan andra, NCI-H3122, kännetecknas av ALK flyttningar.
Ett ALK-genen paus-apart detektionssystem för fisk analysen användes. Systemet består av två sonder, en (orange) korsa till proximala regionen inom ALK på 2p 23 och en (grön) korsa distalt ALK. På 2D stöd förutsatt Immuno-DNA fisk väldefinierade signaler för både antikroppar och sonden (figur 2). I synnerhet cellinjer både visade väldefinierade EpCAM membran lokalisering. Dessutom sonden signaler dök upp ljus och skarp: NCI-H1975 celler visade överlappande orange och grönt sonder, bekräftar vildtyp status av ALK-genen (figur 2a, b). Däremot visade NCI-H3122 celler överlappande signaler och enda gröna prickar, återspeglar en radering av ALK-genen (figur 2 c, d). När Immuno-DNA fisk analysen utfördes på 3D stöd functionalized tråd, antikropp och sonden signaler var generellt mindre definierade än 2D stöd. EpCAM färgning var synlig. ALK sonden signaler var mindre definierad men fortfarande återspeglas den förväntade ALK-statusen (figur 3). Resultaten visade att immunofluorescens färgning inte hindrade DNA fisk signaler. Sonderna hybridiseras specifikt med sina mål. NCI-H3122 cellinje visade en avvikande ALK-genen status (figur 3b), i motsats till NCI-H1975, med en vildtyp ALK-genen (figur 3a).
Figur 1 : Functionalized tråd, schematisk arrangemang av ALK paus-apart sonder, system av förväntade mönster av ALK rearrangering och speciell hållare. (en) röda lådor belysa de tre delarna av tråden: functionalized tip, tråd-propp och un-functionalized tip. Functionalized spetsen är den känsligaste delen av tråden och måste inte vidröras under hantering för att undvika cell avlossning eller skada. (b) de gröna och röda sonderna, varje respektive binda till sekvenser uppströms och nedströms loci av ALK-genen (till vänster). Till höger visas varigenom mönster av ALK arrangemang. Röda och gröna samtidig lokalisering signaler på normala celler; separerade gröna och röda signaler indikerar en ALK-genen kromosom paus (flyttning av ALK-genen) och en grön-orange colocalization signal (avvikande cell-1). En röd signal och två gröna signaler indikerar förlust av en röd signal, vilket tyder på en kromosomal translokation och en borttagning (avvikande cell-2). (c), Wire hållare; röda boxar belysa områden där vård behövs vid hantering av tråden vid mikroskopi analys. Tråden kan genomgå en 360 °-analys genom att vrida rotator. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Immuno-DNA fisk test på 2D stöd (täckglas). (en, b) NCI-H1975 celler svagt positiv för EpCAM. EpCAM FITC signaler var märkbar. De orange och grönt sonderna av ALK paus-apart överlappade, bekräftar WT status av ALK-genen i NCIH1975 cellinje. Celler som visar mer än två ihopkopplade signaler var närvarande på grund av deras aneuploidi. (c, d) I den höga EpCAM-uttryckande NCIH3122 cellinje var immunofluorescens signaler ljusa, som accentuerades i cell cell korsningar. FISK analyser bekräftade borttagningar av ALK-genen, typisk för denna cellinje. Röda pilarna visar enda gröna sonder (utan motsvarande orange sonder), återspeglar ALK-genen radering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Immuno-DNA fisk assay med functionalized tråd som stöd för 3D. (en) representativ bild av NCI-H1975 celler på linan. Även om 3D formen av cellerna på tråd gör svårt att förvärva fullt i fokus bilderna, är EpCAM signal väl synlig i alla celler. (b), representativ bild av NCI-H3122 celler på linan. ALK sonder visade gen radering (röda pilar), som tidigare sett på 2D stöd. Synlig bakgrund signalerna var troligen på grund av närvaron av polymerskikt. Dock påverkar det inte väsentligt cell identifiering eller fluorescens analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffert | Sammansättning | Obs | Bestånd |
| Komplett cellodlingsmedium | RPMI 1640 + 2 mM glutamin + 5-10% fetalt bovint Serum (FBS). | RPMI: 4 ° C; Glutamin, FBS:-20 ° C | |
| Antikropp Diluition buffert | 1% BSA, 0,3% Triton x-100 i 1 x PBS | RT. tätning med laboratorium film. | |
| 20 x SSC lösning | 3 M natriumklorid, 300 mM Trinatriumcitrat upplöst i ddH20 | Filtrera lösningen och pH = 7.0 +/-0,1 med HCl | RT. tätning med laboratorium film. |
| 0,4 x SSC lösning | Späd lager 20 x SSC i destillerat H2O | Filtrera lösningen och pH = 7.0 +/-0,1 med HCl | RT. |
Tabell 1: Lösningar recept.
