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Cancer Research

순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근

doi: 10.3791/56936 Published: December 21, 2017

Summary

우리는 종양 세포의 특성에 대 한 새로운 접근을 제시. 우리 DNA 형광-제자리에서면역 형광 결합-셀 기능성된 의료 와이어에 vivo에 직접 환자의 혈액에서에서 CTCs를 풍부 하 게의 수에 의해 점령을 평가 하는 교 잡.

Abstract

순환 종양 세포 (CTCs) 전이성 암에 가난한 생존에 연관 됩니다. 그들의 식별, 형질, 및 유전형 종양이 더 나은 이해로 이어질 수 있고 따라서 맞춤된 치료에 대 한 환자의 선택을 촉진. 그러나, 이것은 CTCs의 희귀 한 때문에 방해 된다. 우리는 환자 혈액의 높은 볼륨 샘플링 및 CTCs의 전 존재, 표현 형, 그리고 유전자 좌에 대 한 정보를 얻기 위한 혁신적인 접근 방식을 제시. 방법은 결합 면역 형광 염색 및 DNA 형광-제자리-교 잡 (물고기 DNA) 기능성된 의료 와이어 기반. 이 와이어 주변 혈액의 큰 볼륨에서 CTCs vivo에서 절연을 허용 하는 혁신적인 장치입니다. 혈액 볼륨 와이어의 30 분 관리에 의해 상영은 대략 1.5-3 나 이 방법의 타당성을 입증, 상피 세포 접착 분자 (EpCAM) 표현과 ALK 유전자의 염색체 전 좌 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC) 셀 라인 기능성된 와이어에 의해 점령에 결정 했다 고 면역-DNA 물고기 방식으로 얼룩진. 우리의 주요 과제 3 차원 구조, 기능성된 와이어에 분석 결과 수행 하 고 면역 표현 형을 결정 하 고이 물고기 신호를 기존의 형광 현미경을 사용 하 여 지원. 결과 표시는 CTCs을 잡는 그들의 표현 형 및 염색체 재배열 분석 수 잠재적으로 새로운 동행자 진단 접근 및 제공 하는 혁신적인 향상을 위한 전략 맞춤 암 치료.

Introduction

CTCs 암 셀 보급1의 중요 한 단계를 나타냅니다. 환자의 말 초 혈액에 그들의 존재 (전이성) 재발 및 질병 진행2,3와 연결 됩니다. CTC 격리 및 암 환자의 혈액에서 특성화 비-침략 적 액체 생의 유형입니다. 최근 몇 년 동안, 그것은 점점 더 분명 그 중요 한 임상 정보4,5제공 모니터링 진행 및 종양의 분석의이 종류를 사용 하 여 다른 치료에 응답 되었다. 액체 생 인지 더욱 유용한 수술 가능 하지 않습니다 기본 종양 조직 되지 않은 경우 사용할 수 있는, , 비-biopsiable 병 변. 따라서,이 방법은 어디 CTCs의 존재는 부정적인 전조 역할6에 보였다 전이성 NSCLC 같은 특정 암 설정에 유망 하다. NSCLC 타겟된 치료 접근7,8,9 진행, 성장에 관련 된 것으로 알려진 특정 분자 (분자 표적)에 설계에서 특히 이익이 되는 종양 이다 하 고 질병의 확산입니다. 따라서, 질병의 진행 하는 동안 특정 대상의 검출이 필요 합니다. CTC 조사는 감지 하 고 기본 또는 전이성 조직에 대 한 필요 없이 약물 대상 모니터링 매우 재미 있는 진단 방법입니다. 예를 들어 NSCLC 셀에서 ALK 유전자 translocations의 검출 감도 crizotinib, 특정 타겟된 치료10에 연결 됩니다. 그러나, 현재가 translocations의 검색 미세 바늘 aspirates 또는 작은 biopsies;에 실행 됩니다. 그 결과, 종양 없이 조직이 분석 불가능합니다. CTCs는 종양에 대 한 잠재적인 대안 조직 기반 조사 하 고 매우 유망한 동행자 진단 접근을 대표 한다.

그들의 잠재적인 중요성에도 불구 하 고 CTCs 지금도 연구 중 좋은 토론의 주제 (1-10 셀/mL 주변 혈액11) 그들의 진귀 때문에 주로. 현재 액체 생 검 방법 혈액 (, 1-30 mL)12,13의 제한 금액을 사용 하지만이 CTCs 그러므로의 검출을 위한 차선 감도의 상황을 만들고, 연구 발견을 보증 접근 하며 말 초 혈액의 더 큰 볼륨에 CTC 대상 액체 biopsies을 수행 하기 위해 개발 장치

