Summary
Vi præsenterer en ny tilgang til at karakterisere tumorceller. Vi kombineret immunfluorescens med DNA fluorescerendein situ-hybridisering til at evaluere celler taget til fange af en functionalized medicinsk wire i stand til at i vivo berigende CTCs direkte fra patientens blod.
Abstract
Cirkulerende tumorceller er (CTCs) forbundet med dårlig overlevelse i metastatisk kræft. Deres identifikation, fænotyper og genotypebestemmelse kunne føre til en bedre forståelse af tumor heterogenitet og dermed lette udvælgelsen af patienter for personlig behandling. Dette er imidlertid hæmmet på grund af sjældenhed af CTCs. Vi præsenterer en innovativ tilgang til prøveudtagning en stor mængde af patientens blod og indhentning af oplysninger om tilstedeværelse, fænotype, og genet omplantning af CTCs. Metoden kombinerer immunofluorescens farvning og DNA fluorescerendein situ-hybridisering (DNA fisk) og er baseret på en functionalized medicinsk wire. Denne tråd er en innovativ enhed, der tillader i vivo -isolation af CTCs fra en stor mængde af perifert blod. Blodvolumen screenet af en 30-min administration af wiren er ca 1,5-3 L. For at bevise gennemførligheden af denne tilgang, epitelcelle vedhæftning molekyle (EpCAM) udtryk og kromosomale omplantning af ALK-genet blev fastsat i ikke-småcellet lungekræft kræft (NSCLC) cellelinjer fanget af den functionalized ledning og farves med en immuno-DNA fisk tilgang. Vores største udfordring var at udføre analysen på en 3D-struktur, den functionalized wire, og at bestemme immuno-fænotype og fisk signaler på denne støtte ved hjælp af en konventionel fluorescens mikroskop. Resultaterne viser at fange CTCs og analysere deres fænotype og kromosomal omrokering kunne potentielt repræsenterer en ny følgesvend diagnostisk tilgang og give en innovativ strategi for at forbedre personificeret kræftbehandlinger.
Introduction
CTCs repræsenterer et vigtigt skridt for kræft celle formidling1. Deres tilstedeværelse i de perifere blod af patienter er forbundet med (metastatisk) tilbagefald og sygdom progression2,3. CTC isolering og karakterisering af blod af kræftpatienter er en type af non-invasiv likvide biopsi. I de seneste år, er det blevet stadig tydeligere, at overvågning af progression og svar af tumorer på forskellige behandlinger ved hjælp af denne form for analyse giver vigtige kliniske oplysninger4,5. Flydende biopsi er endnu mere nyttigt, hvor kirurgi er ikke muligt eller når primær tumor væv er ikke tilgængelig, dvs., for ikke-biopsiable læsioner. Denne tilgang er derfor lovende i bestemt kræft indstillinger som metastatisk NSCLC, hvor tilstedeværelsen af CTCs har vist sig at have en negativ prognostiske rolle6. NSCLC er en tumor, der gavner især fra målrettede terapeutiske tilgange7,8,9 designet til at fungere på specifikke molekyler (molekylære mål) kendt for at være involveret i vækst, progression, og spredning af sygdommen. Derfor er det nødvendigt påvisning af specifikke mål i løbet af sygdomsprogression. CTC undersøgelse er en yderst interessant diagnostisk tilgang til at opdage og overvåge drug mål uden behov for primær eller metastatisk væv. For eksempel er påvisning af ALK-genet omplantninger i NSCLC celler forbundet med følsomhed over for crizotinib, en specifik målrettet terapi10. Dog på nuværende tidspunkt, der påvisning af ALK omplantninger udføres kun på fine nål aspirates eller små biopsier; som et resultat, uden en tumor er væv ALK analyse ikke muligt. CTCs er en potentiel alternativ til tumor væv-baserede undersøgelser og repræsenterer en meget lovende følgesvend diagnostisk tilgang.
På trods af deres potentielle betydning er CTCs stadig genstand for stor diskussion blandt forskning, hovedsagelig på grund af deres sjældenhed (1-10 celler/mL af perifert blod11). Nuværende flydende biopsi metoder bruger en begrænset mængde af blod (dvs., 1-30 mL)12,13, men dette skaber en situation med suboptimal sensitivitet til påvisning af CTCs. derfor, forskning er berettiget til at finde tilgange og udvikle enheder til at udføre CTC-målrettet flydende biopsier på en større volumen af perifert blod.
