Summary
이 원고 설명 기자 유전자 변형 마우스의 사용 및 다른 관리 경로 angiotensin II 유발 고혈압 면역 세포의 활성화를 평가 하기 위해 혈관의 intravital 비디오 현미경을 사용 하 여 형광 염료의 그들의 롤 및 endothelium에 고착 하는 능력.
Abstract
혈관의 Epifluorescence intravital 비디오 현미경 (IVM) 면역 세포의 활성화 및 역할에 그들의 능력을 평가 하 고 내 피 층에 고착 하는 설정된 방법입니다. 형광 염료의 fluorophore 결합 항 체를 주입 하 여 세포를 순환의 일반적으로 사용 됩니다. 또는, 형광 기자 마우스 사용할 수 있습니다. + (LysM+) 특정 lysozyme M에서에서 백혈구의 상호작용 monocytes, 혈관 벽과 혈관 장애 및 동맥 고혈압에 중추적인 역할. 우리는 여기 시각화 하 고 압 연 하는 백혈구 및 접착 angiotensin II (AngII)에 있는 경 동맥에서 계량 기법 제시-IVM에 의해 쥐에서 고혈압을 유발.
카 테 터의 이식 혈관 벽을 손상 하 고 바꾸 인된 혈액 세포 응답에 연결 됩니다. 우리 다른 주입 기술 및 LysMCre++ IRG에서에서 백혈구를 시각화 하기 위해 관리 경로 비교 붉은 형광 단백질의 광범위 한 표현 및 LysM에 있는 녹색 형광 단백질의 조건식 마우스 + 세포. LysM+ 세포 활성화, 연구를 사용 하는 AngII 마우스 주입 압 연 및 접착 endothelium에 백혈구의 증가. 우리 역시 acridine 오렌지는 경을 사용 하 여 카 테 터를 주입 또는 직접 꼬리 정 맥 하 고 비교의 양을 압 연 및 준수 세포. 우리는 jugular 카 테 테 르 주입 당 회전의 수를 증가에 붙는 LysM+ 세포 가짜 주입 LysMCre++ IRG 마우스 컨트롤에 비해 발견. 이 활성화는 AngII 주입 마우스에서 증강 되었다. 흥미롭게도, acridine 오렌지 직접 꼬리를 통해 정 맥 증가 하지 않았다 LysM+ 세포 접착을 주입 또는 가짜 주입 마우스에서 압 연. 우리는 그로 인하여 실험 동안 vivo에서 프로세스와 방해 하지에 형광 단백질을 표현 하는 유전자 변형 기자 마우스의 중요성을 설명 했다. 또한, 형광 추적기의 꼬리 정 맥 주입 jugular 테 주사 가능한 대안을 수 있습니다.
Introduction
동맥 고혈압 심혈 관 질환과 죽음의 위험을 증가 하 고 동맥 경화 증, 관상 동맥 심장 병 및 동맥 또는 정 맥 thromboembolisms1의 개발을 촉진. 고혈압의 개발 환경, 유전, 내 분 비과 hemodynamic 요인의 상호 작용에 따라 달라 집니다. 현재, 면역과 관련 된 염증 고혈압2의 병 인에 중요 한 역할을 감사 합니다.