대체 장치, 기능성된 의료 와이어 ( 재료의 표참조), 혈액 샘플링 한계를 극복 하 고를 가져오는 CTCs의 더 대표적인 분석 개발 되었습니다. 이 기능성된 와이어를 암 환자1의 혈 류에서 직접 CTCs CE 승인 의료 기기입니다. 그것은 황금의 0.2 µ m 두께 레이어와 코팅 2 cm 긴 기능성 팁 16 cm 긴 스테인리스 와이어 (그림 1a) 구성 됩니다. 레이어 covalently EpCAM CTCs14의 표면에 가장 널리 표현된 항 중 하나에 대하여 지시 하는 항 체와 결합 하 여 1 ~ 5 µ m 두께 polycarboxylate 히드로 지층에 차례로 적용 됩니다. 철사의 기능성된 팁 환자의 팔의 정 맥에 고 적어도 30 분 동안 위치에 남아 있습니다. 이 방법은 주변 혈액, 그리고 화면 혈액 (약 300-fold 이상 대체 방법을 사용 하는 볼륨)1. 의 약 1.5-3.0 L 직접 CTCs vivo에서 의 격리를 허용

Pantel . 폐 암 환자15팔 혈관에 직접 CTCs을 분리에이 접근의 효능을 설명 했다. 그들은 얼룩 CTCs 백혈구 검색 EpCAM와 팬-cytokeratin, CD45에 대하여 지시 하는 기존의 항 체를 사용 하 여 식별 하는 와이어 면역 형광 검사 수행. 와이어 광 형광 현미경15시험 되었다. 저자 시연 장치 CTCs, 격리 수 있었습니다 하지만 그들은 translocations 등 치료 관련 어떤 표적을 조사 하지 않았다.

제시 방법은 putative CTCs phenotypical 매개 변수, 예를 들어, EpCAM 양성 및 분자 마커의 존재가 상태 (그림 1b) 예를 들어 기초 NSCLC 셀 라인에서 식별 하는 것을 목표로. 이 3-하루-긴 절차 결합 기능성된 와이어 및 면역 형광 DNA 형광-제자리에얼룩-교 잡 (DNA 물고기) 라는 면역-DNA-물고기. CTCs는 희소 한, 그에 주어진이 프로토콜의 장점은 CTCs immunophenotypic 기능 및 DNA 재배열 동일한 철사에 특성화 될 수 있습니다.