Discussion
I detta papper, för första gången, en metod som kombinerar immunofluorescens färgning och DNA fisk, för användning med functionalized tråd föreslogs. Metoden kallades Immuno-DNA fisk. Denna teknik utvecklades tillåta samtidig identifiering av förmodad CTCs på en 3D tråd utifrån fenotypiska parametrar, såsom positivitet till EpCAM (fall 1), och underlätta upptäckt av molekylära förändringar, såsom ALK-genen status) (händelse 2). Samtidiga identifiering av två händelser kan påvisande av deras samtidig localization. Detta tillvägagångssätt kan därför skräddarsys för att identifiera och karaktärisera CTCs Hämtad från blodet av cancerpatienter. De potentiella effekterna av Ante-komponenter och leukocyter på färgningsproceduren stör inte vanligtvis förfarandet. Uppgifter som rapporterats i litteraturen anges särskilt att Ante-komponenter och leukocyter inte påverkar immunofluorescens färgningen av cellerna bifogas tråd, den kritiska steget att identifiera faktiska CTCs1,15.
Fluorescens ljusstyrka Immuno-DNA fisk är något mindre markant än en traditionell immunophototyping assay och är resultatet av den höga temperaturen behövs för fisk analysen. Det är dock fortfarande märkbar immunofluorescens färgning. En svag signal är exempelvis fortfarande spåras i den låga EpCAM-uttryckande cellinje, NCIH1975. Den höga temperatur som krävs för fisk analysen är den viktigaste begränsande faktorn i valet den rätt fluorokrom kopplade till antikroppen. I detta protokoll, måste antikroppar kopplas till en termostabila fluorokrom för att tolerera DNA denaturering temperaturen. Till exempel rekommenderas inte fykoerytrin, en värmekänslig fluorokrom, i den här inställningen på grund av fluorokrom nedbrytning, orsakad av hög temperatur. Fluorescein isotiocyanat är ett bra val och ofta gemensamma fluorokrom anställd på fisk sonder. Immuno-DNA fisk autofluorescens signalen är mycket dålig på standard 2D stöd. På tråd stöd, kan polymerskikt inducera en liten autofluorescens signal, särskilt på den röda kanalen. Till skillnad från 2D bakgrunden, en ett bakgrund signal kan skönjas på tråd men påverkar inte signifikant atomkärnor identifiering eller cell karakterisering.
Mikroskopet utvärdering av tråden är mycket mer tröttande än på en 2D stöd på grund av gränserna för ett optiskt mikroskop i läsning på ytan av en cylindrisk-formade 3D-strukturen. Denna svårighet kan dock lösas genom roterande tråd innehavaren och de bilder som är främst lokaliserade längs mittlinjen av tråd. Tråd innehavaren tillåter en 360 ° rotation av tråd. När fokuserade på atomkärnor, hålla fluorescens kanalbyte inte nödvändigtvis fokus på målområdet. Därför är det viktigt att behålla fokus på inner-cell målområdet.
