Summary
هنا توضح لنا كيف جزيء واحد التعريب تنشيط صور مجهرية يمكن الاضطلاع على المحطة الطرفية الأعصاب الحركية ليعيش melanogaster المورفولوجية الثالثة instar اليرقة.
Abstract
عدد متزايد من تقنيات مجهرية فائقة القرار تساعد على الكشف عن الآليات التي تحكم العالم النانوي الخلوي. تصوير جزيء واحد تكتسب زخما لأنه يوفر الوصول الاستثنائي إلى تصور الجزيئات الفردية في الخلايا الحية. هنا، يمكننا وصف أسلوب الذي قمنا بتطوير أداء تتبع الجسيمات أحادية المنشط صور التعريب مجهرية (سبتبالم) في اليرقات المورفولوجية . الاتصالات متشابك يعتمد على البروتينات بريسينابتيك الرئيسية التي تعمل بالارساء، فتيلة، وتعزيز الانصهار التي تحتوي على ناقل عصبي حويصلات مع غشاء البلازما. مجموعة من تفاعلات البروتين البروتين والدهن البروتين محكم ينظم هذه العمليات والبروتينات بريسينابتيك ولذلك يحمل تغييرات في الحركة المرتبطة بكل من هذه الأحداث الرئيسية. التحقيق في كيفية التنقل من هذه البروتينات يرتبط بوظيفتها الفسيولوجية في الحيوانات حية سليمة أمر ضروري لفهم هذه الآلية الدقيقة للعمل. استخراج البروتين التنقل مع دقة عالية في فيفو يتطلب التغلب على قيود مثل الشفافية الضوئية، وإمكانية الوصول، وعمق الاختراق. يصف لنا كيف instar البروتينات الفلورية فوتوكونفيرتيبلي معلم للبروتين بريسينابتيك سينتاكسين-1A يمكن تصور عبر الإضاءة المائلة طفيف وتعقبها في المحطة الطرفية الأعصاب الحركية أو على طول إكسون العصبون الثالثة المورفولوجية يرقة.
Introduction
الاتصالات العصبية تعتمد على إطلاق سراح العصبي، الذي يحدث من خلال التنظيم الانصهار التي تحتوي على ناقل عصبي حويصلات متشابك مع غشاء البلازما1. هذه العملية تسمى الرقابة2،،من34،،من56 ديناميكية للغاية ويمكن أن تنظم أعلى أو أسفل وفقا للتقلبات في معدل التحفيز7. البروتينات المشاركة في هذه العمليات تخضع البراونية، وعرض ذلك نانومترى منظمة قادرة على الحفاظ على طائفة من ربط الإجراءات التي ترتكز عليها هذه الوظائف الفسيولوجية. بروتينات الغشاء البلازما ديناميكية للغاية، السماح بالتراكب الجانبي الجزيئات في nanoclusters على غشاء البلازما7،،من89،10،11، 12. على هذا النحو، التحقيق في التنقل من هذه البروتينات تساعد على توضيح طريقة العمل8. البروتينات متشابك مثل قابل للذوبان اثيلماليميدي ن العوامل الحساسة مرفق البروتين مستقبلات (الافخاخ)، على سبيل المثال سينتاكسين-1A، من المعروف الآن أن يحمل التنقل الأفقي السريع، فضلا عن الوحشي الملائمة داخل nanoclusters التي قد تخدم الجزيئية مستودعات ومواقع لحويصلة الانصهار9،13،،من1415.
التطور الأخير للبروتينات الفلورية فوتوكونفيرتيبلي، مثل أحادي (m) ايوس16،17 و18من كايد، سمح القرار نانومترى البروتينات غشاء البلازما الخلايا العصبية عن طريق استخدام نهج هذه كالتعريب تنشيط صور مجهرية (النخيل) والتعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)14،،من1519. وقد مكنت هذه التطورات التحقيقات في التنقل ونانوكلوستيرينج من البروتينات البيولوجية في استزراع الخلايا الحية والخلايا العصبية. في الآونة الأخيرة، وقد أجريت دراسات توضيح (بدقة عالية مماثلة) ديناميات وتنظيم هذه البروتينات الغشاء في الخلايا العصبية للكائنات الحية سليمة مثل موس موسكولوس، ايليجانس كاينورهابديتيس، و Melanogaster المورفولوجية14،20،،من2122.