En alternativ enhed, en functionalized medicinsk wire (Se Tabel af materialer), er blevet udviklet for at overvinde blod prøveudtagning begrænsninger og opnå et mere repræsentativt analyse af CTCs. Denne functionalized wire er et CE-godkendt medicinsk anordning, der fanger CTCs direkte fra blodbanen af kræft patienter1. Det er sammensat af en 16 cm lange rustfrit stål wire (figur 1a) med 2 cm lange functionalized spids belagt med et 0,2 µm tykt lag af guld. Laget er igen dækket af en 1-5 µm tykt strontiumpolycarboxylat hydrogel stratum kovalent kombineret med antistoffer rettet mod EpCAM, en af de mest udbredte udtrykt antigener på overfladen af CTCs14. Den functionalized spids af wiren er indført i en blodåre i armen på patienten og forbliver i position i mindst 30 min. Denne tilgang giver isolation af CTCs in vivo direkte i perifert blod, og at skærmen omkring 1.5-3.0 L blod (ca 300-fold mere end diskenhed for alternative tilgange)1.
PanTel mfl. påvist effekten af denne tilgang i isolere CTCs direkte i arm venerne i lunge cancer patienter15. De optrådte for wire immunofluorescens farvning for at identificere CTCs ved hjælp af konventionelle antistoffer rettet mod EpCAM og pan-cytokeratin og CD45 for Leukocytdepleterede påvisning. Wiren var undersøges under et optisk fluorescens mikroskop15. Forfatterne demonstreret at enheden var i stand til at isolere CTCs, men de ikke undersøge enhver terapi-relaterede mål, såsom ALK omplantninger.
Den præsenterede metode tager sigte på at identificere formodede CTCs i NSCLC cellelinjer phenotypical parametre, fx, EpCAM positivitet og tilstedeværelsen af molekylære markører, for eksempel ALK status (figur 1b). Denne 3-dag-lange procedure kombinerer en functionalized wire og immunfluorescens farvning med DNA fluorescens -in situ-hybridisering (DNA fisk), opkaldt Immuno-DNA-fisk. Eftersom CTCs er sjældne enheder, er fordelen ved denne protokol, at CTCs kan karakteriseres på den samme ledning både immunophenotypic funktioner og DNA rearrangementer.
Protocol
1. Immuno-DNA fisk på en 2D Coverslip
- Coverslip forberedelse og tilhænger celle såning
Bemærk: Udføre alle de følgende trin under en laminar flow hætte i sterile forhold.- Fordybe coverslip i 100% ethanol desinficere dem.
Bemærk: Vi bruger 12 mm × 12 mm silikone-støttede kvadrerede coverslips (alle reagenser er angivet i Tabel af materialer). - Placere coverslips i en petriskål (100 mm i diameter). Tør bruge tvang luftstrøm i 5 min.
- Vask petriskål med 15 mL sterilt 1 × Dulbecco phosphat bufferet saltvand (PBS).
- Vaske petriskål med 10 mL af komplet medium (Se tabel 1).
- Seed vedhængende celler (ca 1,650,000 celler i 10 mL af medium, optalt af FACS analyse) ved forsigtigt at droppe cellesuspension på petriskål at opnå ensartet celle plating (omkring 30.000 celler/cm2).
Bemærk: For ~ 70% sammenløb, tilhænger celler bør være kulturperler på coverslips i mindst 48 timer.
- Fordybe coverslip i 100% ethanol desinficere dem.
- Fiksering og permeabilization
Forsigtig: Acetone er en brandfarlig og irriterende flygtige stoffer. Brug kun acetone-resistent plast eller glas containere (ikke PVC eller PVDF).
Bemærk: Udfør disse trin under en kemisk stinkskab.- Fjerne dyrkningsmediet ved hjælp af en engangs aspirating pipette.
- Vask petriskål med 1 × PBS.
- Brug af pincet, vaske coverslips ved at dyppe dem i et glas bægerglas der indeholder 5 mL af 1 × PBS.
- Tørre coverslips på trækpapir.
- Fix cellerne på coverslip ved at nedsænke det i et 100% acetone løsning i 10 min. ved stuetemperatur (RT).
- Fjerne coverslip af pincet. Tør coverslip ved hjælp af en tvungen luftstrøm i 5 min.
Bemærk: Protokollen kan pause på dette tidspunkt. Coverslip skal opbevares ved-20 ° C.
- Immunfluorescens dag 1
Bemærk: Denne fase indebærer en overnight (O/N) inkubation (~ 16 h).- Vask af coverslips i 1 × PBS to gange.