Denna teknik kan skräddarsys för att upptäcka och karaktärisera celler på olika typer av 3D stöd. Det kan också vara möjligt att använda olika antikroppar och fisk sonder. När du väljer att använda olika antikroppar, är fluorokrom termostabiliteten och uttryck av målet antigenet på cellmembranet viktiga faktorer att tänka på. Intra-cytoplasmatic antigener kan också färgas. När använder olika fisk sonder, är det viktigt att kontrollera databladet specifikationerna för denaturering förfarandet och att förbereda celler för fisken assay med detta.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Carlo Erba | # 414605 | |
| Tween 20 | BIO RAD | # 1706531 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Medicago | # 09-9400-100 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | # 534064-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | # A7906 | |
| Triton X-100 Detergent | BIO RAD | # 1610407 | |
| RUBBERCEMENT | Royal Talens | # 95306500 | |
| Vysis 20X SSC (66g) | Abbott Molecular Inc. | # 30-804850 | powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended |
| RPMI 1640 | Gibco | # 31870-025 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | # 10270-098 | |
| L-Glutamine (200mM) | Gibco | # 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | # 15140-122 | |
| H20 | MilliPore | ||
| XT ALK BA | MetaSystems Probes | # D-6001-100-OG | |
| DAPI, FluoroPure grade | Invitrogen | # D21490 | |
| SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI | Life Technologies | # S36973 | |
| EpCAM-FITC (clone: HEA-125) | Mitenyi | # 130-080-301 | |
| Micro tubes M-Tube18 | Gilupi Nanomedizin | ||
| Detektor CANCER01 EpCAM | Gilupi Nanomedizin | Functionalized wire | |
| STAR FROST Microscope Slides | Knittel GLÄSER | VS1117# 076FKB | |
| SecureSlip Silicone Supported Coverglass | GRACE BIO-LABS | # 104112 | |
| ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop | ZEISS | ||
| Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software | Nikon | BR 4.11.00 | |
| Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera | Nikon | DS-QiMc |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int. J. Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Xu, W., et al. Comparison of three different methods for the detection of circulating tumor cells in mice with lung metastasis. Oncol. Rep. , 1-8 (2017).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci. Rep. 7 (February), 43424 (2017).
- Masuda, T., Hayashi, N., Iguchi, T., Ito, S., Eguchi, H., Mimori, K. Clinical and biological significance of circulating tumor cells in cancer. Mol. Oncol. 10 (3), 408-417 (2016).
- Toss, A., Mu, Z., Fernandez, S., Cristofanilli, M. CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine. Ann. Transl. Med. 2 (11), 108 (2014).
- Wang, J., Huang, J., Wang, K., Xu, J., Huang, J., Zhang, T. Prognostic significance of circulating tumor cells in non-small-cell lung cancer patients: a meta-analysis. PLoS One. 8 (11), e78070 (2013).
- Maemondo, M., et al. Gefitinib or Chemotherapy for Non?Small-Cell Lung Cancer with Mutated EGFR. N. Engl. J. Med. 362 (25), 2380-2388 (2010).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK -Positive Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 368 (25), 2385-2394 (2013).
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Costa, D. B., et al. Clinical Experience With Crizotinib in Patients With Advanced ALK -Rearranged Non-Small-Cell Lung Cancer and Brain Metastases. J. Clin. Oncol. 33 (17), 1881-1888 (2015).
- Fischer, J. C., et al. Diagnostic leukapheresis enables reliable detection of circulating tumor cells of nonmetastatic cancer patients. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (41), 16580-16585 (2013).
- Coumans, F. A. W., Ligthart, S. T., Uhr, J. W., Terstappen, L. W. M. M. Challenges in the enumeration and phenotyping of CTC. Clin. Cancer Res. 18 (20), 5711-5718 (2012).
- Allard, W. J., Terstappen, L. W. M. M. CCR 20th Anniversary Commentary: Paving the Way for Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 21 (13), 2883-2885 (2015).
- Theil, G., et al. The use of a new CellCollector to isolate circulating tumor cells from the blood of patients with different stages of prostate cancer and clinical outcomes - A proof-of-concept study. PLoS One. 11 (8), 1-14 (2016).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