التحقيق لمنظمة البروتين في الجسم الحي وديناميات يتطلب ليس فقط استخدام أدوات التصوير المتقدمة مؤخرا القرار فائقة (مثل النخيل، والعواصف، وفوتوكونفيرتيبلي فلوروفوريس)، ولكن أيضا القدرة على التغلب على العوائق مثل هذه كإمكانية الحصول على البروتين، وعمق تغلغل الليزر التصوير. التصوير البروتينات داخل الخلية في حيوان سليمة أصلاً صعبة كما التصوير البروتينات في هياكل مضمن عميقة داخل الأنسجة الحية للحيوان سليمة، مثل الحصين الماوس سليمة. ومن ثم فهي أكثر سهولة تصويرها البروتينات في أو بالقرب من سطح الأنسجة. وهناك صعوبة أخرى مع التصوير في فيفو ضمان إمكانية تكرار نتائج عبر الحيوانات. كما التشريح قد تختلف عن عينة واحدة إلى أخرى، تحديد هيكل بسهولة من النسخ المتماثل في مختلف العينات الحيوانية سليمة يمكن أن يكون أيضا تحديا. استخدام الهياكل النمطية، مثل synapses، والمساعدة في التغلب على بعض هذه الصعوبات.
الدراسات التي أجريت مؤخرا قد تصويرها التنقل البروتين في الحيوانات مع البشرة شفافة بصريا مثل ايليجانس كاينورهابديتيس22، بينما التحقيقات الأخرى يكون تصويرها المنظمة البروتين على السطح النسيج/الجهاز، على سبيل المثال تصوير أكتين في الخلايا العصبية القشرية عن طريق الجمجمة الماوس يعيش21. وفي بعض الحالات، استخدمت المسكنات لإبقاء الحيوان متحرك؛ ومع ذلك، المسكنات محددة قد تؤثر سلبا على بروتين الفائدة. ولذلك ينبغي استكشاف وسائل بديلة للحفاظ على الحيوانات غير متحرك خلال في فيفو تصوير للتقليل من الأخطاء.
تحذير آخر للقرار فائقة التصوير في فيفو هو أن الليزر المستخدمة لإلقاء الضوء على بروتينات الفائدة يمكن أن تؤثر سلبا على الأنسجة المحيطة، ويوصي بحفظ ومن ثم شدة الإثارة منخفضة قدر الإمكان. إضاءة الأنسجة المحيطة بالليزر يميل أيضا إلى زيادة الإشارات الخلفية. استخدام الإثارة منخفض الكثافة يساعد في الحد من الخلفية، والتحذير بأنه يمكن أن يؤدي أيضا إلى انخفاض في العائد فوتون بروتين فلوري. الطرح الخلفية أثناء التحليل يمكن أن تستخدم كوسيلة بديلة لتقليل الإشارات الخلفية قبل تحليل الصور.
المورفولوجية يعرض الكائن حي مثالي للتصوير في فيفو كما أنه يوفر الأدوات الوراثية الراسخة لتحقيق وظيفة البروتين محددة. تسلسل تفعيل المنبع (UAS)-Gal4 نظام يتيح التعبير الزماني والمكاني للبروتينات، وذلك يمكن استخدامها للتعامل مع23من كبيرة، حيث أن التحفيز الحراري الجينية المورفولوجية عابر باستخدام الأسرة الفرعية المحتملة مستقبلات A1 (dTRPA1)24 أو علم البصريات الوراثية التحفيز باستخدام كشريمسون فر تحول ريد25 يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع التصوير14. أننا تغلبنا على العديد من المضاعفات الناجمة عن أداء في فيفو تصوير جزيء وحيدة في هذا النظام والآن تصف كيف يمكن القيام تتبع الجسيمات أحادية في يرقات الطور الثالث melanogaster المورفولوجية .
Protocol
1-تصميم المعدلة وراثيا المورفولوجية معربا عن البروتينات معلم mEos2
- حدد البروتين يكون معلم مع البروتين mEos2. لزيادة معدل النجاح في التصوير، حدد البروتينات مع مجال ترانسميمبراني في غشاء البلازما الخلايا العصبية14 (مثلاً، سينتاكسين-1A)، البروتينات على حويصلات متشابك أو أوتوفاجوسوميس26،27 (مثلاً، Synaptobrevin-2)، أو بروتينات سيتوسوليك مع التفاعل الوثيق مع بروتينات غشاء البلازما الخلايا العصبية (مثلاً، Munc18-1).
- بناء المتسلسلات ترميز البروتين معلم mEos2 (الشكل 1). تصميم الإشعال إلى الأمام وعكس للبروتين و mEos2.