면역 세포 중 T 림프 톨, monocytes 그리고 대 식 세포는 AngII 유도 혈관 염증과 고혈압, 반응성 산소 종3하 그들의 능력에 관련 부분에 원인이 되 관련 된 것을 발견 했다. 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 결핍 마우스 혈압 증가 및 혈관 염증4AngII 감소 반응을 보였다. 이전 작품에서 우리는 LysM + monocytes 드라이브 AngII 유발 고혈압5에 염증과 혈관 장애는 표시할 수 있습니다. 더 최근에, 우리는 새로운 통로 응고에 요소 사이 협력 혈소판 및 트 롬 빈-종속 혈관 염증6유도 하 혈관 벽 설명. 고혈압에 면역 시스템의 역할에 대 한 현재의 지식은 요약 최근 되었고 로드 리 게 스-Iturbe 외의 검토. 7
때문에 고혈압의 개발에 면역 세포의 관련 되었다 분명, 모델 및 선박 및 면역 세포 간의 상호 작용을 공부 하는 기술을 필요한 되었다. 혈관의 Epifluorescence IVM vivo에서 순환 하는 혈액 세포와 내 피8,,910간의 상호작용을 관찰 하는 유용한 도구입니다. 이 기술로 염료 (acridine orange) 같은 dna intercalating의 주입 nucleated 세포 순환 뿐만 아니라 (endothelium에서)을 시각화할 수 있습니다. Ex vivo rhodamin-6 G와 격리 된 혈소판 스테인드 또는 dichlorofluorescein (DCF) 동맥 또는 정 맥 손상 모델에서 혈소판이 풍부한 혈전을 시각화를 주입 할 수 있습니다.
경 정 맥 카 테 터를 추적기를 삽입 하는 데 사용 하 또는 표시 하는 일반적으로, 혈소판. Endothelium의 변경 및 응고 캐스케이드의 후속 활성화 모두 monocyte 활성화에 효과를 알려져 있습니다. 내 피 부상 즉시 이끌어 낸다 혈소판 활성화 subendothelial 매트릭스 분자를 통해 이어지는 monocyte 매력 및 활성화11조직 인감. 그와 반대로, 그대로 피는 항 응 혈 약 속성 (예를 들어, 직물 요인 통로 억제 물 또는 thrombomodulin)12 과 직접 금지 monocyte, 예를 들면,의 분 비를 통해에 알려져 microRNAs13를 포함 하는 extracellular 소포. Monocytes 조직 요인, 특급 프로 테아 제-활성화 수용 체 (동위) 트 롬 빈에 의해 활성화 될 수 있다 monocyte 활성화14,15에에서 참여 하 고 응고 캐스케이드의 외부 활성 제를 생산 알려져 있습니다. . 따라서, 어떤 활성화 혈소판 또는 응고 캐스케이드 혈관 부상으로 인해 있을 수 있습니다 monocyte 활성화에 대 한 예기치 않은 효과 관찰된 현상 방해. IRG 유전자 변형 LysM Cre 유전자 변형 생쥐, 더블-형광 Cre 기자 마우스 (LysMCre+IRG+)의 도움으로, 우리는 LysM+ 에 카 테 터와 대안 방법으로 주사의 효과 자세히 연구 제안 동맥 고혈압16의 마우스 모델에서 myelomonocytic 셀.
Protocol
실험은 남성 쥐 나이에 라인 지방 팔 라틴 (승인 번호 23 177-07/G12-1-002 및 23 177-07/G15-1-051)에서 동물 실험 윤리 위원회의 승인 아래 오래 된 8 ~ 12 주에 실시 했다.
1. 마우스 마 취 및 수술 준비
- 수술 전에 좋은 건강 및 동물의 상태를 확인 합니다. 수술 전에 체중, 음식, 및 물 소비 (모양, 자세, 자연 스러운 행동) 그들의 일반적인 조건에 대 한 2-3 일 동안 하루에 한 번씩 동물을 모니터링 합니다.
- 준비 마스터 믹스 midazolam (5 mg/kg 체중), medetomidine (0.5 mg/kg 체중), 펜타닐 (0.05 mg/kg 몸 무게)와 마 취에 대 한 intraperitoneally (i.p.) 26 G 바늘 200 µ L/30 g 마우스 1 mL 주사기에 주입.
- 삼 투 펌프 주입 및 IVM 실험 동물 준비 플랫폼 온난화 39 ° c는 작업 필드에 수행 됩니다. 소독 목욕에 모든 도구를 소독 하 고 소독 온난화 플랫폼.
- 절차 동안 눈 연 고와 동물 눈을 보호 합니다. 삼 투 펌프 주입 전에 면도기와 모피를 제거 합니다. 제 모 크림, 면봉을 사용 하 여 년 및 jugular 카 테 테 르 주입 IVM 실험에서의 격리에 대 한. 2 피부 소독 제를 사용 하 여 동물의 피부를 소독: 한 살 균 및 살 균 제 povidone 요오드와 한을 포함 하 피부 살 균 포함 octenidine 알코올 기반 솔루션.