Protocol

1. 면역-DNA 물고기 2D Coverslip에

  1. 시드 Coverslip 준비 및 부착 세포
    참고: 메 마른 조건에서 층 류 흐름 후드 아래 모든 다음 단계를 수행 합니다.
    1. 그들을 소독 100% 에탄올으로는 coverslip 담가.
      참고: 우리는 12 m m × 12 m m 실리콘 지원 제곱된 coverslips (모든 시 약은 재료의 테이블에에서 나열 된)를 사용 합니다.
    2. 페 트리 접시 (직경 100 m m)에 coverslips를 놓습니다. 5 분 동안 공기 흐름 강제 건조를 사용 하 여.
    3. 워시와 15 mL 살 균 1 × Dulbecco의 성 페 트리 접시 버퍼링 식 염 수 (PBS).
    4. 완전 한 매체의 10 mL를 페 트리 접시를 세척 ( 표 1참조).
    5. 부착 세포 씨앗 (FACS 분석에 의해 매체의 10 mL에 약 1,650,000 셀 계산) 균일 한 셀 도금 (약 30, 000 셀/cm2)를 페 트리 접시에 세포 현 탁 액을 부드럽게 놓아.
      : 참고 ~ 70% 합류, 점착 세포 적어도 48 h에 대 한 coverslips에 경작 한다.
  2. 고정 및 permeabilization
    주의: 아세톤은는 가연성 및 휘발성 물질을 자극. 만 아세톤-내성 플라스틱 또는 유리 용기 (PVC 또는 PVDF)를 사용 합니다.
    참고: 화학 증기 두건에서 이러한 단계를 수행 합니다.
    1. 사용 하는 일회용 aspirating 피펫으로 문화 매체를 제거 합니다.
    2. 1 × PBS 페 트리 접시를 씻어.
    3. 핀셋을 사용 하 여, 1 × PBS의 5 mL를 포함 하는 유리 비 커에 그들을 담거 서는 coverslips 세척.
    4. 건조 압 지에 coverslips.
    5. 실 온 (RT)에서 10 분 100% 아세톤 솔루션에 그것을 immersing 하 여는 coverslip에 셀을 수정.
    6. 족집게는 coverslip을 제거 합니다. 5 분 동안 공기 흐름을 사용 하는 coverslip 드라이.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지이 시점에서. -20 ° c.에는 coverslip은 저장 한다
  3. 면역 형광 검사 일 1
    참고:이 단계에서는 하룻밤 (O/N) 외피 (~ 16 h).
    1. 1 × PBS에에서는 coverslips를 두 번 세척.
    2. 항 체 희석 버퍼의 100 µ L를 드롭 (자세한 내용은 표 1 을 참조)는 coverslip에 실시간에 30 분 동안 품 어 고
      참고: 솔루션 볼륨 전체 coverslip 커버 하 고 오버플로 위험을 방지 하기 위해 coverslip 표면에 근거 하 여 조정 되어야 한다.
    3. 1시 20분을 사용 하 여 항 체 혼합 (표 1) 준비 기본 단일 클로 널 항 체의 희석 제조업체에서 제공 하는 데이터 시트에 지정 된 대로 형광 색소 및 항 체 희석 버퍼 활용.
      참고: 그것은 강력 하 게 내 형광 색소와 함께 활용 하는 단일 클론 항 체를 사용 하 여 좋습니다. 내 비 형광 색소를 사용 하는 프로토콜의 DNA-물고기 단계 활용 온도 형광 색소를 손상 하 고 형광 방출 소화 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 EpCAM FITC 항 체에 대 한 하기로 했다 (1시 20분 희석)는 사용된 온도와 어떤 중요 한 문제가 나타나지 않았다.
    4. 린스는 coverslips 1 × PBS에 두 번.
    5. Coverslips 셀 쪽 위로 습 한 약 실 및 드롭 100 µ L는 coverslip에 항 체 혼합의 장소.
      참고: 솔루션 볼륨 전체 coverslip 커버 하 여 과잉의 위험을 줄일 coverslip 표면에 근거 하 여 조정 되어야 한다.
    6. O/N을 품 어 (~ 16 h) 4 ° c.에 어둠 속에서
  4. 면역 형광 검사 주 2
    1. 1 × PBS에에서는 coverslips를 두 번 세척 하 여 항 체 외피를 차단 합니다.
      참고: 저장소는 coverslips에에서 몰두 어둠 속에서 지속적인 습기 환경 챔버에 4 ° C에서 1 × PBS의 100 µ L 물고기 분석 결과 수행 될 때까지.
  5. 2D DNA-물고기 하루 2
    주의: 특별 한 주의 악기와 습 한 챔버의 높은 온도에 지불 한다.
    1. 교 잡 오븐 및 건조 열 오븐을 설정 (~ DNA-물고기 프로토콜을 시작 하기 전에 3 h). 75 ° C에서 교 잡 오븐을 설정 37 ° C에서 열 건조 오븐을 설정 하 고 0.4 × SSC 솔루션을 냉각 (pH = 7.0 ± 0.1) (SSC 레시피 표 1참조) 4 ° c
      참고: 물고기 버퍼의 pH 상태는 중요 한: pH 7.0 ± 0.1 =.
    2. 얼음 처럼 차가운 0.4 × SSC 솔루션에는 coverslip 세 번을 씻어.
    3. 어둠 속에서 10 분 동안 화학 연기 후드 coverslip 건조.
    4. 10 소용돌이의 프로브 튜브의 벽에서 프로브 (최대 속도)에서 내려 빠른 스핀을 수행.
    5. 슬라이드와 물개 고무 시멘트 coverslip의 모든 가장자리에 물고기 조사의 5 µ L의 방울에 coverslip 셀 쪽 아래로 놓습니다.
      주의: 다음 두 단계는 높은 온도 포함 한다. 보호 장갑을 착용 하십시오.
    6. 완전 한 DNA 변성에 대 한 75 ° C에서 8 분 교 잡 오븐에 어두운 습 챔버에 슬라이드를 넣어.
    7. 37 건 열 오븐으로 습 한 챔버를 이동 ° C O/명.
  6. 2D DNA-생선 주 3
    1. 72 ° C에 물 목욕을 설정 하 고 장소 0.4 × SSC 버퍼 슬라이드 얼룩 항아리에 (표 1). 30 분 후 확인 해야 합니다 72 ± 0.4 × SSC 버퍼의 온도 1 ° c.
    2. 두 유리 비 커를 준비: 2 × SSC + 0.05% 트윈 버퍼 하나 (pH = 7.0 ± 0.1) (표 1) 및 증류수와 함께 두 번째 한.
    3. 오븐에서 제거 하는 습 한 챔버, 신중 하 게 슬라이드에서 고무 시멘트를 제거 하 고는 coverslip 핀셋으로 분리.
    4. 72 ° c.에 2 분 동안 0.4 × SSC에에서 담거 서는 coverslip 세척
    5. 2 × SSC + 30 0.05% 트윈 버퍼에 담거 서는 coverslip 씻어 s.
    6. 증류수에 coverslip 린스.
    7. 어둠 속에서 10 분 동안 화학 증기 두건에서 coverslips를 건조.
    8. 4´, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) counterstain 총 DNA의 1.5 µ g/mL와 함께 액체 장착 매체에 coverslip을 탑재 합니다. Coverslip 셀 쪽 아래로 슬라이드 장착 매체의 5 µ L의 하락에, 공기 그리고 매니큐어와 인감에 coverslip에 핀셋을 누릅니다.
      참고: 중간 볼륨을 마운트 coverslip 표면의 크기에 근거 하 여 조정 한다.
  7. 2D 현미경 관찰 및 분석
    참고: 이미지 다른 현미경 시스템으로 취득 될 수 있다.
우리는 기존의 형광 현미경 이미지 수집 (자료 테이블)에 대 한 표준 상용 소프트웨어와 부여를 사용 합니다.
  1. 레드에 대 한 적절 한 필터와 12 비트 디지털 카메라와 20 × / 0.50 총 40 × / 0.65 나 목표를 사용 하 여 이미지 (여기: 599 nm, 방출: 588 nm), 녹색 (여기: 509, 방출: 524), 파랑 (여기: 367 nm, 방출: 452 nm) 조사.
  2. 선택의 소프트웨어 도구를 사용 하 여 이미지를 분석 합니다.
    참고: 면역 형광 염색 및가 프로브 지역화를 평가 하려면 우리 ImageJ 사용. 슬라이드 3 주 최대 어둠 속에서-20 ° C에 저장할 수 있습니다. 장기간된 보관에 대 한 특정 설치 매체를 사용 하 여 장기 저장을 위한 좋습니다 것 이다.