ملاحظة: يمكن تضخيمه تسلسل الترميز mEos2 من بلازميد pmEos2-N1، الذي صمم للصمامات إلى ج-محطة بروتين الفائدة. الاستنساخ على سبيل المثال يمكن أن يقوم بها في فيفو جزئ في Saccharomyces cerevisiae في pFL44S باستخدام-أتتب-الإشراف-w + ناقلات28من14،، وبدلاً من ذلك يمكن استخدام أساليب الاستنساخ لأغراض أخرى مثل جيبسون بروتوكول الجمعية29.- لينيريزي ناقلات مع بامهي وإكسباي وتحويل شارك في ura3- خلايا الخميرة جنبا إلى جنب مع شظايا PCR ترميز mEos2 والبروتين من الفائدة. حقن الأجنة المورفولوجية البناء لإنشاء خط الطيران المعدلة وراثيا30.
- الخلفية ثقافات يطير المحورة وراثيا على القياسية المتوسطة الخميرة ودبس السكر أو بعض بديل مناسب الأخرى الواردة في قارورة من البلاستيك. لضمان boutons متشابك صحية وإلى حد كبير31، تجنب الذباب الاكتظاظ في القنينات، والوجه الذباب على قارورة جديدة بعد كل يوم من وضع البيض؛ وهذا ما يضمن يرقات الطور الثالث هي تغذية جيدة والوصول إلى الحجم المناسب بحلول الوقت الذي تبدأ تجول في المتوسط. رفع الطاير المعدلة وراثيا في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية).
ملاحظة: boutons متشابك أكبر تميل لإنتاج كمية أكبر من البروتينات تصور أثناء التصوير.
2-تشريح ليرقة الطور الثالث
- جعل من دي تو زيرو قاعدة بولي على شكل أسطواني أو سيميسيليندريكال دايمثيل سيلوكسان (PDMS) ملم في القطر ودي تو زيرو مم في الارتفاع باستخدام مجموعة الاستومر سيليكون مناسبة (الشكل 2A). مزيج سيليكون الاستومر مع سيليكون تصلب عامل بنسبة 10:1.
- يحرك الخليط جيدا لأدنى 5 صب الخليط في قالب مع ديمسينسيونس المذكورة أعلاه. وليكن تتصلب في فرن عند 100 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. قاعدة PDMS سيكون بمثابة الأساس لإجراء تشريح. ضمان قاعدة PDMS تناسبها في بئر طبق الثقافة زجاجية.
- حدد تجول يرقة الطور ثالث من الجدار قنينة. استخدام ستيريو-مجهر بصرية التكبير 4.5 لتصور اليرقة وضعها على قاعدة أسطوانية PDMS مع الجانب الظهرية يصل.
- استخدام منحنى والزاوية ملاقط التمسك دبابيس مينوتين على رأسه على خطاطيف الفم، بين البلدين توسيع spiracles الأمامي، وفي الذيل عبر فتحه الشرج، بين spiracles الخلفية اثنين. إضافة 40 ميليلتر من متوسط حشرة شنايدر في درجة حرارة الغرفة على اليرقة المعطل تداولها.
ملاحظة: كما يمكن استخدام حلول مثل هيموليف (HL3 أو HL6) مكان شنايدر الحل32،33. - توفير الوصول عن طريق الجهة الظهرية من الجسم جدار البطن اليرقة باستخدام دبوس مينوتين جداً في خط الوسط للجدار.
- فتح استخدام الربيع مقص قص الجدار الجسم من نقطة شق. قص على طول خط الوسط في الاتجاه الأمامي الخلفي34.
- استخدام الملقط غرامة والربيع المقص الأحشاء اليرقة: إزالة الأعضاء الداخلية بما في ذلك الغدد اللعابية والقصبة الهوائية والأمعاء. أغسل اليرقة مرتين مع متوسط حشرة شنايدر.
- مع الملقط غرامة، عقد اللوحات جدار الجسم اثنين بلطف تمتد بها وعصا دبابيس مينوتين اثنين على كل جانب. ينبغي أن يؤدي هذا إعداد على شكل مسدس (الشكل 2A).
- فصل الدماغ من الحبل البطني العصب باستخدام مقص الربيع لتقليل إمكانية حركة العضلات أثناء التصوير؛ هذا يعمل أيضا على عقد الإعداد شقة ضد الطبق التصوير. استخدام الملقط منحنى لدفع كل ستة دبابيس مينوتين إلى قاعدة PDMS.
ملاحظة: ينبغي تضمين سوى جزء صغير من الدبابيس داخل جدار البطن. - للتأكد من أن اليرقة قد نجا من عملية التشريح، الوخزة طفيفة على الحبل البطني العصب، وهذا ينبغي أن تحظى تحوي انكماش اليرقة جدار البطن.