- Drop 100 µL antistof fortynding buffer (Se tabel 1 for detaljer) på coverslip og Inkuber i 30 min. ved RT.
Bemærk: Løsning lydstyrken skal justeres på grundlag af coverslip overfladen for at dække det hele coverslip og undgå risikoen for overløb. - Forberede antistof mix (tabel 1) ved hjælp af en 1:20 fortynding af monoklonale primære antistof konjugeret med fluorokrom og antistof fortynding buffer, som angivet i dataarket fra producenten.
Bemærk: Det anbefales kraftigt at bruge monoklonale antistoffer konjugeret med termostabil fluorokrom. Hvis en ikke-termostabil fluorokrom bruges, kan temperaturen udnyttede under DNA-fisk trin i protokollen skade i fluorokrom og slukke de fluorescerende emissioner. I denne protokol, valgte vi en EpCAM-FITC antistof (1:20 fortynding), som ikke viser nogen betydelige problemer med den udnyttede temperatur. - Skyl coverslips to gange i 1 × PBS.
- Placer coverslips celle-side op i et fugtigt kammer og drop 100 µL antistof-mix på coverslip.
Bemærk: Løsning lydstyrken skal justeres på grundlag af coverslip overfladen til at dække det hele coverslip og mindske risikoen for overløb. - Inkuber O/N (~ 16 h) i mørke ved 4 ° C.
- Immunfluorescens dag 2
- Blokere antistof inkubation ved at vaske coverslips i 1 × PBS to gange.
Bemærk: Butikken coverslips nedsænket i 100 µL af 1 × PBS ved 4 ° C i et kammer med konstant fugtigt miljø i mørke til fisk-analysen er gennemført.
- Blokere antistof inkubation ved at vaske coverslips i 1 × PBS to gange.
- 2D DNA-fisk dag 2
Forsigtig: Særlig opmærksomhed skal betales til den høje temperatur af instrumenterne og fugtigt kammer.- Oprette hybridisering ovn og tør varme ovn (~ 3 h før du starter DNA-fisk-protokollen). Indstille hybridisering ovnen ved 75 ° C, indstille tør varme ovn ved 37 ° C og cool 0,4 × SSC løsning (pH = 7,0 ± 0,1) (Se tabel 1for SSC opskrift) til 4 ° C.
Bemærk: pH status af fisk buffere er kritisk: pH = 7,0 ± 0,1. - Vask af coverslip tre gange i iskold 0,4 × SSC løsning.
- Tørre coverslip under en kemisk stinkskab i 10 min. i mørke.
- Vortex for 10 s og udføre en hurtig spin ned (på maksimumssats) af sonden fra væggen af sonde-tube.
- Placere coverslip celle-side ned på en dråbe af 5 µL af fisk sonden på et dias og forsegle alle kanter af coverslip med gummi cement.
Forsigtig: De næste to trin indebærer høje temperaturer. Bære beskyttelseshandsker. - Sætte diaset i et mørkt fugtigt kammer i hybridisering ovn i 8 min ved 75 ° C til fuldstændig DNA denaturering.
- Flytte det fugtigt kammer i den tørre varme ovn ved 37 ° C O/N.
- Oprette hybridisering ovn og tør varme ovn (~ 3 h før du starter DNA-fisk-protokollen). Indstille hybridisering ovnen ved 75 ° C, indstille tør varme ovn ved 37 ° C og cool 0,4 × SSC løsning (pH = 7,0 ± 0,1) (Se tabel 1for SSC opskrift) til 4 ° C.
- 2D DNA-fisk dag 3
- Indstille et vandbad ved 72 ° C og placere en dias-farvning krukke med 0,4 × SSC buffer ind i det (tabel 1). Efter 30 min, kontrollere temperaturen på 0,4 × SSC buffer, som skal være på 72 ± 1 ° C.
- Forbered to glas bægre: en med 2 × VSK + 0,05% Tween buffer (pH = 7,0 ± 0,1) (tabel 1) og en anden en med destilleret vand.
- Fjerne den fugtkammer fra ovnen, forsigtigt fjerne gummi cement fra diaset og løsrive coverslip med pincet.
- Vaske coverslip ved dypning i 0,4 × SSC for 2 min på 72 ° C.
- Vaske coverslip ved dypning i 2 × VSK + 0,05% Tween buffer for 30 s.
- Skyl coverslip i destilleret vand.