2. 면역-DNA 물고기 와이어에

  1. 셀 라인 스파이크에서 와이어 (3D 지원)
    참고: 사전 설정 포함 한 정확한 부착의 선택 라인 EpCAM 양성 기반 세포. 와이어는 기능성 안티 EpCAM 항 체와 함께 있도록 EpCAM 긍정적인 셀만 묻은 게 있다.
    참고: 어떤 손상을 방지 하기 위해 철사의 기능성된 부분을 만지지 마십시오.
    참고: 모든 단계 실행 되어야 한다 밖으로 메 마른 조건에서 층 류 후드.
    1. 완전 한 매체;의 4 mL를 사용 하 여 5 mL 유리병에서 T75 플라스 크 (80% 합류)의 전체 내용을 resuspend합니다 단일 스파이크에 대해, 약 2000000 세포 세포 접착에는 와이어를 극대화 하기 위해 권장 됩니다.
    2. 유리 포장에서 와이어를 제거 합니다.
    3. 유리병에 와이어의 기능성된 골드 부분을 찍어, 유리병에 맞는 와이어 스 토퍼는 방수 보장. 실험 영화와 함께 인감.
      참고: 와이어 스 토퍼과 유리병의 정확한 일치 수 있도록 5 mL 튜브의 사용을 권장 합니다.
    4. 튜브 회전에서 RT에서 30 분 동안 품 어 (0-120 각도).
    5. 린스는 와이어 3 다른 깨끗 한 튜브를 사용 하 여 1 × PBS 솔루션에 세 번.
  2. 고정 및 permeabilization
    주의: 아세톤은 호흡기 염증을 일으킬 수 있는 가연성 물질 이다. 아세톤-내성 플라스틱 또는 유리 용기 (PVC 또는 PVDF) 사용 합니다.
    참고: 화학 증기 두건에서 이러한 단계를 수행 합니다.
    1. 와이어 건조
    2. 5 mL 튜브 아세톤 100% 솔루션 실시간 사용에 10 분에 와이어를 담거 서 셀을 수정.
      참고: 와이어 스 토퍼는 정착 액의 접촉으로 오지 않을 해야 합니다.
    3. 실시간에서 5 분 동안 와이어 건조
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. -20 ° c.에는 와이어를 저장 해야 합니다. 장기 저장을 위한 와이어 때, 기능성된 팁 옆 와이어 스 토퍼 놓고 신중 하 게 공업화 팁을 손상 하지 않도록 주의 복용 저장 유리 튜브에 와이어를 삽입 합니다. 스토리지 유리를 닫고-20 ° c.에 (수직 또는 수평으로)를 저장
  3. 면역 형광 검사 일 1
    참고:이 단계에서는 O/N 인큐베이션 (~ 16 h).
    1. 5 mL 튜브를 사용 하 여 1 × PBS 솔루션에 두 번 세척.
    2. RT 5 mL 튜브를 사용 하 여 30 분에 대 한 항 체 희석 버퍼에 와이어를 품 어.
    3. 희석 단일 클로 널 1 차적인 항 체와 항 체 희석 버퍼는 데이터 시트에 지정 된 대로 형광 색소 활용 된 항 체 혼합의 150 µ L를 준비 합니다. 예를 들어, EpCAM FITC 항 체 1시 20분와 함께 사용 된 희석.
    4. P200 팁을 사용 하 여 다음과 같이 부 화, 수행: 와이어 스 토퍼에서 와이어를 추출 하 고 부드럽게 팁의 큰 구멍을 통해 와이어를 삽입. Unfunctionalized 끝을 먼저 삽입 하 고 금 부분은 그냥 넘어 더 큰 구멍까지 작은 구멍을 통해 와이어를 천천히 당겨.
    5. 부드럽게 항 체 혼합의 150 µ L를 드롭 (EpCAM_FITC 안티 예 항 체 희석 1시 20분) 끝에. 거품 형성의 위험을 방지 하려면 기능성된 부분 완전히 뛰어들 때까지 부드럽게 와이어를 돌리기.
    6. 도장 끝의 구멍까지. 실험실 영화 구멍 주위에 배치 수 있습니다.
    7. 품 어 수직으로 O/N (~ 16 h) 4 ° c.에 어둠 속에서
  4. 면역 형광 검사 주 2
    1. 와이어 1 × PBS에 두 번 세척 하 여 항 체 외피를 차단 합니다.
    2. 재 그 와이어 스 토퍼에 와이어를 삽입 합니다.
      참고: 1에서 X 5 mL에 4 ° C에서 PBS 유리병 물고기 분석 결과 수행 될 때까지.
  5. 3 차원 DNA-물고기 하루 2
    주의: 특별 한 주의 악기와 습 한 챔버의 높은 온도에 지불 되어야 합니다.
    1. 교 잡 오븐 및 건조 열 오븐을 설정 (~ DNA-물고기 프로토콜을 시작 하기 전에 3 h). 75 ° C에서 교 잡 오븐을 설정 37 ° C에서 열 건조 오븐을 설정 하 고 0.4 × SSC 솔루션을 냉각 (pH = 7.0 ± 0.1) 4 ° c