- 반대 flumazenil (0.01 mg/kgbody 중량), atipamezol (0.05 mg/kg 체중)와 마 취 ("antisedan") 믹스 마스터 믹스를 준비 하 고 피하 것 26 G 바늘 200 µ L/마우스 1 mL 주사기에 준비 (사우스 캐롤라이나) 주입.
2. 삼 투 펌프 준비 및 이식
참고: 삼 투 펌프를 사용 하 여 피하 AngII 주입 Lu 그 외 여러분 에 의해 상세히에서 기술 되었다 17
- 멸 균 식 염 수와 동결 건조 된 분말을 재구성 하 여는 AngII를 준비 하 고 농도 동물 무게와 펌프의 배달 속도 조정. 플라스틱 튜브 (유리 튜브를 사용 하지 마십시오.)에서 재구성 된 AngII를 유지.
- 7 일 동안 1 mg/(kg·d)를 제공 하는 AngII 솔루션으로 펌프를 채우십시오. 준비 후에, 펌프에서에서 계속 4-6 h에 대 한 살 균 염 분 최소 37 ° c.
- 후면 마 취 혼합의 사출 반사 발 고 따뜻한 작업 필드에는 마우스의 완벽 한 마 취를 테스트 합니다. 마 취 유도 10-15 분 소요 하 고 동물 어두운 환경에서 배치 하는 경우 더 잘 작동 합니다.
- 마우스 뒷면 하단을 면도 하 고 알콜 피부 살 균 소독.
- 가 위를 사용 하 여 척추에 수직인 1 cm 절 개를 확인 합니다. 해협 hemostat를 사용 하 여 펌프에 대 한 주머니를 만들고 펌프를 삽입 (먼저 사회자 흐름). 주머니 없는 압력 상처에 펌프의 자유 운동을 허용 해야 합니다.
- 염증; 제한 하기 위하여 하지 클립, 봉합와 상처를 닫습니다 그런 다음 피부 살 균 소독.
- Antisedan 믹스의 200 µ L의 사우스 캐롤라이나 주사로 마 취를 반대 하 고 그것의 감 금 소를 마우스를 반환 합니다.
- 수술 후 진통 buprenorphine와 수행 (0.075 m g/k g 사우스 캐롤라이나) 한 번 수술 후 및 동물의 행동에 따라 수요에.
3. jugular 카 테 테 르 주입 및 년 준비
- 마우스의 완벽 한 마 취 주입 마 취의 후면 음식 반사와 혼합 하 고 온도 유지 하 고 연 고를 두고 직장 프로브와 39 ° C에 수술 등 recumbence에서 마 취 동물을 배치 후 테스트 절차 동안 그들을 보호 하기 위해 눈입니다.
- 제 모 크림을 사용 하 여 목 머리카락을 제거 합니다. 면봉을 사용 하 여 확산 하 고 머리카락 밖으로을 시작 될 때까지 2 분 동안 크림을 문 지 르 세요. 추가 2 분 후 주걱으로 크림과 머리카락을 제거 하 고 알콜 피부 살 균으로 피부를 소독 합니다.
- 아래는 stereomicroscope 수술을 수행 합니다. 경도 목, 기관지 옆 1 cm에서 피부에 1-1.5 cm 긴 절 개를 확인 합니다. 첫 번째 절 두 사지에 수직으로 다른 두 절을 확인 합니다.
- 신중 하 게 피부 옆 조직 제거 하 고 피부 왼쪽된 경 정 맥 및 기도의 조각을 제거.
- 조심 스럽게 분리 귀 밑 샘; 2 곡선된 겸 자에 대 한 관심의 영역에서 설 하 고 submaxillary 땀 샘. 하지 절단 또는 동맥 손상, 경 정 맥에는 년 최고의 액세스할 수 있도록 그들 장소.