- Tørre coverslips under en kemisk stinkskab i 10 min. i mørke.
- Mount coverslip i flydende montering medium med 1,5 µg/mL af 4´, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) til kontrastfarve samlede DNA. Placere coverslip celle-side ned på en dråbe af 5 µL af montering medium på et dias ved at trykke på pincet på coverslip at få luften ud, og forsegle med neglelak.
Bemærk: Montering medium volumen bør justeres på grundlag af størrelsen af coverslip overfladen.
- 2D mikroskop observation og analyse
Bemærk: Billeder kan erhverves med forskellige mikroskop systemer.
- Erhverve billeder ved hjælp af en 12-bit digital kamera og 20 × / 0,50 NA og 40 × / 0,65 NA mål med passende filtre for rød (excitation: 599 nm, emission: 588 nm), grøn (excitation: 509, emission: 524), og blå (excitation: 367 nm, emission: 452 nm) sonder.
- Analysere billeder ved hjælp af softwareværktøj af valg.
Bemærk: For at evaluere immunofluorescens farvning og ALK-sonde lokalisering, vi brugte ImageJ. Dias kan opbevares ved-20 ° C i mørke i op til 3 uger. For længere opbevaring, vil vi foreslå at bruge specifikke montering medium til langtidsopbevaring.
2. Immuno-DNA fisk på Wire
- Celle spike linjeindgang på wire (3D understøttelse)
Bemærk: Foreløbige set-up indebærer et præcist udvalg af tilhænger celler linjer baseret på EpCAM-positivitet. Wiren er functionalized med anti-EpCAM antistoffer, således at kun EpCAM-positive celler farves.
NOTE: Rør ikke den functionalized del af wire at undgå skader.
Bemærk: Alle trin skal udføres under en laminar flow hætte i sterile forhold.- Resuspend hele indholdet af en T75 kolbe (80% sammenløbet) i en 5 mL hætteglas med 4 mL komplet medium; for en enkelt spike-i anbefales omkring 2.000.000 celler at maksimere celler vedhæftning til wire.
- Fjerne kablet fra sin glasemballage.
- Dyppe den functionalized guld del af wire i hætteglasset, sikrer, at wire-prop er en vandtæt passer til hætteglasset. Forsegle med laboratoriet film.
Bemærk: Brug af 5 mL tube anbefales at give mulighed for en korrekt match mellem metaltråd-prop og hætteglasset. - Inkuber i 30 min. ved RT i en tube rotator (0-120 vinkel).
- Skyl wiren tre gange i 1 × PBS løsning ved hjælp af 3 forskellige rene hætteglas.
- Fiksering og permeabilization
Forsigtig: Acetone er et brandfarligt stof, der kan irritere luftvejene. Kun bruge acetone-resistent plast eller glas containere (ikke PVC eller PVDF).
Bemærk: Udfør disse trin under en kemisk stinkskab.- Lufttørre wiren.
- Fix cellerne ved at dyppe wire i acetone 100% løsning for 10 min på RT. Brug en 5 mL tube.
Bemærk: Wire-prop må ikke komme i kontakt med fiksativ. - Lufttørre ledning i 5 min på RT.
Bemærk: Protokollen kan pause her. Wiren skal opbevares ved-20 ° C. Når emballage wire til langtidsopbevaring, Placer wire-prop ved siden af den functionalized spids og omhyggeligt sæt ledningen i glasrør opbevaring, pas på ikke for at beskadige den functionalized spids. Luk opbevaring glas og gemme (lodret eller vandret) ved-20 ° C.
- Immunfluorescens dag 1
Bemærk: Denne fase indebærer en O/N inkubation (~ 16 h).- Vaskes to gange i 1 × PBS løsning ved hjælp af 5 mL tube.
- Inkuber wire i antistof fortynding buffer i 30 min på RT ved hjælp af 5 mL tube.
- Forberede 150 µL antistof mix med en fortynding af monoklonale primære antistof konjugeret med fluorokrom i antistof fortynding buffer, som angivet i dataarket. For eksempel, EpCAM-FITC antistof blev brugt med en 1:20 fortynding.
- Bruge en p200 tip til at udføre inkubation, som følger: uddrag ledningen fra wire-prop og forsigtigt indsætte wiren gennem det større hul i spidsen. Indsæt den unfunctionalized ende først og langsomt trække wiren gennem mindre hullet, indtil den guld del er lige uden for de større hul.