      참고: 물고기 버퍼의 pH 상태 중요 이며 7.0 ± 0.1 되어야 합니다.
    2. 얼음 처럼 차가운 0.4 × SSC 솔루션에서 와이어 3 번을 씻어.
      참고: 다음 절차 동안 형광 색소 photobleaching을 피하기 위해 어둠 속에서 와이어를 계속.
    3. 증기 찬 장 밑 어둠 속에서 10 분 동안 건조.
    4. 소용돌이 스핀 5 조사 s.
    5. Theglass microtubes에 조사의 10 µ L를 드롭. 실험실 영화 커버.
    6. microtubes를 다음과 같이 회전: 50 mL 튜브에는 microtube 건조 흡수 성, 종이 넣어에 포장 하 고 짧게 스핀.
    7. 조심 스럽게 말린된 와이어는 microtube에 놓고 와이어 스 토퍼를 삽입 합니다. 고무 시멘트와 함께 인감.
      주의: 다음 두 단계는 높은 온도 포함 한다.
보호 장갑을 착용 하십시오.
  • 완전 한 DNA 변성을 75 ° C에서 8 분 교 잡 오븐에 어두운 습 챔버에 와이어를 넣어.
  • 37 건 열 오븐으로 습 한 챔버를 이동 ° C O/명.
  • 3 차원 DNA-생선 주 3
    1. 0.4 × SSC 솔루션 항아리 물 목욕으로 얼룩 슬라이드를 넣고 72 ° c.에 설정
    2. 때까지 72 ± 0.4 × SSC 솔루션 온도 확인 1 ° c.
    3. 두 개의 유리 비 커, 2 × SSC + 0.05% 하나 준비 트윈 (pH = 7.0 ± 0.1) 솔루션 및 두 번째 한 증류수.
    4. 습 한 챔버 건조 열 오븐에서 제거, 와이어 스 토퍼에서 고무 시멘트를 조심 스럽게 제거 핀셋를 사용 하 고 와이어를 꺼내.
      참고: 신중 하 게에 스 토퍼, 기능성된 팁 손상 되지 않도록 주의 되 고를 통해 와이어 uncoated 끝을 당겨.
    5. 72 ° c.에 2 분 동안 0.4 × SSC 솔루션으로 와이어를 찍어
    6. 2 × SSC + 30 0.05% 트윈 솔루션에 와이어를 씻어 실시간에 s
    7. 실시간에 증류수에 와이어를 세척
    8. 어둠 속에서 10 분 연기 후드 와이어 건조.
    9. 1 × PBS의 2 mL에 1.43 µ M의 DAPI 재고 솔루션을 준비 합니다.
    10. 실시간에서 어둠 속에서 1 시간에 2 mL 유리병에 DAPI 솔루션 와이어의 기능성된 팁을 품 어
    11. 1 × PBS에 두 번 와이어를 헹 구 고 건조.
  • 3 차원 현미경 관찰 및 분석
    1. 위치는 와이어 와이어 홀더입니다. 팁 커플링 포인트와 일치 될 때까지 신중 하 게 특별 한 홀더의 진입점을 통해 기능성된 팁을 삽입 합니다. 수 기능성된 팁 (그림 1a)을 손상 하지 않도록 주의 하십시오.
    2. 현미경 단계에 특별 한 홀더를 배치 합니다. 20 × 렌즈를 사용 하 여 현미경의 초점을 조정 합니다. 먼저 개의 특별 한 지원에 집중 하 고 밝은 DAPI 채널에 표시 되는 셀에 정밀 하 게 조정 합니다.
    3. 만 넣어 초점으로 셀 렌즈에 중앙.
      참고: 이미지 다른 현미경 시스템으로 취득 될 수 있다. 이 설정에서 우리는 기존의 형광 현미경 이미지 수집을 위한 표준 상용 소프트웨어와 부여를 사용 합니다.
    4. 레드에 대 한 적절 한 필터와 12 비트 디지털 카메라와 20 × / 0.50 총 40 × / 0.65 나 목표를 사용 하 여 이미지 (여기: 599 nm, 방출: 588 nm), 녹색 (여기: 509, 방출: 524), 파랑 (여기: 367 nm, 방출: 452 nm) 조사.
      참고: 이미지 수 구상 될 다른 도구와 소프트웨어를 사용 하 여. 우리는 면역 형광 염색 및가 프로브 지역화 ImageJ를 사용 합니다.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. -20 ° c.에는 와이어를 저장 해야 합니다. 장기 저장을 위한 와이어 때, 기능성된 팁 옆 와이어 스 토퍼 놓고 신중 하 게 공업화 팁을 손상 하지 않도록 주의 복용 저장 유리 튜브에 와이어를 삽입 합니다. 스토리지 유리를 닫고-20 ° c.에 (수직 또는 수평으로)를 저장
  • Representative Results