- 경 정 맥을, 얇은 집게를 사용 하 고 천천히 열고 주변 조직에서 혈관을 부드럽게 닫습니다. 일단 정 맥이 완전히 깨끗 한는 겸 그릇 아래 놓고 아래 각 10 cm의 2 개의 7-0 봉합을 배치.
- 두 개의 매듭을 가진 머리에 인접 봉합을 닫습니다. 다른 봉합에 한 매듭을 준비 하지만 그것을 닫지 마십시오.
- 잡고 한 손으로 집게와 37 ° C 살 균 염 분 가득한 테 (안쪽 직경, 0.61 m m 외부 직경 0.28 m m) 다른 한편으로는, 함께 하는 동안 얇은 위 또는 곡선된 26 G 바늘 그릇에 작은 절 개를 확인 합니다. 그런 다음 경 정 맥에 카 테 터를 삽입 하 고 두 번 매듭을 닫습니다. 완전 한 동원 정지를 위해 카 테 터를 통해 머리에 인접 봉합을 닫습니다.
- 격리 하 고 경 동맥을 준비, 얇은 곡선된 겸 자 사용 하 여 기관지를 덮고 영역 해 부.
- 일단 고 년 조직 주변에서 자유롭다, 선박에서 미주 신경 (흰색 라인은 경 동맥에 인접 한 모양)를 제거 (하지만 그것을 잘라 하지 않습니다). 얇은 포 셉 폐쇄 하 고 천천히 부드럽게 신경을 동원을 열 수 있습니다.
- 두 동맥은 완전히 깨끗 한, 일단 아래 첫 번째 경 동맥 겸 자 놓고 작은 블랙 3 m m x 폭 2.5 c m 길이 플라스틱 조각 그릇 아래에 배치 합니다. 그것은 매우 중요 한 선박을 overstretch 하지 고 혈액의 흐름은 선박 소유자 배치 되 면 존재 확인. 두 번째 동맥 선박 소유자를 놓습니다. 마우스는 현미경의 밑에 직접 배치 되지 않습니다, 기도에 땀 샘을 다시 넣어 고 37 ° C 살 균 염 분 지 대의 건조 방지를 적용.
4. 압 연 및 백혈구 준수 평가 / LysM + IVM와 세포
- -20 ° C에 저장 하는 2 mg/mL 재고 솔루션에서 오렌지 acridine 준비 하 고 그것에 게 1:4 1 mL 주사기에 멸 균 식 염 수 (최종 농도 0.5 mg/mL)에 희석.
- 다른 조건을 테스트: acridine jugular 테;와 오렌지의 (1) 주입 (2) 주입 acridine 오렌지 직접 꼬리 옆 정 맥 (이 조건으로 아무 jugular 테 이식 했다); (3) 측정 acridine 오렌지 형광 LysMCre+IRG+ 를 사용 하 여 마우스 (여기 다시 아무 jugular 테 이식 했다) 없이.
Representative Results
년 LysMCre++ IRG의 쥐 AngII 주입 IVM를 사용 하 여 관찰 했다. Acridine 오렌지 jugular 카 테 터를 사용 하 여 주입 했다. 우리가 모든 nucleated 순환 세포 (배와 상호 작용 하는 셀 형식의 차별 남아 오픈 이후 선박 상호 작용 또한 수에 비해 혈관 벽 접촉 LysM+ 세포의 비율을 보면 목적 우리의 이전 작품에서 질문)입니다. 기준선에 jugular 카 테 터의 존재는 LysM+ 세포 (그림 2A, D)의 접착을 발생합니다. 오렌지 acridine 주입 후 동일한 세포 형광, 되었지만 또한 내 피 세포 형광 (그림 2B, E). 내 피를 제한 하려면 배경 감소 관련 형광, 후 데이터 나타냅니다 모든 nucleated 고집 셀 LysM+ (그림 2C, F); 이러한 결과 우리의 이전 결과 확인 하 고 LysMCre++ IRG는 LysM+ 세포 활성화에 AngII의 효과 관찰 하기 좋은 모델을 보여주는 AngII 주입 후 사실 만요.