- Forsigtigt drop 150 µL antistof-mix (for eksempel anti EpCAM_FITC antistof 1:20 fortyndet) i spidsen. For at undgå risikoen for boble dannelse, forsigtigt snurre rundt ledningen, indtil den functionalized del er helt kastet.
- Seal op hullet i spidsen. Indpakning laboratorium film omkring hullet kan hjælpe.
- Inkuber lodret O/N (~ 16 h) i mørke ved 4 ° C.
- Immunfluorescens dag 2
- Blokere antistof inkubation ved at vaske wiren to gange i 1 × PBS.
- Sæt wire i sin wire-prop.
Bemærk: Butikken i 1 X PBS ved 4 ° C på en 5 mL vial indtil fisk analysen udføres.
- 3D DNA-fisk dag 2
Forsigtig: Særlig opmærksomhed skal betales til den høje temperatur af instrumenter og fugtigt kammer.- Oprette hybridisering ovn og tør varme ovn (~ 3 h før du starter DNA-fisk-protokollen). Indstille hybridisering ovnen ved 75 ° C, angive tør varme ovn ved 37 ° C og cool 0,4 × SSC løsning (pH = 7,0 ± 0,1) til 4 ° C.
Bemærk: pH status af fisk buffere er kritisk og skal være 7,0 ± 0,1. - Vask wiren 3 gange i iskold 0,4 × SSC løsning.
Bemærk: Hold wiren i mørke til at undgå fluorokrom photobleaching under de følgende procedurer. - Tørre i 10 min. i mørke under stinkskabet.
- Vortex og spin sonden for 5 s.
- Drop 10 µL af sonden i theglass microtubes. Dække med laboratoriet film.
- Spin microtubes som følger: wrap microtube i et tørt absorberende, papir Læg i en 50 mL tube, og spin-kort.
- Omhyggeligt placere den tørrede ledning i microtube og indsætte wire-prop. Forsegle med gummi cement.
Forsigtig: De næste to trin indebærer høje temperaturer.
- Oprette hybridisering ovn og tør varme ovn (~ 3 h før du starter DNA-fisk-protokollen). Indstille hybridisering ovnen ved 75 ° C, angive tør varme ovn ved 37 ° C og cool 0,4 × SSC løsning (pH = 7,0 ± 0,1) til 4 ° C.
- Sætte et dias farvning krukke med 0,4 × SSC løsning i et vandbad og sat på 72 ° C.
- Kontrollere 0,4 × SSC løsning temperatur indtil 72 ± 1 ° C.
- Forbered to glas bægre, en med 2 × VSK + 0,05% Tween (pH = 7,0 ± 0,1) løsning og den anden med destilleret vand.
- Fjern den fugtkammer fra tørre varme ovn, forsigtigt fjerne gummi cement fra wire-prop bruger pincet, og tag ledningen.
Bemærk: Træk forsigtigt ubestrøget slutningen af wiren gennem IN-prop, være omhyggelig med ikke at beskadige den functionalized spids. - Dyp wire i 0,4 × SSC løsning for 2 min på 72 ° C.
- Vaske wire i 2 × VSK + 0,05% Tween løsning til 30 s på RT.
- Vaske wire i destilleret vand på RT.
- Tørre wire under stinkskab i 10 min. i mørke.
- Forberede en DAPI stamopløsning af 1,43 µM i 2 mL af 1 × PBS.
- Inkubér functionalized spidsen af wire med DAPI løsning i et 2 mL hætteglas til 1 h i mørke ved RT.
- Skyl wiren to gange i 1 × PBS og lufttørre.
- Placer ledningen i wire-holderen. Omhyggeligt indsætte functionalized spidsen gennem Indgangspunktet af særlige indehaveren, indtil spidsen passer koblingspunktet. Pas på ikke at beskadige den functionalized spids (figur 1a).
- Sæt særlige holderen på stadiet mikroskop. Justere fokus i mikroskop ved hjælp af en 20 × linse. Først groft fokusere på den særlige støtte og derefter justere fint på celler, der vises lyse i DAPI-kanal.
- Kun bringes i fokus cellerne centrale til linsen.
Bemærk: Billeder kan erhverves med forskellige mikroskop systemer. I denne indstilling bruger vi en konventionel fluorescerende mikroskop udstyret med en standard kommerciel software til billede erhvervelse. - Erhverve billeder ved hjælp af en 12-bit digital kamera og 20 × / 0,50 NA og 40 × / 0,65 NA mål med passende filtre for rød (excitation: 599 nm, emission: 588 nm), grøn (excitation: 509, emission: 524), og blå (excitation: 367 nm, emission: 452 nm) sonder.