    위에 설명 된 절차를 사용 하 여 기능성된 와이어에 의해 농축 CTCs (또는 다른 동등한 세포)에 면역 DNA 물고기 분석 결과 수행 가능 하다. 이 프로토콜을 설정 하기 전에 두 가지 방법의 호환성 결정된 (면역-형광 물고기) 표준 2D 지원에 했다. 두 개의 다른 NSCLC 셀 라인 표현 EpCAM (EpCAM에 대 한 항 체와 결합 하는 와이어를 준수 하는 데 필요한) 선정 되었다. 그들은 다른가 상태를 다른 시작 조건을 테스트 하는 데 유용 했습니다. 두 번째, NCI-H3122가 translocations에 의해 특징입니다 하는 동안 첫 번째, NCI-H1975, 야생 타입 (WT)가 유전자, 있다.

    물고기 분석 결과 대 한 ALK 유전자 휴식-떨어져 탐지 시스템 사용 되었다. 하나 (오렌지) 2 p 23와 하나 (녹색)가 원심 교배 시키기에 내에 있는 인접 영역을 교배 시키기 두 프로브 시스템에 의하여 이루어져 있다. 2D 지원에 면역-DNA 물고기 항 체와 프로브 (그림 2)에 대 한 명확한 신호를 제공합니다. 특히, 둘 다 세포 라인 잘 정의 된 EpCAM 막 지역화를 보여주었다. 또한, 프로브 신호 밝고 날카로운 등장: NCI H1975 셀 겹치는 오렌지와 녹색 프로브, ALK 유전자 (그림 2a, b)의 wildtype 상태를 확인 했다. 반대로, NCI H3122 셀 겹치는 신호와 단일 녹색 점, ALK 유전자 (그림 2 c, d)의 삭제를 반영 했다. 면역-DNA 물고기 분석 결과 수행한 기능성된 와이어를 지 원하는 3D에, 항 체 및 프로브 신호 했다 일반적으로 보다 적게 정의 보다 2D 지원에. EpCAM 얼룩이 표시 했다. ALK 프로브 신호 덜 정의 하지만 여전히 예상된가 상태 (그림 3)를 반영 했다. 결과 면역 형광 염색 DNA 물고기 신호와 방해 하지 않았다 보여주었다. 그들의 목표와 특히 프로브 때 교배. NCI H3122 셀 라인 야생 타입 ALK 유전자 (그림 3a)와 NCI-H1975, 달리 탈 ALK 유전자 상태 (그림 3b)를 보여주었다.