3-قليلاً منحرف إضاءة مجهرية تتبع الجسيمات أحادية
- عكس قاعدة PDMS اليرقة تشريح على طبق ثقافة زجاجية. ملء الطبق التصوير مع 2 مل من الحشرات المتوسطة درجة حرارة الغرفة شنايدر (الشكل 2).
- تحديد الخلايا العصبية الحركية في الجزء الثاني والثالث مع نقاط الاشتباك العصبي في عضلات البطن 6 و 735 استخدام 63 x/1.2 غ الماء الغمر الهدف في مجهر فلوري انعكاس داخلية مجموع الأسفار (TIRF).
- استخدم العدسات المجهر لتحديد موقع اليرقة تشريح؛ تحديد العضلات 6 باستخدام الإضاءة الحقل مشرق.
- استخدام برنامج اقتناء مجهر (انظر الجدول للمواد)، في تكوين TIRF؛ الشريحة زاوية الكاميرا صيد تلسكوب لدرجة 1 لزيادة عمق الاختراق، وإلا الخروج من زاوية حرجة TIRF لتحقيق الإضاءة المائلة.
- التبديل 488 نانومتر الليزر لتصور mEos2 باللون الأخضر. استخدام ليزر منخفض طاقة (أقل من 5 في المائة 22.8 ميغاواط) لتجنب تبيض الفلورية الخضراء. موقع الوصلات العصبية العضلية (التي تبدو وكأنها الخرز على سلسلة) والحصول على صورة TIRF دقة منخفضة.
- التبديل في نفس الوقت على 405 نانومتر الليزر (mEos2 فوتوكونفيرتس من اللون الأخضر للأنواع الحمراء) والليزر نانومتر 561 (صورة mEos2 فوتوكونفيرتيد الأحمر) لتعريب ستوتشاستيكالي البروتينات الفلورية mEos2 واحد.
ملاحظة: يوصي باستخدام طاقة الليزر منخفضة في شمال البحر الأبيض المتوسط 405 (0.005 إلى 0.9 في المائة 4.78 ميغاواط) كما يسمح هذا لمعدل فوتوكونفيرسيون ثابتاً نسبيا خلال اقتناء الفيلم. استخدام بين 50 و 75% من الليزر نانومتر 561 (20.1 ميغاواط)، حيث أن هذا يكفي للحصول على الأسفار من الأنواع الحمراء mEos2 دون أن يؤثر ذلك سلبا على مورفولوجية الأنسجة العضلية المحيطة بالوصلات العصبية العضلية. - لكل سلسلة الوصلات العصبية العضلية، والحصول على وقت سلسلة تتألف من إطارات 15,000 أو أكثر في 33 هرتز. حفظ تنسيق as.czi حفاظا على البيانات الفوقية المرافقة ليمكن الرجوع إليها.
- استخدام إيماجيج لتحويل ملفات الفيلم '.czi' إلى '.tiff' الملفات.
- تحليل الأفلام المكتسبة مع جزيء وحيدة مناسبة تتبع البرامج التحليلية11،،من1436 مثل تراكماتي في فيجي/إيماجيج37 (انظر الجدول للمواد). يحدد موقع 'x' و 'نعم' إحداثيات كل التعريب التي تناسب غاوسي نقطة كثافة انتشار الدالة (PSF).
ملاحظة: استكشاف الأخطاء وإصلاحها: إذا لم يلاحظ الفلورية الخضراء أو قاتمة جداً في الوصلات العصبية العضلية عند التعرض إلى 488 نانومتر الليزر، التبديل بإيجاز في فوتوكونفيرتينج وتصوير أشعة الليزر (405 نانومتر و 561 نيوتن متر)، كما أن هذا يساعد على إنتاج المزيد من الأحمر الأنواع من mEos2. قم بالتبديل إلى 488 نانومتر الليزر وتأخذ صورة TIRF.
4-واحد جزيء التعريب في اليرقات الثابتة
- لقياس حجم نانوكلوستير البروتين عن طريق النخيل، يحل محل الحشرات المتوسطة شنايدر بعد تشريح مع مثبت-بارافورمالدهيد 4% المخفف في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- احتضان اليرقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة دبابيس التشريح واليرقه الثابتة في مل 1.7 مسح أنبوب ميكروسينتريفوجي قفل المفاجئة.
- تشريح وإصلاحها كما العديد من يرقات أخرى حسب الحاجة، ثم غسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- استبدال برنامج تلفزيوني مع كتلة المخزن المؤقت (حل لبرنامج تلفزيوني، 0.1% X-100 تريتون، و 3% من مصل الماعز العادي).