우리 평가 acridine LysM+ AngII LysMCre++IRG에에서 주입 후 세포 활성화에 오렌지의 관리 노선의 역할. AngII 주입, 백혈구 endothelium 상호 작용의 1 주 후 LysMCre++ IRG의 경 동맥에 마우스 몇 군데 있었고 jugular 카 테 터를 통해 또는 꼬리 정 맥을 통해 오렌지 acridine 주입 없이 IVM에 의해 시각. 카 테 터 나 주입, 없이 LysM+ 세포의 롤링 크게 증가 되었다 AngII 주입 치료 쥐 및 접착에 비해 증가 (그림 3)를 보여준 후. Acridine jugular 테 증가 접착 및 AngII에서 오렌지의 주사 카 테 터 (그림 3) 없이 쥐와 비교 된 더 큰 정도로 쥐 취급. 과 비슷한 접착 acridine 꼬리 정 맥에 주황색의 사출 리드 acridine 오렌지 (그림 3)의 주입에는 영향을 받지 않은 쥐에 비해 압 연.
그림 1입니다. Angiotensin II 주입 및 LysM+ 의 평가 제도 압 연 및 쥐에 접착 세포. LysMCre++ IRG 마우스 AngII 7 일 주입 했다 하 고는 년 동안 셀 acridine jugular 카 테 터를 통해 또는 꼬리 정 맥에 의해 오렌지의 주입 없이 계량 했다 준수로 LysM+ 압 연 사출입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. LysM+ 세포 접착 및 IRG+ 마우스 LysMCre+의 경 동맥에서 압 연의 평가. 접착의 LysM+ LysMCre+(A, D) 전에 IRG+ 마우스 세포 (B, E) acridine 주입 jugular 카 테 터를 통해 후. 빨간색과 녹색 형광 기록 했다, (녹색)에서 LysM+ 세포 및 평활 근 세포 (빨간색)으로 표시 했다. Acridine 오렌지의 주입, 후 내 피 세포도 그린에서 볼 수 있지만 셀 시각화 (C, F) nucleated만 순환 수 배경 형광을 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. Angiotensin II에에서 형광 염료의 관리 노선 평가 LysMCre+IRG+ 쥐를 주입. 압 연 (A)와 (B) LysM+ 준수의 정량화 세포 가짜 운영 또는 AngII 생긴 동물 및 또는 없이 acridine 오렌지 jugular 카 테 터를 사용 하 여 또는 꼬리 정 맥 주입 하 여 주입. 다른 조건 (C)의 대표 사진. 결과 평균 ± 표준 오차의 의미. 2-방법은 ANOVA 수행한 Bonferroni의 임시 게시물 테스트, n = 3-12/그룹; p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
LysM+ monocytes 이전 고혈압5의 개발에 연루를 표시 했다. 여기 우리가 LysM+ 면역 세포 롤 및 내 피 레이어 AngII 주입에 대 한 응답에서을 보여줍니다. 이 LysMCre+IRG+ 를 사용 하 여 얻은 acridine 오렌지6,10의 주입으로 백혈구를 시각화 하 여 비보에 고혈압에 면역 세포의 역할을 탐구 하는 우리의 이전 연구에서 생쥐. 따라서, 준수 하는 내 피 세포 유형의 차별 수 없었습니다.