    Figure 1
    그림 1 : 와이어, ALK 휴식-떨어져 프로브 구조 배열, ALK 재배치, 및 특별 한 홀더 예상된 패턴의 구조 기능성. () 빨간 상자는 와이어의 세 가지 주요 부분 강조: 팁, 와이어 스 토퍼, 그리고 유엔 기능성된 팁 기능성. 기능성된 팁 와이어의 가장 민감한 부분 이다 고 셀 분리 또는 손상을 방지 하려면 처리 하는 동안 감동 하지 않을 해야 합니다. (b) 녹색 및 빨간색 프로브는 각 각각 시퀀스에 바인딩할 업스트림과 다운스트림 (왼쪽)에 ALK 유전자의 loci의. 오른쪽에가 준비의 exemplificative 패턴 표시 됩니다. 빨간색과 녹색 공동 지역화 신호에 정상적인 세포; 분리 된 녹색 및 빨간색 신호는 ALK 유전자 염색체 휴식 (ALK 유전자의 전 좌) 한 녹색 오렌지 colocalization 신호 (탈 선 세포-1)을 나타냅니다. 1 빨간 신호 및 2 개의 녹색 신호 한 빨간 신호, 제안 하는 염색체 전 좌 및 삭제 (탈 셀-2)의 손실을 나타냅니다. (c) 와이어 홀더; 빨간 상자 강조 영역 어디 케어는 현미경 분석 중 통신을 처리할 때 필요 하다. 철사는 선회는 선회 하 여 360 ° 분석을 받을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 2
    그림 2 : 2D 지원 (coverslip) 분석 결과 면역 DNA 물고기. (a, b) NCI H1975 EpCAM에 대 한 약하게 긍정적인 세포. EpCAM FITC 신호를 감지할 수 있었다. ALK 휴식-떨어져의 오렌지와 녹색 프로브 겹쳐, NCIH1975 셀 라인에서 ALK 유전자의 WT 상태 확인. 두 개 이상의 쌍을 이루는 신호를 표시 하는 셀의 이수성 인해 참석 했다. (c, d) 높은 EpCAM 표현 NCIH3122 셀 라인에서 면역 형광 신호 했다 밝은,이 셀 접속점에 지기도 했다. 물고기 분석 확인된 삭제 관련이 셀 라인의 전형적인 ALK 유전자의 빨간색 화살표는 단일 녹색 프로브 (없이 해당 오렌지 프로브), ALK 유전자 삭제 반영을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 3
    그림 3: 면역 DNA 물고기 3D 지원으로 기능성된 와이어를 사용 하 여 시험. () 대표 이미지에 NCI H1975 셀의. 에 셀의 3 차원 모양을 완벽 하 게 초점 이미지 어려운 있지만, EpCAM 신호 모든 세포에서 잘 표시 됩니다. 전선에 NCI H3122 셀의 (b) 대표 이미지. ALK 프로브 유전자 삭제 (빨간색 화살표), 이전 2D 지원에 본을 보였다. 보이는 배경 신호 폴리머 층의 존재로 인해 가장 가능성이 있었다. 그러나, 그것은 크게 미치지 않았다 셀 식별 또는 형광 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    버퍼 구성 참고 주식
    셀 완전 한 문화 매체 RPMI 1640 + 2mm 글루타민 + 5-10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS). RPMI: 4 ° C; 글루타민, FBS:-20 ° C
    항 체 Diluition 버퍼 1 %BSA, 1 x PBS에 0.3% 트라이 톤 X-100 실험 영화와 실시간 인감입니다.
    SSC 솔루션 x 20 3 M 300 m m trisodium 시트르산 ddH20에에서 녹아 있는 염화 나트륨 솔루션 및 pH = 7.0 HCl 0.1 + 실험 영화와 실시간 인감입니다.
    SSC 솔루션 x 0.4 주식 20 희석 x SSC에 증류수 H2O 솔루션 및 pH = 7.0 HCl 0.1 + 실시간
    실험 영화와 함께 인감. SSC + 0.05% 트윈 20 솔루션 x 2 주식 20 x SSC 증류수 H2O + 0.05%를 희석 트윈 20 솔루션 및 pH = 7.0 HCl 0.1 + 실험 영화와 실시간 인감입니다. DAPI 솔루션 30 nM 1 x PBS µ M 증권 1.43 희석 Aliquote를 사용 하 여 준비가 어두운 상태에서-20 ° C

    표 1: 솔루션 조리법입니다.

    Discussion

    이 논문에서는, 처음으로, 면역 형광 염색 및 DNA 물고기, 결합 하는 방법에 대 한 기능성된 와이어와 함께 사용 하기 위해 제시 되었다. 메서드를 사용 하면 면역 DNA 물고기를 불렀다. 이 기술은 EpCAM (이벤트 1), 수 양성 같은 phenotypical 매개 변수를 기준으로 하 여 3D 와이어에 상 상속 CTCs의 동시 식별을 허용 하 고 ALK 유전자 상태 (와 같은 분자 변경의 탐지를 촉진 하기 위하여 개발 되었다 이벤트 2)입니다. 두 이벤트의 동시 식별 그들의 공동 지역화의 검색 수 있습니다. 따라서,이 방법은 식별 하 고 암 환자의 혈액에서 검색 하는 CTCs 특성화를 맞출 수 있습니다. 착 색 하는 절차에 haemo-구성 요소 및 백혈구의 잠재적인 효과 절차와 일반적으로 방해 하지 않습니다. 특히, 문학에서 보고 된 데이터는 haemo 구성 요소와 백혈구 좌우 하지 않는다 와이어, 실제 CTCs1,15를 식별 하는 중요 한 단계에 연결 된 셀의 면역 형광 염색 법을 가리킨다.