Bemærk: Billeder kan visualiseres ved hjælp af forskellige værktøjer og software. Vi bruger ImageJ for at evaluere immunofluorescens farvning og ALK-sonde lokalisering.
Bemærk: Protokollen kan pause her. Wiren skal opbevares ved-20 ° C. Når emballage wire til langtidsopbevaring, Placer wire-prop ved siden af den functionalized spids og omhyggeligt sæt ledningen i glasrør opbevaring, pas på ikke for at beskadige den functionalized spids. Luk opbevaring glas og gemme (lodret eller vandret) ved-20 ° C.
Representative Results
Ved hjælp af fremgangsmåden ovenfor det er muligt at udføre en Immuno-DNA fisk analyse på CTCs (eller andre tilsvarende celler) beriget af den functionalized ledning. Før du konfigurerer denne protokol, blev forenelighed af de to teknikker bestemt (immuno-fluorescens med fisk) på standard 2D understøtter. To forskellige NSCLC cellelinjer udtrykker EpCAM (skal overholde wiren kombineret med antistoffer mod EpCAM) blev udvalgt. De har forskellig ALK status, som er nyttige til at teste forskellige start betingelser. Først, NCI-H1975, har vildtype (WT) ALK gener, mens andet, NCI-H3122, er kendetegnet ved ALK omplantninger.
En ALK-genet pause-apart detektionssystemets for fisk analysen blev brugt. Systemet består af to sonder, en (orange) hybridizing til den proksimale region inden for ALK på 2p 23 og en (grøn) hybridizing distalt for ALK. På 2D understøtter såfremt Immuno-DNA fisk veldefinerede signaler til både antistof og sonde (figur 2). Især cellelinjer både viste veldefinerede EpCAM membran lokalisering. Derudover sonde signaler udkom lys og skarp: NCI-H1975 celler viste overlappende orange og grønne sonder, bekræfter statussen vildtype af ALK-genet (figur 2a, b). Omvendt NCI-H3122 celler viste overlappende signaler og enkelt grønne prikker, afspejler en sletning af ALK-genet (figur 2 c, d). Når Immuno-DNA fisk analyse blev udført på 3D støtte functionalized wire, antistof og sonde signaler var generelt mindre afgrænset end 2D støtte. EpCAM farvning var synlige. ALK sonde signaler blev mindre defineret men stadig afspejles den forventede ALK status (figur 3). Resultaterne viste, at immunofluorescens farvning ikke interfererer med DNA fisk signaler. Sonderne hybridiseret specifikt med deres mål. NCI-H3122 cellelinje viste en afvigende ALK-genet status (figur 3b), i modsætning til NCI-H1975, med en vildtype ALK-genet (figur 3a).
Figur 1 : Functionalized wire, skematisk opstilling af ALK pause-apart sonder, ordning af forventede mønstre af ALK omlejring, og særlige indehaveren. (en) røde kasser fremhæve de tre vigtigste dele af wiren: functionalized spids, wire-prop og un-functionalized spids. Den functionalized spids er den mest følsomme del af wiren og skal ikke blive rørt under håndtering for at undgå celle udstationering eller skader. (b) de grønne og røde sonder hver henholdsvis binde til sekvenser opstrøms og nedstrøms for loci af ALK-genet (til venstre). Til højre vises eksemplificerende mønstre af ALK ordninger. Røde og grønne Co lokalisering signaler på normale celler; adskilte grønne og røde signaler angive en ALK-genet kromosom pause (translokation af ALK-genet) og en grøn-orange colocalization signal (afvigende celle-1). Et rødt signal og to grønne signaler angive tabet af et rødt signal, tyder på et kromosom translokation og en sletning (afvigende celle-2). (c) Wire indehaveren; røde bokse fremhæve områder, hvor pleje er nødvendigt når håndtering wiren under mikroskopi analyse. Wiren kan gennemgå en 360 ° analyser ved at dreje rotator. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Immuno-DNA fisk assay på 2D støtte (coverslip). (en, b) NCI-H1975 celler svagt positiv for EpCAM. EpCAM FITC signaler var mærkbar. De orange og grønne sonder af ALK pause-apart overlappede, bekræfter statussen WT af ALK-genet i NCIH1975 cellelinje. Celler viser mere end to parrede signaler var til stede på grund af deres aneuploidi. (c, d) I den høje EpCAM-udtrykker NCIH3122 cellelinie var immunofluorescens signaler lyse, som blev forstærket i celle-celle vejkryds. FISK analyser bekræftede sletninger af ALK-genet, typisk af denne celle. Røde pile indikerer enkelt grønne sonder (uden tilsvarende orange sonder), afspejler ALK-genet sletning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Immuno-DNA fisk assay ved hjælp af den functionalized ledning som 3D understøttelse. (en) repræsentative billede af NCI-H1975 celler på wiren. Selv om 3D form af celler på wiren vanskeligt at erhverve fuldt i-fokus billeder, er EpCAM signal godt synlige i alle celler. (b) repræsentative billede af NCI-H3122 celler på wiren. ALK sonder viste gen sletning (røde pile), som tidligere set på 2D støtte. De synlige baggrund signaler var sandsynligvis på grund af tilstedeværelsen af polymer lag. Men det ikke væsentligt påvirkede celle identifikation eller fluorescens analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer | Sammensætning | Bemærk | Bestande |
| Komplet cellekulturmedium | RPMI 1640 + 2 mM glutamin + 5-10% føtale bovint Serum (FBS). | RPMI: 4 ° C; Glutamin, FBS:-20 ° C | |
| Antistof Diluition Buffer | 1% BSA, 0,3% Triton X-100 i 1 x PBS | RT. segl med laboratoriet film. | |
| 20 x SSC løsning | 3 M natriumchlorid, 300 mM Trinatriumcitrat opløst i ddH20 | Filter løsning og pH = 7,0 +/-0,1 med HCl | RT. segl med laboratoriet film. |
| 0,4 x SSC løsning | Fortynd stock 20 x SSC i destilleret H2O | Filter løsning og pH = 7,0 +/-0,1 med HCl | RT. |
Tabel 1: Løsninger opskrifter.
Discussion
I dette papir, for første gang, en metode, der kombinerer immunofluorescens farvning og DNA fisk, til brug med functionalized wire blev foreslået. Metoden blev kaldt Immuno-DNA fisk. Denne teknik blev udviklet til samtidige identificering af formodede CTCs på en 3D wire på grundlag af phenotypical parametre, såsom positivitet til EpCAM (event 1), og for at lette påvisning af molekylære ændringer, som ALK-genet () status Event 2). Den samtidige identifikation af de to begivenheder giver mulighed for påvisning af deres Co lokalisering. Derfor kan denne tilgang skræddersyes til at identificere og karakterisere CTCs hentet fra blodet af kræftpatienter. De potentielle virkninger af haemo-komponenter og leukocytter på farvning proceduren forstyrrer ikke normalt proceduren. Navnlig anført data, der indberettes i litteratur, at haemo-komponenter og leukocytter ikke påvirker immunofluorescens farvning af de celler, der er knyttet til tråd, det afgørende skridt til at identificere faktiske CTCs1,15.
Fluorescens lysstyrken af Immuno-DNA fisk er lidt mindre markant end med en traditionel immunophototyping assay og er resultatet af den høje temperatur behov for fisk assay. Men immunofluorescens farvning er stadig mærkbar. For eksempel, er et svagt signal stadig detekterbar i den lave EpCAM-udtrykker cellelinje, NCIH1975. Den høje temperatur kræves for fisk assay er den vigtigste begrænsende faktor i at vælge den rigtige fluorokrom knyttet til antistoffet. I denne protokol, skal antistoffer være knyttet til en termostabil fluorokrom for at tolerere DNA denaturering temperatur. Phycoerythrin, en thermosensitive fluorokrom, anbefales for eksempel, ikke i denne indstilling på grund af fluorokrom nedbrydning forårsaget af høje temperaturer. Fluorescein isothiocyanat er et godt valg og ofte fælles fluorokrom ansat på fisk sonder. Immuno-DNA fisk autofluorescence signal er meget fattige på standard 2D understøtter. På wire støtte, kan polymer lag fremkalde et lille autofluorescence signal, især på den røde kanal. I modsætning til 2D baggrunden en konkurrencehandling baggrund signal er mærkbar på wiren men påvirker ikke væsentligt kerner identifikation eller celle karakterisering.
Mikroskop evaluering af wiren er langt mere trættende end på en 2D støtte på grund af begrænsninger af et optisk mikroskop i læsning overflade af et cylindrisk formet 3D struktur. Dog kan denne vanskelighed overvindes af roterende wire indehaveren og erhverve de billeder, der er primært lokaliseret langs midterlinjen af wiren. Indehaveren af wire tillader en 360 ° rotation af wiren. Når fokuseret på kerner, holde ændre fluorescens kanaler ikke nødvendigvis fokus på målområdet. Derfor er det vigtigt at fastholde fokus på indre-celle målområdet.