IVM 혈관 연구 그리고 vivo에서 , 맥 관 구조에 직접 셀의 관찰에 대 한 매우 유용한 도구입니다 하지만 고혈압의 염증 성 맥락에서 수술로 삽입 된 카 테 터의 도움으로 염료를 주입의 영향 알 수 없는 남아 있습니다. 카 테 터와 acridine 오렌지의 잠재적 효과 평가 하기 위해 주입 우리 이용 했다 LysMCre++ IRG 쥐. AngII 주입 증가 수 있는 피에 LysM+ 세포의. 경 정 맥에 카 테 터의 삽입 효과 증폭 하 고 더 롤링 하 고 붙는 백혈구 테 임 플 란 트 없이 마우스에 비해 카 테 터와 기구 AngII-주입 마우스에서 발견 되었습니다. 이 이식 조직의 염증 반응의 맥락에서 상처 고혈압18에서 면역 반응으로 오버레이 치유 경 카 테 터 원인의 나타냅니다. 또한, 경 동맥을 경 정 맥의 근접 때문 추가 면역 활성화 수 생겼다 경 정 맥에 영향을 미치는 여. 이 효과 없는 꼬리 정 맥에 직접 주사 되었다 때, 이후 우리 효과 예정 이었습니다 추측할 수 있는 염료에 아닙니다 그러나 카 테 터를 삽입 하는 절차. 우리 여기 실험 동안 vivo에서 프로세스와 방해 하지에 형광 단백질을 표현 하는 유전자 변형 기자 마우스의 중요성을 설명 했다. 또한, 형광 추적기의 꼬리 정 맥 주입 jugular 테 주사 가능한 대안을 수 있습니다.
절차의 하나의 중요 한 단계는 AngII 주입 이다. 혈압의 꼬리 팔목 평가 펌프 AngII 전달의 효과 제어 하기 위해 만들 수 있습니다. 주입의 2−3 일 후 혈압 증가 한다. 제한 하려면 LysM+ 세포 활성화에 영향을 미칠 수 있는 염증, 펌프는 이식 절 개의 폐쇄 클립 대신 봉합 여야 한다. 꼬리 정 맥 주입에 대 한 한 가지 한계를 지적 한다: 각 경 최고의 가능한 데이터 수집을 하려면 4 동영상 촬영 일반적으로. 형광 신호 감소, acridine 오렌지의 50 µ L 주입 하지만 꼬리 주사로 더 어렵습니다 여러 주사는 년 현미경 목표 아래 안정적으로 유지 하 고. 경 정 맥에 카 테 터의 존재의 기간 때문에 혈소판이 풍부한 혈장 카 테 테 르 주입19후 4 h 준비에 응고 활성화에 영향을 미치는 면역 세포 활성화를 조절 또한 수도 있습니다. 카 테 테 르 주입의이 부분 추가 조사가 필요합니다.
마지막으로, 우리가 감사 jugular 카 테 테 르 주입 AngII 주입 후 LysM+ 세포 활성화에 미치는 영향, 경우에 우리 수 없습니다 완전히 견적 준비, 피부 제거, 및 잠재적인 LysM+ 셀에 경 격리의 역할 활성화입니다. 우리는 그 형광 기자 마우스를 사용 하 여 같은 결론 LysMCre++ IRG 마우스 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 동물 준비 중 선박 무결성의 혼란을 피하기 위해 좋습니다.
Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
이 작품은 교육과 연구 (BMBF 01EO1003 및 BMBF 01EO1503)에 대 한 독일 정부에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH | Anesthesia mix | |
| Medetomidine | Pfizer Deutschland GmbH | Anesthesia mix | |
| Fentanyl | Janssen-Cilag GmbH | Anesthesia mix | |
| Alzane | Zoetis | Antisedan mix | |
| Flumazenil | Hikma pharma | Antisedan mix | |
| Braunol | B Braun | ||
| Octeniderm | Schülke | ||
| Osmotic pumps | Alzet | 1007D | Osmotic pump implantation |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | Osmotic pump implantation | |
| 7-0 prolene suture | Ethicon | Osmotic pump implantation | |
| Acridine orange | Sigma-Aldrich | ||
| Catheter | Smiths Medical Deutschland GmbH | Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm | |
| Microscope | Olympus | BX51WI fluorescence microscope | |
| Beam Splitter | Photometrics | CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager | |
| Objective | Olympus | UMPLFLN10X | Water immersion objective with a monochromator |
| Camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
| Image acquisition and analysis software | Olympus | Realtime Imaging System eXcellence RT | |
| Mice | The Jackson Laboratory | Jax 008705 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J |
| Mice | The Jackson Laboratory | Jax 004781 | LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J ) |
References
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