- أغسل اليرقات مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات، ثم احتضان مع جسم الأولية اللازمة (مخففة في حل كتلة المخزن المؤقت).
- تبني بين عشية وضحاها في 4 ياجيم
- أغسل اليرقات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، ثم احتضان مع جسم الثانوية اللازمة (مخففة في حل كتلة المخزن المؤقت).
- أغسل اليرقات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، قم بإرفاق اليرقة مرة أخرى على قاعدة PDMS، والصورة كما تم وصفه سابقا لتعقب جزيء واحد.
Representative Results
استخدام البروتوكول المعدلة وراثيا المدرجة أعلاه، سينتاكسين--1A--mEos2 دروسوفيلاميلانوجاستير وقد تم إنشاؤها (الشكل 1). المعدلة وراثيا وثالثاً instar المورفولوجية تم تشريح اليرقات على قاعدة أسطوانية PDMS (الشكل 2A-F). تصور الجزيئات واحدة من سينتاكسين-1A، استخدمنا النخيل في مجهر TIRF مع إضاءة الليزر منحرف قليلاً14.
تم تعقب الجزيئات واحدة من سينتاكسين-1A على المحطات presynaptic الأعصاب الحركية في العضلات 6 الجزء الثاني المتعلق بالبطن. يمكن أن يتم الكشف عن الفلورية الخضراء من mEos2 كما هو موضح بالصورة ذات الدقة المنخفضة من سينتاكسين--1A--mEos2 على النوع 1b boutons عندما متحمس باستخدام الليزر 488 نانومتر (الشكل 3A). في تجارب التصوير، 405 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط 561 الإثارة الليزر تصوير أعماق كانت 133.5 نانومتر و 165.6 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي. تم اقتناء الصورة الخضراء كمتوسط 16 الإطارات الفردية. واستخدمت هذه الصورة الخضراء لإنشاء المنطقة للفائدة التي تستخدم للحد من تحليل لتعريب في الفيلم فوتوكونفيرتيد للمحطات الطرفية الأعصاب presynaptic السيارات وحدها.
تحليل الأفلام سبتبالم فوتوكونفيرتيد المكتسبة المتولدة كثافة فائقة حلها، معامل الانتشار، وخرائط مسار (الشكل 3A). كذلك كان كمياً التنقل سينتاكسين--1A--mEos2 بتحليل لمتوسط مربع تشريد (MSD) المسارات الفردية (الشكل 3B). مقارنات إحصائية يمكن أن يتم استخدام المنطقة تحت المنحنى MSD (الشكل 3B). المزيد من التحليل للتنقل غلة توزيع معامل نشر سينتاكسين--1A--mEos2، وهذا يمكن تقييمها إحصائيا بالمقارنة للهاتف النقال إلى السكان غير متحركة (الشكل 3).
الشكل 1 : إنشاء بنيات معلم mEos2. PFL44S-أتتب-الإشراف-w + ناقلات هو خطيا مع بامهي وإكسباي. الأجزاء المتداخلة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ترميز بروتين الاهتمام (POI) و mEos2، على التوالي، يمكن استنساخ، على سبيل المثال، في فيفو جزئ في ura3- خلايا الخميرة أو الجمعية جيبسون. ملاحظة أننا المستنسخة لتوليد التحوير سينتاكسين--1A--mEos2، في بناء محاط بتسلسل منظم والمنهي سينتاكسين-1A الذاتية. يمكن بعد ذلك حقن بناء الناتجة عن الأجنة المورفولوجية لإنشاء خط الطيران المعدلة وراثيا معربا عن بروتين الاهتمام (POI) تنصهر فيها mEos2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : المورفولوجية يرقة تسلخ والإضاءة المائلة. (أ) مخطط عرض المورفولوجية يرقة تسلخ تجري على قاعدة PDMS نصف أسطواني. يرقة شرائح قد احتفظوا PDMS هلام باستخدام دبابيس مينوتين. (ب-ج) وضعت الإعدادية PDMS اليرقة داخل طبق ثقافة زجاجية تحتوي على متوسط حشرة شنايدر. استخدمت مجهر TIRF في تكوين إضاءة منحرف قليلاً تصور سينتاكسين--1A--mEos2 في المحطات الطرفية الأعصاب الحركية. (د-F) قاعدة PDMS نصف أسطواني مع تشريح المورفولوجية اليرقة. إعداد يرقة-PDMS وضعت في طبق تصوير مليئة المتوسطة شنايدر، واليرقه تم تصويرها في المجهر النخيل القرار فائقة. مقياس بار، 10 مم-(تم تعديل هذا الرقم من14). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : في فيفو تتبع من mEos2-سينتاكسين-1A في الأعصاب الحركية presynaptic المحطة الطرفية. (A) A منخفضة الدقة TIRF صورة سينتاكسين--1A--mEos2 على نوع 1b موتور الأعصاب طرفية. تحليل لأفلام فوتوكونفيرسيون تصويرها في 33 هرتز ولدت سبتبالم حل فائقة الكثافة ومعامل نشر، ومسار الخرائط. وكانت المسارات الفردية 5,309 المصورة اقتناء الفيلم إطارات أكثر 16,000. مقياس بار، 3 ميكرومتر. (ب-ج) كان رسم ساحة يعني تشريد (MSD) سينتاكسين--1A--mEos2 من 6 محطات الأعصاب الحركية المختلفة؛ استخدمت المنطقة تحت منحنى MSD (AUC) لقياس مستوى التنقل. ويكشف توزيع معامل نشر متحركة وغير متحركة من السكان سينتاكسين-1A التي يمكن قياسها كمياً كنسب من بعضها البعض؛ تم الحصول على متوسط مسارات ~ 2,400 كل السيارات الأعصاب الطرفية (n = 3 اليرقات). البيانات المعروضة كمتوسط الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
ويصف هذا البروتوكول تتبع جزيء واحد من البروتينات معلم mEos2 عند تقاطع العضلية اليرقة الطور الثالث المورفولوجية . لتجنب التعبير المفرط للبروتين المحورة وراثيا، كان يقودها التعبير سينتاكسين-1A-mEos2 الذاتية سينتاكسين-1A المروج. الدراسات المتعلقة بالتنقل البروتين متشابك معظمها كانت محدودة للتحقيقات في المختبر من استزراع الخلايا والخلايا العصبية القشرية9،11،،من1213. ما إذا كانت هذه البروتينات يحمل تواقيع التنقل مماثلة في الحيوانات حية غير معروف إلى حد كبير. تصور التنقل البروتين وحيد في فيفو، لها قيود مثل العمق الضوئي الشفافية، وإمكانية الوصول، وتغلغل يتعين التغلب عليها. تشريح إعداد اليرقات وتصور الوصلات العصبية العضلية مضمن على سطح العضلات، علينا أن نتجنب مسألة الشفافية الضوئية وسهولة الوصول إليها. باءت بالفشل محاولات صورة جزيء واحد التنقل في التكوين TIRF العادية. ومع ذلك، يتيح استخدام الإضاءة منحرف قليلاً لزيادة الإثارة الليزر اختراق العمق. وعلاوة على ذلك، ساعد مينوتين دبابيس تستخدم لشل اليرقة لتجنب أي أثر سلبي ممكن استعمال مخدر على التنقل البروتين. من الممكن استخدام أعلى التكبير الأهداف، مثل 100 × أهداف الغمر النفط، إلى تصور جزيئات مفردة في فيفو. ومع ذلك، قد يزيد التكبير زيادة حدوث الانجرافات خارج التركيز. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا وتستخدم كثافة أقل (~ 30%) 561 نانومتر الليزر بنجاح إلى جزيئات صورة واحدة في محطات الأعصاب الحركية. قد يلزم إجراء اختبارات إضافية لاستخدام طاقة الليزر أقل.
هذا البروتوكول مناسبة لتصور تنقل البروتينات متشابك داخل بقرب غشاء البلازما الخلايا العصبية. باستخدام هذا النهج، كانت تنقل البروتين الفخ-سينتاكسين-1A وأوتوفاجوسومي ملزمة البروتين Atg18a-14،بنجاح المصورة فيفو في26. تنقل البروتينات في الخلايا العصبية الحركية ويمكن أيضا أن تكون محاور عصبية التحقيق27. ومع ذلك، قد يصعب التحقيق في تنقل البروتينات في الدماغ أو الحبل البطني العصب لتقييم سبب إشارة خلفية عالية تنتجها الأنسجة الكامنة؛ وباﻹضافة إلى ذلك، تصور التنقل البروتين في نفس بنية الدماغ سوف يتطلب فلوريسسينتلي علامات بنية الدماغ (لضمان قابليتها للتكرار)، ويتطلب الاستخدام المزدوج-كاميرا التصوير.