    면역-DNA 물고기의 형광 광도 전통적인 immunophototyping의 시험 그리고 물고기 분석에 필요한 고온의 결과 보다 약간 덜 표시. 그러나, 면역 형광 염색 법은 여전히 감지할입니다. 예를 들어 희미 한 신호는 여전히 낮은 EpCAM 표현 셀 라인, NCIH1975에서 감지. 물고기 분석에 필요한 높은 온도 항 체에 연결 된 오른쪽 형광 색소를 선택에 주요 제한 요소입니다. 이 프로토콜에서 항 체 DNA 변성 온도 용납 하기 위해 내 형광 색소에 연결 합니다. 예를 들어 phycoerythrin, 열에 민감한 형광 색소는 권장 하지 않습니다이 설정에서 높은 온도 의해 발생 하는 형광 색소 저하. Fluorescein isothiocyanate 좋은 선택 및 물고기 프로브에 종종 일반적인 형광 색소 이다. 면역-DNA 물고기 autofluorescence 신호는 표준 2D 지원에 매우 가난. 와이어 지원에 폴리머 레이어는 빨강 채널에 특히 약간의 autofluorescence 신호를 유도 수 있습니다. 2D 배경 달리 특정 배경 신호에 인지할 수 이지만 핵 식별 또는 셀 특성을 크게 영향을 주지 않습니다.

    와이어의 현미경 평가 독서의 원통형 모양의 3 차원 구조 표면에 광학 현미경의 한계 때문에 2D 지원에 보다 훨씬 더 피곤한. 그러나,이 어려움은 와이어 홀더 회전 및 와이어의 중간 선 따라 지역화 주로 이미지를 획득 하 여 극복할 수 있습니다. 와이어 홀더는 와이어의 360 ° 회전을 허용합니다. 일단 핵에 초점을 맞춘, 형광 채널을 변경 유지 하지 않습니다 반드시 대상 지역에 초점. 이러한 이유로, 내부 셀 대상 영역에 초점을 유지 하기 위해 필수적 이다.

    이 기술은 감지 하 여 3D 지원의 종류에는 셀 특성에 맞출 수 있습니다. 그것은 또한 다른 항 체를 사용할 수 있을 수 있습니다 그리고 물고기 프로브. 다른 항 체를 사용 하 여 선택할 때 형광 색소 내열성 및 세포 막에 대상 항 식 수준 고려해 야 할 중요 한 요소는. 내 cytoplasmatic 항 또한 스테인드 수 있습니다. 프로브 다른 물고기를 사용 하 여 때 그것은 물고기에 대 한 셀을 준비 하 고 변성 절차에 대 한 데이터 시트 사양 따라 분석 결과 확인 하는 것이 중요.

    Disclosures

    저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Ethanol Carlo Erba # 414605
    Tween 20 BIO RAD # 1706531
    PBS (Phosphate Buffered Saline)  Medicago # 09-9400-100
    Acetone Sigma Aldrich # 534064-500ML
    BSA Sigma Aldrich # A7906
    Triton X-100 Detergent BIO RAD # 1610407
    RUBBERCEMENT Royal Talens # 95306500
    Vysis 20X SSC (66g) Abbott Molecular Inc.  # 30-804850 powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended
    RPMI 1640 Gibco # 31870-025
    FBS (Fetal Bovine Serum) Gibco # 10270-098
    L-Glutamine (200mM) Gibco # 25030-024
    Penicillin-Streptomycin Gibco # 15140-122
    H20 MilliPore
    XT ALK BA MetaSystems Probes # D-6001-100-OG
    DAPI, FluoroPure grade Invitrogen # D21490
    SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Life Technologies # S36973
    EpCAM-FITC (clone: HEA-125) Mitenyi # 130-080-301
    Micro tubes M-Tube18 Gilupi Nanomedizin
    Detektor CANCER01 EpCAM Gilupi Nanomedizin Functionalized wire
    STAR FROST Microscope Slides Knittel GLÄSER VS1117# 076FKB
    SecureSlip Silicone Supported Coverglass GRACE BIO-LABS # 104112
    ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop  ZEISS
    Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software Nikon BR 4.11.00
    Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera Nikon DS-QiMc

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    References

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    순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근
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    Gallerani, G., Cocchi, C., Bocchini, M., Piccinini, F., Fabbri, F. Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH. J. Vis. Exp. (130), e56936, doi:10.3791/56936 (2017).More

    Gallerani, G., Cocchi, C., Bocchini, M., Piccinini, F., Fabbri, F. Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH. J. Vis. Exp. (130), e56936, doi:10.3791/56936 (2017).

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