Denne teknik kan skræddersyes til at opdage og karakterisere celler på forskellige slags 3D understøtter. Det kan også være muligt at bruge forskellige antistoffer og fisk sonder. Når du vælger at bruge forskellige antistoffer, er fluorokrom thermostability og udtryk niveau af target antigen på cellemembranen vigtige faktorer til at overveje. Intra-intracytoplasmatisk antigener kan også blive plettet. Når ved hjælp af forskellige fisk sonder, er det vigtigt at kontrollere dataark specifikationer for proceduren denaturering og forberede FISKEN celler assay i overensstemmelse hermed.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Carlo Erba | # 414605 | |
| Tween 20 | BIO RAD | # 1706531 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Medicago | # 09-9400-100 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | # 534064-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | # A7906 | |
| Triton X-100 Detergent | BIO RAD | # 1610407 | |
| RUBBERCEMENT | Royal Talens | # 95306500 | |
| Vysis 20X SSC (66g) | Abbott Molecular Inc. | # 30-804850 | powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended |
| RPMI 1640 | Gibco | # 31870-025 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | # 10270-098 | |
| L-Glutamine (200mM) | Gibco | # 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | # 15140-122 | |
| H20 | MilliPore | ||
| XT ALK BA | MetaSystems Probes | # D-6001-100-OG | |
| DAPI, FluoroPure grade | Invitrogen | # D21490 | |
| SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI | Life Technologies | # S36973 | |
| EpCAM-FITC (clone: HEA-125) | Mitenyi | # 130-080-301 | |
| Micro tubes M-Tube18 | Gilupi Nanomedizin | ||
| Detektor CANCER01 EpCAM | Gilupi Nanomedizin | Functionalized wire | |
| STAR FROST Microscope Slides | Knittel GLÄSER | VS1117# 076FKB | |
| SecureSlip Silicone Supported Coverglass | GRACE BIO-LABS | # 104112 | |
| ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop | ZEISS | ||
| Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software | Nikon | BR 4.11.00 | |
| Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera | Nikon | DS-QiMc |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int. J. Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Xu, W., et al. Comparison of three different methods for the detection of circulating tumor cells in mice with lung metastasis. Oncol. Rep. , 1-8 (2017).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci. Rep. 7 (February), 43424 (2017).
- Masuda, T., Hayashi, N., Iguchi, T., Ito, S., Eguchi, H., Mimori, K. Clinical and biological significance of circulating tumor cells in cancer. Mol. Oncol. 10 (3), 408-417 (2016).
- Toss, A., Mu, Z., Fernandez, S., Cristofanilli, M. CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine. Ann. Transl. Med. 2 (11), 108 (2014).
- Wang, J., Huang, J., Wang, K., Xu, J., Huang, J., Zhang, T. Prognostic significance of circulating tumor cells in non-small-cell lung cancer patients: a meta-analysis. PLoS One. 8 (11), e78070 (2013).
- Maemondo, M., et al. Gefitinib or Chemotherapy for Non?Small-Cell Lung Cancer with Mutated EGFR. N. Engl. J. Med. 362 (25), 2380-2388 (2010).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK -Positive Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 368 (25), 2385-2394 (2013).
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Costa, D. B., et al. Clinical Experience With Crizotinib in Patients With Advanced ALK -Rearranged Non-Small-Cell Lung Cancer and Brain Metastases. J. Clin. Oncol. 33 (17), 1881-1888 (2015).
- Fischer, J. C., et al. Diagnostic leukapheresis enables reliable detection of circulating tumor cells of nonmetastatic cancer patients. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (41), 16580-16585 (2013).
- Coumans, F. A. W., Ligthart, S. T., Uhr, J. W., Terstappen, L. W. M. M. Challenges in the enumeration and phenotyping of CTC. Clin. Cancer Res. 18 (20), 5711-5718 (2012).
- Allard, W. J., Terstappen, L. W. M. M. CCR 20th Anniversary Commentary: Paving the Way for Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 21 (13), 2883-2885 (2015).
- Theil, G., et al. The use of a new CellCollector to isolate circulating tumor cells from the blood of patients with different stages of prostate cancer and clinical outcomes - A proof-of-concept study. PLoS One. 11 (8), 1-14 (2016).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