الأساليب الحالية المتاحة للفحص المجهري القرار فائقة في المورفولوجية معظمها يقتصر على تصوير الأجنة، بدلاً من الأكثر نمواً يرقة الطور الثالث38،39. المشكلة الرئيسية مع هذه البروتوكولات هو أنها تسفر عن عدد قليل من المسارات في منطقة تصويرها، وبالتالي الحيلولة دون إجراء تحليل متعمق لتنقل الدول22،40. لدينا في فيفو جزيء واحد تتبع بروتوكول لديه القدرة على توليد عدد كبير من المسارات، ولذلك يمكن أن تستخدم في نماذج حيوانية أخرى مثل كاينورهابيديتيس ايليجانس والزرد. وفي الواقع، ولدت كل سلسلة NMJ مسارات ~ 2,400 يجعلها مناسبة لتحليل مختلف الدول المتنقلة والتحولات بين هذه الدول14،27. بالإضافة إلى ذلك، في فيفو جزيء واحد التصوير استراتيجيات كثيرة تعتمد على استخدام المسكنات شل الحيوانات20،22، الذي قد يغير الوظيفة الفسيولوجية التي يتم التصوير. هنا نحن الأمثل على بروتوكول 'خالية من التخدير' لشل اليرقات باستخدام دبابيس مينوتين.
قد يكون احتمال استخدام هذا البروتوكول لتصور تنقل البروتينات في ثلاثة أبعاد. التقدم الذي أحرز مؤخرا في مجهرية فائقة القرار السماح بالتنقل البروتين تصور في المختبر في 'x'، 'نعم'، و 'z' أبعاد41،42. غير حساب أسلوبنا الحالي لتنقل البروتينات في محور 'z'. بعد المورفولوجية موتور الأعصاب الطرفية هيكل كروي وسيكون نهج مستقبل قيماً تحديد كمية البروتين التنقل في حجم ثلاثي الأبعاد43. من الممكن تصوير في z-البعد باستخدام عدسة أستيجماتيك. بدلاً من ذلك، في وضع TIRF44،45، كما يتم زيادة z-القرار. ومع ذلك، في تجاربنا، استخدمنا الإضاءة منحرف قليلاً تصور الجزيئات واحدة من syntaxin1A-mEos2 دون عدسة أستيجماتيك.
وفي الختام، معلم توافر كلا المعدلة وراثيا المورفولوجية ذبابة الأوراق المالية معربا عن البروتينات مع بروتين فوتوكونفيرتيبلي، PDMS قاعدة تشريح اليرقة المحورة وراثيا، فضلا عن مجهر TIRF مزودة بإمكانية تغيير زاوية الإضاءة هي أهم الأدوات اللازمة لتصور البروتينات واحد كما هو موضح في هذا البروتوكول.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر سبارتا جان-باتيست وشوكت دانيال (المعهد، يزار التابع لجامعة بوردو) على دعمهم الكريم مع تحليل جزيء واحد. ونشكر خصوصا بالماس نك وجيسيكا مكجاو (QBI، جامعة كوينز لاند) لمساعدتهم مع الفيديو تسجيل التعليق الصوتي، فضلا عن الشكل تصميم الرسوم البيانية. هذا العمل كان يدعمها المشروع اكتشاف مجلس البحوث الأسترالية (ع) (DP170100125 إلى F.A.M.)، "مجلس البحوث الأسترالي" (LE0882864 منحة بشرية إلى F.A.M.)، "مستقبل الزمالة" (FT100100725 إلى B.V.S.)، "مجلس البحوث الأسترالية" (منحة بشرية LE130100078 إلى F.A.M). ومنح "تمويل المشروع" (APP1103923 إلى B.V.S.). F.A.M. وهو زميل أبحاث كبار NHMRC (ONT1060075).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
| Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
| Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
| Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
| Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
| Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
| Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
| Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 |
References
- Sudhof, T. C. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12696-12717 (2014).
- Papadopulos, A., et al. Activity-driven relaxation of the cortical actomyosin II network synchronizes Munc18-1-dependent neurosecretory vesicle docking. Nat Commun. 6, 6297 (2015).
- Papadopulos, A., Tomatis, V. M., Kasula, R., Meunier, F. A. The cortical acto-Myosin network: from diffusion barrier to functional gateway in the transport of neurosecretory vesicles to the plasma membrane. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 153 (2013).
- Tomatis, V. M., et al. Myosin VI small insert isoform maintains exocytosis by tethering secretory granules to the cortical actin. J Cell Biol. 200 (3), 301-320 (2013).
- Wen, P. J., et al. Phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate coordinates actin-mediated mobilization and translocation of secretory vesicles to the plasma membrane of chromaffin cells. Nature Communications. 2, (2011).
- Malintan, N. T., et al. Abrogating Munc18-1-SNARE complex interaction has limited impact on exocytosis in PC12 cells. J Biol Chem. 284 (32), 21637-21646 (2009).
- Choquet, D., Triller, A. The dynamic synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59 (3), 359-374 (2008).
- Gandasi, N. R., Barg, S. Contact-induced clustering of syntaxin and munc18 docks secretory granules at the exocytosis site. Nat Commun. 5, 3914 (2014).
- Milovanovic, D., Jahn, R. Organization and dynamics of SNARE proteins in the presynaptic membrane. Front Physiol. 6, 89 (2015).
- Kasula, R., et al. The Munc18-1 domain 3a hinge-loop controls syntaxin-1A nanodomain assembly and engagement with the SNARE complex during secretory vesicle priming. J Cell Biol. 214 (7), 847-858 (2016).
- Constals, A., et al. Glutamate-induced AMPA receptor desensitization increases their mobility and modulates short-term plasticity through unbinding from Stargazin. Neuron. 85 (4), 787-803 (2015).
- Ribrault, C., et al. Syntaxin1A lateral diffusion reveals transient and local SNARE interactions. Journal of Neuroscience. 31 (48), 17590-17602 (2011).
- Bademosi, A. T., et al. In vivo single-molecule imaging of syntaxin1A reveals polyphosphoinositide- and activity-dependent trapping in presynaptic nanoclusters. Nat Commun. 8, 13660 (2017).
- Bar-On, D., et al. Super-resolution imaging reveals the internal architecture of nano-sized syntaxin clusters. J Biol Chem. 287 (32), 27158-27167 (2012).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Zhang, M. S., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-U297 (2012).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Schneider, R., et al. Mobility of calcium channels in the presynaptic membrane. Neuron. 86 (3), 672-679 (2015).
- Berning, S., Willig, K. I., Steffens, H., Dibaj, P., Hell, S. W. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551-551 (2012).
- Willig, K. I., et al. Nanoscopy of filamentous actin in cortical dendrites of a living mouse. Biophys J. 106 (1), L01-L03 (2014).
- Zhan, H., et al. In vivo single-molecule imaging identifies altered dynamics of calcium channels in dystrophin-mutant C. elegans. Nat Commun. 5, 4974 (2014).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Vanhauwaert, R., et al. The SAC1 domain in synaptojanin is required for autophagosome maturation at presynaptic terminals. EMBO J. , (2017).
- Joensuu, M., et al. Subdiffractional tracking of internalized molecules reveals heterogeneous motion states of synaptic vesicles. J Cell Biol. 215 (2), 277-292 (2016).
- Merhi, A., Gerard, N., Lauwers, E., Prevost, M., Andre, B. Systematic mutational analysis of the intracellular regions of yeast Gap1 permease. PLoS One. 6 (4), e18457 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
- Stewart, B. A., McLean, J. R. Population density regulates Drosophila synaptic morphology in a Fasciclin-II-dependent manner. J Neurobiol. 61 (3), 392-399 (2004).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J Neurophysiol. 88 (5), 2659-2663 (2002).
- Halachmi, N., Nachman, A., Salzberg, A. Visualization of proprioceptors in Drosophila larvae and pupae. J Vis Exp. (64), e3846 (2012).
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
- Nair, D., et al. Super-resolution imaging reveals that AMPA receptors inside synapses are dynamically organized in nanodomains regulated by PSD95. J Neurosci. 33 (32), 13204-13224 (2013).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Ferguson, J. P., et al. Deciphering dynamics of clathrin-mediated endocytosis in a living organism. J Cell Biol. 214 (3), 347-358 (2016).
- Greiss, F., Deligiannaki, M., Jung, C., Gaul, U., Braun, D. Single-Molecule Imaging in Living Drosophila Embryos with Reflected Light-Sheet Microscopy. Biophys J. 110 (4), 939-946 (2016).
- Robin, F. B., McFadden, W. M., Yao, B., Munro, E. M. Single-molecule analysis of cell surface dynamics in Caenorhabditis elegans embryos. Nat Methods. 11 (6), 677-682 (2014).
- Singh, A. P., et al. 3D Protein Dynamics in the Cell Nucleus. Biophys J. 112 (1), 133-142 (2017).
- Perillo, E. P., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, 7874 (2015).
- Knodel, M. M., et al. Synaptic bouton properties are tuned to best fit the prevailing firing pattern. Front Comput Neurosci. 8, 101 (2014).
- Yang, Q., Karpikov, A., Toomre, D., Duncan, J. Estimation of 3D geometry of microtubules using multi-angle total internal reflection fluorescence microscopy. Med Image Comput Comput Assist Interv. 13 (Pt 2), 538-545 (2010).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17164-17169 (2014).
